DE10118160A1 - Chitosan enthaltende Mikropartikel - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Mikropartikel zur verzögerten Freisetzung eines physiologisch aktiven Wirkstoffs, die neben einem Wirkstoff und einer polymeren Matrix Chitosan enthalten. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung derartiger Mikropartikel.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Mikropartikel zur verzögerten Freisetzung eines physiologisch aktiven Wirkstoffs, die neben einem Wirkstoff und einer polymeren Matrix Chitosan enthalten. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung derartiger Mikropartikel.

Bei der Verabreichung von Arzneimitteln ist es oftmals wünschenswert, über einen längeren Zeitraum einen möglichst konstanten Plasmaspiegel des Wirkstoffs zu erhalten. Dies ist insbesondere dann schwer zu erreichen, wenn der entsprechende Wirkstoff im Körper schnell abgebaut oder ausgeschieden wird. Um wiederholte Applikationen in kurzen Zeitabständen zu vermeiden, wurden verschiedene Depotarzneiformen vorgeschlagen, die zum Ziel haben, über einen längeren Zeitraum eine möglichst konstante Menge an Wirkstoff freizusetzen. Derartige Depotarzneiformen haben oftmals die Form von Mikropartikeln, die parenteral verabreicht werden können, beispielsweise als Implantat oder durch subkutane Injektion. In der Regel umfassen derartige Arzneiformen eine Polymermatrix, in der der Wirkstoff verteilt ist ("microspheres"), oder einen wirkstoffhaltigen Kern, der von einer polymerhaltigen Schicht umgeben ist (Mikrokapseln).

EP 0 052 510 offenbart eine pharmazeutische Zusammensetzung in Mikrokapselform für die verzögerte Freigabe eines Arzneistoffes, worin die Zusammensetzung ein wasserlösliches Polypeptid, gegebenenfalls ein Polymerhydrolyse- Modifizierungsmittel und ein bioabbaubares Verkapselungspolymer umfaßt. Als Polymer wird Poly(lactid-co­ glykolid)-copolymer eingesetzt.

EP 0 145 240 offenbart eine Mikrokapsel mit verlängerter Freisetzung und ein Verfahren zu ihrer Herstellung. Demnach wird eine Wasser-in-Öl-Emulsion zubereitet, die eine innere wäßrige Schicht, die ein wasserlösliches Arzneimittel und eine dasselbe zurückhaltende Substanz enthält und eine Ölschicht umfaßt, die eine hochpolymere Substanz enthält, dann wird die genannte innere wäßrige Schicht auf eine Viskosität von nicht weniger als 5.000 Centipoise verdickt und schließlich die entstandene Emulsion einer "Trocknung in Wasser" unterworfen. EP 0 145 240 offenbart damit das sogenannte W/O/W-Verfahren zur Herstellung von Mikropartikeln.

Beim W/O/W-Verfahren wird zunächst eine den Wirkstoff enthaltende wäßrige Phase (W1) in einer organischen Lösung des Polymers (O) dispergiert, die entstehende W1/O-Emulsion wird dann in einer weiteren wäßrigen Phase (die sogenannte äußere Phase; W2) dispergiert. Das Polymer wird durch das Entfernen des organischen Lösungsmittels koazerviert und bildet Mikropartikel. Durch das jeweilige Dispergierverfahren kann die Partikelgröße beeinflußt werden. Die Entstehung der Mikropartikel hängt schließlich noch von der Möglichkeit des Abdampfens des Lösungsmittels ab. Deshalb wird das W/O/W- Doppelemulsionsverfahren auch als "solvent evaporation/­ extraction method/technique" bezeichnet. Nach Aushärten der Mikropartikel und Entfernen der Lösungsmittel erhält man Mikropartikel, die den Wirkstoff enthalten. Oft enthalten derartige Mikropartikel viskositätserhöhende Substanzen wie z. B. Gelatine.

Im Stand der Technik sind ebenfalls S/O/W-Verfahren bekannt, bei denen der Wirkstoff nicht in einer wäßrigen Lösung vorliegt, sondern als Feststoff (S). Der Feststoff wird dann direkt in der organischen Phase (O) dispergiert. Die weiteren Schritte entsprechen dem W/O/W-Verfahren.

Schließlich gibt es sogenannte S/O/O-Verfahren, bei denen die äußere Phase keine wäßrige Phase ist, sondern eine nicht­ wäßrige Phase, die ein Schutzkolloid oder einen Emulgator enthält.

Es ist wünschenswert, die an den Patienten zu verabreichende Menge an Mikropartikeln möglichst gering zu halten. Beispielsweise sollte das zu injizierende Volumen an Mikropartikeln möglichst gering sein, damit unter anderem die Schmerzen bei der Injektion geringer sind. Daher sollte der Wirkstoffgehalt in den Mikropartikeln möglichst hoch sein. Die Wirkstoffbeladung ist ein wichtiges Charakteristikum von Mikropartikeln. Man unterscheidet zwischen praktischem und theoretischem Beladungsgrad. Als Synonyme für den praktischen Beladungsgrad werden auch die Ausdrücke effektiver Beladungsgrad oder effektiver Wirkstoffgehalt verwendet. Der theoretische Beladungsgrad ist wie folgt definiert:

Dabei handelt es sich um die Masse der während der Herstellung eingesetzten Bestandteile. Der effektive Wirkstoffgehalt ist wie folgt definiert:

Das Verhältnis aus effektivem Wirkstoffgehalt und theoretischem Beladungsgrad wird als Verkapselungsausbeute bezeichnet. Die Verkapselungsausbeute ist ein wichtiger Prozeßparameter und ein Maß für die Effektivität des Verfahrens:

Ebenfalls ein bedeutendes Kriterium ist das Freisetzungsprofil der Mikropartikel. Die Wirkstofffreisetzung kann zeitlich grob in drei Phasen unterteilt werden. In einer anfänglichen "Burst"-Phase werden üblicherweise in relativ kurzer Zeit etwa 20 bis 30%, gegebenenfalls auch deutlich höhere Raten des in den Mikropartikeln enthaltenen Wirkstoffs freigesetzt. Zum Teil handelt es sich hierbei um Wirkstoff, der sich auf der oder nahe der Oberfläche der Partikel befindet. In der sich anschließenden "Lag"-Phase ist bei den bisher im Stand der Technik bekannten Zubereitungen die Wirkstofffreisetzung vernachlässigbar gering, insbesondere beim Einsatz von PLGA- Polymeren als Matrixbildner. Es wäre wünschenswert, daß während der "Lag"-Phase eine gewisse über den Freisetzungszeitraum konstante Wirkstoffabgabe erfolgt. In der abschließenden Phase der Bioerosion werden die Partikel hydrolysiert und geben so durch starken Massenverlust und Molekulargewichtsverlust verstärkt Wirkstoff frei.

