DE102004059376A1

DE102004059376A1 - GDH-Mutante mit verbesserter chemischer Stabilität

Info

Publication number: DE102004059376A1
Application number: DE102004059376A
Authority: DE
Inventors: Rupert Dr. Pfaller
Original assignee: Consortium fuer Elektrochemische Industrie GmbH
Current assignee: Wacker Chemie AG
Priority date: 2004-12-09
Filing date: 2004-12-09
Publication date: 2006-06-22
Also published as: WO2006061137A1

Abstract

Gegenstand der Erfindung ist Glucose-Dehydrogenase mit einer Aminosäuresequenz, die der Aminosäuresequenz einer GDH von Bacillus subtilis, umfassend einen Glutaminsäurerest an Position 96, entspricht mit dem Unterschied, dass der Glutaminsäurerest an Position 96 gegen eine umpolare bzw. hydrophobe Aminosäure oder Glycin ausgetauscht ist.

Description

Die Erfindung betrifft eine Mutante des Enzyms Glucose Dehydrogenase (GDH) der Art Bacillus subtilis mit hoher Prozessstabilität bei Biotransformationen, ihre Herstellung und Verwendung zur Regenerierung von NADH, bzw. NADPH Redox-Cofaktoren bei enzymatisch katalysierten Reduktionsreaktionen.
Optisch aktive Hydroxyverbindungen sind wertvolle Synthesebausteine, z. B. bei der Herstellung pharmazeutischer Wirkstoffe oder von Agrochemikalien. Sie haben daher eine wichtige wirtschaftliche Bedeutung. Diese Verbindungen sind durch klassische chemische Verfahren oft nur schwer herstellbar. Die erforderlichen optischen Reinheiten für Anwendungen im pharmazeutischen oder agrochemischen Bereich sind auf diesem Wege nur schwer zu erreichen. Daher werden zur Herstellung chiraler Verbindungen im zunehmenden Maße biotechnologische Verfahren angewendet. Speziell Enzyme, die Carbonylverbindungen reduzieren können, finden wegen ihrer hohen Enantioselektivität vermehrt Verwendung.
Enzyme aus der Klasse der Oxidoreduktasen, die zur Herstellung chiraler Verbindungen durch Reduktion prochiraler Carbonylverbindungen eingesetzt werden, werden definitionsgemäß mit dem Sammelbegriff Carbonylreduktasen (in der Folge „CR") bezeichnet. In der Mehrzahl der Fälle ist das Produkt einer CR-Reaktion ein Alkohol. Es ist aber auch möglich, dass das Produkt einer CR-Reaktion ein Amin ist. Zu den unter dem Sammelbegriff Carbonylreduktasen zusammengefassten Enzymklassen zählen unter anderen Alkohldehydrogenasen (in der Folge „ADH"), Aldo-Ketoreduktasen („AKR"), Aldehydreduktasen, Glycerindehydrogenasen und die Fettsäuresynthase (bezeichnet als „FAS"). Aber auch Aminotransferasen oder Aminosäuredehydrogenasen (z. B. Threonindehydrogenase) sind zu den CRs zu zählen. Diesem breiten Spektrum reduzierender Enzyme ist gemeinsam, dass sie die Elektronen für die Reduktion der Carbonylverbindung aus Redox-Cofaktoren in deren reduzierter Form, üblicherweise NADH oder NADPH, beziehen. Diese Redox-Cofaktoren werden bei der Reaktion stöchiometrisch verbraucht, d. h. sie müssen entweder stöchiometrisch eingesetzt werden oder aber durch Oxidation eines Cosubstrats regeneriert werden. Der stöchiometrische Einsatz von NADH oder NADPH ist aufgrund des hohen Preises dieser Verbindungen unwirtschaftlich. Dieser Nachteil kann durch die sog. Cofaktor-Regenerierung umgangen werden. Voraussetzung dafür sind ein billiges Reduktionsmittel und ein Cofaktorreduzierendes Enzym. Erst die effiziente und billige Regenerierung des Redox-Cofaktors ermöglicht den technischen Einsatz biokatalytischer Reduktionsverfahren.

Verschiedene Möglichkeiten zur Cofaktor-Regenerierung sind bekannt: Beim Einsatz einer CR aus der Klasse der ADH's ist die Cofaktor-Regenerierung durch Oxidation eines billigen Alkohols (Cosubstrat), z. B. Isopropanol, möglich. Es werden also die stereoselektive Reduktion des Substrats und die Cofaktor-Regenerierung von einem Enzym besorgt. Dabei besitzen ADH's im allgemeinen den Nachteil, dass ihr pH-Optimum der Reduktion und Oxidation stark unterschiedlich sind, so dass die Gesamtreaktion nur mit verminderter Geschwindigkeit abläuft, was die Raum-Zeit-Ausbeuten beeinträchtigt. So wurde z. B. für die ADH aus Rhodococcus erythropolis ein pH-Optimum für die Reduktion von 5,5, für die Oxidation dagegen von 9,5 gefunden (Zelinski et al., J. Biotechnol. (1994) 33: 283-292). Zusätzliche Nachteile sind, dass nicht alle ADH's mit Isopropanol reagieren und außerdem bei den gewünschten hohen Raum-Zeit-Ausbeuten große Mengen Isopropanol eingesetzt werden müssen, bzw. große Mengen an Aceton anfallen, dem Reaktionsprodukt der Isopropanoloxidation. Bekanntermaßen sind beide Verbindungen in hohen Konzentrationen enzymschädigend. Schließlich kann die Einstellung eines Reaktionsgleichgewichts dazu führen, dass quantitative Reaktionsumsätze nicht erreicht werden, was zu reduzierten Ausbeuten und wegen ähnlicher physikalisch-chemischer Eigenschaften von Edukt (das Substrat der CR-Reaktion) und Produkt oftmals zu Schwierigkeiten bei der Produktisolierung führt.

Bei Nicht-ADH CRs erfolgt aufgrund eines fehlenden Cosubstrats die Cofaktor-Regenerierung grundsätzlich auf andere Weise. Bekannt ist die gleichzeitige Verwendung der CR mit einem zweiten Enzym. Dabei reduziert eine CR das Substrat stereoselektiv zum gewünschten Produkt. Die Regenerierung des verbrauchten NADH, bzw. NRDPH Cofaktors wird durch ein zweites Enzym bewerkstelligt. Prinzipiell ist jedes Enzym zur Cofaktor-Regenerierung geeignet, das in einer enzymatischen Reaktion ein Substrat oxidiert und gleichzeitig NRD zu NADH, bzw. NADP zu NADPH reduziert. Man wird jedoch ein Enzym verwenden, das ein möglichst billiges Substrat oxidiert. Enzyme, die zur Cofaktor-Regenerierung eingesetzt werden können, sind z. B. Formiatdehydrogenase (FDH), Glutamatdehydrogenase, Glycerindehydrogenase und Glucose Dehydrogenase (GDH).

Bei Ganzzellbiotransformationen kann die Cofaktor-Regenerierung auch durch den zellulären Stoffwechsel erfolgen. Ein bekanntes Beispiel dafür sind Biotransformationen der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae. Jedoch ist nicht jeder Mikroorganismus dafür geeignet. Nachteilig sind bei diesen Biotransformationen die generell niedrigen Raum-Zeit-Ausbeuten, sowie die Erfordernis eines intakten zellulären Stoffwechsels.

Unter den bekannten Cofaktor-regenerierenden Enzymen eignet sich die FDH nur zur Regenerierung des NADH Cofaktors. Nachteil der FDH ist die bekannt geringe spezifische Aktivität des Enzyms, was geringe Raum-Zeit-Ausbeuten bedingt. Außerdem ist damit zu rechnen, dass Ameisensäure (das Cosubstrat) oder deren Salze in großen Konzentrationen enzymschädigend auf die CR wirken. FDH-Mutanten mit Spezifität für NRDPH wurden beschrieben, der Einsatz im technischen Maßstab ist aufgrund ihrer niedrigen Aktivität nur von geringem Nutzen.

Glutamatdehydrogenase eignet sich zur Regenerierung von NADPH, wobei Glutaminsäure zu α-Ketoglutarat oxidiert wird. Über ihre Verwendung zur Cofaktor-Regenerierung ist wenig bekannt.

