DE10143410A1

DE10143410A1 - Biomaterial und Verfahren zu dessen Herstellung

Info

Publication number: DE10143410A1
Application number: DE10143410A
Authority: DE
Inventors: Minh Tan Pham; Manfred Franz Maitz
Original assignee: Forschungszentrum Dresden Rossendorf eV
Current assignee: Forschungszentrum Dresden Rossendorf eV
Priority date: 2001-09-05
Filing date: 2001-09-05
Publication date: 2003-03-27

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Biomaterial zu dessen Herstellung. Potentielle Anwendungen sind medizinische Implantologie, Gewebezüchtung, Biotechnologie und Pharmazeutik. DOLLAR A Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Biomaterial für Anwendungen in medizinischer Implantologie, Gewebezüchtung, Biotechnologie und Pharmazeutik zu schaffen, das eine gute Strukturbildung und Haftfestigkeit aufweist sowie die zellbiologischen Aspekte berücksichtigt. Der Erfindung obliegt auch die Aufgabe, ein einfaches und anwendungswirksames Verfahren zur Herstellung des genannten Biomaterials vorzuschlagen. DOLLAR A Das erfindungsgemäße Biomaterial besteht aus einem Polymergerüstnetzwerk der extrazellulären Matrix und einer calciumcarbonat- und calciumphosphathaltigen Mineralphase, wobei beide Phasen zu einer für die Biomineralisation charakteristischen Kompositstruktur miteinander verwachsen sind. DOLLAR A Das Verfahren beinhaltet, dass Adhärenzzellen auf einer festen Unterlage ausgesiedelt und zur Expression der extrazellulären Matrix kultiviert werden, dass folgend die Zellen von der Unterlage entfernt werden, dass danach die von den Zellen befreite Oberfläche der Unterlage mit einer wässrigen Minerallösung behandelt wird, dass abschließend das auf der Oberfläche der Unterlage gebildete Produkt gewonnen wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Biomaterial und ein Verfahren zu dessen Herstellung. Potentielle Anwendungen sind medizinische Implantologie, Gewebezüchtung, Biotechnologie und Pharmazeutik.

Bekannt ist die Materialgruppe Hydroxylapatit/Kollagen-Komposit, dessen Herstellung auf einer UV-Strahlhärtung einer Mischung aus Hydroxylapatit und Kollagen (M. Okazaki, H. Ohmae, J. Takahashi, H. Kimura, M. Sakuda, Biomarer. 11 (1990) 568), oder auf einer Verdichtung einer Hydroxylapatit/Kollagen-Mischung bei 200 MPc und 40°C basiert (K. Hirota, K. Nishihara, H. Tanaka, Bio-Med. Mater. Eng. 3 (1993) 147). Dieses Material enthält als Komponenten zwar Hydroxylapatit und Kollagen, zwei wesentliche Bestandteile des Hartgewebes. Es unterscheidet sich aber grundlegend vom Letzteren. Die organische Polymerphase des Hartgewebematerials ist komplex in chemischer Zusammensetzung und zellulärspezifischer Konzentration. Sie ist strukturell organisiert. Die Mineralphase ist durch die Biomineralisation in die organische Polymerphase eingebunden. All diese Aspekte sind in dem bekannten Material, welches lediglich ein Gemenge zweier bezüglich Zusammensetzung und Struktur unkorrelierter Bestandteile darstellt, nicht realisiert. Bekannt ist weiterhin die Abscheidung von Hydroxylapatit auf Kollagenfasern (R. Z. Wang, F. Z. Cui, H. B. Lu, H. B. Wen, C. L. Ma, H. D. Li, J. Mater. Sci. Lett. 14 (1995) 490). Dieser Ansatz bringt eine partielle Verbesserung hinsichtlich der Strukturbildung, kann aber die oben genannten Nachteile nicht aufheben.

Desweiteren bekannt ist ein als Organoapatit bezeichnetes Material. Die Synthese erfolgt durch Precipitation von Apatitmikrokristalliten aus einer Lösung in Anwesenheit von Polyaminosäuren sowie synthetischen Polyelektrolyten (S. I. Stupp, G. W. Ciegler, J. Biomed. Mater. Res. 26 (1992) 169). Die Makromoleküle modulieren die Nukleation und das Kristallwachstum des Hydroxylapatits. Als zellbiologisch fremdes Material und Einzelkomponentenmodulator sind sie nicht in der Lage, den zellbiologischen Aspekten des Hartgewebes im ganzen nachzubilden.

