DE10129010A1

DE10129010A1 - Verfahren und Vektoren zur Erzeugung von transgenen Pflanzen

Info

Publication number: DE10129010A1
Application number: DE10129010A
Authority: DE
Inventors: Victor Klimyuk; Serik Eliby; Gregor Benning; Yuri Gleba
Original assignee: Icon Genetics AG
Current assignee: Icon Genetics AG
Priority date: 2001-06-13
Filing date: 2001-06-13
Publication date: 2002-12-19
Also published as: JP2004529654A; EP1395668A1; CA2450665A1; WO2002101060A1; US20040221330A1; MXPA03011302A; US20040151795A1

Abstract

In einem Verfahren zur Erzeugung von transgenen Pflanzen oder Pflanzenzellen, die ein gewünschtes Merkmal exprimieren können, ein Verfahren zur Expression einer gewünschten Codiersequenz unter transkriptioneller und translationeller Kontrolle von Transkriptions- und Translationselementen des Zellkerns des Wirts, durch Einführen eines Vektors in das Kerngenom von Wirtspflanzen oder Pflanzenzellen für die transgenen Pflanzen oder Pflanzenzellen, wobei der Vektor die gewünschte Codiersequenz enthält, die frei ist von DOLLAR A (a) einem stromaufwärts gelegenen Transkriptionsinitiationselement, das in den Wirtspflanzen oder den Pflanzenzellen funktionell ist, mit der gewünschten Codiersequenz funktionsfähig verknüpft ist und für seine Transkription nötig ist, DOLLAR A (b) einem stromaufwärts gelegenen Translationsinitiationselement, das in den Wirtspflanzen oder den Pflanzenzellen funktionell ist und mit der gewünschten Codiersequenz funktionsfähig ist, und DOLLAR A anschließende Selektion von Pflanzenzellen oder Pflanzen, die die gewünschte Codiersequemz exprimieren.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft Verfahren und Vektoren zur Erzeugung transgener Pflanzen sowie so gewonnene Pflanzen und Pflanzenzellen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Das Erreichen eines gewünschten und stabil vererbbaren Expressionsmusters eines Transgens bleibt eines der Hauptprobleme der Pflanzenbiotechnologie. Der Standardansatz besteht darin, ein Transgen als Teil einer völlig unabhängigen Transkriptionseinheit in einen Vektor einzuführen, wo das Transgen unter transkriptioneller Kontrolle eines pflanzenspezifischen heterologen oder homologen Promotors und von Transkriptionsterminationssequenzen ist (siehe z. B. US 5 591 605, US 5 977 441, WO 0053762 A2, US 5 352 605 usw.). Da die Insertion exogener DNA in die pflanzliche genomische DNA zufällig ist, wird die Genexpression von solchen transkriptionellen Vektoren nach der Integration in die genomische DNA von vielen Faktoren des Wirts beeinflusst. Diese Faktoren machen die Transgenexpression instabil, nicht vorhersagbar und führen oft zur Stilllegung (silencing) des Transgens in der Nachkommenschaft (Matzke & Matzke, 2000, Plant Mol Biol., 43, 401-415; S. B. Gelvin, 1998, Curr. Opin. Biotechnol., 9, 227-232; Vaucheret et al., 1998, Plant J., 16, 651-659). Es gibt gut dokumentierte Beispiele für Transgen-Silencing in Pflanzen, wozu das transkriptionelle (TGS) und das posttranskriptionelle Gen-Silencing (PTGS) gehören. Neuere Befunde zeigen eine enge Beziehung zwischen Methylierung und der Chromatin- Struktur beim TGS und die Beteiligung einer RNA-abhängigen RNA-Polymerase und einer Nuclease beim PTGS (Meyer, P., 2000, Plant Mol. Biol., 43, 221-234; Ding, S. W., 2000, Curr. Opin. Biotechnol., 11, 152-156; Lyer et al., Plant Mol. Biol., 2000, 43, 323-346). Zum Beispiel kann beim TGS der Promotor des Transgens an vielen Integrationsstellen mit der Chromatin- Struktur methyliert werden, was für eine stabile Transgenexpression nachteilig ist. Deshalb ist es nach bekannten Verfahren nötig, viele unabhängige transgene Pflanzen zu produzieren und über viele Generationen zu analysieren, um diejenigen mit dem gewünschten stabilen Expressionsmuster zu finden. Ferner können auch Pflanzen, die über mehrere Generationen ein stabiles Transgenexpressionsmuster zeigen, später noch bei natürlich vorkommenden Bedingungen, wie z. B. Stress oder Pathogenbefall, stillgelegt werden. Verfahren, die auf eine verbesserte Expressionskontrolle abzielen, wie z. B. die Verwendung von Scaffold-Attachment- Regions (Allen, G. C., 1996, Plant Cell, 8, 899-913; Clapham, D., 1995, J. Exp. Bot., 46, 655-662; Allen, G. C., 1993, Plant Cell, 5, 603-613), die die Transkriptionseinheit flankieren, könnten die Unabhängigkeit und Stabilität der Transgenexpression verbessern, indem sie die Abhängigkeit von sogenannten Positionseffekt-Variationen (position effect variation) vermindern (Matzke & Matzke, 1998, Curr. Opin. Plant Biol., 1, 142-148; S. B. Gelvin, 1998, Curr. Opin. Biotechnol., 9, 227-232; WO 9844139 A1; WO 006757 A1; EP 1 005 560 A1; AU 00 018 331 A1). Diese Verfahren sind jedoch lediglich eine teilweise Lösung für das Problem des Designs von transgenen Pflanzen mit einem bestimmten Transgenexpressionsmuster.

Gen-Silencing als Pflanzenabwehrmechanismus kann von die Pflanze infizierenden Viren getriggert werden (Ratcliff et al., 1997, Science, 276, 1558-1560; Al-Kaff et al., 1998, Science, 279, 2113-2115). In nicht-transgenen Pflanzen ist das Silencing gegen das Pathogen gerichtet. In transgenen Pflanzen kann es jedoch auch das Transgen stilllegen, insbesondere dann, wenn das Transgen mit einem Pathogen homolog ist. Dies ist besonders dann ein Problem, wenn viele verschiedene Elemente viralen Ursprungs beim Design von transkriptionellen Vektoren verwendet werden. Ein illustratives Beispiel ist die Publikation von Al-Kaff und Kollegen (Al-Kaff et al., 2000, Nature Biotech., 18, 995-999), die gezeigt haben, dass eine CaMV(Blumenkohlmosaikvirus)-Infektion einer transgenen Pflanze das BAR-Gen unter der Kontrolle des CaMV-35S-Promotors stilllegen kann. Es sollte erwähnt werden, dass alle transgenen Pflanzen, die bis jetzt in die Umgebung freigesetzt und kommerziell kultiviert wurden, unter Verwendung des 35S-Promotors als Transkriptionspromotionssignal hergestellt wurden.

