DE10054632B4 - Verfahren zur Isolierung von disseminierten Krebszellen aus einer zellhaltigen Körperflüssigkeit und Verwendung einer Filtervorrichtung in einem solchen Verfahren - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Isolierung von disseminierten Krebszellen aus einer zellhaltigen Körperflüssigkeit, wobei man
die zellhaltige Körperflüssigkeit oder Teile davon in einen Einlassstutzen eines Filtergehäuses senkrecht zu einem im Filtergehäuse angeordneten Flachfilter einleitet,
kurz vor dem Erreichen der Filteroberfläche mit Hilfe von Umlenkmitteln die Körperflüssigkeit seitlich aus dem Einlassstutzen in einen einlassseitigen Fluidraum des Filtergehäuses, welches eine geringe Höhe über dem Filter und ein geringes Volumen aufweist, führt
über einem in dem Filtergehäuse angeordneten Flachfilter mit einer Maschen- bzw. Porenweite von 10 bis 200 μm parallel zur Oberfläche des Flachfilters verteilt,
die Körperflüssigkeit in einen auf dem Flachfilter verbleibenden Rückstand und ein Filtrat auftrennt,
das Filtrat in einem auslassseitigen Fluidraum sammelt und über einen Auslassstutzen abführt,
und anschließend den Rückstand gewinnt.

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von disseminierten Krebszellen aus einer zellhaltigen Körperflüssigkeit und die Verwendung einer Filtervorrichtung zur Isolierung von disseminierten Krebszellen.
• Die Isolierung und Charakterisierung von Krebszellen ist vor allem im Bereich der Onkologie für die Beantwortung diagnostischer, prognostischer, therapeutischer und wissenschaftlicher Fragestellungen, sowohl im tierexperimentellen als auch im humanmedizinischen Bereich von großer Bedeutung.
• Die Isolierung von Krebszellen zur Durchführung von in-vitro oder ex-vivo Untersuchungen aus Gewebeproben, die beispielsweise von Primärtumoren oder Metastasen gewonnen werden, ist heutzutage relativ unproblematisch.
• In jüngster Zeit gewinnt jedoch die Identifizierung und Charakterisierung von sogenannten disseminierten Krebszellen zunehmend an Bedeutung. Dabei handelt es sich um in Körperflüssigkeiten zirkulierende Krebszellen, die sich von Primärtumoren, Metastasen oder Rezidiven abgelöst haben. Es ist bekannt, dass disseminierte Krebszellen genetische und physiologische Merkmale aufweisen, die sich von denen des Primärtumors, der Metastase bzw. dem Rezidiv unterscheiden. Man spricht in diesem Zusammenhang von einer sogenannten "klonalen Selektion". Demnach ist der Primärtumor ein Konglomerat von Zellen mit unterschiedlicher genetischer Ausstattung, die ständigen Veränderungen unterliegen. Aus diesem Konglomerat heraus disseminieren nur ganz bestimmte Zellen, nämlich diejenigen, die ein bestimmtes genetisches Profil erworben habe, das ihnen unter anderem die erforderlichen Eigenschaften zur Disseminierung verleiht und aufgrund dessen sich diese Zellen folglich von den im Zellverband verbleibenden Zellen oder von lediglich unspezifisch abgetrennten Zellen oder grösseren Bruchstücken des Primärtumors unterscheiden. Die selektive Identifizierung und Charakterisierung von disseminierten Krebszellen erlaubt nicht nur speziellere und frühere Diagnosen von betroffenen Patienten, sondern ermöglicht neben der Behandlung des Primärtumors auch eine weitere und davon unabhängige, individuelle, auf disseminierte Krebszellen gerichtete Therapie.