Bekannt ist die Beschichtung von Polymeroberflächen mit Hydroxylapatit (G. J. Liu, F. Miyaji, T. Kokubo, H. Takadawa, T. Nakamury, A. Murakami, J. Mater. Sci. Mater. Med. 9 (1998) 285). Hierbei werden Polymeroberflächen, wie Polyethylenterephthalat, Polyethersulphon, Polyethylen, Polymethylmethacrylat und Polyamid, mit UV-Licht bestrahlt, dann zusammen mit Partikeln aus CaO-SiO₂-Glas in einer simulierten Körperflüssigkeit inkubiert, und anschließend einer an Calcium- und Phosphationen gegenüber Hydroxylapatit höher übersättigten simulierten Körperflüssigkeit ausgesetzt. Durch die photochemische Aktivierung wird die Schichthaftung verbessert. Dieses Überzugshydroxylapatit besitzt nicht die Merkmale eines biologisch gebildeten Hydroxylapatits. Das Letztere ist in die extrazelluläre organische Polymermatrix eingebunden. Seine Morphologie und Struktur werden durch spezifische Komponenten der Polymermatrix kontrolliert. Die Bioaktivität ist abhängig von diesen Komponenten.

Bekannt ist weiterhin die Erzeugung einer HA-Oberflächenschicht auf einer metallischen Oberfläche, wobei die Metalloberfläche und ein dieser gegenüber in einem geringen Abstand platziertes Plättchen aus bioaktivem Glas in einer calcium- und phosphationenhaltigen simulierten Körperflüssigkeit, für eine bestimmte Dauer inkubiert werden (M. Tanahashi, T. Kokubo, T. Nakamura, Y. Katsura, M. Nagano, Biomater. 17 (1996) 47). Die Nukleation des Hydroxylapatits, im Unterschied zur in vivo Mineralisation, erfolgt durch die in die Lösungsphase passierten Komponenten des Glases, und die gebildeten Hydroxylapatit-Partikel lagern sich an die Metalloberfläche an. Das Produkt ist ein synthetisches Apatit und unterscheidet sich vom biologisch gebildeten Apatit bezüglich Struktur und Zusammensetzung. Die lose Anlagerung bietet zudem keine genügende Haftfestigkeit.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Biomaterial für Anwendungen in medizinischer Implantologie, Gewebezüchtung, Biotechnologie und Pharmazeutik zu schaffen, das eine gute Strukturbildung und Haftfestigkeit aufweist sowie die zellbiologischen Aspekte berücksichtigt. Der Erfindung obliegt auch die Aufgabe, ein einfaches und anwendungswirksames Verfahren zur Herstellung des genannten Biomaterials unter Einsatz von derzeit verfügbaren Techniken und Ausgangsmaterialien vorzuschlagen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe mit den in den Patentansprüchen 1 und 6 ausgeführten Merkmalen und den in den Unteransprüchen beschriebenen Aus- und Weiterbildungen gelöst.

Der besondere Vorteil des erfindungsgemäßen Biomaterials ist die Identität in chemischer Zusammensetzung, Konzentration und Struktur mit dem biologisch natürlichen Material. Die organische Phase verfügt über eine vollständige Komposition von extrazellulären Polymeren und deren assoziierten Proteinen und ist zellbiologisch spezifisch organisiert. Das Hydroxylapatit ist in die organische Phase in der für die Biomineralisation charakteristischen Weise und Form eingebunden. Das Herstellungsverfahren ist einfach und anwendungswirksam. Es basiert auf verfügbaren Techniken und Ausgangsmaterialien. Kompaktmaterial, Sinterkörper, Granulat, Pulver, Folien und Filmüberzug auf verschiedenen Festkörperoberflächen sind herstellbar. Das Material und dessen Herstellungsverfahren sind von potentiellem Nutzen für medizinische Implantologie, Biotechnologie, Gewebezüchtung und Pharmazeutik.

Die Erfindung wird nachfolgend an einem Ausführungsbeispiel für das erfindungsgemäße Biomaterial und an vierzehn Ausführungsbeispielen für das Herstellungsverfahren näher erläutert.

Beispiel 1

Ein Biomaterial baut sich aus einem durch Knochenzellen produzierten Gerüstnetzwerk von in Struktur und Zusammensetzung mit der extrazellulären Matrix identischen natürlichen Polymeren und Carbonathydroxylapatit auf, mit welchem Komponenten des Netzwerkes mineralisiert und zu einem Materialverband zusammengewachsen sind.