Während der letzten Jahre hat die Menge der cis-regulatorischen Elemente stark zugenommen und umfasst heute Möglichkeiten für die raffinierte örtliche und zeitliche Kontrolle über die Transgenexpression. Hierzu gehören mehrere Transkriptionselemente, wie verschiedene Promotoren und Transkriptionsterminatoren sowie regulatorische Translationselemente/Enhancer der Genexpression. Im allgemeinen können Translations-Enhancer als cis-wirkende Elemente definiert werden, die zusammen mit zellulären trans-wirkenden Faktoren die Translation der mRNA fördern. Die Translation in eukaryotischen Zellen wird im allgemeinen durch das Scannen vom 5'-Ende der mRNA mit Cap-Struktur aus initiiert. Die Initiation der Translation kann jedoch auch durch einen Mechanismus geschehen, der von der Cap-Struktur unabhängig ist. In diesem Fall werden die Ribosomen durch interne Ribosomen-Eingangsstellenelemente (internal ribosome entry site elements, IRES) zum Translationsstartkodon geführt. Diese ursprünglich in Picornaviren entdeckten Elemente (Jackson & Kaminski, 1995, RNA, 1, 985-1000) wurden auch in anderen viralen und zellulären eukaryotischen mRNAs identifizert. IRES sind cis-wirkende Elemente, die zusammen mit anderen zellulären trans-wirkenden Faktoren den Aufbau des ribosomalen Komplexes am internen Startkodon der mRNA fördern. Dieses Merkmal von IRES-Elementen wurde für Vektoren ausgenutzt, die eine Expression zweier oder mehrerer Proteine von polycistronischen Transkriptionseinheiten in Tier- oder Insektenzellen erlauben. Derzeit werden sie in bicistronischen Expressionsvektoren in tierischen Systemen weit verwendet, in denen das erste Gen in einer Cap-abhängigen Weise translatiert wird, und in denen das zweite Gen unter der Kontrolle eines IRES-Elements ist (Mountford & Smith, 1995, Trends Genet., 4, 179-184; Martines-Salas, 1999, Curr. Opin. Biotech., 19, 458-464). Üblicherweise variiert das Expressionsniveau eines Gens unter der Kontrolle einer IRES stark und liegt in einem Bereich von 6 bis 100% im Vergleich zur Cap-abhängigen Expression des ersten Gens (Mizuguchi et al., 2000, Mol. Ther., 1, 376-382). Diese Befunde haben eine große Bedeutung für die Verwendung von IRESs, z. B. für die Bestimmung, welches Gen als das erste in einem bicistronischen Vektor verwendet werden soll. Die Anwesenheit einer IRES in einem Expressionsvektor ermöglicht selektive Translation nicht nur unter Normalbedingungen, sondern auch unter Bedingungen, wenn die Cap-abhängige Translation inhibiert ist. Dies geschieht üblicherweise unter Stress- Bedingungen (virale Infektion, Hitzeschock, Wachstumsstillstand usw.), normalerweise wegen dem Fehlen von erforderlichen trans-wirkenden Faktoren (Johannes & Sarnow, 1998, RNA, 4, 1500-1513; Sonenberg & Gingras, 1998, Cur. Opin. Cell Biol., 10, 268-275).

Translationsvektoren erweckten kürzlich die Aufmerksamkeit von Forschern, die mit tierischen Zellsystemen arbeiten. Es gibt einen Bericht, der die Verwendung einer IRES-Cre-Rekombinase- Kassette für die gewebsspezifische Expression der Cre-Rekombinase in Mäusen beschreibt (Michael et al., 1999, Mech. Dev., 85, 35-47). In dieser Arbeit wurde eine neue IRES-Cre-Kassette in die Exon-Sequenz des EphA2-Gens eingeführt, das für den Eph-Rezeptor der Proteintyrosinkinase, die früh in der Entwicklung exprimiert wird, kodiert. Diese Arbeit ist von besonderem Interesse, da sie zum ersten Mal die Verwendung eines Translationsvektors für die gewebsspezifische Expression eines Transgens in tierischen Zellen zeigt, wobei die Expression auf der transkriptionellen Kontrolle der Wirts-DNA beruht. Eine weitere wichtige Anwendung von IRES-Elementen ist ihre Verwendung in Vektoren für die Insertionsmutagenese. In diesen Vektoren ist das Reporter- oder Selektionsmarkergen unter der Kontrolle eines IRES-Elements und kann nur exprimiert werden, wenn es in die transkribierte Region eines transkriptionell aktiven Gens inseriert (Zambrowich et al., 1998, Nature, 392, 608-611; Araki et al., 1999, Cell Mol Biol., 45, 737-750). Trotz der Fortschritte bei der Anwendung von IRESs in tierischen Systemen sind IRES-Elemente von diesen Systemen in Pflanzenzellen nicht funktionell. Da außerdem die ortsgerichtete oder homologe Rekombination in Pflanzenzellen sehr selten und ohne praktische Bedeutung ist, wurden ähnliche Ansätze mit Pflanzenzellen nicht in Betracht gezogen.

Bezüglich pflanzenspezifischer IRES-Elemente ist sehr viel weniger bekannt. Kürzlich wurden jedoch mehrere IRESs im Tobamovirus crTMV (ein TMV-Virus, der Kreuzblütler infiziert) entdeckt, die auch in Pflanzen aktiv sind (Ivanov et al., 1997, Virology, 232, 32-43; Skulachev et al., 1999, Virology, 263, 139-154; WO 98/54342), und es gibt Hinweise auf Translationskontrolle durch IRES in anderen Pflanzenviren (Hefferon et al., 1997, J. Gen. Virol., 78, 3051-3059; Niepel & Gallie, 1999, J. Virol., 73, 9080-9088). Die IRES-Technologie verfügt über ein großes Potential für die Verwendung in transgenen Pflanzen und pflanzenviralen Vektoren und stellt eine bequeme Alternative zu bereits existierenden Vektoren dar. Die einzige bekannte Anwendung von pflanzlichen IRES-Elementen für die stabile Kerntransformation betrifft die Verwendung von IRESs für die Expression eines gewünschten Gens in bicistronischen Konstrukten (WO 98/54342). Das fragliche Konstrukt beinhaltet in 5'-3'-Richtung einen Transkriptionspromotor, das erste Gen, das mit dem Transkriptionspromotor verbunden ist, ein IRES-Element, das 3' zum ersten Gen liegt, sowie das zweite Gen 3' bezüglich des IRES-Elements, d. h., das Konstrukt enthält einen vollen Satz von Transkriptionskontrollelementen.

Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, ein neues Verfahren zur Erzeugung transgener Pflanzen oder Pflanzenzellen bereitzustellen, das eine gewünschte kodierende Sequenz, die in das Genom integriert ist, stabil exprimieren kann und das wenig anfällig für Transgen-Silencing ist.

ALLGEMEINE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen oder Pflanzenzellen, die eine gewünschte Kodiersequenz unter transkriptioneller und translationeller Kontrolle von Transkriptions- und Translationselementen des Zellkerns des Wirts exprimieren können, durch Einführen eines Vektors in das Kerngenom von Wirtspflanzen oder Wirtspflanzenzellen für die transgenen Pflanzen oder Pflanzenzellen, wobei der Vektor die gewünschte Kodiersequenz enthält, die frei ist von

a) einem stromaufwärts gelegenen Transkriptionsinitiationselement, das in den Wirtspflanzen oder den Pflanzenzellen funktionell ist, mit der gewünschten Kodiersequenz funktionsfähig verknüpft ist und für seine Transkription nötig ist,
b) einem stromaufwärts gelegenen Translationsinitiationselement, das in den Wirtspflanzen oder den Pflanzenzellen funktionell ist und mit der gewünschten Kodiersequenz funktionsfähig verknüpft ist, und

anschließende Selektion von Pflanzenzellen oder Pflanzen, die die gewünschte Kodiersequenz exprimieren.

Diese Erfindung beschreibt ferner in einem Verfahren zur Erzeugung von transgenen Pflanzen oder Pflanzenzellen, die ein gewünschtes Merkmal exprimieren können, ein Verfahren zur Expression einer gewünschten Codiersequenz unter transkriptioneller und translationeller Kontrolle von Transkriptions- und Translationselementen des Zellkerns des Wirts, durch Einführen eines Vektors in das Kerngenom von Wirtspflanzen oder Pflanzenzellen für die transgenen Pflanzen oder Pflanzenzellen, wobei der Vektor die gewünschte Codiersequenz enthält, die frei ist von

a) einem stromaufwärts gelegenen Transkriptionsinitiationselement, das in den Wirtspflanzen oder den Pflanzenzellen funktionell ist, mit der gewünschten Codiersequenz funktionsfähig verknüpft ist und für seine Transkription nötig ist,
b) einem stromaufwärts gelegenen Translationsinitiationselement, das in den Wirtspflanzen oder den Pflanzenzellen funktionell ist und mit der gewünschten Codiersequenz funktionsfähig verknüpft ist, und

anschließende Selektion von Pflanzenzellen oder Pflanzen, die die gewünschte Codiersequenz exprimieren.