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mikropartikel bereitzustellen, die vorteilhafte Eigenschaften bezüglich Wirkstoffbeladung und Freisetzungsprofil aufweisen.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß die Anwesenheit von Chitosan in Mikropartikeln signifikant höhere Beladungsgrade an Wirkstoff ermöglicht, als bei Mikropartikeln des Standes der Technik. Chitosan ist ein Polymer, das durch Deacetylierung von Chitin, einem in Insekten und Krebsen vorkommenden Polysaccharid, erhältlich ist. Es ist üblicherweise ein Polysaccharid mit einer linearen Kette, die aus 2-Amino-2-desoxy-β-D-glucopyranose (GlcN) aufgebaut ist, wobei die Monomere β-(1,4)-verknüpft sind (100% Deacetylierung). Bei einer unvollständigen Deacetylierung entstehen aber Chitosanpräparationen, die noch unterschiedliche Anteile an 2-Acetamido-2-desoxy-β-D- glucopyranose (GlcNAc) in der Polysaccharidkette aufweisen.

Polk et al. (1994) J. Pharm. Sci. 83, 178-185 offenbaren Mikrokapseln, die einen BSA-haltigen Kern aufweisen, der von einem Alginat-Chitosan-Polyelektrolytkomplex umhüllt ist. Die Mikrokapseln setzen das BSA aber bereits innerhalb von Stunden frei und besitzen einen großen Durchmesser. Sie sind daher beispielsweise für eine subkutane Anwendung ungeeignet.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit Mikropartikel zur verzögerten Freisetzung eines Wirkstoffs, enthaltend eine Polymermatrix, wenigstens einen physiologisch aktiven Wirkstoff und Chitosan, wobei die Polymermatrix nicht aus Chitosan, einem Derivat davon oder einem Chitosan-Alginat- Komplex besteht.

Die erfindungsgemäßen Mikropartikel haben üblicherweise einen Durchmesser von 1 bis 500 µm, vorzugsweise von 1 bis 200 µm, noch bevorzugter von 1 bis weniger als 150 µm, am bevorzugtesten von 1 bis 100 µm. Sie können im wesentlichen kugelförmig sein oder eine andere Form aufweisen. Falls die Partikel nicht kugelförmig sind, ist unter dem Durchmesser die größte räumliche Ausdehnung eines Partikels zu verstehen. Die Polymermatrix kann dabei als Hülle ausgebildet sein, die einen Kern umgibt, oder als ein den gesamten Partikel durchziehendes "Gerüst". Die Mikropartikel der vorliegenden Erfindung umfassen daher sowohl Partikel, die einen wirkstoffhaltigen Kern, umgeben von einer polymeren Schicht, aufweisen (Mikrokapseln), als auch Partikel, die eine Polymermatrix aufweisen, in der der Wirkstoff verteilt ist ("microspheres").

Bevorzugt besitzt das in den Mikropartikeln enthaltene Chitosan ein Molekulargewicht von 10.000 bis 2.000.000 Da, besonders bevorzugt von 40.000 bis 400.000 Da. Erfindungsgemäß kann das Chitosan in den Mikropartikeln verschiedene Deacetylierungsgrade aufweisen. Ein zu praktisch 100% deacetyliertes Chitosan enthält im wesentlichen nur noch GlcN und kein GlcNAc mehr. Vorzugsweise hat das erfindungsgemäße Chitosan einen Deacetylierungsgrad von 25 bis 100%, am bevorzugtesten von 50 bis 100%.

Das Gewichtsverhältnis von physiologisch aktivem Wirkstoff zu Chitosan in den Mikropartikeln ist vorzugsweise 1 : 0,01 bis 1 : 25, bevorzugter 1 : 0,01 bis 1 : 10, am bevorzugtesten 1 : 1. Das Verhältnis ist angegeben in Gew./Gew.

Als Polymere, die die Polymermatrix der Mikropartikel bilden, kommen alle bioabbaubaren und biologisch verträglichen Polymere in Frage. Diese können natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein. Beispiele für Polymere natürlichen Ursprungs sind Albumin, Gelatine, Carragen. Beispiele für synthetische Polymere, die in den erfindungsgemäßen Mikropartikeln enthalten sein können, sind Polymere aus Fettsäuren (z. B. Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Polyzitronensäure, Polyäpfelsäure, Polymilchsäurecaprolacton, usw.), Poly-α- cyanoacrylsäureester, Poly-β-hydroxybuttersäure, Polyalkylenoxalate (z. B. Polytrimethylenoxalat, Polytetramethylenoxalat; usw.), Polyorthoester, Polyorthocarbonate und andere Polycarbonate (z. B. Polyethylencarbonat, Polyethylenpropylencarbonat, usw.), Polyaminosäuren (z. B. Poly-γ-benzyl-L-glutaminsäure, Poly-L- alanin, Poly-γ-methyl-L-glutaminsäure, usw.), und Hyaluronsäureester, usw. Weitere bioverträgliche Copolymere sind Polystyrol, Polymethacrylsäure, Copolymere aus Acrylsäure und Methacrylsäure, Polyaminosäuren, Dextranstearat, Ethylcellulose, Acetylcellulose, Nitrocellulose, Maleinsäureanhydrid-Copolymere, Ethylen-Vinylacetat- Copolymere, wie Polyvinylacetat, Polyacrylamid, usw. Die genannten Polymere können allein oder in Kombination miteinander verwendet werden. Sie können in Form von Copolymeren oder als eine Mischung von zwei oder mehreren der Polymere verwendet werden. Auch ihre Salze können eingesetzt werden. Unter den genannten Polymeren sind Milchsäure/Glykolsäure-Copolymere (PLGA) bevorzugt. Bevorzugt sind PLGA-Polymere mit einer Zusammensetzung von 0 : 100 bis 100 : 0 Milchsäure zu Glykolsäure und einem Molekulargewicht von 2.000 bis 2.000.000 Da. Besonders bevorzugt sind PLGA-Polymere mit einem Molekulargewicht von 2.000 bis 200.000 Da und einem Verhältnis Milchsäure zu Glykolsäure von 25 : 75 bis 75 : 25 oder 50 : 50. Es können dabei auch L-PLA oder D,L-PLA oder Mischungen dieser oder Copolymere davon eingesetzt werden.