GDH oxidiert Glucose zu δ-Gluconolacton, das in wässriger Lösung weiter zur Gluconsäure dehydratisiert. Vorteile der GDH, speziell der Enzyme aus der Gattung Bacillus, sind eine hohe spezifische Aktivität des Enzyms sowie die Möglichkeit, sowohl NRDH wie NADPH Cofaktoren zu regenerieren. Somit sind hohe Raum-Zeit-Ausbeuten und ein breiter Einsatz des Enzyms in Verbindung mit praktisch allen CRs gewährleistet. Außerdem ist Glucose als Cosubstrat ein billiges Reduktionsmittel. Nachteil der bekannten GDH's ist die schlechte chemische Stabilität des Enzyms, was den Einsatz großer Mengen Enzym erfordert.

Bei der am weitest verbreiteten GDH für die Cofaktorregenerierung handelt es sich um eine GDH aus Bacillus megaterium (zusammengefasst in einem Übersichtsartikel von Kataoka et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2003) 62: 437-445). GDH aus B. megaterium wird für Biotransformationen eingesetzt ( EP 0967271 ). Bei dem Enzym handelt es sich um ein Tetramer aus vier identischen Untereinheiten. Bekannt ist seine niedrige thermische Stabilität (Makino et al., J. Biol. Chem. (1989) 264: 6381-6385). Eine gewisse Stabilisierung wird erreicht durch hohe NaCl-Konzentrationen im Reaktionspuffer. Die Gensequenz der Bacillus megaterium GDH und Mutanten dieser GDH, die eine höhere Temperaturstabilität besitzen sind in Makino et al., J. Biol. Chem. (1989) 264: 6381-6385 offenbart. Diese Mutanten sind in ihren kinetischen Eigenschaften dem Wildtypenzym jedoch deutlich unterlegen (Nagao et al., FEBS Lett. (1989) 253, 113-116).

Um mit GDH aus B. megaterium zur Cofaktor-Regenerierung bei Biotransformationen hohe Raum-Zeit-Ausbeuten zu erreichen, werden üblicherweise aufwändige Verfahrensschritte wie Zweiphasensysteme eingesetzt. Oft kann dann kein quantitativer Umsatz des Eduktes mehr erzielt werden. Zusätzlich bereitet dann oft die Abtrennung von nicht umgesetztem Edukt Schwierigkeiten bei der Produktisolierung. Auch ist ein Wiedereinsatz der GDH nicht bekannt, der die Wirtschaftlichkeit der Biotransformationen verbessern würde.

Ein durch Biotransformation hergestelltes Produkt von großer wirtschaftlicher Bedeutung ist (S)-4-Chlor-3-Hydroxybuttersäureethylester (S-CHBE), das großtechnisch als Synthesebaustein zur Herstellung der sogenannten Statine verwendet wird. Statine sind eine Klasse pharmakologischer Wirkstoffe, die als Cholesterinsenker in Medikamenten eingesetzt werden. Sie sind von enormer medizinischer Bedeutung bei der Vorbeugung und Behandlung der zum Herzinfarkt führenden Arteriosklerose. S-CHBE wird technisch in Biotransformationen aus 4Cl-ACE hergestellt. Als chlorierter sekundärer Alkohol besitzt S-CHBE eine hohe chemische Reaktivität und S-CHBE ist für die schnelle irreversible Inaktivierung der an der Biotransformation beteiligten Enzyme, speziell der Cofaktor-regenerierenden GDH, verantwortlich.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine GDH zur Verfügung zu stellen, die nicht die Nachteile des Standes der Technik aufweist und insbesondere eine erhöhte chemische Stabilität gegen alpha-halogenierte Carbonylverbindungen oder alpha-halogenierte Alkohole aufweist.

Ein Beispiel für eine solche Verbindung ist S-CHBE.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine GDH mit einer im Vergleich zum Stand der Technik erhöhten Stabilität gegenüber Lösungsmitteln, die bei einer Biotransformation zum Einsatz kommen, zur Verfügung zu stellen. Beispiele für solche Lösungsmittel sind n-Butylacetat, welches als nicht wassermischbares Lösungsmittel bei Zweiphasen-Biotransformationen Verwendung findet, sowie Methyl-Tertiärbutylether (MTBE) als Lösungsmittel zur Produktextraktion aus wässrigen Biotransformationsansätzen.

Die Aufgabe wird gelöst durch eine GDH mit einer Aminosäuresequenz, die der Aminosäuresequenz einer GDH von Bacillus subtilis umfassend einen Glutaminsäurerest an Position 96 entspricht mit dem Unterschied, dass der Glutaminsäurerest an Position 96 gegen eine unpolare bzw. hydrophobe Aminosäure oder Glycin ausgetauscht ist.

Die Aminosäuresequenz einer erfindungsgemäßen Bacillus subtilis GDH-Mutante umfassend einen Alaninrest an Position 96 entspricht vorzugsweise SEQ. ID. NO: 1.

Bevorzugt befindet sich bei der erfindungsgemäßen GDH an Position 96 eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Methionin, Phenylalanin, Tyrosin, und Tryptophan.

Besonders bevorzugte befindet sich bei der erfindungsgemäßen GDH an Position 96 eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin.

Insbesondere bevorzugt befindet sich bei der erfindungsgemäßen GDH an Position 96 die hydrophobe Aminosäure Alanin.

Die erfindungsgemäßen GDHs, im folgenden auch GDH-Mutanten genannt, zeichnen sich vor allem durch eine überraschend hohe chemische Stabilität gegen (S)-4-Chlor-3-Hydroxybuttersäureethylester (S-CHBE) aus. Darüber hinaus besitzen die GDH-Mutanten eine hohe Stabilität gegenüber Lösungsmitteln wie n-Butylacetat und MTBE, die häufig bei Biotransformationen verwendet werden. Schließlich weisen die GDH-Mutanten nicht den Nachteil einer stark erniedrigten enzymatischen Aktivität im Vergleich zum Wildtypenzym auf, wie bei ähnlichen Enzymen aus der Gattung Bacillus megaterium beobachtet.

Die erfindungsgemäßen GDH-Mutanten eignen sich aufgrund ihrer hohen Prozessstabilität für Biotransformationen mit hoher E-dukt- und Produktkonzentration, für Zweiphasensysteme und zur Wiederverwendung des Biokatalysators. Die Erfindung dient daher zur Verbesserung der Wirtschaftlichkeit bei Biotransformationen.

Die Erfindung betrifft ferner ein Gen codierend für eine erfindungsgemäße GDH. Ein bevorzugte Ausführungsform eines solchen Gens ist charakterisiert durch SEQ. ID. NO 2.

Erfindungsgemäße Gene sind ferner auch alle durch den degenerierten genetischen Code bedingten Varianten der Gene codierend für eine erfindungsgemäße GDH.

Ein erfindungsgemäßes Gen lässt sich herstellen aus einem GDH-Gen aus B. subtilis. Das Gen kann aus genomischer DNS von B. subtilis mit an sich bekannten Methoden wie PCR isoliert und in einen Expressionsvektor kloniert werden. Dadurch ist die Produktion des erfindungsgemäßen Enzyms und seiner genetischen Varianten in rekombinanter Form möglich. Beispielsweise kann das Gen aus dem B. subtilis Stamm LK5 DSM 13487 (hinterlegt nach dem Budapester Vertrag bei der DSMZ Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig) verwendet werden.

Das GDH-Wildtypenzym aus dem Stamm Bacillus subtilis LK5 ist charakterisiert durch die in SEQ ID NO: 3 angegebene Proteinsequenz und die dafür kodierende Gensequenz (SEQ ID NO: 4). Die Proteinsequenz aus SEQ ID NO: 3 ist zu 99 % identisch mit der in Lampel et al., J. Bacteriol. (1986) 166: 238-243 offenbarten Proteinsequenz der GDH aus Bacillus subtilis, bzw. zu 83 % identisch mit der Proteinsequenz der GDH aus Bacillus megaterium.

In der vorliegenden Anmeldung beziehen sich alle Homologiewerte auf Ergebnisse, die mit dem Computerprogramm "Wisconsin Package Version 10.3, Accelrys Inc." erhalten wurden. Die Homologiebestimmung erfolgte durch Vergleich der Proteinsequenzen mit dem Unterprogramm "gap". Hierbei werden die voreingestellten Parameter "gap creation penalty 8" und "gap extension penalty 2" verwendet.