Während Experimenten mit Translationsvektoren haben wir ein neues Verfahren zur genetischen Transformation von Pflanzen oder Pflanzenzellen gefunden. Es beruht auf der Verwendung von Vektoren, die eine gewünschte Kodiersequenz ohne funktionell mit ihr verknüpfte Transkriptions- oder Translationsinitiationselemente (funktionelle Elemente (a) und (b)) enthalten, und die in den Wirtspflanzen oder Pflanzenzellen funktionsfähig sind. Die Kodiersequenz kann ein funktionsfähig mit ihr verknüpftes Element zur Termination der Transkription aufweisen, muss dies jedoch nicht. Vorzugsweise weist sie ein Translationsstoppsignal (Stopp-Kodon) auf. Diese Vektoren werden als Translationsfusionsvektoren bezeichnet. Ein Vergleich der Transformationseffizienz von Transkriptionsvektoren, IRES-basierten Translationsvektoren und Translationsfusionsvektoren ergab ein sehr überraschendes Ergebnis. Die Anzahl der Transformanten mit Translationsfusionsvektoren, die ursprünglich als Negativkontrollen für Transformationsexprimente gedacht waren, war lediglich 2- bis 10-fach geringer als die, die mit IRES-basierten Translationsvektoren erhalten wurde. Diese Transformationseffizienz liegt in einem Bereich, der praktisch nützlich ist. Zum Beispiel ergab der Translationsfusionsvektor pIC1451 (Fig. 3) eine Zahl von Brassica napus-Transformanten, die im Vergleich zum IRES-basierten Translationsvektor pIC1301 (Fig. 2) nur halb so groß war. Translationsvektoren weisen ein Translationsinitiationselement, wie eine IRES stromaufwärts einer gewünschten Kodiersequenz auf und benötigen die Transkriptionsmaschinerie der Wirtspflanze.

Fig. 3 zeigt ein Beispiel der einfachsten Form eines Translationsfusionsvektors gemäß dieser Erfindung. Er enthält eine gewünschte Kodiersequenz und ist frei von funktionell mit ihr verknüpften funktionsfähigen Transkriptions- und Translationsinitiationselementen. Wahlweise kann der Vektor einen Transkriptionsterminator (35S-Terminator in Fig. 3) aufweisen. Eine mögliche Ausführungsform des Verfahrens dieser Erfindung unter Verwendung eines solchen Translationsfusionsvektors ist in Fig. 1A gezeigt: Die Transformation sollte zur Einführung des Vektors in einen kodierenden Teil (ein Exon) eines transkriptionell aktiven Gens der Wirtspflanze führen. Bei der Transkription wird eine hybride mRNA gebildet, die von der Kern-DNA der transgenen Pflanze oder Pflanzenzellen abgeleitete RNA umfasst, sowie RNA, die von der gewünschten Kodiersequenz abgeleitet ist, d. h. eine hybride mRNA. Nach der RNA-Prozessierung (z. B. Intron-Spleißen, Capping, Polyadenylierung) führt die Translation zu einem Fusionsprotein, das als N-terminalen Teil einen Teil eines nativen Wirtsproteins aufweist und das Genprodukt der gewünschten Kodiersequenz als C-terminalen Teil. Vorzugsweise endet die Translation nach der gewünschten Kodiersequenz wegen eines Translationsstoppsignals.

Fig. 1B zeigt eine etwas komplexere allgemeine Ausführungsform, wobei der Vektor eine gewünschte Kodiersequenz (Transgen 1), die frei ist von den funktionellen Elementen (a) und (b), sowie stromabwärts ein weiteres und hiermit verknüpftes Cistron aufweist. In diesem Fall weist die gewünschte Kodiersequenz (Transgen 1) vorzugsweise kein funktionsfähiges Transkriptionsterminationselement auf, das die Transkription nach dem Transgen 1 beendet. Die weiteren Cistrons können funktionell mit Transkriptions- und/oder Translationselementen verknüpft sein, wie einem Promotor oder einem IRES-Element stromabwärts der gewünschten Kodiersequenz und stromaufwärts des (der) weiteren Cistrons. Weiterhin verfügen die weiteren Cistrons vorzugsweise über ein Transkriptionsterminationssignal stromabwärts davon. Vorzugsweise sind die Cistrons unter der Kontrolle eines oder mehrerer IRES-Elemente. Im in Fig. 1B gezeigten Fall führt die Transkription und die Translation zu einem Fusionsprotein, das das Genprodukt der gewünschten Kodiersequenz enthält. Ein weiteres Cistron (Transgen 2) wird unter der Kontrolle eines IRES-Elements translatiert.

Wenn der Translationsfusionsvektor die gewünschte Kodiersequenz als die einzige Kodiersequenz oder als einziges Cistron enthält, kodiert die Kodiersequenz vorzugsweise für einen Selektionsmarker, um die Selektion von Transformanten zu erlauben. Wenn der Vektor ein oder mehrere weitere Cistrons stromabwärts der Kodiersequenz enthält, kann eines dieser Cistrons für einen Selektionsmarker kodieren.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform folgt der gewünschten Kodiersequenz (die vorzugsweise für einen Selektionsmarker kodiert) in dem Translationsfusionsvektor eine DNA- Sequenz, die von ortsspezifischen Rekombinasen erkannt werden kann (Fig. 1C). Ein nach dem Verfahren dieser Erfindung erhaltener Transformant kann dann dazu benutzt werden, bei einer zweiten Transformation irgendein gewünschtes Gen zu integrieren. Dieses gewünschte Gen ist vorzugsweise unter translationeller Kontrolle eines IRES-Elements. Das IRES-Element kann stromaufwärts der Sequenz liegen, die in dem Translationsfusionsvektor von einer ortsspezifischen Rekombinase erkannt werden kann. Für den zweiten Transformationsschritt kann eine Transformant mit einem bekannten, gewünschten oder geeigneten Expressionsmuster ausgewählt werden. Alternativ kann der Selektionsmarker in einem Transformanten unter Verwendung von ortsspezifischen Rekombinationsstellen in dem Translationsfusionsvektor durch irgendein gewünschtes Gen ersetzt werden (siehe z. B. den in Fig. 4 gezeigten Vektor). Folglich können die nach dem Verfahren dieser Erfindung erhaltenen trangenen Pflanzen oder Pflanzenzellen für eine weitere genetische Modifizierung verwendet werden, insbesondere für die gezielte (targeted) Transformation mittels ortsspezifischer Rekombination.

Wenn der Translationsfusionsvektor weitere Cistrons stromabwärts der gewünschten Kodiersequenz enthält, wird der Transformationsmarker vorzugsweise als das erste Cistron in dem Vektor verwendet. Ein solches Verfahren weist alle Vorteile von Translationsvektoren auf der Basis von IRES-Elementen auf, kann jedoch die Wahrscheinlichkeit, Transformanten zu erhalten, weiter vergrößern. Eine solche direkte Selektion für Translationsfusionsexpression erlaubt erlaubt die direkte Selektion für weitere nützliche Merkmale, wie z. B. Herbizidresistenz.

Die Vektoren für das erfindungsgemäße Verfahren können leicht verbessert werden, z. B. durch Einführen von Spleißstellen, um die Wahrscheinlichkeit von Fusionen im richtigen Leseraster zu erhöhen, wodurch die Transformationseffizienz deutlich gesteigert werden kann.

Üblicherweise führt das erfindungsgemäße Verfahren zur Bildung von hybrider RNA (mRNA), die von der Kern-DNA der transgenen Pflanzen oder Pflanzenzellen abgeleitete RNA umfasst, sowie von der gewünschten Kodiersequenz abgeleitete RNA. In einer typischen Ausführungsform kodiert die hybride mRNA für ein Fusionsprotein. Die hybride mRNA kann jedoch auch für mehrere heterologe Polypeptidsequenzen kodieren, z. B., wenn der Vektor ein oder mehrere Cistrons stromabwärts der gewünschten Kodiersequenz enthält. In einer anderen Ausführungsform enthält die hybride mRNA eine Sequenz, die zumindest teilweise zu einer nativen mRNA der Pflanze oder der Pflanzenzellen komplementär (anti-sense) ist, um die Expression der für die Pflanze oder die Pflanzenzellen nativen mRNA zu unterdrücken, z. B. für die funktionelle Genomanalyse.