• Aufgrund der geringen Konzentration von Krebszellen in Körperflüssigkeiten sind die entsprechenden Analysen jedoch technisch extrem schwierig. Zur Isolierung der disseminierten Krebszellen müssen diese zunächst angereichert werden. Um beispielsweise Veränderun gen von Krebszellen auf DNA-Ebene zu analysieren, sind extrem reine Populationen der Krebszellen erforderlich, da ansonsten verunreinigende "Wildtyp-Zellen" potentielle Genomveränderungen überdecken, so dass diese nicht mehr detektiert werden können. Daher sind Verfahren zur unspezifischen Anreicherung von Krebszellen, beispielsweise das in US 5,529, 903 beschriebene Leukapherese-Verfahren oder das in EP-A-0 448 837 beschriebene Filtrationsverfahren zur Untersuchung von disseminierten Krebszellen nicht geeignet. Bekannte spezifische Anreicherungsverfahren beruhen meist auf einer antigenspezifischen Immunadsorption. Diese Verfahren haben jedoch den Nachteil, dass durch eine Quervernetzung der Oberflächenantigene unkalkulierbare Effekte, wie Apoptose, Anergie, Aktivierung und weitere Zustandsänderungen der Zelle auftreten können, so dass sich die Eigenschaften derartiger isolierten Zellen drastisch von den Eigenschaften der in der Körperflüssigkeit disseminierten Krebszellen vor ihrer Isolierung unterscheidet. Ausserdem kann die Sensitivität derartiger Verfahren in Fällen von fehlender oder unzureichender Epitopexpression sehr gering sein.
• In der WO 00/06702 wird ein Verfahren zur Isolierung disseminierter Krebszellen aus Körperflüssigkeiten beschrieben. Mit diesem Verfahren ist es möglich, die Krebszellen auf schonende Art und Weise, insbesondere in vitalem Zustand, anzureichern, ohne dass Antikörper verwendet oder ähnliche adsorptive Wechselwirkungen eingesetzt werden müssen. Dies eröffnet nicht nur die Möglichkeit, genomische DNA-Analytik und sogar die ein Verhältnis von wenigstens 1 : 1 Krebszellen zu Nichtkrebszellen erfordernde LOH-Analytik (LOH = loss of heterocygosity) sinnvoll durchzuführen, sondern es werden auch disseminierte Krebszellen für eine Reihe weiterer diagnostischer, therapeutischer, tierexperimenteller oder wissenschaftlicher Fragestellungen zur Verfügung gestellt. So werden zahlreiche Verwendungsmöglichkeiten disseminierter Krebszellen beschrieben, z. B. die Identifizierung neuer therapeutischer Targets; im Rahmen der Wirkstoffentwicklung das Screenen von Wirkstoffen, z. B. die Identifizierung und Charakterisierung von Leitsubstanzen und insbesondere zur Entwicklung von Wirkstoffen gegen Oberflächenstrukturen disseminierter Krebszellen; die Wahl einer vom jeweiligen Individuum und vom Stadium der Erkrankung abhängenden Therapie. Bei dem bekannten Verfahren wird eine zellhaltige Körperflüssigkeit oder Teile davon, beispielsweise eine unspezifisch angereicherte Fraktion, durch ein Sieb mit einer Maschen- bzw. Porenweite von etwa 10 bis 200 μm geführt und der auf dem Sieb zurückbleibende Siebrückstand gewonnen. Durch Verwendung von Sieben bestimmter Maschen- bzw. Porengröße, die einen größen- und gestaltabhängigen Trennvorgang ermöglichen, wird im Siebrückstand ein Krebszellanteil von wenigstens 50% erreicht. Als Siebe werden bei den bekannten Verfahren flächige oder poröse Gebilde mit Öffnungen verwendet, die so dimen sioniert sind, dass in der zellhaltigen Körperflüssigkeit enthaltene Nichtkrebszellen noch passieren können, während Krebszellen bzw. Krebszellaggregate zurück gehalten werden.