Als Wirkstoffe in den Mikropartikeln können alle physiologisch aktiven Wirkstoffe eingesetzt werden. Bevorzugt sollte es sich um wasserlösliche Substanzen handeln. Beispiele für Wirkstoffe, die verwendet werden können, sind Antibiotika, Impfstoffe, blutdrucksenkende Mittel, Substanzen zur Beeinflussung des Herz-Kreislauf-Systems, Substanzen gegen die Blutplättchenaggregation, Antitumormittel, Antipyretika, Analgetika, antiinflammatorische Substanzen, Antitussiva, Sedativa, Muskelrelaxantien, Antiulcerativa, Psychopharmaka, ZNS-Mittel, Antidepressiva, Antiallergika, Cardiotonika, Vasodilatatoren, blutdrucksenkende Diuretika, antidiabetische Substanzen, Antikoagulantien, Hämostatika, Antituberkulosemittel, Hormonpräparate, Kontrazeptiva, Hemmstoffe der Knochenresorption, Angiogeneseinhibitoren, usw. Üblicherweise werden als Wirkstoffe Peptide oder Proteine verwendet. Beispiele für mögliche Peptid- oder Proteinwirkstoffe sind Salmon-Calcitonin (sCT), Lysozym, Cytochrom C, Erythropoietin (EPO), luteinizing hormone releasing hormone (LHRH), Buserelin, Goserelin, Triptorelin, Leuprorelin, Vasopressin, Gonadorelin, Felypressin, Carbetocin, Rinderserumalbumin (BSA), Oxytocin, Tetanustoxoid, Bromocriptin, growth hormone releasing hormone (GHRH), Somatostatin, Insulin, tumor necrosis factor (TNF), colony stimulating factor (CSF), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), epidermal growth factor (EGF), nerve growth factor (NGF), Bradykinin, Urokinase, Asparaginase, Neurotensin, Substanz P, Kallikrein, gastric inhibitory polypeptide (GIP), growth hormone releasing factor (GRF), Prolactin, adrenocorticotropes Hormon (ACTH), thyrotropin releasing hormone (TRH), thyroid stimulating hormone (TSH), melanocyte stimulating hormone (MSH), Parathormon (LH), Gastrin, Glucagon, Enkephalin, bone morphogenetic protein (BMP), α-, β-, γ-Interferon, Angiotensin, Thymopoetin und thymic humoral factor (THF). Wirkstoffe, die Peptide bzw. Proteine sind, können aus einer natürlichen Quelle stammen oder aber rekombinant hergestellt und isoliert werden. Rekombinant hergestellte Wirkstoffe können sich von den entsprechenden nativen Wirkstoffen unterscheiden, beispielsweise in der Art und dem Umfang der posttranslationalen Modifikationen, aber auch in der Primärsequenz. Derart veränderte Wirkstoffe können andere Eigenschaften besitzen, wie veränderte pharmakologische Wirksamkeit, verändertes Ausscheidungsverhalten, usw. Alle derartigen "Varianten" natürlicher Wirkstoffe sind von der Erfindung umfaßt. Weitere mögliche Wirkstoffe sind Heparin und Nukleinsäuren wie DNA- und RNA-Moleküle. Die DNA-Moleküle können in linearer oder zirkulärer Form vorliegen. Es kann sich auch um Plasmide oder Vektoren, insbesondere Expressionsvektoren handeln. Ein Beispiel ist der in WO 98/51321 beschriebene Expressionsvektor pcDNA3. Schließlich sind auch virale Vektoren umfaßt, die zur Gentherapie eingesetzt werden. Dabei können auch Komplexe aus Chitosan, Natrium-Alginat oder anderen kationischen Polymeren, wie Polyethylenimin oder Poly(Lysin) oder anderen kationischen Aminosäuren eingesetzt werden. Die eingesetzte Nukleinsäure kann einzel- oder doppelsträngig sein. Einzelsträngige DNA kann beispielsweise in Form von Antisense-Oligonukleotiden verwendet werden. Es können auch "nackte" Nukleinsäurefragmente eingesetzt werden; in diesen Fällen ist die Nukleinsäure nicht mit anderen Stoffen verbunden.

Die Wirkstoffkonzentration in den Mikropartikeln ist unter anderem abhängig vom jeweiligen Wirkstoff und der Art der Behandlung, für die sie verwendet werden sollen. Peptid-/­ Proteinwirkstoffe werden in der Regel in einer Konzentration von 0,01 bis 30% eingesetzt, bevorzugt von 0,5 bis 15%, vor allem 2,5 bis 7,5%, bezogen auf die eingesetzte Polymermasse. Wirkstoffe zum Einsatz in der Gentherapie, vornehmlich DNA/RNA und entsprechende Komplexe dieser Wirkstoffe, werden in der Regel in einer Konzentration von 0,001% bis 15% eingesetzt, bevorzugt 0,001% bis 7,5%, vor allem 0,001 bis 2,5%.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Mikropartikeln zur verzögerten Freisetzung eines Wirkstoffs. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß eine den Wirkstoff und Chitosan enthaltende Zusammensetzung bereitgestellt wird, die den Wirkstoff und Chitosan enthaltende Zusammensetzung dann zu einer organischen Lösung eines Polymers gegeben wird und darin dispergiert wird. Die daraus entstehende Emulsion oder Dispersion wird in die äußere Phase gegeben und darin dispergiert.

Üblicherweise wird Chitosan mit einem Molekulargewicht von 10.000 bis 2.000.000 Da verwendet, vorzugsweise mit 40.000 bis 400.000 Da. Meist wird das Chitosan in einer 0,001% bis 70%igen Essigsäure gelöst, bevorzugt in einer 0,01% bis 10%igen Essigsäure (m/m). Erfindungsgemäß können die Partikel durch W/O/W-, S/O/W- oder S/O/O-Verfahren hergestellt werden. Die Konzentration von Chitosan in der inneren Phase beim W/O/W-Verfahren ist im allgemeinen 0,01% bis 50% Chitosan, bezogen auf die Polymermasse, bevorzugt aber 0,01% bis 25% Chitosan, bezogen auf die Polymermasse. Das Gewichtsverhältnis von physiologisch aktivem Wirkstoff zu Chitosan sollte 1 : 0,01 bis 1 : 25, bevorzugt 1 : 0,1 bis 1 : 10, am bevorzugtesten 1 : 1, sein. Wird das S/O/W-Verfahren angewendet, sollte eine Konzentration von Chitosanwirkstoffkomplex von 0,01% bis 50%, bevorzugt 0,1% bis 25%, bezogen auf die Polymermasse, eingesetzt werden.

Wird das erfindungsgemäße Verfahren als W/O/W-Verfahren durchgeführt, dann ist die Zusammensetzung, die den Wirkstoff und Chitosan enthält, eine wäßrige Lösung. Hierbei wird das Chitosan üblicherweise in Essigsäure vollständig gelöst. Das Peptid oder der Wirkstoff wird entweder simultan mit dem Chitosan zusammen in Essigsäure gelöst oder zunächst in Wasser gelöst und dann mit dem gelösten Chitosan dispergiert. Dieses Chitosanwirkstoffgel wird dann direkt in die organische Polymerlösung dispergiert. Die entstehende W1/O- oder Primäremulsion wird dann in die gegebenenfalls ein Schutzkolloid enthaltende äußere wäßrige Phase (W2) eingespritzt und mit üblichen Hilfsmitteln dispergiert. Nach diesem Schritt entsteht die Doppelemulsion oder W1/O/W2- Emulsion. Nach einer Aushärtungsphase meist unter Rühren und Atmosphärendruck, werden die entstandenen Mikropartikel von der äußeren wäßrigen Phase separiert und können danach lyophilisiert werden. Bei großem W1-Volumen und niedriger Viskosität der Polymerlösung werden beim W/O/W-Verfahren Mikrokapseln erhalten. Beispielsweise würde ein Volumenverhältnis W1 : O : W2 von 1 : 10 : 1000 zur Bildung von "microspheres" führen, ein Volumenverhältnis von 9 : 10 : 1000 zur Bildung von Mikrokapseln.