Beispiel 2

Die Oberfläche eines Plättchens aus TiAlV-Legierung wird mit Sand bestrahlt. Es folgt die Reinigung mit Aceton, Äthanol und destilliertem Wasser. Es wird mit einer 10%-igen HNO₃- Lösung für 2 h kochend behandelt. Eine Spülung mit Wasser schließt sich an. Es wird in einem Autoklav sterilisiert. (a) Das Plättchen wird in einer Suspension von SAOS-2-Zellen (1 × 10⁵ Zellen/cm²) in Alpha-Minimal Essential Medium mit 15% fetalem Kälberserum bei 37°C, 95% Luftfeuchtigkeit und 5% CO₂ bis zur Ausbildung einer konfluierenden Zellschicht auf der Oberfläche inkubiert. Die Inkubation wird in einem erneuerten Medium, dem 50 µg/ml Askorbinsäure, 890 mg/l b-Glycerophosphat und 10 nM Dexamethason zugesetzt sind, unter den gleichen Bedingungen für weitere 5 Tage fortgesetzt. (b) Die Oberfläche wird durch Behandlung mit einer NH₃-Lösung (15 mM, bei Raumtemperatur für 8 min) von den adhärierten Zellen befreit und mit neutralem isotonem Phosphatpuffer (8 g/l NaCl, 0,2 g/l KCl, 1,44 g/l Na₂HPO₄, 0,24 g/l KH₂PO₄, pH 7,4) gespült. (c) Die nach dem Schritt b erhaltene Oberfläche wird in einer Minerallösung (0,5744 g/l CaCl₂.6H₂O, 0,2282 g/l K₂HPO₄, 7,9946 g/l NaCl, 0,2237 g/l KCl, 0,5477 g/l MgCl₂.6H₂O, 0,1611 g/l Na₂SO₄.10H₂O, 0,3529 g/l NaHCO₃, pH 7,4) bei 37°C für 4d inkubiert. (d). Es folgt eine Spülung mit Wasser und Trocknung bei 110 °C für 20 min. Die das Probenplättchen umgebende mineralisierte Oberfläche bildet das Biomaterial.

Beispiel 3

Ein Prozess entsprechend dem Protokoll des Beispiels 2 wird modifiziert. Dem Schritt c wird eine Behandlung in einer aus NaH₂PO4 (0,1 m), Saccharose (1%) und Paraformaldehyd (2,5%) bestehenden wässrigen Lösung bei pH 7,10 vorausgegangen.

Beispiel 4

Ein Prozess entsprechend dem Protokoll des Beispiels 2 wird modifiziert. Die Inkubation im Medium mit Askorbinsäure-, β-Glycerophosphat- und Dexamethasonzusatz erfolgt für 24 h.

Beispiel 5

Ein Prozess entsprechend dem Protokoll des Beispiels 2 wird modifiziert. Eine Minerallösung mit folgender Zusammensetzung wird eingesetzt: 0,2086 g/l CaCl₂.6H₂O, 0,06 g/l KH₂PO₄, 0.09 g/l Na₂HPO₄.7H₂O, 8,00 g/l NaCl, 0,4 g/l KCl, 0,1 g/l MgCl₂.6H₂O, 0,1 g/l Na₂SO₄.7H₂O, 0,35 g/l NaHCO₃.

Beispiel 6

(a) In einer Zellkulturflasche aus Polystyrol mit einer Bodenfläche von 25 cm² werden 5 ml Suspension von SAOS-Zellen (1 × 10⁵ Zellen/cm²) in Alpha-Minimal Essential Medium mit 15% fetalem Kälberserum gegeben und bei 37°C, 95% Luftfeuchtigkeit und 5% CO₂ bis zur Ausbildung einer konfluierenden Zellschicht auf der Bodenfläche inkubiert. Das Medium wird erneuert und mit 50 µg/ml Askorbinsäure, 891 mg/l β-Glycerophosphat und 10 nM Dexamethason versetzt. Die Kultivierung erfolgt für weitere 5 Tage. (b) Der Überstand wird abgesaugt. Der Flascheninhalt wird mit neutralem isotonem Phosphatpuffer (8 g/l NaCl, 0,2 g/l KCl, 1,44 g/l Na₂HPO4, 0,24 g/l KH₂PO₄, pH 7,4) gespült. Die adhärierten Zellen werden mit einer 15 mM NH₃-Lösung für 6 min behandelt und abgelöst. Der Flascheninhalt wird mit neutralem isotonem Phosphatpuffer gespült. (c) 10 ml Minerallösung werden in die Kulturflasche gegeben und darin für 4 Tage inkubiert. Der Überstand wird abgesaugt. Die so erhaltene Kulturflasche kommt erneut in den Prozesszyklus, wobei Schritte a, b und c sich 10 × mal wiederholen. (d) Der Flascheninhalt wird mit neutralem isotonem Phosphatpuffer gewaschen. Das am Flaschenboden gebildete Produkt wird durch Abschabbern gesammelt und bei 110°C getrocknet.