• Bei den bekannten Verfahren kann es jedoch zu einer ungleichmäßigen Ansammlung von Zellen durch eine ungleichmäßige Benetzung der Sieboberfläche kommen. Der Durchfluss durch das Sieb kann daher nur schwer geregelt und kontrolliert werden. Zur Gewinnung von vitalen Zellen müssen die auf der Sieboberfläche haftenden Rückstände erst aufwendig gelöst werden. Ohne die Anwendung von hohem Druck lösen sich die Zellen bei dem bekannten Verfahren erst nach mehrstündiger oder mehrtägiger Inkubation in einem geeigneten Puffermedium von der Siebmembran. Falls man Zellbestandteile der im Siebrückstand vorhandenen Zellen gewinnen will und daher eine Zerstörung der Zellen in Kauf nehmen kann, ist es auch möglich, das Sieb samt anhaftender Zellen in ein geeignetes organisches Lösungsmittel zu überführen. Zur Isolierung von Gesamt-RNA, DNA und Proteinen verwendet man üblicherweise Guanidinisothiocyanat und Phenol enthaltende Lösungen bzw. Lösungsgemische, z. B. die unter der Marke Trizol^® vertriebenen Produkte. Eine Automatisierung des bekannten Verfahrens ist allerdings nur mit einer aufwendigen Robotik möglich.
• Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, das aus WO 00/06702 bekannte Verfahren derart weiterzubilden, dass eine einfache Automatisierung und Standardisierung des Verfahrens ermöglicht und gleichzeitig die Reinheit der filtrierten Krebszellenfraktion weiter erhöht wird.
• Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass man die in einer Körperflüssigkeit disseminierten Krebszellen in wesentlich höherer Reinheit und mit besserer Ausbeute gewinnen kann, wenn man einen Flachfilter mit einer Maschen- bzw. Porenweite von etwa 10-200 μm verwendet, der in einem Filtergehäuse angeordnet ist, welches durch eine geeignete strömungstechnische Auslegung ein gleichmäßiges Durchspülen der Filterfläche ermöglicht.
• Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher zum einen ein Verfahren zur Isolierung von disseminierten Krebs- bzw. Tumorzellen aus einer zellhaltigen Körperflüssigkeit, gemäß vorliegendem Patentanspruch 1.
• Erfindungsgemäß wird die zellhaltige Körperflüssigkeit dabei im wesentlichen senkrecht in Richtung Filteroberfläche geführt und kurz vor Erreichen der Filteroberfläche durch geeignete Umlenkmittel im wesentlichen seitlich, beispielsweise in einem Winkel von 90°, in den einlassseitigen Fluidraum abgelenkt, so dass sich die Körperflüssigkeit praktisch über die gesamte Filterfläche verteilen kann, bevor der Flachfilter durchströmt wird. Die wirksame Filterfläche ist dabei wesentlich größer als der Innenquerschnitt des Einlassstutzens, der die Körperflüssigkeit zu dem Filter führt. Durch die spezielle Strömungsführung tritt beim Filtrieren eine parallel zur Filteroberfläche gerichtete Strömungskomponente auf, die wirksam verhindert, dass in bestimmten Bereichen des Filters eine ungleichmäßige Ansammlung oder Verklumpung von Zellen auftritt. Dabei weist der einlassseitige Fluidraum vorteilhaft nur eine geringe Höhe über dem Filter und damit ein geringes Volumen auf, so dass bereits eine geringe Flüssigkeitsmenge diesen Fluidraum ausfüllt.
• Unter Isolierung versteht man im Sinne der vorliegenden Erfindung jegliche Anreicherung eines zu isolierenden Bestandteils aus einem Gemisch, das diesen neben wenigstens einem anderen Bestandteil enthält. Das Ergebnis der Isolierung kann also durchaus ein weiteres Gemisch sein, das aber im Vergleich zum ursprünglichen Gemisch den zu isolierenden Bestandteil im Verhältnis zu wenigstens einem anderen Bestandteil in höherer Konzentration enthält.
• Der Begriff "Krebszelle" steht erfindungsgemäß für eine Zelle, die eine oder mehrere mit Krebs, also Entartung im allgemeinen Sinn, in Zusammenhang stehende Modifikation aufweist. Grundlage dieser Definition ist die Vorstellung, dass es sich bei der Entstehung von Krebs um einen kontinuierlichen Veränderungsprozess handelt. Beispielsweise bedarf es in der Regel mehrerer Veränderungen, insbesondere des genetischen Materials bzw. der Expression des genetischen Materials von Zellen auf dem Weg von einer Normalzelle zu einer Krebs- und insbesondere zu einer Tumorzelle. Der Begriff Krebszelle umfasst daher auch Vorstufen von Krebs- und insbesondere Tumorzellen mit krebsartigen bzw. tumorösen Modifikationen.