Die Zusammensetzung, die den Wirkstoff und Chitosan enthält, kann aber auch in Feststofform vorliegen. Dabei wird der Wirkstoff in fester Form direkt in die organische Polymerlösung dispergiert. Die weiteren Herstellungsschritte entsprechen denen des W/O/W-Verfahrens. In einer besonderen Ausführungsform werden der Wirkstoff und Chitosan zunächst in Essigsäure gelöst und sprühgetrocknet. Dieses feste Pulver kann dann direkt in die organische Polymerlösung dispergiert werden. Durch weitere Verfahrensschritte kann somit entweder ein S/O/W- oder ein S/O/O-Verfahren zur Anwendung kommen.

Als Wirkstoffe können die oben angeführten Wirkstoffe in den entsprechenden Konzentrationen verwendet werden.

Die organische, nicht mit Wasser mischbare Phase dient zum Lösen des biologisch abbaubaren Polymers. Dabei wird das Polymer in einem geeigneten organischen Lösungsmittel gelöst, in dem der Wirkstoff nicht löslich ist. Beispiele für derartige organische Lösungsmittel sind Ethylacetat, Aceton, Dimethylsulfoxid, Toluol, Chloroform, Ethanol, Methanol, usw. Besonders bevorzugt ist Dichlormethan. Die Konzentration des Polymers in der organischen Phase ist üblicherweise höher als 5% (w/v), bevorzugt 5 bis 50%, am bevorzugtesten 15 bis 40%. Als Polymere können die obenstehend genannten, biologisch abbaubaren und verträglichen Polymere eingesetzt werden. Die organische Phase kann auch mehrere verschiedene Polymere enthalten.

In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die äußere Phase eine wäßrige Lösung (W2). Diese wäßrige Lösung kann einen Emulgator oder ein Schutzkolloid enthalten. Beispiele für Schutzkolloide sind Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenglykol, usw. Bevorzugt ist Polyvinylalkohol. Beispielsweise können verschiedene von der Firma Clariant erhältliche Polyvinylalkohole eingesetzt werden wie Mowiol® 18-88, Mowiol® 4-88, Mowiol® 47-88 oder Mowiol® 20-98. Die Schutzkolloide werden üblicherweise in einer Konzentration von 0,01% bis 10% eingesetzt, bevorzugt sind 0,01% bis 5%. Das Molekulargewicht der Schutzkolloide kann zwischen 2.000 und 1.000.000 Da, bevorzugt zwischen 2.000 und 200.000 Da, liegen. Die Volumina von W1/O-Primäremulsion und äußerer Phase sollten ein Verhältnis von 1 : 5 bis 1 : 1.000 zueinander aufweisen.

Alternativ kann als äußere Phase auch eine sogenannte "ölige" Phase zum Einsatz kommen, die nicht mit der Primäremulsion mischbar ist ("W/O/O- bzw. S/O/O-Verfahren"). Beispielsweise können Silikonöl oder Paraffinöl eingesetzt werden, die einen Emulgator und/oder ein Schutzkolloid enthalten. Im Gegensatz zum Einsatz einer wäßrigen äußeren Phase muß bei Verwendung einer "öligen" äußeren Phase ein Emulgator oder Schutzkolloid enthalten sein. Beispiele für Emulgatoren in der äußeren öligen Phase sind Span, Tween oder Brij, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,01 bis 10 Gew.-%.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Arzneimittel, das die erfindungsgemäßen Mikropartikel, gegebenenfalls mit pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen, umfaßt.

Die erfindungsgemäßen Mikropartikel haben nicht nur den Vorteil, daß der Beladungsgrad mit Wirkstoff gegenüber Mikropartikeln aus dem Stand der Technik signifikant erhöht ist, auch das Freisetzungsprofil ist positiv beeinflußt. Durch die Zugabe von Chitosan kommt es zu Beginn der Freisetzung zu einem geringeren "Burst" als bei Mikropartikeln ohne den Zusatz von Chitosan und im weiteren Verlauf der Freisetzung kommt es zu einer konstanten Wirkstoffabgabe. Durch die erfindungsgemäßen Mikropartikel ist eine Wirkstofffreisetzung über Wochen und sogar Monate möglich. Sie eignen sich daher insbesondere für eine subkutane/intramuskuläre Applikation.

Fig. 1a) zeigt die kumulative Freisetzung von Lysozym in Prozent des gesamten in den Mikropartikeln enthaltenen Lysozyms (Beispiel 6a)). Fünf verschiedene Mikropartikelpräparationen wurden miteinander verglichen. Es wurden Chitosan enthaltende Mikropartikel untersucht, die nach dem W/O/W- oder dem S/O/W-Verfahren hergestellt waren. Diese wurden verglichen mit auf gleiche Weise, aber ohne Chitosanzusatz hergestellten Mikropartikeln und mit Mikropartikeln, die gemäß dem in EP 0 145 240 offenbarten Verfahren hergestellt waren und Gelatine enthielten.

Fig. 1b) zeigt einen vergrößerten Ausschnitt von Fig. 1a).

Fig. 1c) zeigt die kumulative Freisetzung von Lysozym in Prozent des gesamten in den Mikropartikeln enthaltenen Lysozyms (Beispiel 6b)). Es wurden vier Mikropartikelpräparationen mit hohen Chitosangehalten miteinander verglichen, die durch das W/O/W-Verfahren hergestellt worden waren.

Fig. 2 zeigt die nach 100 h freigesetzte Menge an Lysozym in µg. Es wurden durch das W/O/W-Verfahren hergestellte Mikropartikel mit Chitosan, mit Gelatine und ohne Zusatz untersucht.

Fig. 3 zeigt die nach 100 h freigesetzte Menge an Lysozym in µg. Es wurden durch das S/O/W-Verfahren hergestellte Mikropartikel mit und ohne Chitosan untersucht.

Fig. 4 zeigt die nach 500 h freigesetzte Menge an Lysozym in µg. Es wurden durch das W/O/W-Verfahren hergestellte Mikropartikel mit Chitosan, mit Gelatine und ohne Zusatz untersucht.

Fig. 5 zeigt die nach 500 h freigesetzte Menge an Lysozym in µg. Es wurden durch das S/O/W-Verfahren hergestellte Mikropartikel mit und ohne Chitosan untersucht.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.