Beispiel 7

Ein Prozessablauf entsprechend Schritten (a) bis (d) in Beispiel 6 wird durchgeführt. Das aus (d) erhaltene Zwischenprodukt wird unter 1000 bar bei 850°C zu einem Presskörper verdichtet.

Beispiel 8

Ein Prozessablauf entsprechend Schritten (a) bis (d) in Beispiel 2 wird durchgeführt. Das aus (d) erhaltene Produkt wird in einem Autoklav mit gespanntem Wasserdampf bei 121°C für 20 min sterilisiert.

Beispiel 9

Eine Folie aus Polypropylen wird auf dem Boden einer Petrischale plaziert und über Kleberstreifen befestigt. SAOS-Zellen als Suspension (1 × 10⁵ Zellen/cm²) in Alpha-Minimal Essential Medium mit 15% fetalem Kälberserum werden in die Schale gegeben und bei 37°C, 95% Luftfeuchtigkeit und 5% CO₂ bis zur Ausbildung einer konfluierenden Zellschicht auf der Folieoberfläche kultiviert. Die Kultivierung wird in einem erneuerten Medium, dem 50 µg/ml Askorbinsäure und 891 mg/l β-Glycerophosphat zugesetzt sind, unter den gleichen Bedingungen für weitere 5 Tage fortgesetzt. Die weitere Prozessbehandlung erfolgt auf die gleiche Weise entsprechend Schritt (b) und (c) in Beispiel 2. Die Minerallösung wird abgesaugt. Die Folie wird mit neutralem isotonem Phosphatpuffer gewaschen und bei 60°C getrocknet.

Beispiel 10

Ein Glasplättchen wird mit Aceton, Ethanol und Wasser gereinigt. Es wird in einer 5%igen NaOH-Lösung für 2 h gekocht. Nach Reinigung mit Wasser wird es getrocknet und im Autoklav sterilisiert. Plaziert in einer 35 mm-Kulturschale wird die Probe mit 3 ml einer Suspension von Knochenmark-Stromazellen in Eagle Minimal Essential Medium mit 15% fetalem Kälberserum, 1 × 10⁴ Zellen/cm² versetzt (Die verwendeten Zellen wurden durch 7- tägige Kultivierung des Knochenmarks aus den Oberschenkelknochen mehrerer 7-wochenalter Raten gewonnen, wobei durch zwei Medienwechsel die nicht adhärent wachsenden Zellen entfernt wurden) und bei 37°C mit 95% Luftfeuchtigkeit und 5% CO₂ für 2 Tage inkubiert. Die Probe wird in eine neue Kulturschale überführt, mit 2 ml des obigen Mediums versetzt. Dem Medium sind Askorbinsäure (50 mg/l), β-Glycerophosphat (891 mg/l) und Dexamethason (0,4 mg/l) zugegeben. Die Inkubation wird unter den gleichen kontrollierten Bedingungen für 5 Tage durchgeführt. Die weitere Prozessierung erfolgt auf die gleiche Weise entsprechend Schritt b, c und d in Beispiel 2.

Beispiel 11

Ein Implantatkörper mit Oberfläche aus porösem Titan wird mit Tetrachloroform behandelt. Es folgt eine Reinigung mit Aceton, Ethanol und Wasser. Eine Sterilisation im Autoklav schließt sich an. In einem Zellkulturbehälter plaziert wird die Probe mit SAOS-Zellen (1 × 10⁵ Zellen/cm²) in Alpha-Minimal Essential Medium mit 15% fetalem Kälberserum besiedelt und bei 37 °C, 95% Luftfeuchtigkeit und 5% CO₂ über 5 Tage inkubiert. Die Inkubation wird in einem erneuerten Medium, dem 50 µg/ml Askorbinsäure, 891 mg/l β-Glycerophosphat und 10 nM Dexamethason zugesetzt sind, unter den gleichen Bedingungen für weitere 5 Tage fortgesetzt. Die weitere Prozessführung ist identisch mit Schritt b, c und d in Beispiel 2.

Beispiel 12

Ein Implantatkörper mit Oberfläche aus porösem Titan wird entsprechend dem Protokoll des Beispiels 9 behandelt. In einem letzten Schritt wird das behandelte Implantat einer Temperung bei 680°C für 2 h unterworfen.