• Die Begriffe "disseminierte Krebszelle" oder "disseminierte Tumorzelle" definieren sich insbesondere im Verhältnis zu soliden Tumoren, also vor allem Primärtumoren, Metastasen und Rezidiven. Im Gegensatz zu soliden Tumoren können disseminierte Krebszellen im Körper eines Individuums zirkulieren. Dies geschieht in der Regel über körpereigene Transportorgane, vor allem Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut. In der Regel leiten sich disseminierte Krebszellen von einem soliden Tumor dadurch ab, dass sie zunächst Teil eines soliden Tumors, also insbesondere des Tumorgewebes, sind, von dem sie sich in Folge ablösen. Dadurch verlassen disseminierte Krebszellen den durch den soliden Tumor vorgegebenen Körperbereich, insbesondere die vom Tumor befallenen morphologischen Struktureinheiten, beispielsweise das Organ, und gelangen unter anderem an Orte, zu denen ausgehend vom soliden Tumor kein morphologischer Zusammenhang besteht.
• Einem besonderen Aspekt zufolge sind disseminierte Krebszellen gekennzeichnet durch ihre relativ geringe Menge bezogen auf gleichermaßen vorhandene Nichtkrebszellen. Man bezeichnet sie daher auch als Restkrebszellen (minimal residual disease, kurz MRD). Betrachtet man beispielsweise zellhaltige Körperflüssigkeiten, so liegt der Anteil disseminierter Krebszellen in der Regel unterhalb von 1 : 1000, meist unterhalb von 1 : 10.000 und in vielen Fällen sogar unterhalb von 1 : 100.000, bezogen auf die Anzahl von Nichtkrebszellen einer zufällig genommenen Probe der Körperflüssigkeit. Im Falle von Blut gelten diese Verhältnisse insbesondere in Bezug auf mononukleäre Zellen (kurz: MNC).
• Zellhaltige Körperflüssigkeiten im Sinne der vorliegenden Erfindung sind all jene Körperflüssigkeiten, welchen disseminierte Krebszellen enthalten können. Dabei kann es sich sowohl um native Körperflüssigkeiten handeln, die dem Körper entnommen werden oder von diesem ausgeschieden werden, als auch um nichtnative Flüssigkeiten, insbesondere Waschflüssigkeiten, die Zellen aus dem Körper und insbesondere bestimmten Körperteilen und Organen enthalten. Man kann beispielsweise derartige Flüssigkeiten dem Körper zunächst in geeigneter Weise zuführen und dann wieder entnehmen. Selbstverständlich können auch native mit nichtnativen Flüssigkeiten versetzt sein. Zu nennen sind beispielsweise Lymphe, Urin, Sputum, Ascites, Ergüsse, Fruchtwasser, Punktate, Waschflüssigkeiten von Organen, z. B. Colon-, Lungen-, Bronchiallavage oder Blasenspülflüssigkeiten, Aphereseprodukte, Fäzes und insbesondere Knochenmark (vor oder nach Transplantation) und Blut. Es kann sich um Körperflüssigkeiten unterschiedlicher Spezies handeln, beispielsweise von Säugern, insbesondere Menschen, Labor- und Versuchstieren, wie Mäusen, Ratten, Kaninchen, Meerschweinchen usw. Derartige Körperflüssigkeiten können dem Siebvorgang direkt zugeführt werden. Vielfach ist es allerdings von Vorteil, die zellhaltige Körperflüssigkeit zunächst einer vorbereitenden Aufbereitung zu unterziehen. So kann man beispielsweise zelluläre von nichtzellulären Bestandteilen trennen. Auch die zellulären Bestandteile können ggf. noch weiter aufgetrennt werden, indem man beispielsweise eine zellhaltige Fraktion isoliert, in der bekanntermaßen Krebszellen mit enthalten sind. Zu diesem Zweck bieten sich vor allem an sich bekannte physikalische Trennverfahren, wie die Dichtegradientenzentrifugation, an.