Beispiel 1 W/O/W-Verfahren mit Chitosan

Verschiedene Konzentrationen an Chitosan wurden in Essigsäure gelöst, und das entstandene Chitosangel wurde mit verschiedenen Konzentrationen an Lysozym oder sCT mittels W/O/W-Verfahren verkapselt. Die Chitosanwirkstofflösung wurde in 5,7 ml Dichlormethanlösung, die 35% (2 g) PLGA-Polymer (RG 503 H von der Firma Boehringer Ingelheim) enthält, gegeben und für 60 Sekunden bei 13.500 U/min mit einem SN-10 G Ultraturraxwerkzeug emulgiert. Die so hergestellte W1/O- oder Primäremulsion wurde dann zu 300 ml 0,1% wäßriger PVA-Lösung (temperiert auf 5°C) gegeben und für 60 Sekunden bei 13.500 U/min in einem SN-18 G Ultraturraxwerkzeug emulgiert. Anschließend erfolgte eine dreistündige Aushärtung der Mikropartikel in einem 600 ml Becherglas bei 240 U/min (Rührwerk mit Propellerrührer). Die Mikropartikel wurden 3 Minuten bei 2.500 U/min zentrifugiert und die W2-Phase abdekantiert. Die Mikropartikel wurden durch Filtration über eine Nutsche mit einer Glasfritte Pore 4 gewonnen. Schließlich wurden die Mikropartikel mindestens 72 Stunden bei -80°C und 0,01 mbar Vakuum und Nachtrocknung bei 10°C lyophilisiert. Die lyophilisierten Mikropartikel können bei -30°C mit Blaugel in eine PE-Folie eingeschweißt gelagert werden.

• a) Es wurden 100 mg Low Molecular Chitosan (MW = 150.000) in 4 ml 1% Essigsäure gelöst und 1,33 g dieses Chitosangels in 0,5 ml einer 200 mg/ml Calcitoninlösung dispergiert. Dabei wurde ein theoretischer Wirkstoffgehalt von 5,82% eingesetzt und eine Verkapselungsausbeute von 63% mit einem praktischen Wirkstoffgehalt von 3,66% erreicht.
• b) Es wurden 110 mg Low Molecular Chitosan und 110 mg Lysozymlyophilisat in 12 ml 1% Essigsäure bis zur Klarheit gelöst und 3 g dieses Chitosanlysozymgels direkt in die organische Phase dispergiert. Dies entspricht bezogen auf die Masse einer theoretischen Beladung an Chitosan von 4,85%. Es wurde ein theoretischer Wirkstoffgehalt von 4,94% eingesetzt und eine Verkapselungsausbeute von 90,8% mit einem praktischen Wirkstoffgehalt von 4,48% erzielt.
• c) Es wurde 33 mg High Molecular Chitosan (MW = 600.000) und 33 mg Lysozym in 12 ml 1% Essigsäure gelöst und 1 g dieses Chitosanlysozymgels direkt in die organische Phase dispergiert. Dies entspricht bezogen auf die Masse einer theoretischen Beladung an Chitosan von 1,6%. Es wurde ein theoretischer Wirkstoffgehalt von 1,54% eingesetzt und eine Verkapselungsausbeute von 100% mit einem praktischen Wirkstoffgehalt von 1,57% erzielt.
• d) Es wurden 100 mg High Molecular Chitosan (MW = 600.000) in 4 ml 1% Essigsäure gelöst, und in 2 g dieses Chitosangels wurde 124 mg Salmon-Calcitonin (sCT) dispergiert. Es wurde ein theoretischer Wirkstoffgehalt von 5,68% eingesetzt und eine Verkapselungsausbeute von 72,42% mit einem praktischen Wirkstoffgehalt von 4,11% erreicht.
• e) Es wurden 25 mg Low Molecular Chitosan und 85 mg Lysozymlyophilisat in 1% Essigsäure gelöst und 2 g dieses Chitosanlysozymgels direkt in die organische Phase dispergiert. Dies entspricht bezogen auf die Masse einer theoretischen Beladung an Chitosan von 1,18%. Es wurde ein theoretischer Wirkstoffgehalt von 3,7% eingesetzt und eine Verkapselungsausbeute von 80% mit einem praktischen Wirkstoffgehalt von 2,95% erreicht.

Bei allen Chargen zeigten sich schon durch den Zusatz von Chitosan in der W1-Phase sehr hohe effektive Wirkstoffbeladungen, sowohl beim Lysozym als auch beim sCT, die sehr viel höher liegen, als die vergleichbaren W/O/W- Ansätze ohne Chitosanzusatz oder auch Ansätze mit dem Zusatz an Gelatine (vgl. Beispiele 2 und 3).

Es wurden weitere Mikropartikel mit noch höherem Chitosanzusatz hergestellt:

• a) Es wurden 500 mg Low Molekular Chitosan (Mw = 150000) und 500 mg Lysozym in 12,5 g 2% Essigsäure gelöst. 2,75 g dieses Chitosangels mit dem enthaltenen Wirkstoff wurde direkt in die organische Polymerlösung dispergiert und diese Primäremulsion in die äußere Phase zu einer Doppelemulsion dispergiert. Die Doppelemulsion wird einer in Wassertrocknung unterzogen. Dabei wurde ein theoretischer Wirkstoffgehalt von 4,6% eingesetzt und eine Verkapselungsausbeute von 86% mit einem praktischen Wirkstoffgehalt von 3,95% erreicht (Ansatz "Lys 230300A").
• b) Es wurden 1 g Low Molekular Chitosan (Mw = 150000) und 1 g Lysozym in 25 g 2% Essigsäure gelöst. 5,4 g dieses Chitosangels mit dem enthaltenen Wirkstoff wurde direkt in die organische Polymerlösung dispergiert und diese Primäremulsion in die äußere Phase zu einer Doppelemulsion dispergiert. Die Doppelemulsion wird einer in Wassertrocknung unterzogen. Dabei wurde ein theoretischer Wirkstoffgehalt von 8,3% eingesetzt und eine Verkapselungsausbeute von 60% mit einem praktischen Wirkstoffgehalt von 4,98% erreicht (Ansatz "Lys 230300B").
• c) Es wurden 500 mg Low Molekular Chitosan (Mw = 150000) und 500 mg Lysozym in 12,5 g 2% Essigsäure gelöst. 8,2 g dieses Chitosangels mit dem enthaltenen Wirkstoff wurde direkt in die organische Polymerlösung dispergiert und diese Primäremulsion in die äußere Phase zu einer Doppelemulsion dispergiert. Die Doppelemulsion wird einer in Wassertrocknung unterzogen. Dabei wurde ein theoretischer Wirkstoffgehalt von 11,53% eingesetzt und eine Verkapselungsausbeute von 74% mit einem praktischen Wirkstoffgehalt von 8,53% erreicht. Dies entspricht einer theoretischen Beladung an Chitosan von 11,53% (Ansatz "Lys 230300C").
• d) Es wurden 400 mg Low Molekular Chitosan (Mw = 150000) und 135 mg Lysozym in 12,5 g 2% Essigsäure gelöst. 6,6 g dieses Chitosangels mit dem enthaltenen Wirkstoff wurde direkt in die organische Polymerlösung dispergiert und diese Primäremulsion in die äußere Phase zu einer Doppelemulsion dispergiert. Die Doppelemulsion wird einer in Wassertrocknung unterzogen. Dabei wurde ein theoretischer Wirkstoffgehalt von 8,89% eingesetzt und eine Verkapselungsausbeute von 74% mit einem praktischen Wirkstoffgehalt von 6,57% erreicht (Ansatz "Lys 230300D").