Beispiel 13

Ein Glasplättchen wird mit Aceton, Ethanol und Wasser gereinigt. Es wird in einer 5%igen NaOH-Lösung für 2 h gekocht. Es folgt eine Reinigung mit Wasser und Trocknung bei 110°C für 15 min. Die Probe wird mit einer Mischung aus 40 ml trockenem Aceton 2 ml Aminopropyltriethoxysilan und 1 ml Triethylamin bei 40°C für 2 h behandelt. Mit Aceton, Ethanol und destilliertem Wasser wird die Probe gewaschen. Bei 110°C wird die Probe in einer Stickstoffatmosphäre für 8 h getrocknet. Der weitere Prozess ist identisch mit Schritt a, b, c und d in Beispiel 2.

Beispiel 14

Ein Glasplättchen wird mit Aceton, Ethanol und Wasser gereinigt. Bei 110°C für 1 h erfolgt die Trocknung. Die Probe wird in Chloroform unter Ultraschall für 20 min behandelt. Es wird mit Chloroform gespült und Luft getrocknet. Die Probe wird einer Glimmentladung in Ar/H₂O (15 mm Hg, 20 min) unterworfen. Es folgt eine Inkubation in einer Lösung von Octadecyltrichlorosilan (3 mM) in Dicyclohexyl für 1 h. Die Probe wird mit Chloroform unter Ultraschall behandelt. Der weitere Prozess ist identisch mit Schritt a, b, c und d in Beispiel 2.

Beispiel 15

Ein Prozessablauf entsprechend Beispiel 10. Verwendet werden humane Knochenmarksstromazellen, die einem traumatisierten Patienten in einer ersten Operationssitzung entnommen wurden.

Claims

1. Biomaterial, vorzugsweise für den Einsatz in der medizinischen Implantologie, Biotechnologie, Gewebezüchtung und Pharmazeutik, wobei das Biomaterial Hydroxylapatit enthält, dadurch gekennzeichnet, dass das Biomaterial aus den mineralischen Komponenten Calciumphosphat und Calciumcarbonat sowie einem Gerüstnetzwerk aus extrazellulären organischen Polymeren besteht, wobei die Calciumverbindungen und das Gerüstnetzwerk zu einer für Biomineralisation charakteristische Kompositstruktur miteinander verwachsen sind.

2. Biomaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Calciumphosphat aus Hydroxylapatit oder Tricalciumphosphat oder einem Gemisch von diesen besteht.

3. Biomaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Calciumcarbonat mindestens als carbonatsubstituiertes Hydroxylapatit enthalten ist.

4. Biomaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die das Gerüstnetzwerk bildenden organischen Polymeren bezüglich chemischer Zusammensetzung, Konzentration und struktureller Architektur identisch mit der zellspezifischen extrazellulären Matrix (ECM) sind.

5. Biomaterial nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Gerüstnetzwerk ECM- assoziierte Proteine enthält.

6. Verfahren zur Herstellung eines Biomaterials entsprechend Anspruch 1, wobei eine Hydroxylapatit-Beschichtung auf einer Festkörperoberfläche aufgebracht wird, dadurch gekennzeichnet, dass

a) Adhärenzzellen auf einer festen Unterlage ausgesiedelt und bis zur Vollendung der Expression der extrazellulären Matrix kultiviert werden,

b) die Adhärenzzellen danach von der Unterlage entfernt werden,

c) die von den Adhärenzzellen befreite Oberfläche der Unterlage mit einer wässrigen Minerallösung behandelt wird und

d) das Biomaterial von der Unterlage durch mechanische Abtrennung oder als integrierter Bestandteil zusammen mit der Unterlage entnommen wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte (a), (b), (c) einmalig durchgeführt oder mehrfach wiederholt werden.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass Adhärenzzellen aus einer Primärkultur oder einer Zelllinie eingesetzt werden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Primärkultur aus patienteneigenen Zellen gewonnen wird.

10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass bei Verwendung von Metall, Keramik, Glas, Polymer oder Komposit als feste Unterlage die Oberfläche der festen Unterlage zur Anheftung der Adhärenzzellen vorbehandelt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Minerallösung mindestens Calcium-, Phosphat- und Carbonationen enthält, dass das molare Mengenverhältnis von Calcium zu Phosphat 1,5 bis 3 beträgt, dass die Carbonatmenge in 2- bis 6-facher Phosphatmenge bemessen wird, dass der pH-Wert des Gemisches im Bereich 7-9 gehalten wird und dass Calcium- und Phosphationen in einer Konzentration von 1- bis 3- facher Übersättigung von Hydroxylapatit vorliegen.

12. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung der Unterlagen mit einer wässrigen Minerallösung bei 25-50°C durchgeführt wird.