DE10106827A1 - Use of a conjugate of interleukin-6 (IL-6) and its receptor to induce cellular expression of stem cell factor (SCF) and flat-3 ligand (Flt-3L) - Google Patents
Use of a conjugate of interleukin-6 (IL-6) and its receptor to induce cellular expression of stem cell factor (SCF) and flat-3 ligand (Flt-3L)Info
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Konjugats aus (IL-6) und seinem Rezeptor zur Induktion der zellulären Expression von SCF und FIt-3L. Vorzugsweise wird diese Verwendung bei der ex vivo Expansion von Stamm- oder Vorläuferzellen, insbesondere von solchen des hämatopoetischen Systems, genutzt.The present invention relates to the use of a conjugate of (IL-6) and its receptor for Induction of cellular expression of SCF and FIt-3L. This use is preferably used in the ex vivo expansion of stem or progenitor cells, especially those of the hematopoietic Systems.
Die Möglichkeit der ex vivo Expansion von Stamm- oder Vorläuferzellen, insbesondere von solchen des hämatopoetischen Systems, hat für viele Bereiche der Forschung und Medizin, z. B. der Regeneration bzw. Ersatzes von Geweben und Organen, eine große Bedeutung. Es ist bekannt, daß z. B. hämatopoetische Stamm- oder Vorläuferzellen entsprechend dem Stadium ihrer Differenzierung unterschiedlich stimuliert werden können, was zu funktionellen Veränderungen des hämatopoetischen Systems während der Entwicklung führt. Hämatopoetische Stamm- oder Vorläuferzellen aus verschiedenen Organkompartimenten zeigen beträchtliche Unterschiede hinsichtlich ihrer Kapazität für Proliferation und Selbsterneuerung. Die Fähigkeit zur Proliferation und Selbsterneuerung findet sich z. B. in fötalen Leberzellen, Nabelschnurblutzellen und in adulten Knochenmarkzellen (in ansteigendem Ausmaß). Der funktionelle Unterschied zwischen diesen Zelltypen wird höchstwahrscheinlich durch ein entwicklungsreguliertes Expressionsmuster der Zytokin/Wachstumsfaktor-Rezeptoren repräsentiert. Allerdings war bisher die ex vivo Expansion von Stamm- oder Vorläuferzellen, insbesondere von solchen des hämatopoetischen Systems, in der Praxis mit einer Reihe von Schwierigkeiten verbunden. Beispielsweise mußten den zur Expansion der Zellen verwendeten Kulturmedien Faktoren, wie SCF und FIt-3L, zugegeben werden, was wegen Ihrer Verfügbarkeit oft schwierig und mit hohen Kosten verbunden war.The possibility of ex vivo expansion of stem or progenitor cells, especially those of the hematopoietic system, has for many areas of research and medicine, e.g. B. regeneration or replacement of tissues and organs, of great importance. It is known that e.g. B. hematopoietic stem or progenitor cells according to the stage of their differentiation can be stimulated differently, leading to functional changes in the hematopoietic System leads during development. Hematopoietic stem or progenitor cells different organ compartments show considerable differences in their capacity for Proliferation and self-renewal. The ability for proliferation and self-renewal can be found e.g. B. in fetal liver cells, umbilical cord blood cells and in adult bone marrow cells (in increasing Extent). The functional difference between these cell types is most likely due to a represents developmentally regulated expression pattern of the cytokine / growth factor receptors. So far, however, the ex vivo expansion of stem or progenitor cells, especially those, has been of the hematopoietic system, in practice associated with a number of difficulties. For example, the culture media used to expand the cells had factors such as SCF and FIt-3L, can be added, which is often difficult and associated with high costs due to their availability was.
Somit liegt der vorliegenden Erfindung das technische Problem zugrunde, diese Nachteile der im Stand der Technik angewandten Verfahren zu überwinden, d. h. Mittel bereitzustellen, die eine einfache und effiziente ex vivo Expansion von Stamm- oder Vorläuferzellen erlauben.The present invention is therefore based on the technical problem, these disadvantages of the prior art to overcome techniques used in technology, d. H. Provide means that are simple and allow efficient ex vivo expansion of stem or progenitor cells.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erreicht. Überraschenderweise wurde gefunden, daß Stamm- oder Vorläuferzellen, insbesondere solche des hämatopoetischen Systems, einfach und effizient expandiert werden können, wenn dem Kulturmedium ein Konjugat aus IL-6 und seinem Rezeptor, insbesondere ein IL-6/sIL-6R Fusionsprotein, zugegeben wird.According to the invention, this is achieved by the provision of those characterized in the patent claims Embodiments achieved. Surprisingly, it was found that stem or progenitor cells, especially those of the hematopoietic system that can be easily and efficiently expanded, if the culture medium is a conjugate of IL-6 and its receptor, in particular an IL-6 / sIL-6R Fusion protein is added.
IL-6 ist ein pleiotropes Zytokin, das mit einem großen Spektrum von Zielzellen interagiert. So ist IL-6 vor allem ein Vermittler des Wachstums und der Differenzierung von Zellen, z. B. solcher des hämatopoetischen Systems. IL-6 wirkt auf die Zielzellen über einen Rezeptorkomplex, der aus einem spezifischen IL-6 bindenden Protein (IL-6R) und einem signalübertragenden Molekül (gp 130) besteht. Der IL-6/IL-6R-Komplex induziert die Homodimerisierung von zwei gp 130-Molekülen, was wiederum die intrazelluläre Signalgebung einleitet. Lösliche Formen von IL-6R (sIL-6R) finden sich in verschiedenen Körperbereichen, sind in Patienten mit verschiedenen chronischen, mit Entzündungen einhergehenden Erkrankungen und hämatologischen Erkrankungen erhöht. Beim Menschen wird die Spaltung von IL-6R zu sIL-6R als Antwort auf Akut-Phase-Proteinen und bakterielle Toxine ausgelöst. Bei dem IL-6/sIL-6R Fusionsprotein (Hyper-IL-6) handelt es sich um ein Fusionspolypeptid, das ein humanes sIL-6R- Polypeptid, d. h. die extrazelluläre bzw. lösliche Untereinheit eines IL-6-Rezeptors, und ein humanes IL-6- Peptid umfaßt, wobei die beiden Polypeptide über einen Polypeptidlinker miteinander verknüpft sind. Die Struktur von "Hyper-IL-6" sowie dessen Aminosäuresequenz sind in DE 196 08 813 C2 beschrieben.IL-6 is a pleiotropic cytokine that interacts with a wide range of target cells. So is IL-6 before all a mediator of the growth and differentiation of cells, e.g. B. such the hematopoietic system. IL-6 acts on the target cells via a receptor complex that consists of a specific IL-6 binding protein (IL-6R) and a signal-transmitting molecule (gp 130). The IL-6 / IL-6R complex induces the homodimerization of two gp 130 molecules, which in turn initiates intracellular signaling. Soluble forms of IL-6R (sIL-6R) can be found in several Body areas are in patients with various chronic inflammatory conditions Diseases and hematological disorders increased. In humans, the cleavage of IL-6R to sIL-6R triggered in response to acute phase proteins and bacterial toxins. With the IL-6 / sIL-6R Fusion protein (Hyper-IL-6) is a fusion polypeptide that contains a human sIL-6R- Polypeptide, i.e. H. the extracellular or soluble subunit of an IL-6 receptor, and a human IL-6 Peptide comprises, the two polypeptides being linked to one another via a polypeptide linker. The The structure of "Hyper-IL-6" and its amino acid sequence are described in DE 196 08 813 C2.