Es ist bekannt, dass viele Proteine ihre Aktivität als Translationfusionsproteine beibehalten, darunter der Pflanzenreporter GUS (Kertlundit et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 5212-5216), GFP (Santa Cruz et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 6286-6290) und die Transformationsselektionsmarker NPTII (Vergunst et al., 1998, Nucleic Acids Res., 26, 2729-2734), APH(3')II (Koncz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 86, 8467-8471), BAR (Botterman et al., 1991, Gene, 102, 33-37). Dieser Befund hatte jedoch eine begrenzte Anwendbarkeit, die z. B. nicht über Gen-Trapping in Pflanzen (Koncz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8467-8471); Sundaresan et al., 1995, Genes Dev., 9, 1797-1810) oder das Studium von Proteinlokalisation/Expressionsmustern hinausging. In allen oben genannten Fällen wurden Vektoren mit irgendeiner Art von Transkriptions- und/oder Translationsterminationssignalen verwendet. Hier zeigen wir zum ersten Mal, dass Transformationsmarker effizient für die direkte Selektion transformierter Pflanzenzellen als Translationsfusionsprodukte mit nativen Proteinen benutzt werden können.

Der Vektor für das erfindungsgemäße Verfahren kann ferner neben oder in der gewünschten Kodiersequenz oder der stromabwärks gelegenen Cistrons eine oder mehrere Sequenzen enthalten, die für proteolytische Spaltstellen kodieren. Dies erlaubt es, das Protein, für das die gewünschte Kodiersequenz kodiert, von dem primär-exprimierten Fusionsprotein abgespalten zu erhalten. Die proteolytische Spaltstelle kann autokatalytisch sein, wodurch das Fusionsprotein sich selbst spalten kann. Alternativ kann das Spalten des exprimierten Fusionsproteins eine ortsspezifische Protease benötigen. Eine solche Protease kann eine native Protease der Pflanze oder der Pflanzenzellen sein. Alternativ kann die Pflanze oder die Pflanzenzellen genetisch modifiziert oder transfiziert sein, um sie mit einer heterologen ortsspezifischen Protease zum Spalten des Fusionsproteins auszustatten. Das erfindungsgemäße Verfahren kann für die Herstellung von transgenen Pflanzen, vorzugsweise von transgenen Nutzpflanzen, verwendet werden. Diese Pflanzen exprimieren vorzugsweise ein nützliches Merkmal. Dieses Merkmal kann zumindest teilweise das Ergebnis der Expression der gewünschten Kodiersequenz zu einem RNA-Molekül, z. B. einem ribosomalen, einem Transfer- oder einer mRNA (z. B. für Antisense-Technologie) sein. Vorzugsweise ist das Merkmal das Ergebnis der Expression der gewünschten Kodiersequenz zu einem Polypeptid oder Protein. Ferner kann das Merkmal das Ergebnis der Expression der gewünschten Kodiersequenz und einer oder mehrerer zusätzlicher Cistrons sein.

Die erfindungsgemäßen Verfahren haben den Vorteil, dass die erhaltenen transgenen Pflanzen oder Pflanzenzellen eine minimale Anzahl xenogenetischer Elemente aufweisen, was die Transgenexpression stabiler und das Transgen-Silencing weniger wahrscheinlich macht.

Vorzugsweise sind die Sequenzen und Elemente, die in den Vektoren für das Verfahren verwendet werden, pflanzlicher Herkunft, was den Gehalt fremder Sequenzen in den transgenen Pflanzen und Pflanzenzellen reduziert.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 zeigt drei Varianten von vielen möglichen Translationsfusionvektoren.
A - die einfachste Version eines Translationsfusionsvektors, der aus einer gewünschten Kodiersequenz (Transgen) besteht;
B - der Vektor enthält ein zweites Transgen, das von dem ersten durch ein IRES-Element getrennt ist;
C - der Vektor enthält ein IRES-Element und eine Rekombinationsstelle (RS), die von einer ortsspezifischen Rekombinase erkannt wird.

Fig. 2 zeigt den Translationsvektor pIC1301, der IRES_MP,75 ^CR, BAR und den 35S-Terminator enthält;

Fig. 3 zeigt den Vektor pIC1451, der ein promotorloses BAR-Gen und den 35S-Terminator enthält;

Fig. 4 zeigt den Vektor pIC052, der eine LoxP-Stelle, das HPT-Gen und einen nos-Terminator enthält;

Fig. 5 zeigt den Vektor pIC-GB, der die BAR-GFP-Translationsfusion enthält.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Konstruktion von Vektoren für die stabile Transformation von Pflanzen wurde von vielen Autoren beschrieben (für eine Übersicht siehe Hansen & Wright, 1999, Trends in Plant Science, 4, 226-231; Gelvin, S. B., 1998, Curr. Opin. Biotech., 9, 227-232). Das Grundprinzip all dieser Konstrukte ist identisch: Eine voll funktionsfähige Transkriptionseinheit, die, in 5'-3'-Richtung, aus einem pflanzenspezifischen Promotor, dem Strukturteil eines gewünschten Gens und einem Transkriptionsterminator besteht, muss in eine Pflanzenzelle eingeführt und stabil in das Genom integriert werden, um die Expression des gewünschten Gens zu erreichen.

Wir haben eine andere Technologie entwickelt, um stabile Kerntransformanten von Pflanzen zu erhalten. Unsere Erfindung beruht auf dem überraschenden Befund, dass das Einführen einer Kodiersequenz ohne funktionellem Transkriptions- oder Translationsinitiationselement in eine Pflanzenzelle mit relativ hoher Häufigkeit Transformanten ergibt, die die gewünschte Kodiersequenz exprimieren, da die Transkriptions/Translationsmaschinerie des Wirts anscheinend für die Bildung von mRNA des gewünschten Transgens in der transformierten Pflanzenzelle sorgen kann. Das vorgeschlagene Verfahren verwendet Vektoren mit einer gewünschten Kodiersequenz, die nicht funktionell mit einem Promotor oder einem IRES-Element in dem Vektor verknüpft ist, sondern nach der Insertion in einen kodierenden Teil des Wirtsgenoms eine Translationsfusion mit einem pflanzenkodierten Wirtsprotein bildet.

Die Vektoren, die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden, ergeben nach der Integration in einen transkribierten Bereich eines Wirtsgens chimäre mRNA, die anschließend in das gewünschte Fusionsprotein translatiert wird (Fig. 1). Unseres Wissens gibt es keinen Stand der Technik für dieses Verfahren zur Erzeugung stabiler pflanzlicher Kerntransformanten. Wegen des geringen Anteils transkriptionell aktiver DNA in den meisten Pflanzengenomen war es sehr überraschend, dass Transformationsexperimente, mit denen in dieser Erfindung beschriebenen Translationsfusionsvektoren zahlreiche Transformanten ergeben, die das gewünschte Gen exprimieren.

Diese Erfindung nimmt bedeutende Probleme einer verlässlichen Transgenexpression in Angriff. Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in das Wirtsgenom integrierte Transgen benötigt die Transkriptions-Translations-Maschinerie, einschließlich aller oder der meisten transkriptionellen Regulatorelemente des Wirtsgens, was das Transgen-Silencing, das üblicherweise von xenogenetischen regulatorischen DNA-Elementen verursacht wird, minimiert.