Aus der Kristallstruktur einer B. megaterium GDH (Yamamoto et al., J. Biochem. (2001) 129: 303-312) ist bekannt, dass das enzymatisch aktive GDH-Tetramer durch hydrophobe Wechselwirkung zwischen den einzelnen Untereinheiten stabilisiert wird. Eine Verstärkung der hydrophoben Wechselwirkung, z. B. durch eine NaCl-Konzentration von 1-2 M oder durch Zusatz von Glycerin, ermöglicht in begrenztem Umfang die Erhöhung der thermischen Stabilität. Über einen Einfluss auf eine chemische Inaktivierung des Enzyms durch Verbindungen wie S-CHBE lassen sich aus dieser Beobachtung keine Vorhersagen treffen.

In Makino et al., J. Biol. Chem. (1989) 264: 6381-6385 werden Genmutationen offenbart, die zu einer Erhöhung der Temperaturstabilität der GDH aus B. megaterium führen. Eine dieser Mutationen ersetzte die negativ geladene Aminosäure Glutaminsäure an Position 96 durch eine ungeladene Aminosäure, wie z. B. Alanin oder Glycin. Die erhöhte Temperaturstabilität in dieser Mutante wird dadurch erklärt, dass die negative Ladung der Glutaminsäure zu einer elektrostatischen Abstoßung der einzelnen Untereinheiten des GDH-Enzyms führt, was vor allem bei höheren Temperaturen und pH-Werten zu einer Dissoziation und Inaktivierung des Enzyms führt. Die Einführung einer ungeladenen Aminosäure reduziert die elektrostatische Abstoßung und erhöht die thermische Stabilität des Enzyms. Aus diesen Beobachtungen lassen sich keine Aussagen über die Veränderung der chemischen Stabilität ableiten. Der Fachmann erwartet eher keinen Zusammenhang zwischen thermischer und chemischer Stabilität, da die Enzyminaktivierung durch eine Verbindung wie S-CHBE nicht durch Beeinflussung ionischer oder hydrophober Wechselwirkungen erfolgt, sondern durch chemische Modifikation reaktiver Aminosäurereste im GDH-Protein.

Daher ist der Befund, dass die Einführung einer erfindungsgemäß definierten Mutation in dem GDH Enzym aus B. subtilis die chemische Stabilität dieses Enzyms drastisch erhöht, ohne dass gleichzeitig eine Stabilisierung durch NaCl-Konzentrationen von 1-2 M erforderlich ist, überraschend. Die erfindungsgemäße Mutation, die bei der GDH aus Bacillus subtilis zu einer erhöhten chemischen Stabilität führt, bewirkt bei Mutationen der GDH aus Bacillus megaterium nur eine Erhöhung der Temperaturstabilität.

Die besonders bevorzugte erfindungsgemäße GDH-Mutante, bei der eine Glutaminsäure an Position 96 ersetzt ist durch Alanin, wird bezeichnet als GDBS-E96A. Die Gensequenz dieser Mutante ist spezifiziert durch die in SEQ ID NO: 2 aufgeführte DNS-Sequenz bzw. die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 1).

Unerwarteterweise bewirken die erfindungsgemäßen Mutationen in GDBS-E96A eine drastische Erhöhung der chemischen Stabilität gegenüber enzymschädigenden Verbindungen wie S-CHBE.

Die erfindungsgemäße GDBS-E96A zeichnet sich dementsprechend durch eine hohe Prozessstabilität bei Biotransformationen aus wie z. B. der enzymatischen Synthese von S-CHBE aus 4Cl-ACE.

Die erfindungsgemäße GDH, z. B. das GDBS-E96A Protein kann durch an sich bekannte Methoden in rekombinanter Form hergestellt werden. Dazu wird ein erfindungsgemäßes GDH Gen, vorzugsweise das GDBS-E96A Gen, in einen geeigneten Expressionsvektor kloniert, dieser in einen Produktionswirt transformiert, transformierte Zellen kultiviert, wobei die erfindungsgemäße GDH entweder konstitutiv oder nach Induktion der Genexpression produziert wird. Darüber hinaus kann in dem gleichen Produktionswirt neben der erfindungsgemäßen GDH eine oder auch mehrere CRs in rekombinanter Form hergestellt werden.

Die Erfindung umfasst somit auch Expressionsvektoren, die zur rekombinanten Produktion einer erfindungsgemäßen GDH, vorzugsweise der GDH GDBS-E96A geeignet sind. Wo gewünscht lassen sich mit den erfindungsgemäßen Expressionsvektoren auch eine oder mehrere CRs in einem Wirtsorganismus produzieren.

Das auf diese Weise hergestellte GDH Enzym kann dann direkt in den Zellen des Produktionswirts weiterverwendet werden oder aber nach Aufschluss der Zellen als Proteinextrakt bzw. nach entsprechender Aufarbeitung durch z. B. Säulenchromatographie als gereinigtes Protein.

Für die Enzymproduktion sind bakterielle und eukaryontische Expressionssysteme geeignet. Wirtsorganismen für die Enzymproduktion sind vorzugsweise ausgewählt aus Escherichia coli, Stämmen der Gattung Bacillus, Hefen wie Pichia pastoris, Hansenula polymorpha oder Saccharomyces cerevisiae sowie Pilzen wie Aspergillus oder Neurospora, sie sind aber nicht auf die genannten Wirtsorganismen beschränkt.

Zu den bevorzugten Expressionssystemen zählen E. coli, Bacillus, Pichia pastoris, S. cerevisiae, Hansenula polymorpha oder Aspergillus.

Besonders bevorzugte Expressionssysteme für die Produktion des GDH Enzyms sind E. coli, Pichia pastoris und S. cerevisiae.

Das so produzierte erfindungsgemäße GDH Protein, vorzugsweise GDBS-E96A, entweder in ganzen Zellen oder als Zellextrakt bzw. als gereinigtes Protein vorliegend, kann in Biotransformationen zur Regenerierung von NADH- und NADPH Cofaktoren verwendet werden. Es zeichnet sich dadurch aus, dass es nach einer Behandlung mit S-CHBE bis zu einer Konzentration von 10 % (v/v) (entsprechend einer Konzentration von 710 mM) in einem wässrigen Medium bei pH 7,0 und 30°C für 2,5 h weniger als 30 % seiner Aktivität im Vergleich zum unbehandelten Enzym verliert. Die Wildtyp GDH (entsprechend der in SEQ ID NO: 3 aufgeführten Proteinsequenz) ist dagegen bereits nach einer Behandlung mit 3 (v/v) S-CHBE für 30 min bei pH 7,0 und 30°C zu 100 % inaktiv. Diese erfindungsgemäß hohe chemische Stabilität ist Grundlage für die Verwendung der GDH Mutante in Biotransformationen.

In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung zeichnet sich die erfindungsgemäße GDH-Mutante dadurch aus, dass es nach einer Behandlung mit S-CHBE bis zu einer Konzentration von 10 % (v/v) in einem wässrigen Medium bei pH 7,0 und 30°C für 2,5 h weniger als 20 % seiner Aktivität im Vergleich zum unbehandelten Enzym verliert.

In einer besonders bevorzugten Ausführung der Erfindung zeichnet sich die GDH-Mutante dadurch aus, dass es nach einer Behandlung mit S-CHBE bis zu einer Konzentration von 10 % (v/v) in einem wässrigen Medium bei pH 7,0 und 30°C für 2,5 h weniger als 10 % seiner Aktivität im Vergleich zum unbehandelten Enzym verliert.

Ferner zeichnet sich die erfindungsgemäße GDH-Mutante durch eine hohe Lösungsmittelstabilität gegenüber n-Butylacetat und MTBE aus. In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung ist die GDH-Mutante charakterisiert dadurch, dass sie nach einer Behandlung in wässriger Lösung in einem Zweiphasengemisch unter ständigem Mischen, um eine Phasentrennung zu verhindern, mit 20 % (v/v) eines der beiden Lösungsmittel n-Butylacetat oder MTBE für 2 h bei 30°C und pH 7,0, nicht mehr als 20 % seiner Aktivität verliert.

In einer besonders bevorzugten Ausführung verliert die GDH-Mutante unter diesen Bedingungen nicht mehr als 10 % seiner Aktivität.

Die Anwendung der erfindungsgemäßen GDH ist jedoch nicht nur auf Biotransformationen beschränkt. Es findet auch in anderen Anwendungen Verwendung. Bekannt sind z. B. die Verwendung in Biosensoren, z. B. zur Glucosebestimmung. Das erfindungsgemäße Enzym kann aber auch zur Herstellung von Gluconsäure, bzw. deren Salze, durch Oxidation von Glucose, verwendet werden. Darüber hinaus umfasst die Erfindung auch die Verwendung der erfindungsgemäßen GDH-Mutante zur Oxidation anderer Zucker, wie z. B. 2-Deoxyglucose oder D-Glucosamin.