Methode zur Bestimmung der Wirkstoffbeladung der Mikropartikel

Die Bestimmung der Wirkstoffbeladung der Mikropartikel erfolgte nach der modifizierten Methode von Sah et al. (A new strategy to determine the actual Protein Content of Poly(lactide-co-glycolide) Microspheres; Journal of Pharmac. Sciences; 1997; 86; (11); S. 1315-1318). Die Mikropartikel werden in einer Lösung von DMSO/0,5% SDS/0,1 N NaOH gelöst, anschließend wird aus dieser Lösung ein BCA-Assay (Lowry et al. Protein measurement with the Folin Phenol Reagent; J. Biol. Chem.; 193; S. 265-275; 1951) durchgeführt. Damit wird der effektive Beladungsgrad der Mikropartikel bestimmt.

Beispiel 2 W/O/W-Verfahren mit Gelatine

Gelöstes Peptid in Wasser oder Puffer wird zu einer Gelatinelösung gegeben und gemischt. Diese Peptid-haltige Gelatinelösung wird zu dem gelösten Polymer in Dichlormethan gegeben und mit herkömmlichen Zahnkranz-Dispergiermaschinen (Utraturrax) oder Hochdruckhomogenisatoren dispergiert. Die weitere Verarbeitung erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben.

Beispielsweise wurden 0,5 ml einer 20%igen Gelatinelösung mit 0,5 ml einer 200 mg/ml wäßrigen Lysozymlösung gemischt. Zur Herstellung der Gelatinelösung wurde die Gelatine 4 h bei 60°C gelöst und vor der Mikroverkapselung auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Die Lysozym-haltige Gelatinelösung wurde dann zu dem gelösten Polymer in der organischen Lösung gegeben und wie unter Beispiel 1 beschrieben weiterverarbeitet.

Hieraus ergab sich bei einer theoretischen Wirkstoffbeladung von 2% Lysozym eine Verkapselungsausbeute von 92% und ein effektiver Wirkstoffgehalt von 1,85%.

Beispiel 3 W/O/W-Verfahren ohne Chitosan

Zur Herstellung von Mikropartikeln ohne Chitosanzusatz wurden verschiedene Konzentrationen an Wirkstoff mittels W/O/W- Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben verkapselt, wobei aber kein Chitosan hinzugefügt wurde. Beispielsweise wurden 2 g PLGA-Polymer in 5,7 ml Dichlormethan gelöst und diese Lösung wie in Beispiel 1 beschrieben weiterverarbeitet.

• a) 100 mg Lysozym wurden in 1 ml Wasser gelöst und in der organischen Polymerlösung dispergiert. Dabei wurde bei einem theoretischen Beladungsgrad von 5% eine Verkapselungsausbeute von 57% mit einem effektiven Beladungsgrad von 2,88% gefunden.
• b) 40 mg Lysozym wurden in 1 ml Wasser gelöst und in der organischen Polymerlösung dispergiert. Dabei wurde bei einem theoretischen Beladungsgrad von 2% eine Verkapselungsausbeute von 95% und ein effektiver Wirkstoffgehalt von 1,9% erzielt.

Beispiel 4 S/O/W-Verfahren mit Chitosan Ansatz A

2 g LMW Chitosan (ca. 150.000 Da) und 1 g Lysozym wurden 4 Stunden in 265 ml 2% Essigsäure gelöst. Diese wurden dann mit einem Büchi 190 Mini Spray Dryer versprüht (Flow Indicator: 700, Pump Control: 5, Aspirator Control: 20, Heating Control: 8,5).

Bei Ansatz A wurden 300 mg des sprühgetrockneten Komplexes in 5,7 ml organische Polymerlösung (2 g RG 503 H in Dichlormethan) dispergiert. Die weitere Verarbeitung erfolgte wie für das W/O/W-Verfahren in Beispiel 1 dargestellt.

Ansatz B

Bei Ansatz B wurden 1 g LMW Chitosan und 1 g Lysozym in 350 ml 2% Essigsäure gelöst und anschließend unter den gleichen Bedingungen versprüht wie bei Ansatz A.

200 mg des sprühgetrockneten Komplexes wurden in die Polymerphase dispergiert. Die weitere Bearbeitung erfolgte wie für das W/O/W-Verfahren dargestellt.

Bei den nach Ansatz A hergestellten Mikropartikeln ergab sich ein effektiver Wirkstoffgehalt von 1,86% Lysozym und eine theoretische Beladung von 8,7% LMW Chitosan. Für die nach Ansatz B hergestellten Mikropartikel ergab sich ein effektiver Wirkstoffgehalt von 2,72% Lysozym und eine theoretische Beladung von 4,54% LMW Chitosan. Die Mikropartikel nach Ansatz A zeigten einen höheren "Burst", eine höhere kontinuierliche Freigabe und höhere Freigaberaten in freigesetzter Peptidmenge pro Zeiteinheit.

Vergleicht man den sprühgetrockneten Chitosan-Lysozymkomplex im S/O/W-Verfahren gegen den Chitosanzusatz im W/O/W- Verfahren, so sieht man, daß es hier zu einer vergleichbaren initialen Freisetzung kommt, aber der sprühgetrocknete Komplex ca. 6% Wirkstoff zusätzlich freisetzt bis zu einer Marke von 600 h (siehe Fig. 1a) S/O/W mit Chitosan und W/O/W mit Chitosan), obwohl hier der effektive Wirkstoffgehalt nur bei 1,86% gegenüber 4,48% beim Chitosanzusatz im W/O/W liegt. Um die Zunahme der Beladung beim S/O/W-Verfahren beurteilen zu können, muß man dies mit Chargen ohne Chitosan vergleichen. Dort liegen die Verkapselungsausbeuten beim Standard-S/O/W nur zwischen 20 und 50%, und es wurden keine effektiven Beladungsgrade über 1% erzielt. Dies ist bedingt durch die hohen Verluste während der Herstellung. Mit dem Zusatz von sprühgetrocknetem Chitosan-Lysozym konnten hier die Verkapselungsausbeuten auf 69% gesteigert werden, bei Erzielung einer effektiven Wirkstoffbeladung von bis zu 2,72%. Vergleicht man die Zusätze von Chitosan in Bezug auf die Gesamtmasse an Polymer und Wirkstoff, so ergibt sich für den 300 mg Chitosan-Lysozymkomplex eine theoretische Beladung von 8,7% Chitosan und für den 200 mg Chitosan-Lys-Komplex eine theoretische Beladung von 4,54%. Im W/O/W-Verfahren waren dies ca. 6% Chitosan.