Bei den zu der vorliegenden Erfindung führenden Experimenten stellte sich z. B. heraus, daß durch intrazelluläre Expression eines IL-6/sIL-6R Fusionsproteins (Hyper-IL-6) und nachfolgender Sezernierung bzw. durch Zusatz dieses Fusionsproteins zu einem Zuchtmedium die zelluläre Expression von SCF sowie von FIt-3L induziert werden kann. In den Experimenten konnte durch immunhistochemische Untersuchungen gezeigt werden, daß die zelluläre Expression von SCF und FIt-3L in der Leber und Milz von doppelt transgenen Mäusen (also Mäusen, die sowohl IL-6 als auch sIL-6R exprimierten) induziert wurde, nicht jedoch in für IL-6 bzw. sIL-6R einzeln transgenen Mäusen. Außerdem konnte gezeigt werden, daß auf murinen NIH/3T3-Fibroblasten und humanen Präputium-Fibroblasten die Stimulation mit Hyper-IL-6 ebenfalls zu einer Induktion der zellulären Expression von SCF und FIt-3L führte. Bei Stimulierung humaner Fibroblasten (HTB 158) mit Hyper-IL-6 und nachfolgender Co-Kultivierung mit Nabelschnurblut-CD34+-Zellen konnte eine signifikante Hochregulation des Koloniewachstums der Nabelschnurblut-CD34+-Zellen beobachtet werden.In the experiments leading to the present invention, z. B. out that by intracellular expression of an IL-6 / sIL-6R fusion protein (Hyper-IL-6) and subsequent secretion or by adding this fusion protein to a culture medium, the cellular expression of SCF and FIt-3L can be induced. In the experiments, it could be shown by immunohistochemical investigations that the cellular expression of SCF and FIt-3L in the liver and spleen was induced by double-transgenic mice (ie mice which expressed both IL-6 and sIL-6R), but not in individually transgenic mice for IL-6 or sIL-6R. It could also be shown that stimulation with Hyper-IL-6 also led to induction of the cellular expression of SCF and FIt-3L on murine NIH / 3T3 fibroblasts and human prepuce fibroblasts. When human fibroblasts (HTB 158) were stimulated with Hyper-IL-6 and then co-cultivated with umbilical cord blood CD34 + cells, a significant upregulation of the colony growth of the umbilical cord blood CD34 + cells was observed.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Konjugats aus IL-6 und seinem Rezeptor, insbesondere eines IL-6/sIL-6R Fusionsproteins (Hyper-IL-6) zur Induktion der zellulären Expression von SCF und FIt-3L.The present invention thus relates to the use of a conjugate of IL-6 and its receptor, in particular an IL-6 / sIL-6R fusion protein (Hyper-IL-6) for inducing the cellular expression of SCF and FIt-3L.
Der verwendete Ausdruck "Konjugat aus IL-6 und seinem Rezeptor" umfaßt jegliches Konjugat bei dem IL-6 und sein Rezeptor bzw. Teile von diesen kovalent miteinander verbunden sein können. Beispielsweise kann das Konjugat ein solches sein, bei dem IL-6 und sein Rezeptor bzw. Teile davon über einen Linker, wie eine Disulfidbrücke, ein Peptid oder ein chemisches Agens miteinander verbunden sind. Vorzugsweise ist das Konjugat ein Fusionsprotein, insbesondere ein IL-6/sIL-6R Fusionsprotein (Hyper-IL-6), wie in DE 196 08 813 C2 beschrieben oder ein Fusionsprotein, daß sich gegenüber dem in DE 196 08 813 C2 beschriebenen Fusionsprotein dadurch unterscheidet, daß es Deletionen, Additionen und/oder Substitutionen von einer oder mehreren Aminosäuren und/oder (eine) modifizierte Aminosäure(n) im IL-6-, sIL-6R- und/oder Linker-Anteil aufweist, wobei die biologische Aktivität nicht wesentlich beeinflußt wird. Ob ein solches Fusionsprotein noch die gewünschten biologischen Eigenschaften aufweist, kann mittels üblicher Verfahren, z. B. mittels der in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Verfahren untersucht werden.The term "conjugate of IL-6 and its receptor" includes any conjugate in the IL-6 and its receptor or parts thereof can be covalently linked to one another. For example, the conjugate can be one in which IL-6 and its receptor or parts thereof connected to one another via a linker, such as a disulfide bridge, a peptide or a chemical agent are. The conjugate is preferably a fusion protein, in particular an IL-6 / sIL-6R fusion protein (Hyper-IL-6), as described in DE 196 08 813 C2 or a fusion protein that is opposite to the differs in fusion protein described in DE 196 08 813 C2 in that it deletions, Additions and / or substitutions of one or more amino acids and / or (one) modified Has amino acid (s) in the IL-6, sIL-6R and / or linker portion, the biological activity not is significantly influenced. Whether such a fusion protein still has the desired biological Has properties can by means of conventional methods, for. B. by means of in the following Examples described methods are examined.
Bei der erfindungsgemäßen Verwendung kann es zweckmäßig sein, die Zellen mit dem Konjugat dadurch in Kontakt zu bringen, daß sie in einem das Konjugat enthaltenden Medium gezüchtet werden oder mit einem Vektor transformiert worden sind, der zu einer intrazellulären Expression des Konjugats und nachfolgender Sezernierung führt. Der Fachmann kennt geeignete Transformationssysteme und Vektoren, z. B. zur Gentherapie, und in diesem Zusammenhang wird auch auf DE 196 08 813 C2 verwiesen (siehe außerdem die nachstehenden Beispiele 1 bis 4). Der Fachmann ist in der Lage zu entscheiden, welche Vorgehensweise in dem entsprechend Fall am vorteilhaftesten ist.In the use according to the invention, it may be appropriate to use the conjugate by contacting them by growing them in a medium containing the conjugate or have been transformed with a vector which leads to an intracellular expression of the conjugate and subsequent secretion leads. The person skilled in the art knows suitable transformation systems and Vectors, e.g. B. for gene therapy, and in this context is also on DE 196 08 813 C2 referenced (see also Examples 1 to 4 below). The skilled person is able to decide which approach is most advantageous in the respective case.
Der Fachmann kennt ferner geeignete Züchtungsverfahren und Medien, um Säugerzellen, z. B. hämatopoetische Stamm- oder Vorläuferzellen kultivieren zu können; siehe z. B. DE 196 08 813 C2, EP-B1 0 695 351 oder die nachstehenden Beispiele 1, 5 und 6. Der Fachmann kann auch anhand einfacher Versuche die optimale Konzentration des Konjugats für den gewünschten Zweck bestimmen; siehe z. B. DE 196 08 813 C2. Das Grundmedium, das u. a. das Konjugat enthält, kann jedes Medium sein, das üblicherweise für die Züchtung von Säugerzellen verwendet wird. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mediums ist das Grundmedium, in dem das Konjugat enthalten ist, DMEM (Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland). Die gewünschten Zellen werden in dem vorstehenden Medium unter geeigneten Bedingungen, gegebenenfalls unter (teilweiser) Erneuerung des Mediums in geeigneten Zeitabständen, gezüchtet. Geeignete Bedingungen, beispielsweise hinsichtlich geeigneter Behälter, Temperatur, relativer Luftfeuchte, O2-Gehalt und CO2-Gehalt der Gasphase sind dem Fachmann bekannt. Vorzugsweise werden die Zellen in dem vorstehenden Medium unter den folgenden Bedingungen kultiviert: (a) 37°C, (b) 100% rel. Luftfeuchte und (c) 5% CO2.The person skilled in the art is also familiar with suitable cultivation methods and media for producing mammalian cells, e.g. B. to be able to cultivate hematopoietic stem or progenitor cells; see e.g. B. DE 196 08 813 C2, EP-B1 0 695 351 or Examples 1, 5 and 6 below. The person skilled in the art can also determine the optimum concentration of the conjugate for the desired purpose on the basis of simple experiments; see e.g. B. DE 196 08 813 C2. The basic medium, which contains the conjugate, among others, can be any medium which is usually used for the cultivation of mammalian cells. In a preferred embodiment of the medium according to the invention, the basic medium in which the conjugate is contained is DMEM (Life Technologies, Karlsruhe, Germany). The desired cells are grown in the above medium under suitable conditions, optionally with (partial) renewal of the medium at suitable time intervals. Suitable conditions, for example with regard to suitable containers, temperature, relative air humidity, O 2 content and CO 2 content of the gas phase, are known to the person skilled in the art. Preferably, the cells are cultured in the above medium under the following conditions: (a) 37 ° C, (b) 100% rel. Humidity and (c) 5% CO 2 .
Die Herstellung des Konjugats als Zusatz zu einem Medium erfolgt gemäß üblicher Verfahren, wobei vorzugsweise das Konjugat rekombinant wie in Beispiel 2 von DE 196 08 813 C2 beschrieben unter Verwendung der in Beispiel 1 von DE 196 08 813 C2 beschriebenen DNA-Sequenz hergestellt wird.The conjugate is prepared as an additive to a medium in accordance with customary methods, wherein preferably the conjugate recombinantly as described in Example 2 of DE 196 08 813 C2 Use of the DNA sequence described in Example 1 of DE 196 08 813 C2 is produced.