Erfindungsgemäße Biotransformationszusammensetzungen umfassen eine erfindungsgemäße GDH-Mutante, ein CR-Enzym, einen Redox-Cofaktor ausgewählt aus NAD, NADH, NADP oder NADPH, ein Reduktionsmittel, vorzugsweise Glucose oder 2-Deoxyglucose sowie ein zu reduzierendes Substrat (Edukt) für das CR-Enzym, ausgewählt aus der Klasse der Carbonylverbindungen.

Die erfindungsgemäße Zusammensetzung wird genutzt in einem Verfahren zur Herstellung von chiralen Alkoholen oder chiralen Aminen, wobei die erfindungsgemäße GDH die kostengünstige Regenerierung von NADH bzw. NADPH-Cofaktoren bewirkt, die bei der enantioselektiven Reduktion des Edukts durch die CR verbraucht werden.

Die Erfindung bezieht sich also auch auf Verfahren, bei denen eine erfindungsgemäße GDH zur Cofaktor-Regenerierung verwendet wird. Die Einsatzmenge der GDH im Verhältnis zum CR-Enzym ist dabei nicht festgelegt. Die Biotransformation wird dabei vorzugsweise in einem gepufferten, wässrigen Medium ausgeführt. Es ist aber auch möglich, die Biotransformation in einem zweiphasigen Gemisch durchzuführen, bestehend aus einer gepufferten, wässrigen Phase und einer zweiten, nicht mit Wasser mischbaren Phase, vorzugsweise einem organischen Lösungsmittel.

Insbesondere umfasst die Erfindung auch Verfahren, bei denen die GDH aufgrund ihrer hohen chemischen Stabilität, entweder alleine oder zusammen mit der CR, aus dem Reaktionsansatz zurückgewonnen werden kann für eine Wiederverwendung mit dem Ziel, die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens zu erhöhen. Die Wiedergewinnung bezieht sich dabei auf Verfahren, wo das Reaktionsprodukt in an sich bekannter Weise nach Reaktionsende durch Extraktion mit einem in der wässrigen Phase nicht löslichen Lösungsmittel extrahiert wird und das Enzym mit der wässrigen Phase für den Wiedereinsatz zurückgewonnen wird. Dabei kann die Extraktion kontinuierlich oder diskontinuierlich erfolgen.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst außerdem alle CR-Enzyme, die als Edukt einer Biotransformation eine Carbonylverbindung reduzieren können, wobei als Reduktionsmittel NADH oder NADPH verbraucht wird.

Bevorzugte CRs sind alle Enzyme, die eine Carbonylverbindung zu einem Alkohol, insbesondere einen chiralen Alkohol, reduzieren können.

Besonders bevorzugt sind CRs aus der Gruppe der ADHs, der AKRs, der Glycerindehydrogenasen, der Aldehydreduktasen und der Fettsäuresynthasen.

Insbesondere bevorzugt sind ADH's aus den Gattungen Lactobacillus, Rhodococcus, Thermoanaerobacter (bzw. Thermoanaerobium), sowie AKRs, Glycerindehydrogenasen, Aldehydreduktasen und Fettsäuresynthasen aus Hefen oder filamentösen Pilzen.

Die erfindungsgemäße GDH und die CR können im erfindungsgemäßen Verfahren entweder vollständig gereinigt oder teilweise gereinigt eingesetzt werden oder in Zellen enthalten (Ganzzellverfahren) verwendet werden. Dies schließt die Möglichkeiten ein, dass die GDH und die CR getrennt oder aber auch zusammen in den Zellen (Co-Expression) enthalten sind. Die eingesetzten Zellen können dabei nativ, permeabilisiert oder lysiert vorliegen. Die Einsatzmengen der CR und der erfindungsgemäßen GDH in dem erfindungsgemäßen Verfahren sind dabei nicht festgelegt, dem Fachmann ist aber geläufig, dass mit einem möglichst geringen Enzymeinsatz bei hoher Raum-Zeit-Ausbeute ein möglichst quantitativer Umsatz des Substrates zum Produkt erfolgen soll.

Als Substrate der Biotransformationen, bei denen die erfindungsgemäße GDH die Regenerierung von NADH bzw. NADPH bewerkstelligt, können allgemein Carbonylverbindungen verwendet werden, bevorzugt solche mit 3 bis 40 C-Atomen.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden prochirale Carbonylverbindungen der allgemeinen Formel (I) R1-C(O)-R2 (I)eingesetzt, wobei
R1 und R2 unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe enthaltend C1-C20-Alkyl, C3-C20-Cycloalkyl, C5-C20-Aryl, C1-C20-Heteroaryl, C2-C20-Alkenyl, C5-C20-Aralkyl, C5-C20-Alkylaryl oder R1 und R2 zusammen einen Ring bilden können
und R1 und R2 gegebenenfalls unabhängig voneinander mit einem oder mehreren Resten Z substituiert sein können, wobei
Z ausgewählt wird aus der Gruppe enthaltend Fluor, Chlor, Brom, Iod, -CN, -NO2, -NO, -NR3OR3, -CHO, SO3H, -COOH oder -R3 und
R3 für Wasserstoff steht oder die Bedeutung von R1 haben kann und
in R1 und R2 gegebenenfalls unabhängig voneinander eine oder mehrere Methylengruppen durch gleiche oder verschiedene Gruppen Y ersetzt sein können, wobei
Y ausgewählt wird aus der Gruppe enthaltend -CR3=CR3-, -C=C-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -C(O)OC(O)-, -O-, -O-O-, -CR3=N-, -C(O)-NR3-, N=N-, -NR3-NR3-, -NR3-O-, -NR3-, -P(O)(OR3)O-, -OP(O)(R3)O-, -P(R3)-, P(O)(R3)-, -S-, -S-S-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)NR3-, -S(O)(OR3)O-, -Si(R3)2-, Si(R3)2O-, -Si(R3)(OR3)-, -OSi(R3)2O-, -OSi(R3)2-oder -Si(R3)2OSi(R3)2-.

Bevorzugte C5-C20-Aryl oder C1-C20-Heteroaryl-Reste für R1 und R2 werden insbesondere ausgewählt aus der Gruppe enthaltend -Phenyl, -Naphthyl, -Indolyl, -Benzofuranyl, -Thiophenyl, -Pyrrolyl, -Pyridinyl, -Imidazolyl, -Oxazolyl, -Isoxazolyl, -Furanyl, oder -Thiazolyl.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) können im allgemeinen auch als Salze eingesetzt werden.

Besonders bevorzugte Verbindungen der allgemeinen Formel (I) werden ausgewählt aus der Klasse der α-Ketoester, β-Ketoester, γ-Ketoester, α-Diketone, β-Diketone, γ-Diketone, δ-Diketone, α- Halogenketone, β-Halogenketone, αα-Dihalogenketone, α-Alkoxyketone, α-Acyloxyketone, β-Alkoxyketone, α-Alkinketone, Alkenketone, αα-Dialkoxyketone, ββ-Dialkoxyketone, Arylketone, Heteroarylketone.

Insbesondere eignen sich als Verbindungen der allgemeinen Formel (I) 3-Oxo-butansäuremethylester, 3-Oxo-butansäureethylester, 4-Chlor-3-oxo-butansäuremethylester, 4-Chlor-3-oxo-butansäureethylester, 3-Oxo-pentansäuremethylester, 3-Oxo-pentansäureethylester, 1-Chlor-propan-2-on, 1,1-Dichlor-propan-2-on, 3-Oxo-butan-2-on, 2,6-Dimethyl-hexan-3,5-dion, 2,7-Dimethyl-hexan-3,6-dion, 2,4-Hexandion, 2,4-Pentandion, 3-Oxo-butansäuretertbutylester, 2,5-Hexandion, 4-Trimethylsilyl-3-butin-2-on, 4-Triisopropylsilyl-3-butin-2-on, 1-Chlor-4-trimethylsilyl-3-butin-2-on, 1-Chlor-4-triisopropylsilyl-3-butin-2-on oder 1-Chlor-butin-2-on, 1-Chlorbutan-3-on, Butanon, Pentan-2-on, Hexan-2-on, Heptan-2-on, Octan-2-on, 3-Penten-2-on, 4,4-Dimethoxybutan-2-on, 1-Acetoxypropan-2-on, Cyclopent-2-en-1-on, 3-Oxotetradecansäuremethylester, 3-Oxododecansäuremethylester, 1,1-Dimethoxy-4-methyl-3-pentanon, 2-Oxo-propionsäureethylester, 1,4-Dichlorbutanon, Acetophenon, 3-Methylbutanon, 1-Benzyloxy-propan-2-on oder 2-Methylcyclopentanon.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) werden im erfindungsgemäßen Verfahren in einer Menge von 1 % bis 50 % bezogen auf das Gesamtvolumen eines jeden Reaktionsansatzes eingesetzt, bevorzugt von 3 % bis 30 %, insbesondere von 5 % bis 20 %.