Die Vektoren für das Einführen des Transgens können auf viele verschiedene Weisen hergestellt werden. Die einfachste Version enthält die gewünschte Kodiersequenz oder einen Teil derselben (Grundform eines Translationsfusionsvektors - Fig. 1A) und, wenn gewünscht, ein Transkriptions- und ein Translationsstoppsignal. Für eine andere Version wird ein IRES- oder ein Promotorelement nach der gewünschten Kodiersequenz eingebaut für die Transkription und/oder Translation etwaiger weiterer Cistrons. Kompliziertere Versionen des Translationsfusionsvektors können Sequenzen für eine ortsspezifische Rekombination enthalten (für eine Übersicht siehe Corman & Bullock, 2000, Curr. Opin. Biotechnol., 11, 455-460), was entweder den Ersatz eines vorliegenden Transgens oder die Integration weiterer gewünschter Gene in den transkribierten Bereich der Wirts- DNA erlaubt (Fig. 1C). Ortsspezifische Rekombinasen/Integrasen von Bakteriophagen und Hefen werden viel für die DNA-Manipulation in vitro und in Pflanzen verwendet. Beispiele für Rekombinasen/Rekombinationsstellen für die Verwendung in dieser Erfindung sind unter anderem die folgenden: cre-Rekombinase/LoxP-Rekombinationsstellen, FLP-Rekombinase/FRT- Rekombinationsstellen, R-Rekombinase/RS-Rekombinationsstellen, phiC31-Integrase-attP/attB- Rekombinationsstellen usw.

Die Einführung von Spleißstellen in den Translationsvektor kann dazu benutzt werden, die Wahrscheinlichkeit dafür zu erhöhen, dass das Transgen in dem prozessierten Transkript enthalten ist.

Der Vektor kann ferner stromaufwärts der gewünschten Kodiersequenz oder der weiteren Cistrons eine Sequenz enthalten, die für ein Leit- oder Signalpeptid kodiert. Bevorzugte Beispiele eines solchen Signalpeptids sind unter anderem ein Plastid-Leitpeptid, ein mitochondriales Leitpeptid, ein nukleäres Leitpeptid, ein vakuoläres Leitpeptid und ein Sekretionsleitpeptid.

Wenn Vektoren proteolytische Spaltstellen enthalten, die die gewünschte Kodiersequenz flankieren, wird das Fusionsprotein gespalten und das gewünschte Protein in reiner Form freigesetzt, wenn die Bedingungen für eine solche proteolytische Spaltung geeignet sind.

Verschiedene Methoden können zum Einführen der Translationsvektoren in Pflanzenzellen verwendet werden, darunter eine direkte Einführung des Vektors in eine Pflanzenzelle mittels Mikroprojektilbombardierung, Elektroporation oder PEG Behandlung von Protoplasten. Die Agrobakterium-vermittelte Pflanzentransformation stellt einen weiteren effizienten Weg dar. Die T-DNA-Insertionsmutagenese in Arabidopsis und Nicotiana mit dem promotorlosen Reporter- APH(3')II-Gen, das eng mit der rechten T-DNA-Grenze verknüpft ist, zeigte, dass mindestens 30% aller Inserts transkriptionelle und translationelle Genfusionen induzierte (Koncz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8467-8471).

Alle oben beschriebenen Ansätze zielen auf ein System ab, bei dem eine gewünschte Kodiersequenz unter die Expressionskontrolle eines Wirtsgens, in das die Insertion stattfindet, stellt. Dies sollte einen geeigneten Expressionslevel der gewünschten Sequenz ergeben. In vielen anderen Fällen mag ein anderes Transgenexpressionsmuster bevorzugt sein. In diesen Fällen kann der Translationsfusionsvektor mit transkriptionsaktiven Elementen ausgestattet werden, wie Enhancern, die das Expressionsmuster eines Transgens modulieren können. Es ist bekannt, dass Enhancersequenzen die Stärke eines Promotors, der bis zu mehreren tausend Basenpaaren entfernt liegt, beeinflussen können (Müller, J., 2000, Current Biology, 10, R241-R244). Die Durchführbarkeit eines solchen Ansatzes wurde in Activation-Tagging-Experimenten in Arabidopsis gezeigt (Weigel et al., 2000, Plant physiol., 122, 1003-1013), wobei T-DNA- lokalisierte 35S-Enhancerelemente das Expressionsmuster von Wirtsgenen veränderten so wie beim oben beschriebenen Enhancer-Trap-Transposon-Tagging. Im letzten Beispiel bestimmten Wirtsgene das Expressionsmuster von Reporter-Transgenen. Dieser Ansatz kann z. B. in den frühen Phasen der Pflanzentransformation nützlich sein, oder wenn eine Modulation des Transgen- Expressionsmusters nach der Transformation erforderlich ist.

Das Expressionsmuster kann auch durch Translations-Enhancer moduliert werden. Die Enhancersequenzen können leicht mittels sequenzspezifischen Rekombinationssystemen manipuliert (inseriert, ersetzt oder entfernt) werden, je nach den speziellen Anforderungen. Enhancer wirken jedoch nicht als Initiatoren der Transkription oder Translation.

Unser Ansatz bestand darin, einen Satz von Konstrukten auf der Grundlage eines pflanzlichen Selektionsmutagens, das als Translationsfusionsprotein funktionell ist, herzustellen. Einem solchen Markergen kann eine von einer ortsspezifischen Rekombinase erkennbare Rekombinationsstelle vor- oder nachgelagert sein, was die Integration eines weiteren gewünschten Gens an einer vorbestimmten Stelle über einen zusätzlichen Transformationsschritt erlaubt. Wahlweise kann dem Markergen ein weiteres Transgen (Cistron) unter der Kontroller einer IRES oder eines Promotors folgen. Diese Konstrukte können direkt für die Transformation einer Pflanzenzelle verwendet werden, nachdem sie am 5'-Ende vor der gewünschten Kodiersequenz linearisiert wurden, oder sie können in eine T-DNA für eine Agrobakterium-vermittelte Transformation kloniert werden.

Ein weiterer Satz Konstrukte zielt auf die Expression eines gewünschten Merkmals als selbstständiges Fusionsprodukt ab. In diesen Experimenten muss eine gewünschte Kodiersequenz einen Selektionsvorteil, wie z. B. eine Herbizidresistenz, vermitteln. Unser Beispiel beruht auf der Verwendung eines Translationsfusionsvektors, um eine Pflanze zu erzeugen, die Resistenz gegen das Herbizid Basta exprimiert, da sie ein Fusionsprotein aufweist, das den funktionellen Teil des Enzyms enthält.

Dieser Ansatz kann auch dann verwendet werden, wenn die gewünschte Sequenz eine Antisense- Sequenz ist, und die Transkription eine hybride RNA ergibt, von der ein Teil in Antisense- Orientierung vorliegt und so entworfen ist, dass er ein endogenes Gen stilllegt.

Ein weiterer Satz Konstrukte, die als Kontrollen dienen, können entweder ein promotorloses Selektionsgen unter IRES-Kontrolle aufweisen (ein positiver Translationsvektor) oder ein Selektionsgen unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors, der in Zellen von Monocotyledonen und/oder Dicotyledonen wirksam ist (ein positiver Kontroll- oder Transkriptionsvektor). DNA wird in Pflanzenzellen über verschiedene geeignete Verfahren transformiert, wie z. B. Ti-Plasmidvektoren aus Agrobakterium (US 5 591 616, US 4 940 838, US 5 464 763), Teilchen- oder Mikroprojektilbombardierung (US 5 100 792, EP 00 444 882 B1; EP 00 434 616 B1). Prinzipiell können auch andere Pflanzentransformationsmethoden benutzt werden, wie z. B. Mikroinjektion (WO 09209696, WO 09400583 A1, EP 175 966 B1), Elektroporation (EP 00 564595 B1, EP 00 290395 B1, WO 08706614 A1).

Die Transformationsmethode hängt von der zu transformierenden Pflanzenart ab. Unsere Beispiele umfassen Daten zur Transformationseffizienz für einkeimblättrige Pflanzenarten (z. B. Triticum monococcum) und zweikeimblättrige Pflanzenarten (z. B. Bassica napus, Orichophragmus violaceous), was die Ausführbarkeit unseres Verfahrens für Pflanzenarten verschiedenen phylogenetischen Ursprungs und mit verschiedenen Dichten der transkribierten Regionen des Genoms demonstriert.