Wird das Konjugat nicht direkt, z. B. als Zusatz zu einem Medium, verwendet, sondern erfolgt dessen
Bereitstellung für die Zelle durch intrazelluläre Expression und nachfolgender Sezernierung, so ist die für
das Konjugat kodierende DNA-Sequenz in einen geeigneten Vektor, vorzugsweise Expressionsvektor
unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors inseriert, wobei geeignete Promotoren dem Fachmann
bekannt sind. Dabei kann der die DNA-Sequenzen enthaltende Vektor über verschiedene Wege
transfiziert werden:
If the conjugate is not directly, e.g. B. as an additive to a medium, but if it is made available to the cell by intracellular expression and subsequent secretion, the DNA sequence coding for the conjugate is inserted into a suitable vector, preferably expression vector, under the control of a suitable promoter, wherein suitable promoters are known to the person skilled in the art. The vector containing the DNA sequences can be transfected in various ways:
- a) Lipid- bzw. Liposomen-verpackte DNA oder RNA, z. B. allgemein beschrieben von Nabel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, (1996), 15388-15393 (siehe auch Nair et al., Nature Biotechnology 16 (1998), 364ff;a) Lipid or liposome-packed DNA or RNA, e.g. B. generally described by Nabel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, (1996), 15388-15393 (see also Nair et al., Nature Biotechnology 16 (1998), 364ff;
- b) Mit einem Bakterium als Transportvehikel für den Expressionsvektor. Geeignete Bakterien sind beispielsweise (attenuierte) Listerien [z. B. Listeria monocytogenes], Salmonellen-Stämme [z. B. Salmonella spp.]. Allgemein ist diese Technik von Medina et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999), 693-699, sowie Guzman et al., Eur. J. Immunol. 28 (1998), 1807-1814 beschrieben worden. Desweiteren wird auf WO 96/14087; Weiskirch et al., Immunological Reviews 158 (1997), 159-169 und US-A-5,830,702 verwiesen;b) With a bacterium as a transport vehicle for the expression vector. Suitable bacteria are for example (attenuated) listeria [e.g. B. Listeria monocytogenes], Salmonella strains [e.g. B. Salmonella spp.]. In general, this technique is described by Medina et al., Eur. J. Immunol. 29: 693-699 (1999) and Guzman et al., Eur. J. Immunol. 28: 1807-1814 (1998). Furthermore, on WO 96/14087; Weiskirch et al., Immunological Reviews 158 (1997), 159-169 and US-A-5,830,702 referenced;
- c) Mit einem Virus als Vektor (Kim et al., J. of Immunotherapy 20 (4) (1997), 276-286;c) With a virus as a vector (Kim et al., J. of Immunotherapy 20 (4) (1997), 276-286;
- d) Mittels Gene-Gun (Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 2726-2730.d) Using Gene-Gun (Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 2726-2730.
Der Vektor ist vorzugsweise ein Virus, beispielsweise ein Adenovirus, Vaccinia-Virus oder ein AAV-Virus. Besonders bevorzugt sind Retroviren. Beispiele für geeignete Retroviren sind MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV sowie Fowlpox-Virus, Canarypox-Virus, Influenza-Virus oder Sindbis-Virus.The vector is preferably a virus, for example an adenovirus, vaccinia virus or an AAV virus. Retroviruses are particularly preferred. Examples of suitable retroviruses are MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV or GaLV as well as fowlpox virus, canarypox virus, influenza virus or Sindbis virus.
Allgemeine auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion von Vektoren oder Plasmiden, die die vorstehenden DNA-Sequenzen und geeignete Kontrollsequenzen enthalten, verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in vitro-Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren, sowie in vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989), beschrieben sind.General methods known in the art can be used to construct vectors or Plasmids containing the above DNA sequences and suitable control sequences, be used. These methods include, for example, in vitro recombination techniques, synthetic methods, as well as in vivo recombination methods, as described for example in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989).
Eine bevorzugte Verwendung betrifft die Verwendung eines Konjugats zur ex vivo Expansion von Stamm- oder Vorläuferzellen, insbesondere von solchen des hämatopoetischen Systems. Dabei erfolgt die Züchtung bzw. Haltung der Zellen wie vorstehend bzw. in den nachstehenden Beispielen 1, 5 und 6 beschrieben, vorzugsweise unter Verwendung eines das Konjugat enthaltenden Mediums. Beispiele für geeignete Stamm- oder Vorläuferzellen sind solche des mesenchymalen oder hämatopoetischen Systems, wobei Stamm- oder Vorläuferzellen des letzteren, wie CD34+-Zellen, besonders bevorzugt sind. Die ex vivo Expansion von Stamm- oder Vorläuferzellen, insbesondere von CD34+-Zellen erfolgt vorzugsweise durch Co-Kultivierung mit Feederzellen als Zellrasen, insbesondere humanen Fibroblasten, vorzugsweise HTB-158 Fibroblasten, die vorher mit dem Konjugat behandelt worden waren, z. B. wie in den nachstehenden Beispielen 1, 5 und 6 beschrieben.A preferred use relates to the use of a conjugate for the ex vivo expansion of stem or progenitor cells, in particular those of the hematopoietic system. The cells are grown or kept as described above or in Examples 1, 5 and 6 below, preferably using a medium containing the conjugate. Examples of suitable stem or progenitor cells are those of the mesenchymal or hematopoietic system, with stem or progenitor cells of the latter, such as CD34 + cells, being particularly preferred. The ex vivo expansion of stem or progenitor cells, in particular CD34 + cells, is preferably carried out by co-cultivation with feeder cells as cell turf, in particular human fibroblasts, preferably HTB-158 fibroblasts, which had previously been treated with the conjugate, e.g. B. as described in Examples 1, 5 and 6 below.
Eine weitere bevorzugte Verwendung betrifft die in vivo Verwendung eines Konjugats zur Behandlung von Erkrankungen, die mit einer erniedrigten Expression von SCF und FtI-3L in Zusammenhang stehen oder bei denen eine Erhöhung der Expression oder Konzentration von SCF und FtI-3L wünschenswert ist. Beispiele solcher Krankheiten sind Tumor- oder degenerative Erkrankungen.Another preferred use relates to the in vivo use of a conjugate for treatment diseases related to decreased expression of SCF and FtI-3L or where an increase in expression or concentration of SCF and FtI-3L is desirable is. Examples of such diseases are tumor or degenerative diseases.
Weitere bevorzugte Verwendungen eines Konjugats sind folgende:
Other preferred uses of a conjugate are as follows:
- a) Verwendung zur Verbesserung der Rekonstitution und Reinigung von mit Tumorzellen kontaminierten Stamm- oder Vorläuferzellen-Transplantaten, wobei eine Expansion von Stamm- oder Vorläuferzellen, insbesondere von solchen des hämatopoetischen Systems erfolgt, was letztlich ein effizienteres Purgen erlaubt.a) Use to improve the reconstitution and purification of contaminated with tumor cells Stem or progenitor cell transplants, whereby an expansion of stem or progenitor cells, in particular from those of the hematopoietic system, which ultimately results in a more efficient purge allowed.
- b) Verwendung zur Verbesserung der Mobilisation von Stamm- oder Vorläuferzellen, insbesondere von solchen des hämatopoetischen Systems zum peripheren Blut, wobei eine Expansion von Stamm- oder Vorläuferzellen erfolgt. b) Use to improve the mobilization of stem or progenitor cells, in particular of those of the hematopoietic system to peripheral blood, with an expansion of stem or Progenitor cells.
- c) Verwendung zur Verbesserung des Gentransfers in Stamm- oder Vorläuferzellen, insbesondere solchen des hämatopoetischen Systems, wobei eine Expansion von Stamm- oder Vorläuferzellen erfolgt.c) Use to improve gene transfer in stem or progenitor cells, in particular those of the hematopoietic system, with an expansion of stem or progenitor cells.
Das Konjugat wird als Bestandteil eines Mediums vorzugsweise in einer Konzentration von 5 bis 100 ng/ml eingesetzt.The conjugate is used as a component of a medium, preferably in a concentration of 5 to 100 ng / ml used.