Die Reaktionsmischung sollte generell einen pH-Wert von 5 bis 9 haben, bevorzugt von 6 bis 8.

Die wässrige Phase (Reaktionsmedium) enthält bevorzugt einen Puffer, insbesondere einen Kaliumphosphat/Kaliumhydrogenphosphat-, Tris(hydroxymethyl)aminomethan/HCl- oder Triethanolamin/HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 5 bis 10, vorzugsweise ein pH-Wert von 6 bis 9. Die Pufferkonzentration sollte von 5 mM bis 150 mM betragen.

Zusätzlich kann die wässrige Phase auch Magnesiumionen enthalten, beispielsweise in Form von zugesetztem MgCl2 in einer Konzentration von 0.2 mM bis 10 mM, bevorzugt 0.5 mM bis 2 mM bezogen auf die eingesetzte Wassermenge. Daneben kann die wässrige Phase weitere Salze, wie beispielsweise NaCl, vorzugsweise in einer Konzentration von 50-200 mM, sowie weitere Zusätze wie beispielsweise Dimethylsulfoxid, Glycerin, Glycol, Ethylenglycol oder bekannt Enzym-stabilisierende Zucker, wie Trehalose, Sorbitol oder Mannitol enthalten.

Als Coenzym können NADP, NADPH, NAD, NADH oder deren Salze eingesetzt werden. Die Konzentration an Coenzym in der wässrigen Phase beträgt bevorzugt von 0.01 mM bis 0.25 mM, besonders bevorzugt von 0.02 mM bis 0.1 mM.

Die Temperatur des Reaktionsgemisches beträgt bevorzugt von 0°C bis 70°C, besonders bevorzugt von 20°C bis 50°C.

Im Laufe der Reaktion kann weiteres Reduktionsmittel, vorzugsweise in Form von Glucose, oder Edukt insbesondere in Form von Carbonylverbindungen der allgemeinen Formel (I), zugegeben werden. Die Zugabe kann dabei jeweils kontinuierlich (als sog. „Feed") oder aber auch in Portionen (sog. „batchweise") erfolgen.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird der pH des Ansatzes infolge der Oxidation von Glucose zu Gluconsäure kontinuierlich abnehmen, was durch Gegentitrieren mit einer Base korrigiert wird. Der pH des Reaktionsgemisches wird konstant gehalten durch Zugabe einer Base, ausgewählt aus Natronlauge, Kalilauge, Ammoniak (sog., dem Fachmann geläufiges, „pH-stat" Verfahren) oder aber durch Zugabe von Calciumcarbonat, aus dem durch Säureeinwirkung gasförmiges Kohlendioxid freigesetzt wird.

Je nach Art und Menge der eingesetzten Alkohol-Dehydrogenase und der eingesetzten Verbindung der allgemeinen Formel (I) beträgt die Reaktionszeit zwischen 30 min und 200 h, bevorzugt 6 h bis 60 h.

Die Extraktion des Produktes erfolgt nach an sich bekannten Methoden, vorzugsweise mit einem mit Wasser nicht mischbaren, organischen Lösungsmittel. Die Extraktion kann dabei diskontinuierlich (batchweise) oder kontinuierlich erfolgen. Wie dem Fachmann bekannt, werden dabei Temperatur und Druck so eingestellt, dass eine optimale Extraktion des Produktes aus der wässrigen Phase gewährleistet ist.

Als organische Lösemittel sind alle mit Wasser nicht mischbaren Lösemittel geeignet, die den gebildeten sekundären Alkohol aus der wässrigen Phase isolieren können.

Bevorzugt werden organische Lösemittel, ausgewählt aus der Gruppe der Ester und/oder Ether, verwendet.

Besonders bevorzugt werden Ethylacetat, Methylacetat, Propylacetat, Isopropylacetat, Buhylacetat, Tertbutylacetat, Diethylether, Diisopropylether, Dibutylether und MTBE oder deren Mischungen verwendet.

Insbesondere bevorzugte Lösungsmittel sind MTBE, Ethylacetat und Butylacetat.

Nach der Abtrennung der organischen Extraktionsphase wird diese vorzugsweise destillativ aufgearbeitet, wobei eine Anreicherung des Reaktionsproduktes erreicht und die teilweise bis vollständige Abtrennung von Nebenprodukten vom Extraktionslösemittel bewirkt wird und dieses erneut zur Extraktion eingesetzt werden kann.

Durch Aufreinigung der organischen Extraktionslösung enthaltend das Rohprodukt, beispielsweise mittels Feindestillation, erhält man das gewünschte Endprodukt. Das Endprodukt zeichnet sich typischerweise durch Ausbeuten > 90 % und einem Enantiomerenüberschuss ee > 90 %, bevorzugt durch Ausbeuten > 95 % und ee > 97 % aus.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst auch den Wiedereinsatz eines wässrigen, enzymhaltigen Reaktionsmediums zur Umsetzung von Carbonylverbindungen zu chiralen Alkoholen. Die sich ergebenden hohen Raum-Zeit-Leistungen und der durch wiederholten Einsatz der Enzymlösung geringe Enzymverbrauch pro Mol Produkt ermöglichen die kostengünstige Umsetzung von Carbonylverbindungen zu chiralen Alkoholen unter Verwendung von Enzymen.