Die transgene Kodiersequenz in einem Vektor kann nur einen Teil eines gewünschten Gens repräsentieren, wobei das Gen durch folgende ortsgerichtete oder homologe Rekombinationen zu voller Länge rekonstruiert wird.

BEISPIELE BEISPIEL 1 Konstruktion IRES enthaltender Translationsfusionsvektoren

IRES-vermittelte Expressionsvektoren wurden nach Standard-molekularbiologischen Verfahren konstruiert (Maniatis et al., 1992, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York). Vektor pIC1301 (Fig. 2) wurde durch Verdau des Plasmids pIC501 (p35S- GFP-IRES_MP,75 ^CR-BAR-35S Terminator in pUC120) mit Hindill und Religation des großen gelgereinigten Fragments erhalten. Die IRES_MP,75 ^CR-Sequenz stellt die 3'-terminalen 75 Basen der 5'-translatierten Leitsequenz (leader sequence) der subgenomischen RNA des Movement-Proteins (MP) eines Kreuzblütler infizierenden Tobamovirus (crucifer (CR)-infecting tobamovirus) dar.

Ein ein promotorloses BAR-Gen enthaltendes Konstrukt wurde durch Deletion des 35S-Promotors aus einem Plasmid erhalten, das p35S:BAR-3'35S (pIC1311, nicht gezeigt) enthält. Plasmid pIC1311 wurde mit HindIII-NruI verdaut und durch Behandlung mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase 1 abgestumpft. Das große Restriktionsfragment wurde gelgereinigt und religiert, was pIC1451 (promotorloses BAR-35S Terminator, siehe Fig. 3) ergab.

Der Vektor pIC-BG (Fig. 5) wurde folgendermaßen hergestellt: Das 3'Ende des BAR-Gens wurde PCR-amplifiziert unter Verwendung des Plasmids pIC026 als Templat und zweier BAR-Gen- spezifischer Primer (Vorwärtsprimer: 5'-acgcgtcgaccgtgtacgtctccc-3', Rückwärtsprimer: 5'- ccatggcgatctcggtgacgggc aggac-3'). Mit diesen Primern wurde eine Sal I- und eine Nco I-Stelle am 5'-Ende bzw. am 3'-Ende des PCR-Fragments eingeführt. Um das BAR/GFP-Fusionskonstrukt zu klonieren, wurde das Sal I/Nco I-verdaute und gelgereinigte PCR-Produkt mit dem gelgereinigten kleinen Nco I/Pst I-Fragment von Konstrukt pIC011 (HBT-Promotor: GFP-NOS-Terminator) ligiert, und das gelgereinigte große Fragment von Konstrukt pIC1451 wurde mit Sal 1 und Pst 1 verdaut. In diesem Konstrukt (pIC BG) ist das BAR-Gen im Leserahmen mit dem 5'-Ende des GFP-Gens fusioniert. Auf Proteinebene kann das BAR-GFP-Fusionsprotein von diesem Konstrukt exprimiert werden, wobei der Teil des BAR-Proteins durch eine Aminosäure (Ala) von dem GFP- Protein getrennt ist. Dieses Konstrukt wurde amplifiziert und sequenziert, um die Sequenz zu bestätigen.

Alle Vektoren wurden zur Verwendung in den Transformationsexperimenten entweder mit SacI (pIC1451, pIC BG) oder mit HindIII (pIC052, pIC1301) verdaut und gelgereinigt zur Abtrennung von unverdautem Vektor.

BEISPIEL 2 PEG-vermittelte Protoplasten-Transformation von Brassica napus Isolierung von Protoplasten

Die Isolierung von Brassica-Protoplasten beruhte auf früher veröffentlichten Protokollen (Glimelius K., 1984, Physiol. Plant., 61, 38-44; Sundberg & Glimelius, 1986, Plant Science, 43, 155-162 und Sundberg et al., 1987, Theor. Appl. Genet., 75, 96-104).

Sterilisierte Samen (siehe Anhang) wurden in 90 mm Petrischalen, die ein ½ MS-Medium mit 0,3% Gelrite enthielten, gekeimt. Die Samen wurden in Reihen in geringen Abständen plaziert. Die Petrischalen wurden verschlossen, zu einem Winkel von 45° geneigt und 6 Tage im Dunkeln bei 28°C gehalten. Die Hypokotylen wurden in 1 bis 3 mm lange Stücke mit einer scharfen Rasierklinge geschnitten. Die Klingen wurden häufig ersetzt, um eine Mazeration des Materials zu vermeiden. Die Stücke der Hypokotylen wurden in TVL-Lösung (siehe Appendix) gelegt, um die Zellen zu plasmolysieren. Das Material wurde bei Raumtemperatur 1 bis 3 Stunden behandelt. Diese Vorbehandlung verbessert die Ausbeute intakter Protoplasten beträchtlich. Die Präplasmolyselösung wurde durch 8 bis 10 ml Enzymlösung ersetzt (siehe Appendix). Die Enzymlösung sollte das gesamte Material bedecken, jedoch nicht im Überschuß verwendet werden. Dieses Material wurde bei 20 bis 25°C im Dunkeln mindestens 15 Stunden lang inkubiert. Die Petrischalen wurden auf einem Rotationsschüttler bei sehr geringer Agitation gehalten.

Die Mischung aus Protoplasten und Zelldebris wurde durch einen 70 mm-Netzfilter filtriert. Die Petrischalen wurden mit 5 bis 10 mm W5-Lösung (Menczel et al., 1981, Theor. Appl. Genet., 59, 191-195) (siehe Appendix) gespült, die dann auch filtriert und mit dem Rest der Suspension vereint wurde. Die Protoplasten-Suspension wurde in ein steriles 40 ml-Falconröhrchen überführt, und die Protoplasten wurden durch Zentrifugation bei 120 g 7 Minuten pelletiert. Der Überstand wurde entfernt, und das Pellet aus Protoplasten in 0,5 M Sucrose resuspendiert. Die Suspension wurde in sterile 10 ml Zentrifugenröhrchen (8 ml pro Röhrchen) überführt und 2 ml W5-Lösung zugesetzt. Nach 10-minütigem Zentrifugieren bei 190 g wurden die intakten Protoplasten aus der Interphase mit einer Pasteur-Pipette gesammelt. Sie wurden in neue Zentrifugenröhrchen überführt, in 0,5 M Mannitol mit 10 mM CaCl₂ resuspendiert und für 5 Minuten bei 120 g pelletiert.

PEG-Behandlung

Die Protoplasten wurden in Transformationspuffer (siehe Appendix) resuspendiert. Die Protoplasten-Konzentration wurde mit einer Zählkammer (counting chamber) bestimmt und auf 1 bis 1,5 × 10⁶ Protoplasten/ml eingestellt. Ein 100 µl-Tropfen dieser Suspension wurde in das untere Eck einer geneigten 6 cm-Petrischale platziert und für einige Minuten stehen gelassen, damit die Protoplasten niedersanken. Die Protoplasten wurden dann vorsichtig mit 50 bis 100 µl DNA- Lösung (Qiagen-gereinigt, in TE zu einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst) gemischt. Dann wurden 200 µl PEG-Lösung (siehe Appendix) tropfenweise zu der Protoplasten/DNA-Mischung gegeben. Nach 15 bis 30 Minuten wurde der Transformationspuffer (oder W5-Lösung) in kleinen Aliquots (tropfenweise) zugegeben, bis die Schale beinahe voll war (ungefähr 6 ml). Die Suspension wurde 1 bis 5 Stunden stehen gelassen, um das Absinken zu erlauben. Dann wurden die Protoplasten in Zentrifugenröhrchen überführt, in W5-Lösung resuspendiert und bei 120 g 5 bis 7 Minuten pelletiert.

Protoplastenkultur und Transformantenselektion

Die Protoplasten wurden in 8 pM Kulturmedium überführt (Kao & Michayluk, 1975, Planta, 126, 105-110, siehe auch Appendix) und bei 25°C und geringer Lichtdichte in 2,5 oder 5 cm Petrischalen mit 0,5 bzw. 1,5 ml Medium inkubiert. Die Protoplastendichte betrug 2,5 × 10⁴ Protoplasten/ml. Die drei Volumina frisches 8 pM-Medium ohne jegliche Hormone wurden direkt nach der ersten Protoplastenteilung zugefügt. Die Zellen wurden bei hoher Lichtdichte, 16 Stunden pro Tag inkubiert.