Immunhistochemische Analyse der SCF-Expression in der Leber von 4 (A), 8 (B) und 16 (C) Wochen alten, für IL-6/sIL-6R doppelt transgenen Mäusen, einer 16 Wochen alten, für IL-6 einzeln transgenen Maus (D), einer 16 Wochen alten, für sIL-6R einzeln transgenen Maus (E) und einer nicht-transgenen Maus als Kontrolle (F). Die Balken entsprechen 100 µm.Immunohistochemical analysis of SCF expression in the liver from 4 (A), 8 (B) and 16 (C) weeks old, double-transgenic mice for IL-6 / sIL-6R, one 16-week-old, single-transgenic for IL-6 Mouse (D), a 16-week-old mouse (E) individually transgenic for sIL-6R and a non-transgenic Mouse as a control (F). The bars correspond to 100 µm.
Gesamt-RNA aus der Leber wurde präpariert und mit dieser eine Northern-Blot-Analyse durchgeführt. In den Spuren 1-7 ist die mRNA von 4 bis 16 Wochen alten, für IL-6/sIL-6R doppelt transgenen Mäusen gezeigt, in den Spuren 8-13 die mRNA von für IL-6 einzeln transgenen Mäusen im Alter von 4 bis 16 Wochen und in den Spuren 14 und 15 die mRNA von einer 4 Wochen bzw. 16 Wochen alten Kontrollmaus. Im unteren Teil der Figur ist das mit Ethidiumbromid gefärbte RNA-Gel zum Nachweis der für alle Spuren gleichen Probenmengen gezeigt.Total RNA from the liver was prepared and a Northern blot analysis was carried out with it. In lanes 1-7 is the mRNA of 4 to 16 week old mice which are double transgenic for IL-6 / sIL-6R shown in lanes 8-13 the mRNA of individually transgenic mice for IL-6 aged 4 to 16 Weeks and in lanes 14 and 15 the mRNA from a 4 week and 16 week old Control mouse. In the lower part of the figure is the RNA gel stained with ethidium bromide for the detection of same sample amounts shown for all tracks.
Immunhistochemische Analyse der SCF-Expression in der Milz von 6 Wochen (A-C) und 16 Wochen (A'- C') alten transgenen Mäusen, die entweder sowohl IL-6 als auch sIL-6R (A, A'), nur sIL-6R (B, B') oder nur IL-6 (C, C') in der Leber exprimierten. Die Balken entsprechen 100 µm.Immunohistochemical analysis of SCF expression in the spleen at 6 weeks (A-C) and 16 weeks (A'- C ') old transgenic mice that have both IL-6 and sIL-6R (A, A'), only sIL-6R (B, B ') or only IL-6 (C, C ') expressed in the liver. The bars correspond to 100 µm.
Milzgewebe von transgenen und nicht-transgenen Mäusen (wie in der Figur angegeben) wurde homogenisiert und einer Immunpräzipitation unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-antihomogenisiert und einer Immunpräzipitation unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-anti murinen-SCF-Antikörpers unterzogen. Die Immunpräzipitate wurden auf ein SDS-Polyacrylamidgel geladen und danach wurde ein Western-Blot unter Verwendung des polyklonalen Kaninchen-anti murinen-SCF-Antikörpers durchgeführt. Eine starke Bande bei etwa 29 kD und eine schwächere Bande bei etwa 20 kD erscheint nur in Immunpräzipitaten aus der Milz von für IL-6/sIL-6R doppelt transgenen Mäusen. Diese Banden entsprechen höchstwahrscheinlich der membrangebundenen und löslichen Form von SCF-2 (KL-2).Spleen tissue from transgenic and non-transgenic mice (as indicated in the figure) was examined homogenized and immunoprecipitated using a rabbit polyclonal antihomogenized and immunoprecipitation using a polyclonal rabbit anti murine SCF antibody subjected. The immunoprecipitates were on an SDS-polyacrylamide gel loaded and then a Western blot was performed using the polyclonal rabbit anti murine SCF antibody performed. A strong band at around 29 kD and a weaker band at around 20 kD appears only in immunoprecipitates from the spleen of double transgenes for IL-6 / sIL-6R Mice. These bands most likely correspond to the membrane-bound and soluble form from SCF-2 (KL-2).
Immunhistochemische Analyse der FIt-3L-Expression in der Milz von 6 Wochen (A-C) und 16 Wochen (A'-C') alten transgenen Mäusen, die entweder sowohl IL-6 als auch sIL-6R (A, A'), nur sIL-6R (B, B') oder nur IL-6 (C, C') in der Leber exprimierten. Die Balken entsprechen 100 µm.Immunohistochemical analysis of FIt-3L expression in the spleen at 6 weeks (A-C) and 16 weeks (A'-C ') old transgenic mice that have both IL-6 and sIL-6R (A, A'), only sIL-6R (B, B ') or only expressed IL-6 (C, C ') in the liver. The bars correspond to 100 µm.
NIH/3T3-Zellen (A-C, A'-C') und primäre humane Präputium-Fibroblasten (A''-C'', A'''-C''') wurden auf mit Gelatine beschichteten Glaskammerträgern ausgesät und in DMEM in einer wassergesättigten Atmosphäre bei 5% CO2 gezüchtet. Die Zellen wurden 24 Std. mit den entsprechenden Zytokinen stimuliert: Nur mit Medium (A-A'''), mit 10 ng/ml IL-6 (B-B''') oder mit 10 ng/ml Hyper-IL-6 (C-C'''). Danach erfolgte eine Analyse über Immunfluoreszenz. Primäre Antikörper gegen SCF (A-C, A''-C'') und FIt-3L (A'-C', A'''-C''') wurden wie in Beispiel 1 beschrieben verwendet.NIH / 3T3 cells (AC, A'-C ') and primary human prepuce fibroblasts (A''-C'',A''' - C ''') were seeded on gelatin-coated glass chamber supports and in DMEM in grown in a water-saturated atmosphere at 5% CO 2 . The cells were stimulated with the corresponding cytokines for 24 hours: only with medium (A-A '''), with 10 ng / ml IL-6 (B-B''') or with 10 ng / ml Hyper-IL- 6 (C-C '''). This was followed by an analysis using immunofluorescence. Primary antibodies against SCF (AC, A '' - C '') and FIt-3L (A'-C ', A''' - C ''') were used as described in Example 1.
Aus Nabelschnurblut erhaltene humane CD34+-Zellen wurden mittels immunmagnetischer Perlen (Dynabeads) gereinigt, die mit einem monoklonalen anti-CD34 Antikörper beschichtet waren. (A, B) 10000 Zellen wurden auf humane HTB-158 Fibroblasten ausgesät, die, wie in Beispiel 1 angegeben, mit IL-6 (50 ng/ml) oder Hyper-IL-6 (10 ng/ml) in 3 ml Kulturmedium behandelt worden waren. Nach zwei Wochen wurden die Zellen gezählt und in Gegenwart von SCF (100 ng/ml) IL-3, IL-6, EPO (10 E/ml) und G-CSF (200 ng/ml) in Weichagar ausgesät (500 Zellen/ml). Nach weiteren zwei Wochen wurden die Kolonien angefärbt und gezählt. (C, D) 10000 Zellen wurden in 3 ml Kulturmedium, wie angegeben, ausgesät und entweder mit Medium behandelt oder mit IL-6 (50 ng/ml) bzw. Hyper-IL-6 (10 ng/ml). Nach zwei Wochen wurden die Zellen gezählt und in Gegenwart von SCF (100 ng/ml), IL-3, IL-6, EPO (10 E/ml) und G-CSF (200 ng/ml) in Weichagar ausgesät (1000 Zellen/ml). Nach weiteren zwei Wochen wurden die Kolonien angefärbt und gezählt.Human CD34 + cells obtained from umbilical cord blood were purified by means of immunomagnetic beads (Dynabeads) which were coated with a monoclonal anti-CD34 antibody. (A, B) 10,000 cells were seeded on human HTB-158 fibroblasts which, as indicated in Example 1, with IL-6 (50 ng / ml) or Hyper-IL-6 (10 ng / ml) in 3 ml culture medium had been treated. After two weeks, the cells were counted and seeded in soft agar in the presence of SCF (100 ng / ml) IL-3, IL-6, EPO (10 U / ml) and G-CSF (200 ng / ml). ml). After a further two weeks, the colonies were stained and counted. (C, D) 10,000 cells were seeded in 3 ml culture medium as indicated and either treated with medium or with IL-6 (50 ng / ml) or Hyper-IL-6 (10 ng / ml). After two weeks, the cells were counted and seeded in soft agar (1000 cells.) In the presence of SCF (100 ng / ml), IL-3, IL-6, EPO (10 U / ml) and G-CSF (200 ng / ml) / ml). After a further two weeks, the colonies were stained and counted.
Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung.The following examples illustrate the invention.
Die Erzeugung von für menschliches sIL-6R und menschliches IL-6 transgenen Mäusen ist in Peters et al., J. Exp. Med. 183 (1996), 1399 und Fattori et al., Blood 83 (1994), 2570 beschrieben. Durch Kreuzung homozygoter sIL-6R- und IL-6-Mäuse wurden hemizygote doppelt transgene Mäuse (IL-6/sIL-6R-Mäuse) erhalten, die beide Transgene coexprimieren (Peters et al., J. Exp. Med. 185 (1997), 755). Die Expression des sIL-6R-Transgens steht unter der Kontrolle des neonatalen PEPCK-Promotors, der 3 Tage nach der Geburt transkriptionell aktiviert wird und keine intra-uterine Entwicklungseffekte bewirkt, das IL-6- Transgen unter der Kontrolle des murinen Metallothionein-1-Promotors (Fattori et al., 83 (1994), 2570).The generation of mice transgenic for human sIL-6R and human IL-6 is described in Peters et al., J. Exp. Med. 183 (1996), 1399 and Fattori et al., Blood 83 (1994), 2570. By crossing homozygous sIL-6R and IL-6 mice became hemizygous double transgenic mice (IL-6 / sIL-6R mice) obtained, which both express transgenes (Peters et al., J. Exp. Med. 185 (1997), 755). The expression of the sIL-6R transgene is under the control of the neonatal PEPCK promoter, which is 3 days after the Birth is activated transcriptionally and has no intra-uterine developmental effects, the IL-6 Transgenic under the control of the murine metallothionein-1 promoter (Fattori et al., 83 (1994), 2570).
Die folgenden Antikörper wurden verwendet: Anti-Gr-1 (RB6-8C5), Mac-1 (M1/70), B220 (RA3-6B2), CD4 (H129.19), und CD8a (53-6.7) (alle von Pharmingen, San Diego, USA; diese monoklonalen Antikörper wurden als Linien-spezifische Marker verwendet), polyklonaler Ziegen-anti-humanes-SCF-IgG-Antikörper (R + D, Wiesbaden, Deutschland), polyklonales Kaninchen-anti-Maus-SCF-IgG (Genzyme, Cambridge, USA) und polyklonales Ziegen-anti-Maus/humanes-FtI-3L-IgG (Santa Cruz, USA). Die folgenden sekundären Antikörper wurden verwendet: FITC-konjugiertes Ziegen-anti-Kaninchen-IgG (Dianova, Hamburg, Deutschland) und FITC-konjugiertes Maus-anti-Ziegen-IgG (Dianova).The following antibodies were used: Anti-Gr-1 (RB6-8C5), Mac-1 (M1 / 70), B220 (RA3-6B2), CD4 (H129.19), and CD8a (53-6.7) (all from Pharmingen, San Diego, USA; these monoclonal antibodies were used as line-specific markers), goat anti-human SCF-IgG polyclonal antibody (R + D, Wiesbaden, Germany), polyclonal rabbit anti-mouse SCF-IgG (Genzyme, Cambridge, USA) and goat anti-mouse / human FtI-3L IgG polyclonal (Santa Cruz, USA). The following secondary antibodies were used: FITC-conjugated goat anti-rabbit IgG (Dianova, Hamburg, Germany) and FITC-conjugated mouse anti-goat IgG (Dianova).
Murine Fibroblasten (NIH/3T3) und primäre Präputium-Fibroblasten wurden in DMEM bei 5% CO2 in einer wassergesättigten Atmosphäre gezüchtet. Alle Zellkulturmedien waren mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), 100 mg/L Streptomycin und 60 mg/L Penicillin supplementiert. Murine fibroblasts (NIH / 3T3) and primary prepuce fibroblasts were grown in DMEM at 5% CO 2 in a water-saturated atmosphere. All cell culture media were supplemented with 10% fetal calf serum (FCS), 100 mg / L streptomycin and 60 mg / L penicillin.
Humane CD34+-Zellen aus Nabelschnurblut wurden mittels immunmagnetischer, mit einem monoklonalen anti-CD34+-Antikörper beschichteten Perlen (Dynabeads) gereinigt. Die Flüssigkultur und Assays für hämatopoetische Vorläuferzellen wurden wie von Fischer et al. (Nature Biotech. 15 (1997), 142) beschrieben durchgeführt. Dazu wurden 10000 Zellen auf mit IL-6 (50 ng/ml) oder Hyper-IL-6 (10 ng/ml) behandelten humanen HTB-158-Fibroblasten in eine 3 ml-Kultur wie in der Legende zu Fig. 7 angegeben ausgesät. Nach zwei Wochen wurden die Zellen gezählt und in Gegenwart von SCF (100 ng/ml), IL-3, IL-6, EPO (10 E/ml) und G-CSF (200 ng/ml) in Weichagar ausgesät (500 Zellen pro ml). Nach weiteren zwei Wochen wurden Kolonien angefärbt und gezählt. In einem Kontrollexperiment wurden 10000 Zellen in 3 ml-Kulturen ohne Fibroblasten ausgesät, die entweder kein Zytokin, IL-6 oder Hyper-IL-6 enthielten. Danach wurde das Experiment wie vorstehend beschrieben durchgeführt außer, daß 1000 Zellen in den Weichagar ausgesät wurden.Human CD34 + cells from umbilical cord blood were purified using immunomagnetic beads (Dynabeads) coated with a monoclonal anti-CD34 + antibody. The liquid culture and assays for hematopoietic progenitor cells were carried out as described by Fischer et al. (Nature Biotech. 15 (1997), 142). For this purpose, 10,000 cells were seeded on human HTB-158 fibroblasts treated with IL-6 (50 ng / ml) or hyper-IL-6 (10 ng / ml) in a 3 ml culture as indicated in the legend to FIG. 7 , After two weeks, the cells were counted and seeded in soft agar (500 cells.) In the presence of SCF (100 ng / ml), IL-3, IL-6, EPO (10 U / ml) and G-CSF (200 ng / ml) per ml). After a further two weeks, colonies were stained and counted. In a control experiment, 10,000 cells were seeded in 3 ml cultures without fibroblasts that did not contain either cytokine, IL-6 or Hyper-IL-6. The experiment was then carried out as described above, except that 1000 cells were sown in the soft agar.
Immunhistochemische Untersuchungen wurden mittels des "ABC"-Verfahrens durchgeführt. Es wurden Gefrierschnitte von muriner Leber und Milz aus transgenen und nicht-transgenen Tieren analysiert. Polyklonales Kaninchen-anti-Maus-SCF-IgG (Genzyme, Cambridge, USA) und polyklonales Ziegen-anti- Maus/humanes-FIt-3L-IgG (Santa Cruz, USA) wurde als primäre Antikörper verwendet und diese wurden in einer Verdünnung von 1 : 50 bei 4°C ü. N. verwendet. Als sekundärer Antikörper wurde Biotin konjugiertes Ziegen-anti-Ratte-IgG (Dianova, Hamburg, Deutschland) verwendet. Das Signal wurde mit Meerrettich-Peroxidase-gekoppeltem Streptavidin und Diaminobenzidin als Chromogen entwickelt. Die Schnitte wurden mit Mayer's Hämalaun und Eosin gegengefärbt. Die Schnitte wurden mikroskopisch betrachtet und Mikrophotographien wurden mit einem Olympus "NHH"-Mikroskop aufgenommen.Immunohistochemical studies were carried out using the "ABC" method. There were Frozen sections of murine liver and spleen from transgenic and non-transgenic animals were analyzed. Rabbit polyclonal anti-mouse SCF IgG (Genzyme, Cambridge, USA) and goat anti-polyclonal Mouse / human FIt 3L IgG (Santa Cruz, USA) was used as the primary antibody and these were in a dilution of 1:50 at 4 ° C. N. used. Biotin became the secondary antibody conjugated goat anti-rat IgG (Dianova, Hamburg, Germany) was used. The signal was with Horseradish-peroxidase-coupled streptavidin and diaminobenzidine developed as a chromogen. The Sections were counterstained with Mayer's Hämalaun and Eosin. The cuts were microscopic and microphotographs were taken with an Olympus "NHH" microscope.