Die erfindungsgemäße GDH-Mutante GDBS-E96A zeichnet sich durch eine unerwartet hohe chemische Stabilität aus, die durch den Stand der Technik nicht zu erwarten war. Für den Fachmann überraschend ergeben sich unter Einbeziehung der erfindungsgemäßen, chemisch stabilen, GDH-Mutante GDBS-E96A zur Cofaktor-Regenerierung die dargestellten Vorteile bei der enzymkatalysierten Herstellung chiraler Alkohole, ausgehend von prochiralen Carbonylverbindungen.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele beschrieben:
1. Beispiel:
Isolierung und Klonierung des GDH-Gens aus genomischer B. subtilis DNS.
Verwendet wurde der B. subtilis Stamm LK5. Genomische DNS aus Bacillus subtilis wurde nach an sich bekannten Methoden isoliert (Makino et al., J. Biol. Chem. (1989) 264: 6381-6385). Das GDH Gen wurde durch PCR mit der Pfu DNS-Polymerase (Stratagene) nach den Angaben des Herstellers mit genomischer DNS aus Bacillus subtilis LK5 und den Primern gdbs-a (SEQ ID NO: 5) und gdbs-b (SEQ ID NO: 6) amplifiziert. Die Primer wurden aus der publizierten Sequenz (Lampel et al., J. Bacteriol. (1986) 166: 238-243) abgeleitet und hatten folgende Sequenzen:
Oligo gdbs-a:
5'-GCAGAATTCATGTATCCGGATTTAAAAGG-3' SEQ ID NO: 5
Oligo gdbs-b:
5'-CACGCGGCCGCTTAACCGCGGCCTGCCTGG-3' SEQ ID NO: 6
Primer gdbs-a enthielt am 5'-Ende eine Eco RI Schnittstelle, Primer gdbs-b enthielt am 5'-Ende eine Not I Schnittstelle. Bei der PCR-Reaktion von genomischer Bacillus subtilis DNS mit den Primern gdbs-a und gdbs-b entstand ein DNS-Fragment von 780 bp Größe.
Vektor pGDBSpic für die Expression in Pichia pastoris:
Das durch die PCR-Reaktion hergestellte 780 bp DNS-Fragment der B. subtilis GDH wurde mit Eco RI und Not I geschnitten und in den mit Eco RI und Not I geschnittenen und dephosphorylierten Vektor pPIC3 (Invitrogen) kloniert. Es entstand der Vektor pGDBSpic (1). Sequenzierung des klonierten GDH Gens ergab die in SEQ ID NO: 4 aufgeführte DNS-Sequenz. Der Expressionsvektor pGDBSpic ist zur Expression des GDH Gens in der Hefe Pichia pastoris geeignet.
Vektor pGDHyexl für die Expression in Saccharomyces cerevisiae:
Das GDH-Gen wurde aus dem Vektor pGDBSpic mit Eco RI und Not I herausgeschnitten und isoliert. Das dabei erhaltene 780 bp Fragment wurde in den mit Not I und Eco RI geschnittenen und dephosphorylierten S. cerevisiae Expressionsvektor pYEXL (Clontech) kloniert. Dadurch entstand der Expressionsvektor pGDHyexl (2). In pGDHyexl steht das GDH Gen unter Kontrolle des PGK-Promoters (Phosphoglyceratkinase Gen). Das URA3 Selektionsmarkergen komplementiert eine Uracil Auxotrophie in transformierten S. cerevisiae Stämmen. Vektor pGDHyexl ist als autonom replizierender Vektor für die Expression des GDH-Gens in S. cerevisiae geeignet.
Integrativer Vektor pGDHnts für die Expression der GDH in S. cerevisiae:
Vektor pGDHyexl wurde mit Nde I geschnitten und der linearisierte Vektor anschließend mit Pfu DNS-Polymerase behandelt, um die überhängenden, einzelsträngigen DNS-Enden aufzufüllen. Es folgte ein Verdau mit Hind III. Dabei entstanden neben einem 2,4 kb auch ein 6,6 kb DNS-Fragment, das neben der GDH-Expressionskassette auch das URA3 Selektionsmarkergen enthielt. Das 6,6 kb Genfragment wurde durch präparative Gelelektrophorese gereinigt und in mit Hpa I und Hind III geschnittenen und dephosphorylierten Vektor pNTS kloniert.
Vektor pNTS (3) enthielt ein 980 bp großes DNS-Fragment aus dem Genbereich der repetitiven ribosomalen rDNA aus S. cerevisiae. Das NTS-Genfragment wurde durch PCR mit der Taq DNS-Polymerase (Qiagen) mit den Primern ntsA (SEQ ID NO: 7) und ntsB (SEQ ID NO: 8) aus genomischer DNS aus S. cerevisiae isoliert. Die Primer waren aus der publizierten Sequenz (Gendatenbankdatei SCNTS1.gb pl1. Primer ntsA: ab bp 11. Primer ntsB: ab bp 990, in revers-komplementärer Orientierung) ausgewählt worden und hatten folgende Sequenzen:
Primer ntsA:
5'-GCGGGATCCGGCGCGCCATCCGGGTAAAAACATG-3' SEQ ID NO: 7
Primer ntsB:
5'-GCGATCGATGGCGCGCCTATGCTAAATCCCATAAC-3' SEQ ID NO: 8
Primer ntsA enthielt am 5'-Ende eine Bam HI Schnittstelle, gefolgt von einer Asc I Schnittstelle. Primer ntsB enthielt am 5'-Ende eine Cla I Schnittstelle, gefolgt von einer Asc I Schnittstelle.
Das bei der PCR-Reaktion gebildete PCR-Fragment wurde mit Bam HI und Cla I geschnitten und in den mit Bam HI und Cla I geschnittenen und dephosphorylierten Bluescript Vektor (Stratagene) kloniert, wodurch der Vektor pNTS (3) entstand.
Vektor pecGDBS für die Expression in Escherichia coli:
Plasmid-DNS des Expressionsvektors pGDBSpic wurde dazu verwendet, um das GDH-Gen mit den Primern gdbs-c (SEQ ID NO: 9) und gdbs-d (SEQ ID NO: 10) in einer PCR-Reaktion mit der Pfu DNS-Polymerase herzustellen. Die Primer hatten folgende Sequenzen:
Oligo gdbs-c:
5'-GAATTCGGTCTCAAATGTATCCGGATTTAAAAGG-3' SEQ ID NO: 9
Oligo gdbs-d:
5'-GTAAAGCTTGGTCTCTGCGCTTTAACCGCGGCCTGCCTGGA-3' SEQ ID NO: 10
Primer gdbs-c enthielt am 5'-Ende eine Eco RI Schnittstelle gefolgt von einer Bsa I Schnittstelle. Primer gdbs-d enthielt am 5'-Ende eine Hind III Schnittstelle gefolgt von einer Bsa I Schnittstelle.
Bei der PCR-Reaktion von pGDBSpic Plasmid-DNS mit den Primern gdbs-c und gdbs-d entstand ein DNS-Fragment von 780 bp Größe. Das DNS-Fragment wurde mit Bsa I geschnitten und in den mit Bsa I geschnittenen und dephosphorylierten Vektor pASK-IBA3 (sog. „Strep-tag" Protein Produktionssystem der Firma IBA, Institut für Bioanalytik) kloniert. Es entstand der Vektor pecGDBS ( 4). Sequenzierung des klonierten GDH Gens ergab die in SEQ ID NO: 4 aufgeführte DNS-Sequenz. Der Expressionsvektor pecGDBS ist zur Expression des GDH Gens in E. coli geeignet.
2.Beispiel:
Herstellung der Mutante GDBS-E96A
Zur gezielten Mutagenese (sog. „site-directed" Mutagenese) des GDH-Gens, kloniert in den Expressionsvektor pecGDBS, wurde der „Quick Change" Mutagenese Kit der Fa. Stratagene verwendet. Als Primer für die Mutagenese wurden GDmut1 (SEQ ID NO: 11) und GDmut2 (SEQ ID NO: 12) verwendet. Die Primer hatten folgende Sequenzen:
GDmut1:
5'-AATGCCGGTCTTGCAAATCCTGTGCCATCTC-3' SEQ ID NO: 11
GDmut2:
5'-GAGATGGCACAGGATTTGCAAGACCGGCATT-3' SEQ ID NO: 12
Die Mutagenese wurde entsprechend den Angaben des Herstellers durchgeführt. Der resultierende Vektor mit dem mutierten GDH-Gen wurde als pecGDBS-E96A (5) bezeichnet. Die erfolgreiche Einführung der Mutation wurde durch DNS-Sequenzierung überprüft. Die DNS-Sequenz der GDH-Mutante GDBS-E96A ist in SEQ ID NO: 2 aufgeführt. Die aus SEQ ID NO: 2 abgeleitete Proteinsequenz ist in SEQ ID NO: 1 aufgeführt. Der Expressionsvektor pecGDBS-E96A ist zur Expression des GDH Gens in E. coli geeignet.
Autonom replizierender Vektor pGDBS-E96Ayexl zur Expression der GDH-Mutante in S. cerevisiae:
Durch PCR-Reaktion mit den Primern gdbs-a (SEQ ID NO: 5) und gdbs-b (SEQ ID NO: 6, siehe 1. Beispiel), pecGDBS-E96A Plasmid-DNS und Pfu DNS-Polymerase wurde das mutierte GDH-Gen als 780 bp Fragment hergestellt, mit Eco RI und Not I geschnitten und in den mit Eco RI und Not I geschnittenen und dephosphorylierten Vektor pYEXL kloniert (siehe 1. Beispiel). Die korrekte DNS-Sequenz des mutierten GDH-Gens wurde durch Sequenzierung überprüft. Es entstand der Expressionsvektor pGDBS-E96Ayexl (6), der zur Expression des mutierten GDH-Gens in S. cerevisiae geeignet ist.