• Bevorzugt ist der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Flachfilter im wesentlichen kreisförmig zugeschnitten. Das zu filtrierende Fluid, also die Körperflüssigkeit oder Teile davon, kann beispielsweise durch im einlassseitigen Fluidraum angeordnete, radial vom Ende des Einlassstutzens zum Aussenrand des Flachfilters verlaufende Kanäle über die Filterfläche verteilt werden. Es ist auch denkbar, einen spiralförmig vom Einlassstutzen zum Außenrand des Flachfilters verlaufenden Kanal vorzusehen. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens verteilt man das zellhaltige Fluid aber über radial angeordnete Stichkanäle und eine Vielzahl konzentrischer, mit den Stichkanälen kommunizierender Kreiskanäle über den Flachfilter.
• Zur Realisierung der als besonders vorteilhaft erkannten Strömungsführung der zu filtrierenden zellhaltigen Körperflüssigkeit eignen sich insbesondere Filtervorrichtungen, wie sie beispielsweise in den US-Patenten US 2,818,178 und US 4,113,627 oder der deutschen Patentanmeldung DE-A-28 09 321 beschrieben sind. Besonders bevorzugt wird jedoch das in der deutschen Patentanmeldung DE-A-32 02 330 beschriebene Filtergehäuse verwendet. Derartige Filtervorrichtungen werden heute beispielsweise von der Fa. Sartorius, Göttingen, Deutschland unter der Marke MINISART^®, von der Millipore Corp. unter den Produktbezeichnungen MILLEX und MULTILEX oder von der Firma Advantec MFS, Inc. als Einmalfilter zur Hochreinigung von Flüssigkeiten bzw. zur Steril- oder Klärfiltration vertrieben. Die dabei verwendeten Porendurchmesser der Filtermembranen liegen jedoch typischerweise im Bereich von einem Mikrometer und weniger. Die besondere Eignung derartiger Filtergehäuse in Verbindung mit Flachfiltern einer Porengrößen im Bereich von 10 bis 200 μm zur Isolierung von disseminierten Krebszellen war daher völlig überraschend.
• Werden Krebszellen aus Blut isoliert, so ist erfindungsgemäß bevorzugt, zunächst Zellen des weißen Blutbildes durch Dichtegradientenzentrifugation abzutrennen. Krebszellen findet man vor allem in der Fraktion, die auch mononukleäre Zellen enthält, so dass diese Fraktion bevorzugt der anschließenden Filtration zugeführt wird.
• Die Filtration der zellhaltigen Körperflüssigkeit oder der Fraktion ist beendet, wenn die gesamte zellhaltige Flüssigkeit den Flachfilter passiert hat. Es kann sich ein Waschvorgang anschließen, bei dem weitere Flüssigkeit, vorzugsweise Puffer oder Kulturmedium, durch den Flachfilter geführt wird. Die Waschflüssigkeit kann zu dem zuvor gewonnenen Filtrat gegeben oder auch getrennt davon gesammelt und ggf. verworfen werden.
• Die auf dem Flachfilter zurückgehaltene Zellfraktion kann direkt der sich anschließenden Verwendung, beispielsweise der Charakterisierung der Zellen, insbesondere der Krebs- oder Tumorzellen oder der Aufbewahrung zugeführt werden. Vorteilhafterweise wird der die Krebszellen enthaltende Rückstand zunächst von dem Flachfilter abgelöst und gesammelt. Je nach Art der anschließenden Verwendung kann man zu diesem Zweck verschiedene Vorgehensweisen wählen.