Murine NIH/3T3-Zellen, humane HUT-158-Zellen und humane primäre Präputium-Fibroblasten wurden in DMEM in Glaskammerträgern (LabTeks; Nung Nalgene, Naspenrille, USA) bis zum Erreichen von 80% Konfluenz gezüchtet. Die Zellen wurden 24 Stunden mit den entsprechenden Zytokinen stimuliert. Nach der Stimulation wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und in 50% Methanol/50% Aceton 15 Min. bei -20°C fixiert. Die Träger wurden luftgetrocknet und 30 Min. in PBS/5% Rinderserumalbumin inkubiert. Die Zellen wurden bei 4°C mit dem polyklonalen Kaninchen-anti-Maus-SCF-Antikörper (Genzyme, USA) bei einer Verdünnung von 1 : 50 in PBS/1% Rinderserumalbumin ü. N. inkubiert. Als sekundärer Antikörper wurde ein FITC-konjugierter Ziege-anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (Dianova, Deutschland) bei einer Verdünnung von 1 : 100 in PBS/1% Rinderserumalbumin verwendet. Die Träger wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie ausgewertet.Murine NIH / 3T3 cells, human HUT-158 cells and human primary prepuce fibroblasts were found in DMEM in glass chamber carriers (LabTeks; Nung Nalgene, nasal groove, USA) up to 80% Bred to confluence. The cells were stimulated with the appropriate cytokines for 24 hours. To the stimulation, the cells were washed twice with PBS and in 50% methanol / 50% acetone for 15 min. fixed at -20 ° C. The carriers were air dried and in PBS / 5% bovine serum albumin for 30 min incubated. The cells were washed at 4 ° C with the polyclonal rabbit anti-mouse SCF antibody (Genzyme, USA) at a dilution of 1:50 in PBS / 1% bovine serum albumin. Incubated. As a FITC-conjugated goat anti-rabbit IgG antibody (Dianova, Germany) at a dilution of 1: 100 in PBS / 1% bovine serum albumin. The bearers were evaluated using fluorescence microscopy.
Die Mäuse wurden durch cervikale Dislokation getötet und Gesamt-RNA aus der Leber wurde mittels des Phenol/Chloroform-Verfahrens isoliert (Rose-John, Carcinogenesis 9 (5) (1988), 831). Pro Probe wurden 5 µg hitzedenaturierte RNA auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt, das 7% Formaldehyd enthielt. Die aufgetrennte RNA wurde entsprechend den Angaben des Herstellers auf GenScreen-Plus™-Membranen (Dupont-New England Nuclear, Dreieich, Deutschland) transferiert. Die Filter wurden 2 Stunden bei 68°C in 10% Dextransulfat, 1 M NaCl, 1% SDS vorhybridisiert und in der gleichen Lösung mit cDNA- Fragmenten, die durch "random priming" mit [32P]-ATP markiert worden waren, inkubiert. Das Maus-SCF- cDNA-Fragment wurde durch reverse Transkription mittels eines "RT-PCR"-Kits (Invitrogen, USA) von Gesamt-mRNA erhalten, die aus murinen NIH/3T3-Fibroblasten erhalten worden war, die 24 Stunden mit 10 ng/ml IL stimuliert worden waren. Es wurden die folgenden Primer verwendet: 5'-GTC AAA ACC AAG GAG ATC TGC-3' (sense) und 5'-AGG GAG CTG GCT GCA ACA GGG-3' (antisense). Das erhaltene Fragment (577 bp) wurde in einen pBS+-Vektor (Stratagene, la Jolla, USA) kloniert und die Korrektheit des Konstrukts durch Sequenzierung bestätigt.The mice were sacrificed by cervical dislocation and total RNA from the liver was isolated using the phenol / chloroform method (Rose-John, Carcinogenesis 9 (5) (1988), 831). 5 μg of heat-denatured RNA per sample were separated on a 1% agarose gel which contained 7% formaldehyde. The separated RNA was transferred to GenScreen-Plus ™ membranes (Dupont-New England Nuclear, Dreieich, Germany) according to the manufacturer's instructions. The filters were prehybridized for 2 hours at 68 ° C. in 10% dextran sulfate, 1 M NaCl, 1% SDS and incubated in the same solution with cDNA fragments which had been randomly labeled with [ 32 P] -ATP , The mouse SCF cDNA fragment was obtained by reverse transcription using an "RT-PCR" kit (Invitrogen, USA) of total mRNA obtained from murine NIH / 3T3 fibroblasts that had been exposed to 10 ng for 24 hours / ml IL had been stimulated. The following primers were used: 5'-GTC AAA ACC AAG GAG ATC TGC-3 '(sense) and 5'-AGG GAG CTG GCT GCA ACA GGG-3' (antisense). The fragment obtained (577 bp) was cloned into a pBS + vector (Stratagene, la Jolla, USA) and the correctness of the construct was confirmed by sequencing.
Milzhomogenate wurden von transgenen und nicht-transgenen Mäusen präpariert. Die Überstände der Homogenate wurden mit 100 µg Protein A-Sepharose™ (20 mg/ml; Pharmacia, USA) 4 Stunden bei 4°C vorgeklärt. Die Proben wurden anschließend bei 4°C für weitere 4 Stunden unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-anti-muriner-SCF-Antikörpers (Genzyme, Cambridge, MA, USA) bei einer Konzentration von 2 µg/ml immunpräzipitiert. Nach Zugabe von 100 µl Protein A-Sepharose™ (20 mg/ml) und Inkubation bei 4°C für weitere 2 Stunden wurde der Sepharose-gebundene SCF durch Zentrifugation gewonnen, einmal mit TNET-Puffer (Tris/HCl, 10 mM, pH 7,4; Na-deoxycholat, 0,4%; EDTA, 60 mM; Triton-x-100, 1%) und zweimal mit PBS/0,05% Tween gewaschen, dann in 2× Laemmli-Puffer resuspendiert und über SDS-PAGE aufgetrennt. Die aufgetrennten Proteine wurden auf Nitrozellulose- Membranen elektrisch geblottet und schließlich wurde eine Western-Blot-Analyse unter Verwendung von polyklonalem Kaninchen-antimurinen-SCF-Antikörper bei einer Konzentration von 2 µg/ml durchgeführt. Als sekundärer Antikörper wurde ein Peroxidase-konjugierter Ziege-anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (Dianova, Hamburg, Deutschland) verwendet. Zum Nachweis wurde das "enhanced chemiluminescence system" (ECL) von Amersham (Arlington Heights, USA) verwendet.Spleen homogenates were prepared from transgenic and non-transgenic mice. The supernatants of the Homogenates were carried out with 100 µg Protein A-Sepharose ™ (20 mg / ml; Pharmacia, USA) for 4 hours at 4 ° C precleared. The samples were then at 4 ° C for an additional 4 hours using a polyclonal rabbit anti-murine SCF antibody (Genzyme, Cambridge, MA, USA) in one Concentration of 2 µg / ml immunoprecipitated. After adding 100 µl Protein A-Sepharose ™ (20 mg / ml) and incubation at 4 ° C for a further 2 hours, the Sepharose bound SCF was by centrifugation obtained once with TNET buffer (Tris / HCl, 10 mM, pH 7.4; Na deoxycholate, 0.4%; EDTA, 60 mM; Triton-x-100, 1%) and washed twice with PBS / 0.05% Tween, then in 2x Laemmli buffer resuspended and separated on SDS-PAGE. The separated proteins were put on nitrocellulose Membranes were electrically blotted and finally a Western blot analysis was carried out using polyclonal rabbit antimurine SCF antibody performed at a concentration of 2 µg / ml. A peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG antibody was used as the secondary antibody (Dianova, Hamburg, Germany) used. The "enhanced chemiluminescence system "(ECL) from Amersham (Arlington Heights, USA).