Integrativer Vektor pGDBS-e96aNTS zur Expression der GDH-Mutante in S. cerevisiae:
Aus dem Vektor pGDBS-E96Ayexl wurde das GDH-Gen mit Eco RI und Bgl II als 780 bp großes Genfragment isoliert. Aus dem integrativen Vektor pGDHnts wurde das Wildtyp GDH-Gen durch Verdau mit Eco RI und Bgl II herausgeschnittenen, das 9,7 kb große Vektorfragment isoliert und dephosphoryliert. Das 780 bp große Genfragment der GDH-Mutante wurde in das Vektorfragment kloniert. Es entstand der integrative Expressionsvektor pGDe96aNTS (7), der für die Expression der GDH-Mutante in S. cerevisiae geeignet ist.
3. Beispiel:
Expression von GDH-Genen in E. coli
Verwendet wurden die Expressionsvektoren pecGDBS und pecGDBS-E96A. Plasmid-DNS wurde nach an sich bekannten Methoden in den E. coli Stamm Top 10F' (Invitrogen) transformiert. Als Kontrolle diente E. coli Top 10F', mit dem pASK-IBA3 Leervektor transformiert. Jeweils ein Klon wurde ausgewählt und in einer Schüttelkolbenanzucht nach den Angaben des Herstellers des pASK-IBA3 Vektors (IBA Institut für Bioanalytik) kultiviert. Von den E. coli-Stämmen wurde in LBamp-Medium (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl, 0,1 mg/ml Ampicillin) eine Vorkultur hergestellt (Anzucht bei 37°C und 120 rpm über Nacht). Je 2 ml Vorkultur wurden als Inokulum einer Hauptkultur von 100 ml LBamp Medium (300 ml Erlenmeyerkolben) verwendet. Die Hauptkulturen wurden bei 30°C und 180 rpm geschüttelt, bis eine Zelldichte OD600 von 0,5 erreicht wurde. Dann wurde der Induktor Anhydrotetracyclin (IBA Institut für Bioanalytik, Endkonzentration 2 μg/ml) zugegeben und weitere 3 h bei 30°C und 180 rpm geschüttelt.
Zur Analyse der GDH-Produktion wurden jeweils 1 ml der E. coli Zellen in an sich bekannter Weise mit einem sog. „French^®Press" Hochdruckhomogenisator (SLM-AMINCO) aufgeschlossen und ein Zellextrakt durch Zentrifugation (15 min 15000 rpm, Sorvall SS34 Rotor) isoliert. Aliquots der Zellextrakte wurden zur photometrischen Bestimmung der GDH-Aktivität verwendet. Während im Kontrollstamm keine GDH-Aktivität gemessen werden konnte, betrug die spezifische GDH-Aktivität in Zellextrakten 34,8 U/mg Protein für das Wildtypenzym und 30,8 U/mg für die Mutante GDBS-E96A (entspricht 88,5 % der spezifischen Aktivität der Wildtyp-GDH). Beide GDH-Enzyme haben somit vergleichbare enzymatische Eigenschaften. Die Mutante GDBS-E96A aus B. subtilis hat damit unerwartet bessere enzymatische Eigenschaften als die analoge Mutante aus Bacillus megaterium, die nur noch ca. 30 der Aktivität des Wildtypenzyms besaß ((Nagao et al., FEBS Lett. (1989) 253, 113-116).
Spektralphotometrische Bestimmung der GDH-Aktivität:
Der Messansatz von 1 ml Volumen zur photometrischen Bestimmung von GDH-Aktivität war zusammengesetzt aus Messpuffer (0,1 M Kaliumphosphat, pH 7,0, 0,1 M NaCl), 10 mg/ml Glucose, 2 mM NADP und GDH-haltigem Zellextrakt. Messtemperatur war 25°C. Die Reaktion wurde gestartet durch Zugabe der Glucose (aus einer 40-fach konzentrierten Stammlösung) und die Extinktionszunahme infolge der Bildung von NADPH bei einer Wellenlänge von 340 nm gemessen (Extinktionskoeffizient von NADPH: ε = 0,63 × 10⁴ l × Mol^–1 × cm^–1). Ein Unit GDH-Aktivität ist definiert als die Bildung von 1 μmol NADPH/min unter Testbedingungen.
Zur Bestimmung der spezifischen Aktivität wurde die Proteinkonzentration der Zellextrakte in an sich bekannter Weise mit dem sog. „BioRad Proteinassay" der Fa. BioRad bestimmt.
4. Beispiel:
Expression von GDH-Genen in der Hefe S. cerevisiae
Ausgangsstamm war der S. cerevisiae Stamm CM3260 (Uracil-, Histidin-, Tryptophanauxotrophie, beschrieben in Dancis et al., Cell (1994) 76: 393-402). Das transformierte Expressionskonstrukt war pGDe96ants. pGDe96ants enthielt das mutierte GDH-Gen GDBS-E96A unter Kontrolle des PGK-Promotors. Selektionsmarker war das URA3 Gen (Uracil Selektion). Der Vektor wurde vor der Transformation mit Asc I geschnitten, um die Expressionskassette freizusetzen. Die Transformation des Hefestammes CM3260 erfolgte nach der dem Fachmann geläufigen Lithiumacetat-Methode (Gietz and Woods, Biotechniques (2001) 30: 816-831).
Transformanten wurden isoliert und durch Schüttelkolbenanzucht auf GDH-Aktivität getestet. Dazu wurde jeweils 50 ml YPD-CSL Medium (10 g/l Hefeextrakt, 20 g/l Pepton, 20 g/l Glucose, 20 g/l Mais Quellwasser, „Corn Steep Liquor") mit einer Transformante beimpft und vier Tage bei 28°C und 140 rpm (Infors Schüttler) inkubiert. Die Zellen wurden, wie im 3. Beispiel für E. coli beschrieben, mit der „French^®Press" aufgeschlossen und die Zellextrakte auf GDH-Aktivität untersucht. Aus dem Vergleich von ca. 50 getesteten Transformanten ging der Stamm GD34 als bester GDH-Produzent hervor. Die spezifische GDH-Aktivität in Rohextrakten (bestimmt wie im 3. Beispiel beschrieben) betrug 1 U/mg Protein. Im CM3260 Kontrollstamm konnte keine GDH-Aktivität gemessen werden.
5. Beispiel:
Chemische Stabilität der GDH-Mutante GDBS-E96A
Verglichen wurde die GDH-Aktivität in Zellextrakten aus der Anzucht in E. coli (Siehe 3. Beispiel) nach Vorbehandlung mit dem enzymschädigenden Produkt S-CHBE, das bei der Biotransformation von 4Cl-ACE entsteht. Außerdem wurde die Stabilität gegen die Lösungsmittel n-Butylacetat und MTBE untersucht.
In einem ersten Test wurden gleiche Enzymaktivitäten von Wildtyp GDH und Mutante GDBS-E96A in Messpuffer (siehe 3. Beispiel) bei 30°C und pH 7,0 mit S-CHBE in einer Konzentration von 3 (v/v) behandelt und die GDH-Aktivität nach verschiedenen Inkubationszeiten bestimmt. Tab. 1 zeigt, dass das Wildtypenzym nach 30 min vollständig inaktiv war. Die Mutante GDBS-E96A war dagegen nach einer Inkubation von 120 min bei 30°C zu noch mehr als 90 % aktiv.
Tabelle 1: Kinetik der Inaktivierung von Wildtyp GDH und GDH-Mutante GDBS-E96A durch Vorinkubation (30°C, pH 7,0) mit 3 (v/v) S-CHBE
In einem zweiten Test wurde die GDH-Mutante mit steigenden Mengen S-CHBE inkubiert (dosisabhängige Inaktivierung) und anschließend die GDH-Aktivität bestimmt. Wie in Tab. 2 dargestellt, wurde unter Reaktionsbedingungen (30°C, pH 7,0) nach einer 2,5 h Inkubation mit S-CHBE in Konzentrationen bis 10 (v/v) (entspricht einer 0,71 M Konzentration) keine signifikante Inaktivierung des Enzyms beobachtet.
Tabelle 2: Dosisabhängige Inaktivierung der GDH-Mutante GDBS-E96A durch Vorinkubation (2,5 h 30°C, pH 7,0) mit steigenden Mengen S-CHBE
In einem dritten Test wurden gleiche Enzymaktivitäten von Wildtyp GDH und Mutante GDBS-E96A in Messpuffer (siehe 3. Beispiel) bei 30°C und pH 7,0 mit steigenden Mengen n-Butylacetat oder MTBE inkubiert (dosisabhängige Inaktivierung) und anschließend die GDH-Aktivität bestimmt. Wie in Tab. 3 dargestellt, wurde unter Reaktionsbedingungen (30°C, pH 7,0) nach einer 2,5 h Inkubation mit n-Butylactet oder MTBE in Konzentrationen bis 20 (v/v) keine signifikante Inaktivierung (n-Butylacetat), bzw. eine Inaktivierung < 20 % (MTBE) der GDH-Mutante GDBS-E96A beobachtet, während die Wildtyp-GDH 50 % (n-Butylacetat), bzw. bis zu 90 % (MTBE) inaktiviert wurde.