• Man beispielsweise den Rückstand in einer Lösung inkubieren, die zur Lyse der Zellen führt und die Gewinnung von Zellbestandteilen, wie Nukleinsäuren, Proteinen oder Lipiden er laubt. Zur Gewinnung von Nukleinsäuren wird man beispielsweise eine Guanidinisothiocyanat und Phenol enthaltenden Lösung verwenden. Dabei ist es vorteilhaft, wenn die Lösung während der Inkubation bewegt wird. Bei einer manuellen Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann man beispielsweise jeweils einen Spritzenkolben am Einlass- und am Auslassstutzen der Filtervorrichtung anschließen und die Lösung zwischen den beiden Spritzen hin und her pumpen. Bei einem automatisierten Verfahrensablauf kann eine entsprechende Bewegung der Lösung durch Fördermittel, wie beispielsweise Pumpen realisiert werden.
• Zur Gewinnung vitaler Krebszellen löst man den am Flachfilter anhaftenden Rückstand vorteilhaft durch Rückspülen des Filters mit einer Flüssigkeit ab, die man vom auslassseitigen Fluidraum des Filtergehäuses in den einlassseitigen Fluidraum fördert. Vorteilhaft handelt es sich bei der Rückspülflüssigkeit um eine Pufferlösung oder ein Kulturmedium. Die so gewonnen Krebs- oder Tumorzellen können beispielsweise zur Gewinnung von Zellbestandteilen oder von Vakzinen kultiviert werden.
• Die beiden beschriebenen Verfahren besitzen den Vorteil, dass sie in einem automatisierten Verfahren ohne aufwendige Robotik realisiert werden können, während andere Verfahren, beispielsweise solche, bei denen die Krebszellen mit Zentrifugalkraft oder mittels sogenannter optischer Pinzetten von der Filteroberfläche abgelöst werden umfangreichere, Manipulationen erfordern und daher einer Automatisierung nur schwer zugänglich sind.
• Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Krebs- bzw. Tumorzellen lassen sich im Bereich des Drug-Screening bzw. Drug-Targeting zur Identifizierung neuer Wirkstoffe oder zur Identifizierung weiterer Zielgruppen für bereits bekannte Wirkstoffe verwenden. Weitere Anwendungen liegen im Bereich Genomics und Proteomics. Zur detaillierten Darstellung der erfindungsgemäß vorgesehenen Anwendungen, sowie typischer Protokolle bei der Gewinnung und Aufbereitung der filtrierten Krebszellen sei auf die WO 00/06702 des Anmelders verwiesen.
• Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung einer Filtervorrichtung zur Isolierung von disseminierten Krebszellen aus einer zellhaltigen Körperflüssigkeit gemäß vorliegendem Patentanspruch 7.
• Die Verteilerkanäle umfassen, wie oben bereits erwähnt, besonders bevorzugt eine Vielzahl konzentrischer Kreiskanäle, welche durch mehrere radial verlaufende und in dem Einlassstutzen endende Stichkanäle geschnitten sind, was eine besonders effektive Verteilung der zu filtrierenden Flüssigkeit über der Filteroberfläche gewährleistet. Vorzugsweise ist ein derartiges Verteilersystem nicht nur im einlassseitigen Fluidraum sondern auch in den auslassseitigen Fluidraum vorgesehen. Diese zweiten Verteilerkanäle umfassen zweite Kreiskanäle und zweite Stichkanäle, die weitgehend mit den ersten Kreiskanälen und den ersten Stichkanälen übereinstimmen, wobei jedoch die zweiten Stichkanäle in den Auslassstutzen des Filtergehäuses münden.
• Um das über den Einlassstutzen einströmende Fluid möglichst effektiv über eine größere Filterfläche zu verteilen, endet der Einlassstutzen und/oder der Auslassstutzen mit seinem inneren Querschnitt dicht oberhalb einer von der Kanalsohle der Kreiskanäle gebildeten Ebene als Sackloch oder als Prallplatte. Die Stichkanäle schneiden das Sackloch im Bereich des Sacklochbodens zur Bildung von Verbindungsschlitzen teilweise an. Der Boden des Sacklochs gewährleistet dabei eine zusätzliche Abstützung des Flachfilters.