Die zelluläre Expression von SCF in doppelt transgenen Mäusen (IL-6/sIL-6R) wurde mittels immunhistochemischen Untersuchungen der Leber von transgenen und nicht-transgenen Mäusen analysiert. Fig. 1 zeigt, daß die Expression von SCF in der Leber von 4 bis 16 Wochen alten für IL- 6/sIL-6R doppelt transgenen Mäusen altersabhängig erhöht ist (Fig. 1A-C). Im Gegensatz dazu konnte durch dieses Verfahren in der Leber von 16 Wochen alten, für IL-6 (Fig. 1D) oder sIL-6R (Fig. 1E) einzeln transgenen Tieren bzw. in Kontrolltieren (Fig. 1F) keine zelluläre Expression von SCF nachgewiesen werden.The cellular expression of SCF in double transgenic mice (IL-6 / sIL-6R) was analyzed by means of immunohistochemical examinations of the liver of transgenic and non-transgenic mice. FIG. 1 shows that the expression of SCF in the liver of 4 to 16 week old mice for IL-6 / sIL-6R double transgenic mice is increased in an age-dependent manner ( FIG. 1A-C). In contrast, no cellular expression of SCF was possible in the liver of 16-week-old animals that were individually transgenic for IL-6 ( FIG. 1D) or sIL-6R ( FIG. 1E) or in control animals ( FIG. 1F) be detected.
Außerdem wurde die SCF-mRNA-Expression in der Leber mittels Northern-Blot-Analysen untersucht. Dazu wurde Gesamt-RNA aus der Leber von für IL-6/sIL-6R doppelt transgenen Mäusen (Fig. 2, Spuren 1-7), von für IL-6 einfach transgenen Mäusen (Fig. 2, Spuren 8-13) oder von Kontrolltieren (Fig. 2, Spuren 14 und 15) bei den in der Figur angegeben Altersstufen präpariert. In Übereinstimmung mit den durch immunhistochemische Untersuchungen gewonnenen Daten konnte ein altersabhängiger Anstieg der SCF-mRNA-Expression lediglich in den IL-6/sIL-6R-doppelt transgenen Mäusen nachgewiesen werden. In den für IL-6 einzeln transgenen Tieren zeigte sich zwar in den 4 und 8 Wochen alten Tieren etwas (basale) Expression von SCF, nicht jedoch in den 16 Wochen alten Tieren. In einer 4 Wochen alten Kontrollmaus konnte eine schwache Bande nachgewiesen werden, in einer 16 Wochen alten Maus zeigte sich jedoch keine Expression. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Gegenwart von sowohl IL-6 als auch sIL-6R, nicht jedoch von ausschließlich IL-6 zu einer erhöhten Expression von SCF- mRNA und einer erhöhten Konzentration des Proteins in der Leber führt.In addition, the SCF-mRNA expression in the liver was examined by means of Northern blot analyzes. To this end, total RNA from the liver of IL-6 / sIL-6R double transgenic mice ( FIG. 2, lanes 1-7), of IL-6 single transgenic mice ( FIG. 2, lanes 8-13) or prepared from control animals ( Fig. 2, lanes 14 and 15) at the age levels indicated in the figure. Consistent with the data obtained from immunohistochemical studies, an age-dependent increase in SCF-mRNA expression could only be detected in the IL-6 / sIL-6R double-transgenic mice. In the animals that were individually transgenic for IL-6, some (basal) expression of SCF was shown in the 4 and 8 week old animals, but not in the 16 week old animals. A weak band was detected in a 4-week-old control mouse, but no expression was found in a 16-week-old mouse. These results show that the presence of both IL-6 and sIL-6R, but not only IL-6, leads to an increased expression of SCF-mRNA and an increased concentration of the protein in the liver.
Die zelluläre SCF-Expression in der Milz von transgenen und nicht-transgenen, 6 Wochen alten (Fig. 3A-C) und 16 Wochen alten Mäusen (Fig. 3A'-C') wurde mittels immunhistochemischer Untersuchungen analysiert. In der Milz aller analysierten Tiere mit einem Alter von 6 Wochen konnte eine basale Expression von SCF nachgewiesen werden (Fig. 3A, IL-6/sIL-6R-doppelt transgen; Fig. 3B, sIL-6R- einfach transgen; Fig. 3C, IL-6-einfach transgen). In den älteren Tieren mit einem Alter von 16 Wochen stieg die SCF-Expression in den für IL-6/sIL-6R doppelt transgenen Mäusen signifikant (Fig. 3A'), nicht jedoch in den für sIL-6R oder IL-6 einfach transgenen Mäusen (Fig. 3B' bzw. 3C'). Die SCF- Immunreaktivität war in Megakaryozyten mit peripherer (sub)membranärer Akzentuierung am stärksten, jedoch auch bei früheren Stadien der Granulopoese gut nachweisbar. In erythropoetischen Zellen, neutrophilen Granulozyten und reifen Lymphozyten konnte kein spezifisches Signal nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Co-Expression von IL-6 und sIL-6R, nicht jedoch von lediglich IL-6, zu einer erhöhten Expression von SCF in der Milz führt.Cellular SCF expression in the spleen of transgenic and non-transgenic, 6 week old ( Fig. 3A-C) and 16 week old mice ( Fig. 3A'-C ') was analyzed by immunohistochemical studies. Basal expression of SCF could be detected in the spleens of all analyzed animals 6 weeks of age ( FIG. 3A, IL-6 / sIL-6R-double transgenic; FIG. 3B, sIL-6R-single transgenic; FIG. 3C , IL-6 single transgene). In the older animals at 16 weeks of age, SCF expression increased significantly in the mice double-transgenic for IL-6 / sIL-6R ( FIG. 3A '), but not in those single-transgenic for sIL-6R or IL-6 Mice ( Fig. 3B 'and 3C'). SCF immunoreactivity was strongest in megakaryocytes with peripheral (sub) membrane accentuation, but was also detectable in earlier stages of granulopoiesis. No specific signal could be detected in erythropoietic cells, neutrophil granulocytes and mature lymphocytes. These results show that the co-expression of IL-6 and sIL-6R, but not only IL-6, leads to an increased expression of SCF in the spleen.