Tabelle 3: Dosisabhängige Inaktivierung der Wildtyp-GDH und der GDH-Mutante GDBS-E96A durch Vorinkubation (2 h 30°C, pH 7,0) mit steigenden Mengen n-Butylacetat oder MTBE
Diese Ergebnisse bedeuten eine signifikante und nach dem Stand der Technik nicht zu erwartende Verbesserung der chemischen Stabilität der GDH-Mutante GDBS-E96A gegenüber dem Wildtypenzym.
6. Beispiel:
Ganzzellbiotransformation mit GDH-produzierenden Hefezellen
Für Biotransformationen wurde der rekombinante S. cerevisiae Stamm FasB-his6 verwendet. Der Stamm FasB-his6 ist abgeleitet vom GDH-produzierenden Stamm GD34. Er zeichnet sich durch eine erhöhte FAS CR-Aktivität aus und eignet sich für die Herstellung von S-CHBE und anderen chiralen β-Hydroxyestern, da die in üblichen Hefestämmen zu beobachtenden CR-Aktivitäten, die zu R-CHBE führen, in natürlicherweise geringer Aktivität vorhanden sind. Die Expressionssteigerung der FAS-Aktivität wurde, dem Stand der Technik entsprechend, erreicht durch Überexpression der sog. Fas1-Untereinheit der Hefe Fettsäuresynthase (beschrieben in Wenz et al., Nucleic Acids Res. (2001) 29: 4625-4632).
Die Anzucht des Hefestammes FasB-his6 erfolgte in Schüttelkolben. 6 × 250 ml YPD-CSL-Medium, jeweils in 1 l Erlenmeyerkolben, wurden mit dem Stamm FasB-his6 beimpft. Die Anzucht erfolgte durch Inkubation für vier Tage auf einem Orbitalschüttler (Infors) bei 28°C und 120 rpm. Zellen wurden entweder direkt für die Biotransformation weiterverwendet oder bei –20°C eingefroren.
Ein Biotransformationsansatz wurde durchgeführt, indem 1,5 l FasB-his6 Zellen aus der Schüttelkolbenanzucht zentrifugiert und in Reaktionspuffer (0,1 M Kaliumphosphat, pH 7,0, 0,1 M NaCl, 2 M Glucose) aufgenommen wurden, so dass das Endvolumen 200 ml betrug. Die Zelldichte OD600 wurde bestimmt. Üblicherweise betrug die Gesamt-OD600 im Ansatz 30.000. Die Zellen wurden in einem thermostatisierbaren Reaktionsgefäß vorgelegt, auf 25°C temperiert und mit einem Magnetrührer gerührt. NADP wurde in einer Konzentration von 10 μM zugegeben. Das Reaktionsgefäß war über eine pH-Elektrode und eine Natronlauge (10 M Stammlösung) fördernde Bürette mit einem Titrator (Titroline alpha, Schott) verbunden, so dass die Biotransformation unter pH-stat-Bedingungen bei einem konstanten pH von 7,5 durchgeführt werden konnte. Das Substrat 4Cl-ACE, in n-Butylacetat gelöst, wurde kontinuierlich zudosiert.
In zwei Versuchsreihen wurden entweder 12 g (Ansatz A) oder 18 g (Ansatz B) des Substrates 4Cl-ACE mit n-Butylacetat gemischt, so dass das Endvolumen 40 ml betrug. Die Substratlösung wurde dann jeweils über eine Zeitdauer von 16–20 h kontinuierlich zudosiert. Die Endkonzentration des zudosierten Substrates im Ansatz A betrug 5 % (w/v), im Ansatz B 7,5 % (w/v).
Die Reaktion wurde nach 24 h gestoppt. Zur Aufarbeitung wurde der gesamte Biotransformationsansatz dreimal mit einem gleichen Volumen Essigester extrahiert, die Essigesterphasen vereinigt und in einem Rotationsverdampfer das Lösungsmittel entfernt. Die so gewonnene S-CHBE Rohfraktion wurde in an sich bekannter Weise durch chirale Gaschromatographie analysiert. In beiden Ansätzen wurde ein quantitativer Umsatz des eingesetzten 4Cl-ACE erzielt. Der durch Gaschromatographie bestimmte S-CHBE Gehalt der Rohfraktionen bzw. Enantiomerenüberschuss ee ist in Tab. 4 aufgeführt.
Tabelle 4 Produktion von S-CHBE durch Ganzzellbiotransformation mit GDH-überexprimierenden Hefezellen
7. Beispiel:
Biotransformation mit Zellextrakten
Die Anzucht des E. coli Stammes pecGDBS-E96A in Schüttelkolben und Extraktion des GDH Enzyms erfolgte wie im 3. Beispiel beschrieben. Die ADH aus Lactobacillus brevis (LB-ADH) war kommerziell verfügbar (Jülich Fine Chemicals GmbH).
Ein Biotransformationsansatz von 100 ml Endvolumen enthielt neben Reaktionspuffer (0,1 M Kaliumphosphat, pH 6,5, 0,1 M NaCl, 1 mM Magnesiumsulfat, 2 M Glucose) GDBS-E96A GDH und LB-ADH, jeweils in 15 U/ml Dosierung, 50 μM NADP und als Substrat 12,9 g Acetessigsäuremethylester (ACMe) in einer Dosierung von 12,9 % (w/v). Der Ansatz wurde in einem thermostatisierbaren Reaktionsgefäß vorgelegt, auf 30°C temperiert und mit einem Magnetrührer gerührt. Das Reaktionsgefäß war über eine pH-Elektrode und eine Natronlauge (10 M Stammlösung) fördernde Bürette mit einem Titrator (Schott) verbunden, so dass die Biotransformation unter pH-stat-Bedingungen bei einem konstanten pH von 6,5 durchgeführt werden konnte.
Die Reaktion wurde nach 21 h gestoppt. Zur Aufarbeitung wurde der gesamte Biotransformationsansatz dreimal mit einem gleichen Volumen Essigester extrahiert, die Essigesterphasen vereinigt und in einem Rotationsverdampfer das Lösungsmittel entfernt. Die so gewonnene (R)-3-Hydroxybuttersäuremethylester (R-HBMe) Rohfraktion wurde durch chirale Gaschromatographie analysiert. Es wurde ein quantitativer Umsatz des eingesetzten ACMe erzielt. Der durch Gaschromatographie bestimmte R-HBMe Gehalt der Rohfraktionen war > 99 %, der Enantiomerenüberschuss ee betrug 100 %.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Glucose Dehydrogenase mit einer Aminosäuresequenz die der Aminosäuresequenz einer GDH von Bacillus subtilis umfassend einen Glutaminsäurerest an Position 96 entspricht mit dem Unterschied, dass der Glutaminsäurerest an Position 96 gegen eine unpolare bzw. hydrophobe Aminosäure oder Glycin ausgetauscht ist.
Glucose Dehydrogenase gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz der Bacillus subtilis GDH umfassend einen Glutaminsäurerest an Position 96 SEQ. ID. NO: 1 entspricht.
Glucose Dehydrogenase gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Glutaminsäurerest an Position 96 gegen eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Methionin, Phenylalanin, Tyrosin, und Tryptophan ausgetauscht ist.
Glucose Dehydrogenase gemäß Anspruch 3 dadurch gekennzeichnet, dass der Glutaminsäurerest an Position 96 gegen eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe Aminosäure ausgewählt ist aus der Gruppe Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin ausgetauscht ist.
Glucose Dehydrogenase gemäß Anspruch 3 dadurch gekennzeichnet, dass der Glutaminsäurerest an Position 96 gegen die Aminosäure Alanin ausgetauscht ist.
Glucose Dehydrogenase gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie bei einer Behandlung mit 10 (v/v) S-CHBE für 2,5 h bei 30°C, pH 7, eine Abnahme < 30 %, vorzugsweise < 20 % besonders bevorzugt < 10 % ihrer enzymatischen Aktivität im Vergleich zum unbehandelten Enzym zeigt.
Gen codierend für eine Glucose Dehydrogenase gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7.
Verfahren zur Herstellung von chiralen Alkoholen oder chiralen Aminen durch eine Carbonylreduktase dadurch gekennzeichnet, dass eine Glucose Dehydrogenase gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Regenerierung von NADH oder NADPH-Cofaktoren eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Carbonylreduktase ausgewählt ist aus Gruppe der Alkohldehydrogenasen, der Aldo-Ketoreduktasen, der Glycerindehydrogenasen, der Aldehydreduktasen und der Fettsäuresynthasen.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9 zur Herstellung eines chiralen Alkohols der allgemeinen Formel (I).