Nach 10 bis 14 Tagen wurden die Zellen im K3-Medium (Nagy & Maliga, 1976, Z. Pflanzenphysiol., 78, 453-455) mit 0,1 M Sucrose, 0,13% Agarose, 5 bis 15 mg/l PPT und einer vierfach geringeren Hormonkonzentration als im 8 pM-Medium überführt. Um die Überführung in frisches Medium zu erleichtern, wurden die Zellen auf ein steriles Filterpapier gelegt und vorsichtig zu einer dünnen Schicht verteilt. Die Zellen wurden bei hoher Lichtdichte, 16 Stunden pro Tag, gehalten. Die Zellkolonien wurden in Petrischalen mit dem Differenzierungsmedium K3 überführt, nachdem ihre Größe 0,5 cm im Durchmesser erreicht hatte.

BEISPIEL 3 Transformation von Triticum monococcum durch Mikroprojektilbombardierung Pflanzenzellkultur

Eine Suspensionszelllinie von T. Monococcum L. wurde in MS2(MS-Salze (Murashige & Skoog, 1962, Physiol. Plant., 15, 473-497), 0,5 mg/l Thiamin HCl, 100 mg/l Inosit, 30 g/l Sucrose, 200 mg/l Bacto-Trypton, 2 mg/l 2,4-D)-Medium in 250 ml-Kolben auf einem Rotationsschüttler bei 160 U/min und 25°C kultiviert und wöchentlich subkultiviert. Vier Tage nach einer Subkultur wurden die Zellen auf einer 50 mm-Filterpapierscheibe auf Gelrite-erhärtetem (4 g/l) MS2 mit 0,5 M Sucrose verteilt.

Mikroprojektilbombardierung

Die Mikroprojektilbombardierung wurde mit einem Biolistic-PDS-1000/He-Particle Delivery System (Bio-Rad) durchgeführt. Die Zellen wurden bei 900 bis 1100 psi, einem 15 mm Abstand vom Makroträgerstartpunkt zur Stoppscheibe und 60 mm Abstand von der Stoppscheibe zum Zielgewebe bombardiert. Der Abstand zwischen der Bruchscheibe und dem Startpunkt des Makroträgers betrug 12 mm. Die Zellen wurden nach 4-stündiger osmotischer Vorbehandlung bombardiert.

Die DNA-Goldbeschichtung gemäß dem originalen Bio-Rad-Protokoll (Sanford et al., 1993, in: Methods in Enzymology, Hg. R. Wu, 217, 483-509) wurde folgendermaßen durchgeführt: 25 µl Goldpulver (0,6, 1,0 mm) in 50% Glycerin (60 mg/ml) wurden mit 5 µl Plasmid-DNA in einer Konzentration von 0,2 µg/ml, 25 µl CaCl₂ (2,5 M) und 10 µl 0,1 M Spermidin gemischt. Die Mischung wurde 2 Minuten gevortext, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur, Zentrifugation (2000 U/min, 1 min) und Waschen mit 70% und 99,5% Ethanol. Schließlich wurde das Pellet in 30 µl 99,5% Ethanol (6 µl/Schuss) resuspendiert.

Ein neues DNA-Goldbeschichtungsverfahren (PEG/Mg) wurde folgendermaßen durchgeführt: 25 µl Goldsuspension (60 mg/ml in 50% Glycerin) wurden mit 5 µl Plasmid-DNA in einem Eppendorfgefäß gemischt, dann wurden 30 µl 40% PEG in 1,0 M MgCl₂ zugesetzt. Die Mischung wurde 2 Minuten lang gevortext und dann 30 Minuten bei Raumtemperatur, ohne zu schütteln, inkubiert. Nach einer Zentrifugation (2000 U/min, 1 min) wurde das Pellet zweimal mit 1 ml 70% Ethanol, einmal mit 1 ml 99,5% Ethanol gewaschen und schließlich in 30 µl 99,5% Ethanol dispergiert. Aliquots von 6 µl der DNA-Goldsuspension in Ethanol wurden auf Makroträgerscheiben geladen und 5 bis 10 Minuten trocknen gelassen.

Plasmid-DNA-Präparation

Plasmide wurden in den E.coli-Stamm DH10B transformiert, Maxipreps wurden in LB-Medium gezogen, und die DNA wurde mit dem Qiagen-Kit gereinigt.

Selektion

Für Experimente zur stabilen Transformation wurden die Filter mit den behandelten Zellen auf festes MS2-Medium mit dem richtigen Filter-sterilisierten Selektionsmittel (150 mg/l Hygromycin B (Duchefa); 10 mg/l Bialaphos (Duchefa) transferiert. Die Platten wurden im Dunkeln bei 26°C inkubiert.

BEISPIEL 4 Transformation von Orychophragmus violaceus durch Mikroprojektilbombardierung Präparation der Suspensionskultur

O. violaceus-Pflanzen werden in vitro auf MS-Medium, 0,3% Gelrite (alternativ ein ½ MS, 2% Sucrose und 0,8% Agar) bei 24°C und 16/8-stündigen Tag/Nacht-Photoperioden 3 bis 4 Wochen kultiviert. 4 bis 6 Blätter (abhängig von ihrer Größe) wurden in kleine Stücke geschnitten und in einer Magenta-Box mit 30 ml Callus-induziertem Medium (CIM) (siehe Appendix) transferiert. Dieses Material wurde 4 bis 5 Wochen in geringem Licht (oder im Dunkeln) bei 24°C und heftiger Agitation gehalten. Während dieser Zeit wurde frisches CIM-Medium zugefügt, um das Pflanzengewebe in der Magenta-Box mit Flüssigkeit bedeckt zu halten. Zellen, die an die Wand der Magenta-Box anhaftenden, wurden durch heftiges Invertieren und Schütteln der Box ins Medium zurückgebracht.

Präparation von Pflanzenmaterial für die Mikroprojektilbombardierung

Ein aliquot der Zellsuspension wurde vorsichtig auf einem sterilen Filterpapier, unterstützt von festem CIM-Medium, in einer Petrischale plaziert. Die Petrischale mit dem Pflanzenmaterial wurde für 5 bis 7 Tage im Dunkeln gehalten. 4 Stunden vor der Behandlung wurde das Filterpapier mit den Zellen in frisches CIM mit 10% Sucrose überführt. Mikroprojektilbombardierung wurde wie in Beispiel 3 durchgeführt. 14 Stunden nach der Bombardierung wurde das Material in CIM mit 3% Sucrose überführt und im Dunkeln gehalten.

Transformantenselektion

2 bis 4 Stunden nach der Bombardierung wurde das Filterpapier mit den Zellen auf eine CIM- Schale mit dem richtigen Selektionsmittel (10 bis 15 µg/ml PPT) transferiert. Alle 7 Tage wurde das Material in frisches Selektionsmedium eingebracht. Die Schalen wurden im Dunkeln gehalten und nach ungefähr 6 Wochen wurde das Pflanzenmaterial auf Petrischalen transferiert mit Morphogenese-induzierendem Medium (MIM) (siehe Appendix), das ferner das richtige Selektionsmittel (10 bis 15 µg/ml PPT) enthielt. Die Platten wurden bei hoher Lichtdichte inkubiert, 16 Stunden pro Tag.