Anschließend wurde SCF aus der Milz von transgenen und nicht-transgenen Tieren aus einem Wurf immunpräzipitiert. Wie in Fig. 4 gezeigt können signifikante Mengen an SCF-Protein nur aus der Milz von für IL-6/sIL-6R doppelt transgenen Mäusen immunpräzipitiert werden, nicht jedoch von für IL-6 oder sIL-6R einfach transgenen Mäusen oder von nicht-transgenen Mäusen eines Wurfs. Eine starke Bande bei etwa 26 kD und eine schwächere Bande bei etwa 20 kD trat in Immunpräzipitaten von der Milz von für IL-6/sIL-6R doppelt transgenen Mäusen in Erscheinung. Diese Banden repräsentieren aller Wahrscheinlichkeit nach die membrangebundenen und löslichen Formen von SCF-2 (KL-2). Zwei alternativ gespleißte SCF-Transkripte kodieren die zwei membrangebundenen Proteine SCF-1 und SCF- 2. In der Milz herrscht vorwiegend die Expression von SCF-2 vor, der aufgrund des Fehlens von Sequenzen, die die Hauptspaltstelle in Exon 6 umfassen, gegenüber proteolytischer Spaltung resistent ist. Aufgrund einer sekundären Spaltstelle, die vermutlich in Exon 7 liegt, wird SCF-2 zu löslichem SCF-2 prozessiert, allerdings nicht so effizient wie SCF-1SCF was then immunoprecipitated from the spleen of transgenic and non-transgenic animals from a litter. As shown in Fig. 4, significant amounts of SCF protein can only be immunoprecipitated from the spleen of mice transgenic for IL-6 / sIL-6R, but not from mice transgenic for IL-6 or sIL-6R or from non- litter transgenic mice. A strong band at approximately 26 kD and a weaker band at approximately 20 kD appeared in immunoprecipitates from the spleen of mice transgenic for IL-6 / sIL-6R. These bands most likely represent the membrane-bound and soluble forms of SCF-2 (KL-2). Two alternatively spliced SCF transcripts encode the two membrane-bound proteins SCF-1 and SCF-2. The expression of SCF-2 predominates predominantly in the spleen is resistant. Due to a secondary cleavage site, presumably located in exon 7, SCF-2 is processed into soluble SCF-2, but not as efficiently as SCF-1
Es wurde die FIt-3L-Expression in der Leber von transgenen Mäusen bei einem Alter von 6 Wochen (Fig. 5A-C) und 16 Wochen (Fig. 5A'-C') analysiert. In 6 Wochen alten Tieren wurde eine basale FIt- 3L-Expression in für IL-6/sIL-6R doppelt transgenen Mäusen (Fig. 5A), in für sIL-6R einzeln transgenen Mäusen (Fig. 5B) und in für IL-6 einzeln transgenen Mäusen (Fig. 5C) beobachtet. In älteren Mäusen (Alter: 16 Wochen) war die FIt-3L-Expression nur in für IL-6/sIL-6R doppelt transgenen Mäusen erhöht (Fig. 5A'), nicht jedoch in für sIL-6R (Fig. 5B') und in für IL-6-einzeln transgenen Tieren (Fig. 5C'). Somit führte die Anwesenheit von IL-6 zusammen mit sIL-6R, nicht jedoch von nur IL-6 zu einer Hochregulation des zellulären FIt-3L-Proteins in der Milz.FIt-3L expression in the liver of transgenic mice at 6 weeks of age ( Fig. 5A-C) and 16 weeks ( Fig. 5A'-C ') was analyzed. In 6-week-old animals, basal FIt-3L expression was found in mice transgenic for IL-6 / sIL-6R ( FIG. 5A), in mice transgenic for sIL-6R ( FIG. 5B) and in for IL-6 individually transgenic mice ( Fig. 5C) were observed. In older mice (16 weeks of age), FIt-3L expression was increased only in mice transgenic for IL-6 / sIL-6R ( Fig. 5A '), but not in sIL-6R ( Fig. 5B'). and in for IL-6 single transgenic animals ( Fig. 5C '). Thus, the presence of IL-6 together with sIL-6R, but not only IL-6, led to an upregulation of the cellular FIt-3L protein in the spleen.
Um die Auswirkungen von IL-6 und IL-6/sIL-6R in vitro untersuchen zu können wurden NIH/3T3-Zellen (Fig. 6A-C, A'-C'), humane HTB-158-Fibroblasten und primäre humane Präputium-Fibroblasten (Fig. 6A''-C'', A'''-C''') 24 Stunden ohne Zytokine (Fig. 6A-A'''), nur mit IL-6 (Fig. 6B-B''') oder mit dem Fusionsprotein Hyper-IL-6 (Fig. 6C-C'''), bei dem IL-6 über einen flexiblen Aminosäurerlinker mit dem löslichen Rezeptor kovalent verknüpft ist, inkubiert. In allen drei Zelltypen führte die Behandlung mit IL-6 nur zu einer sehr schwachen Hochregulation der Expression von SCF und FIt-3L (Fig. 6B-B'''). Die Behandlung mit Hyper-IL-6 führte jedoch zu einer stark erhöhten Expression von SCF und FIt-3L (Fig. 6C-C'''). Somit führt in murinen und humanen Fibroblasten-Zellinien und humanen primären Fibroblasten die Co-Stimulation mit IL-6 und sIL-6R zu einer starken Expression der hämatopoetischen Zytokine SCF und FIt-3L.In order to investigate the effects of IL-6 and IL-6 / sIL-6R in vitro, NIH / 3T3 cells (FIGS . 6A-C, A'-C '), human HTB-158 fibroblasts and primary human prepuce were used -Fibroblasts ( Fig. 6A '' - C '', A '''-C''') 24 hours without cytokines ( Fig. 6A-A '''), only with IL-6 ( Fig. 6B-B''') or with the fusion protein Hyper-IL-6 ( Fig. 6C-C '''), in which IL-6 is covalently linked to the soluble receptor via a flexible amino acid linker. In all three cell types, treatment with IL-6 only led to a very weak upregulation of the expression of SCF and FIt-3L ( FIG. 6B-B '''). However, treatment with Hyper-IL-6 led to a greatly increased expression of SCF and FIt-3L ( Fig. 6C-C '''). Thus, in murine and human fibroblast cell lines and human primary fibroblasts, co-stimulation with IL-6 and sIL-6R leads to strong expression of the hematopoietic cytokines SCF and FIt-3L.
Es wurde untersucht, ob die beobachtete Hochregulation von SCF und FIt-3L als Antwort auf Hyper-IL-6 für die Expansion humaner Nabelschnurblut-Cd34+-Zellen in vitro ausreicht. In Anbetracht der Spezies- Spezifität zwischen humanen und murinen Zytokinen und ihren Rezeptoren und der Tatsache, daß sowohl humane als auch murine Fibroblasten-Zellinien SCF und FIt-3L gleichermaßen gut nach Stimulation mit IL-6 oder Hyper-IL-6 exprimierten, wurde die humane Fibroblasten-Zellinie HTB-158 für die Co-Kultivierungsexperimente verwendet. Dazu wurden HTB-158-Zellen mit IL-6 (50 ng/ml) oder Hyper-IL-6 (10 ng/ml) in 3 ml Kulturmedium behandelt. Im Anschluß daran wurden die Fibroblasten gemeinsam mit humanen Nabelschnurblut-CD34+-Zellen zwei Wochen kultiviert. Neben der Gesamtzellzahl (Fig. 7A) wurde auch die Häufigkeit koloniebildender Einheiten nach einem Zeitraum von 14 Tagen zur Abschätzung der Expansion unreifer Vorläuferzellen bestimmt. Wie aus Fig. 7B ersichtlich ist führte die Vorstimulation mit IL-6 nur zu einem sehr leichten Anstieg der Koloniezahl nach 14 Tagen. Die Vorstimulation mit Hyper-IL-6 ergab jedoch im Vergleich zu der Kontrollbehandlung nach 14 Tagen die doppelte Koloniezahl. Zum Nachweis darüber, daß die beobachteten Auswirkungen hinsichtlich des Koloniewachstums tatsächlich von der Gegenwart der humanen Fibroblasten abhängig war, wurde das Experiment in Abwesenheit von Fibroblasten wiederholt (Fig. 7C und 7D). Dabei zeigte sich, daß die Stimulation von CD34+-Zellen mit IL-6 oder Hyper-IL-6 nicht zu einer Zunahme der Koloniebildung nach 14 Tagen führte (Fig. 7D). Somit zeigt dieses Experiment, daß die in vitro Stimulation humaner Fibroblasten mit Hyper-IL-6 die Expansion humaner hämatopoetischer Vorläuferzellen bei Co-Kultivierung steigert.It was examined whether the observed upregulation of SCF and FIt-3L in response to Hyper-IL-6 is sufficient for the expansion of human umbilical cord blood Cd34 + cells in vitro. Considering the species specificity between human and murine cytokines and their receptors and the fact that both human and murine fibroblast cell lines expressed SCF and FIt-3L equally well after stimulation with IL-6 or Hyper-IL-6, the human fibroblast cell line HTB-158 used for the co-cultivation experiments. HTB-158 cells were treated with IL-6 (50 ng / ml) or Hyper-IL-6 (10 ng / ml) in 3 ml culture medium. The fibroblasts were then cultured together with human umbilical cord blood CD34 + cells for two weeks. In addition to the total cell number ( FIG. 7A), the frequency of colony-forming units was also determined after a period of 14 days to estimate the expansion of immature progenitor cells. As can be seen from FIG. 7B, pre-stimulation with IL-6 only led to a very slight increase in the number of colonies after 14 days. However, pre-stimulation with Hyper-IL-6 resulted in double the colony count after 14 days compared to the control treatment. The experiment was repeated in the absence of fibroblasts to demonstrate that the observed effects on colony growth were actually dependent on the presence of human fibroblasts ( Figures 7C and 7D). It was shown that stimulation of CD34 + cells with IL-6 or Hyper-IL-6 did not lead to an increase in colony formation after 14 days ( FIG. 7D). Thus, this experiment shows that in vitro stimulation of human fibroblasts with Hyper-IL-6 increases the expansion of human hematopoietic progenitor cells when co-cultivated.
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