Beispiel 5 S/O/W-Verfahren ohne Chitosan

Zur Herstellung von Mikropartikeln nach dem S/O/W-Verfahren ohne Chitosanzusatz würde der Wirkstoff in lyophilisierter bzw. sprühgetrockneter Form wie in Beispiel 4 beschrieben in eine organische Polymerlösung dispergiert, wobei aber kein Chitosanzusatz erfolgte.

Es wurden 40 mg Lysozym in 2 g RG 503 H (5,7 ml Dichlormethan) dispergiert. Die weitere Verarbeitung erfolgt wie für das W/O/W-Verfahren in Beispiel 1 dargestellt. Dabei wurde bei einer theoretischen Beladung von 2% eine Verkapselungsausbeute von 39% und eine effektive Wirkstoffbeladung von 0,8% erzielt. Diese niedrigen Verkapselungsausbeuten sind durch die hohen Verluste bei dieser Herstellungsvariante bedingt.

Beispiel 6 (Fig. 1)

• a) Es wurden fünf verschiedene Mikropartikelpräparationen mit Lysozym hergestellt:
  • - nach dem W/O/W-Verfahren mit Chitosan gemäß Beispiel 1b)
  • - nach dem W/O/W-Verfahren ohne Chitosan gemäß Beispiel 3b)
  • - nach dem W/O/W-Verfahren mit Gelatine gemäß Beispiel 2
  • - nach dem S/O/W-Verfahren mit Chitosan gemäß Beispiel 4, Ansatz A
  • - nach dem S/O/W-Verfahren ohne Chitosan gemäß Beispiel 5

Es wurde die kumulative Freisetzung von Lysozym in % des gesamten in den Mikropartikeln enthaltenen Lysozyms untersucht.

Zur Bestimmung der Wirkstofffreisetzung aus den Mikropartikeln wurden je 20 mg Mikropartikel eingewogen (je Charge ein Dreifachansatz). Die Mikropartikel wurden in Pyrexgläser, die einen Schottstopfen GL18-Gewinde mit Teflondichtung aufweisen, gegeben. Die Mikropartikel wurden mit je 5 ml Mac.Ilvaine- Whiting Freisetzungspuffer (Zusammensetzung s. u.) versetzt.

Anschließend wurden die Proben in das Freisetzungsgerät gesetzt (6 U/min. 37°C). Die erste Probe wurde nach circa zwei Stunden entnommen, die zweite nach circa sechs Stunden, die dritte nach circa 24 Stunden, die vierte nach 48 Stunden und die weiteren im Abstand von jeweils drei Tagen. Die Pyrexgläser wurden in der Heraeuszentrifuge bei 3000 U/min 3 Minuten zentrifugiert, anschließend wurde mit einer Pasteurpipette der überstehende Puffer möglichst vollständig abgezogen. Danach wurde wiederum 5 ml Puffer in die Gläser gegeben, und die Proben wurden wieder ins Freisetzungsgerät eingesetzt. Der Puffer sollte vor Licht geschützt und bei 4°C im Kühlschrank gelagert werden.

Zusammensetzung des Mac.Ilvaine-Whiting Freisetzungspuffers:
94 ml 0,1 M Zitronensäure + 906 ml 0,2 M Dinatriumhydrogenphosphat
0,01% Tween 20 für die Molekularbiologie
0,025% Natriumazid
ad 1,0 l destilliertes Wasser

Der pH muß gegebenenfalls mit 0,1 M NaOH auf pH 7,4 eingestellt werden.

Die abpipettierte Peptidlösung aus den Eppendorf-Gefäßen oder den Pyrexgläsern wurde in 4 ml HPLC-Vials mit durchstechbarer Teflondichtung und Drehverschluß überführt und entweder sofort per HPLC analysiert oder bei -30°C aufbewahrt. Die Proben wurden dann vor der HPLC-Analyse zwei Stunden bei Raumtemperatur aufgetaut und dabei mehrfach per Hand kurz geschüttelt. Es wurde auf eine vollständig klare Lösung nach dem Auftauen geachtet.

Die HPLC-Analyse erfolgte auf einer Waters HPLC mit W600- Pumpe, 717 Autosampler, Satin 474 Fluoreszenzdetektor und Millenium 3.15 Software. Die Einstellungen für Lysozym waren:

• - Flußgeschwindigkeit 1 ml/min
• - Puffer A = 0,1% TFA (Trifluoressigsäure) in Wasser,
  Puffer B = 0,1% TFA in Acetonitril
• - Gradient: 80% A, 20% B in 10 Minuten auf 60% A, 40% B; bis 12 Minuten auf 80% A, 20% B
• - Anregungswellenlänge = 280 nm,
  Emissionswellenlänge = 340 nm bei Gain = 100,
  256 Attention und STD
• - Säulenofentemperierung 40°C
• - Säule: TSK Gel RP 18, NP; 5 µm; 35 mm × 4,6 mm
• - Die Fließmittel wurden vorher per Helium oder Ultraschall entgast und während der Analytik mittels Degaser entgast.
• - Pro Sampleset wurden Standardreihen von 0,05 bis 4 µg Lysozym/ml Freisetzungspuffer bei 100 µl Injektionsvolumen und 10 bis 100 µg Lysozym/ml Freisetzungspuffer bei 10 µl Injektionsvolumen als Standard analysiert

Bei der Analyse von Calcitonin wurde entsprechend vorgegangen, mit folgenden Modifikationen:

• - Anregungswellenlänge = 280 nm,
  Emissionswellenlänge = 330 nm, Gain = 1000
• - Gradient: 80% A, 20% B; in 5 Minuten auf 60%A, 40% B; 1 Minute halten; bis 7,5 Minuten auf 50% A, 50% B

Das Ergebnis ist in den Fig. 1a) und 1b) dargestellt. Fig. 1b) zeigt einen vergrößerten Ausschnitt von Fig. 1a). Durch den Zusatz von Chitosan zu den Mikropartikeln ist die Wirkstofffreisetzung während der sogenannten "Burst"-Phase im Vergleich zu Mikropartikeln mit Gelatine oder ohne Zusatz deutlich erniedrigt (Fig. 1b)). Außerdem findet im weiteren Verlauf der Freisetzung während der sogenannten "Lag"-Phase eine konstante Wirkstoffabgabe mit einer Kinetik erster Ordnung aus den Mikropartikeln mit Chitosanzusatz statt (Fig. 1a)). Demgegenüber ist die Wirkstofffreisetzung bei Mikropartikeln ohne Zusatz von Chitosan während der "Lag"- Phase vernachlässigbar gering. Es findet nahezu keine meßbare Wirkstofffreisetzung statt.