BEISPIEL 5 Transformation von Triticum monococcum mit dem promotorlosen LoxP-HPT-Gen

Das Konstrukt pIC052 (Fig. 4) wurde durch Verdau mit HindIII linearisiert, gelgereinigt, um unverdautes Material zu entfernen, und wie oben beschrieben für die Mikroprojektilbombardierung verwendet (siehe Beispiel 3). Der linearisierte Vektor enthält den pUC 19-Polylinker (57 bp), gefolgt von einer LoxP-Stelle vom 5'-Ende des HPT-Gens aus. Im allgemeinen liegen ungefähr 100 Basenpaare am 5'-Ende des Translationsstartkodons des HPT-Gens. 34 Schalen wurden transformiert und nach 1,5 Monaten Selektion auf Hyromycin enthaltendem Medium (Beispiel 3) wurden Hygromycin-resistente Kolonien erhalten. Die Sequenz der Integrationsstellen, erhalten mittels PCR, bestätigten die Unabhängigkeit aller drei Transformanten.

Appendix Samensterilisation

Die Samen werden mindestens 2 Stunden in 1% PPM-Lösung (vorzugsweise über Nacht) behandelt. Dann werden die Samen mit 70% EtOH 1 Minute lang gewaschen und mit 10% Chlorlösung mit 0,01% SDS oder Tween 20 in einem 250 ml-Kolben auf einem Rotationsschüttler sterilisiert. Dann werden die Samen in 0,5 l sterilem Wasser gewaschen.

TVL

0.3 M sorbitol
0.05 M CaCl₂

× 2H₂

O
pH 5.6-5.8

Enzyme solution

1% cellulase R10
0.2% macerase R10
0.1% dricelase
dissolved in 8 pM macrosalt with 0.5 M
pH 5.6-5.8

W5

18.4 g/L CaCl₂

× 2H₂

O
9.0 g/L NaCl
1.0 g/L glucose
0.8 g/L KCl
pH 5.6-5.8

PEG solution

40% (w/v) of PEG-2000 in H₂

O

CIM

Macro MS
Micro MS

MIM

Macro MS
Micro MS

Vitamin B5

MES: 500 mg/L
PVP: 500 mg/L
Sucrose: 30 g/L
2.4-D: 5 mg/L
Kin: 0.25 mg/L
Gelrite: 3 g/L
pH: 5.6-5.8

Vitamin B5

MES: 500 mg/L
PVP: 500 mg/L
Sucrose: 30 g/L
ABA: 1 mg/L
BA: 0.5 mg/L
IAA: 0.1 mg/L
Gelrite: 3 g/L
pH: 5.6-5.8

Greening Medium (GM)

Macro MS
Micro MS
Vit B5
MES: 500 mg/L
PVP: 500 mg/L
Sucrose: 30 g/L
BA: 2 mg/L
Kin: 0.5 mg/L
NAA: 0.1 mg/L
pH: 5.6-5.8

High Auxine Medium (HAM)

Macro MS
Micro MS
Vit B5
MES: 500 mg/L
PVP: 500 mg/L
Sucrose: 30 g/L
NAA: 5 mg/L
Kin: 0.25 mg/L
BA: 0.25 mg/L
pH: 5.6-5.8

Regeneration Medium

Macro MS
Micro MS
Vit B5
MES: 500 mg/L
PVP: 500 mg/L
Sucrose: 30 g/L
ABA: 1 mg/L
BA: 0.5 mg/L
IAA: 0.1 mg/L
pH: 5.6-5.8.

Hormonlösungen wurden filtersterilisiert und den autoklavierten Medien zugesetzt.

Claims

1. In einem Verfahren zur Erzeugung von transgenen Pflanzen oder Pflanzenzellen, die ein gewünschtes Merkmal exprimieren können, ein Verfahren zur Expression einer gewünschten Codiersequenz unter transkriptioneller und translationeller Kontrolle von Transkriptions- und Translationselementen des Zellkerns des Wirts, durch Einführen eines Vektors in das Kerngenom von Wirtspflanzen oder Pflanzenzellen für die transgenen Pflanzen oder Pflanzenzellen, wobei der Vektor die gewünschte Codiersequenz enthält, die frei ist von

a) einem stromaufwärts gelegenen Transkriptionsinitiationselement, das in den Wirtspflanzen oder den Pflanzenzellen funktionell ist und mit der gewünschten Codiersequenz funktionsfähig verknüpft ist und für seine Transkription nötig ist,
b) einem stromaufwärts gelegenen Translationsinitiationselement, das in den Wirtspflanzen oder den Pflanzenzellen funktionell ist und mit der gewünschten Codiersequenz funktionsfähig verknüpft ist, und

2. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Vektor weiterhin Spleißdonor- und/oder Spleißakzeptorstellen stromaufwärts und/oder stromabwärts der gewünschten Codiersequenz aufweist.

3. Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Vektor weiterhin ein oder mehrere Cistrons stromabwärts der gewünschten Codiersequenz aufweist, wobei die Cistrons mit der gewünschten Codiersequenz verbunden sind.

4. Das Verfahren nach Anspruch 3, wobei mindestens eines der Cistrons stromabwärts der gewünschten Codiersequenz funktionsfähig mit Transkriptions- und/oder Translationselementen verknüpft ist, die stromabwärts der gewünschten Codiersequenz liegen.

5. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Vektor ferner eine oder mehrere Sequenzen enthält, die für Leitsignalpeptide codieren, die funktionsfähig mit der gewünschten Codiersequenz oder den Cistrons verknüpft sind.

6. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Vektor ferner neben oder in der gewünschten Codiersequenz oder den Cistrons eine oder mehrere für proteolytische Spaltstellen codierende Sequenzen enhält.

7. Das Verfahren nach Anspruch 6, wobei die für proteolytische Spaltstellen codierenden Sequenzen autokatalytisch sind.

8. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die transgenen Pflanzen oder Pflanzenzellen genetisch verändert oder transfiziert sind, so dass sie ortsspezifische Proteasen, die für die Spaltung exprimierter Fusionsproteine nötig sind, bereitstellen.

9. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Vektor ferner einen oder mehrere Transkriptionsenhancer enthält, die mit der gewünschten Codiersequenz oder den Cistrons funktionsfähig gekoppelt sind.

10. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Vektor ferner einen oder mehrere Translationsenhancer enthält, die mit der gewünschten Codiersequenz oder den Cistrons funktionsfähig gekoppelt sind.

11. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der Vektor ferner eine oder mehrere Rekombinationsstellen enthält, die von ortsspezifischen Rekombinasen erkannt werden.

12. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei hybride messenger RNA entsteht, die von der Kern-DNA der transgenen Pflanzen oder Pflanzenzellen abgeleitete RNA und von der gewünschten Codiersequenz abgeleitete RNA enthält.

13. Das Verfahren nach Anspruch 12, wobei die hybride messenger RNA für mehrere heterologe Polypeptidsequenzen codiert.

14. Das Verfahren nach Anspruch 12, wobei die hybride messenger RNA zumindest teilweise zu einer messenger RNA in der transgenen Pflanze oder Pflanzenzelle komplementär ist.

15. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 12 oder 13, wobei die Translation der hybriden messenger RNA zu einem Fusionsprotein führt.

16. Das Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Fusionsprotein mehrere heterologe Polypeptidsequenzen umfasst.

17. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die gewünschte Codiersequenz pflanzlicher Herkunft ist.

18. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei der Vektor nur Funktionselemente pflanzlicher Herkunft enthält.

19. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die gewünschte Codiersequenz ferner frei von einem Transkriptionsterminationselement ist, das in den Wirtspflanzen oder den Pflanzenzellen funktionell ist und mit der gewünschten Codiersequenz funktionsfähig verknüpft ist.

20. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei die Expression der gewünschten Codiersequenz zur Polypeptidbildung führt.

21. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei die Expression der gewünschten Codiersequenz zur Bildung von RNA führt.

22. RNA erhalten durch Anwendung des Verfahrens eines der Ansprüche 1 bis 21.

23. Protein oder Polypeptid erhalten durch das Verfahren eines der Ansprüche 1 bis 20.

24. Pflanzenzellen oder Pflanzen und deren Nachkommen erhalten durch das Verfahren eines der Ansprüche 1 bis 21.

25. Verwendung von Pflanzenzellen oder Pflanzen gemäß Anspruch 24 zum Genetic Engineering.

26. Verwendung nach Anspruch 25, wobei das Genetic Engineering eine gezielte (targeted) Transformation umfasst.