• a) Ebenfalls wurde die kumulative Freisetzung von Wirkstoff in % des gesamten in den Mikropartikeln enthaltenen Wirkstoffs für die gemäß Beispiel 1f) bis 1) hergestellten Mikropartikel bestimmt. Das Ergebnis ist in Fig. 1c) dargestellt. Auch hier zeigen die erfindungsgemäßen Mikropartikel eine Freisetzungskinetik 1. Ordnung in der "lag-Phase".

Beispiel 7 (Fig. 2, 3, 4 und 5)

Es wurden fünf verschiedene Mikropartikelpräparationen wie in Beispiel 6a) beschrieben hergestellt.

Es wurde die insgesamt freigesetzte Menge an Wirkstoff nach 100 h (Fig. 2 und 3) und nach 500 h (Fig. 4 und 5) bestimmt.

Beim Vergleich der durch W/O/W-Verfahren hergestellten Mikropartikel zeigt sich, daß Mikropartikel mit Chitosan nach 100 h (Fig. 2) und nach 500 h (Fig. 4) eine größere Wirkstoffmenge freigesetzt haben als Mikropartikel ohne Chitosan oder Mikropartikel mit Gelatine.

Auch bei nach dem S/O/W-Verfahren hergestellten Mikropartikeln zeigen die Partikel mit Chitosan eine höhere Menge an insgesamt freigesetztem Wirkstoff als Partikel ohne Chitosan. Das gilt sowohl für die Freisetzung nach 100 h (Fig. 3) als auch nach 500 h (Fig. 5).

Beispiel 8 W/O/W-Verfahren mit Chitosan

Verschiedene Konzentrationen an Chitosan wurden in Essigsäure gelöst, und das entstandene Chitosangel wurde mit verschiedenen Konzentrationen an DNA-Lösung mittels W/O/W- Verfahren verkapselt. Es wurden 1 g Chitosan und 100 mg Plasmid in 25 g 1% Essigsäure und/oder Pufferlösung, wie z. B. TRIS-Puffer oder TRIS-EDTA-Puffer, gelöst. 5 g dieses Chitosangels mit dem enthaltenen Wirkstoff wurde direkt in die organische Polymerlösung dispergiert und diese Primäremulsion in die äußere Phase zu einer Doppelemulsion dispergiert, entsprechend dem Verfahren nach Beispiel 1.

Beispiel 9 S/O/W-Verfahren mit Chitosan

Zur Herstellung von Mikropartikeln nach dem S/O/W-Verfahren mit Chitosanzusatz wurde DNA zusammen mit Chitosan gelöst und anschließend versprüht. Die weitere Verarbeitung erfolgte wie für das W/O/W-Verfahren in Beispiel 1 dargestellt. Dabei kamen die Einstellungen des Büchi Mini Spray Dryers aus Beispiel 4 Ansatz A zum Einsatz. Es wurden 1 g Chitosan und 100 mg Plasmid in 350 ml 2% Essigsäure gelöst und anschließend unter den gleichen Bedingungen versprüht, wie in Beispiel 4, Ansatz A. 200 mg des sprühgetrockneten Komplexes wurden in die organische Polymerphase dispergiert. Die weitere Bearbeitung erfolgte wie für das W/O/W-Verfahren dargestellt.

Claims (23)

1. Mikropartikel zur verzögerten Freisetzung eines Wirkstoffs, enthaltend eine Polymermatrix, wenigstens einen physiologisch aktiven Wirkstoff und Chitosan, wobei die Polymermatrix nicht aus Chitosan, einem Derivat davon, oder einem Chitosan-Alginat-Komplex besteht.

2. Mikropartikel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Chitosan mit einem Molekulargewicht von 10.000 bis 2.000.000 Da enthalten ist.

3. Mikropartikel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Chitosan mit einem Molekulargewicht von 40.000 bis 400.000 Da enthalten ist.

4. Mikropartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewichtsverhältnis von physiologisch aktivem Wirkstoff zu Chitosan 1 : 0,01 bis 1 : 25 ist.

5. Mikropartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewichtsverhältnis von physiologisch aktivem Wirkstoff zu Chitosan 1 : 0,1 bis 1 : 10 ist.

6. Mikropartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymermatrix im wesentlichen aus Polymilchsäure, Polyglykolsäure, einem Milchsäure- Glykolsäure-Copolymer oder einer Mischung aus wenigstens zwei der genannten Komponenten besteht.

7. Mikropartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als physiologisch aktiver Wirkstoff Heparin, eine Nukleinsäure oder ein Peptid oder Protein enthalten ist.

8. Mikropartikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Wirkstoff Calcitonin, Erythropoietin, LHRH oder NGF enthalten ist.

9. Verfahren zur Herstellung von Mikropartikeln zur verzögerten Freisetzung eines Wirkstoffs, dadurch gekennzeichnet, daß

• a) eine den Wirkstoff und Chitosan enthaltende Zusammensetzung bereitgestellt wird,
• b) die den Wirkstoff und Chitosan enthaltende Zusammensetzung zu einer organischen Lösung eines Polymers gegeben wird und darin dispergiert wird,
• c) die entstehende Emulsion oder Dispersion in eine äußere Phase gegeben und darin dispergiert wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß Chitosan mit einem Molekulargewicht von 10.000 bis 2.000.000 Da verwendet wird.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewichtsverhältnis von physiologisch aktivem Wirkstoff zu Chitosan 1 : 0,01 bis 1 : 25 ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß als Polymer Polymilchsäure, Polyglykolsäure oder ein Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer verwendet wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die organische Lösung eines Polymers als Lösungsmittel Dichlormethan enthält.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerkonzentration in der organischen Lösung eines Polymers 5 bis 50% (w/v) ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß als äußere Phase eine wäßrige Lösung eingesetzt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige äußere Phase einen Emulgator und/oder ein Schutzkolloid enthält.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Schutzkolloid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon und Polyethylenglykol.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung, die den Wirkstoff und Chitosan enthält, eine wäßrige Lösung ist.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung, die den Wirkstoff und Chitosan enthält, aus Feststoffen besteht.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Zusammensetzung, die den Wirkstoff und Chitosan enthält, dadurch bereitgestellt wird, daß eine den Wirkstoff und Chitosan enthaltende Lösung sprühgetrocknet wird.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die äußere Phase eine nichtwäßrige Phase ist, die einen Emulgator und/oder ein Schutzkolloid enthält.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die äußere Phase Span, Tween oder Brij enthält.

23. Arzneimittel, enthaltend Mikropartikel nach einem der Ansprüche 1 bis 8.