• Die Kreiskanäle sind im Querschnitt bevorzugt halbkreisförmig ausgebildet. Vorteilhaft reicht der den Verbindungsschlitzen der Peripherie am nächsten liegende Kreiskanal mit seiner Kanalsohle etwa bis zur äußeren Höhe der Verbindungsschlitze und verbindet als Kurzschlussringleitung sämtliche Verbindungsschlitze untereinander.
• Das Filtergehäuse ist bevorzugt als zweiteiliges Kunststoffgehäuse ausgebildet, wobei jedes Gehäuseteil einschließlich der zugehörigen Verteilerkanäle vorteilhaft als einstückiges Kunststoffspritzteil ausgebildet ist.
• Während die an sich bekannten zur Mikrofiltration eingesetzten Einmalfilter mit Flachfiltern versehen sind, die typischerweise eine Porengröße von unter 1 μm besitzen, weist der erfindungsgemäße Flachfilter eine Maschen- bzw. Porenweite von etwa 10-200 μm, vorzugsweise von 15 bis 30 μm, besonders bevorzugt von 17-27 μm und ganz besonders bevorzugt von etwa 20 μm auf. Vorteilhaft ist der Flachfilter als Membranfilter ausgebildet, wobei typische Filtermaterialien, wie Kunststoffnetzwerke oder Gewebe, mikroporöse Membranfilter, Filterfliese oder Kombinationen davon eingesetzt werden können. Geeignete Filtermaterialien und geeignete Herstellungsverfahren für derartige Filter sind insbesondere in der WO 00/06702 beschreiben. Besonders bevorzugt werden Filter aus lösungsmittelbeständigem Material verwendet, die beispielsweise aus Kunststoffen, wie Polypropylen, Polytetrafluorethylen, hochlfluoriertem Polymeren, Vinylidenfluorid, Aminoplasten, insbesondere Polyethylen bestehen können. Zur Auswahl des für die Isolierung bestimmter Krebszellen jeweils geeigneten Filters wird der Fachmann in Vorversuchen mit immer engmaschigeren Filtern (beispielsweise in der Reihenfolge 200 μm, 115 μm, 74 μm, 51 μm, 38 μm, 30 μm, 27 μm, 20 μm, 17 μm, 15 μm und 10 μm) einzelne Zellfraktionen gewinnen und auf deren therapeutische und diagnostische Relevanz untersuchen. Dabei kann es sich auch als vorteilhaft erweisen Filterkombinationen einzusetzen, d. h. in obigem Beispiel etwa mit einem 115 μm-Filter weniger relevante größere Aggregate abzufiltrieren und lediglich die auf einem nachgeschalteten 30 μm-Filter gesammelte Krebszellenfraktion zu analysieren.
• Die Verbindung und Abdichtung des Flachfilters mit den beiden Gehäuseteilen bzw. auch die Verbindung der beiden Gehäuseteile untereinander erfolgt durch übliche Verbindungstechniken, wie Kleben, Verschweißen, Ultraschallverschweißen oder einfach durch Klemm- und Reibungskopplung oder mit Hilfe von Einrastungen einzelner Bauteile bzw. durch Kombination derartiger Verbindungsmittel.
• Besonders bevorzugt besteht der Flachfilter aus einer mikroperforierten Nylonmembran.
• Die Filtervorrichtung ermöglicht nicht nur eine effektive und gleichmäßige Verteilung der zu filtrierenden Flüssigkeit auf der Filteroberfläche, sondern die Anordnung aus zahlreichen konzentrischen Kreiskanälen gewährleistet auch eine wirksame Abstützung des Flachfilters über der gesamten wirksamen Filterfläche, so dass es im Betrieb zu keiner Beschädigung des Filters kommen kann.
• Beim Rückspülen des Filters zum Ablösen der zurückgehaltenen Krebszellen unterstützt das durch den Filter gewährleistete Strömungsprofil höhere Scherkräfte parallel zur Filteroberfläche, die das Ablösen der Krebszellen begünstigen.
• Die vorliegende Erfindung wird im folgenden unter Bezugnahme auf in den beigefügten Zeichnungen dargestellter Ausführungsbeispiele ausführlicher beschrieben.
• In den Zeichnungen zeigt:
• 1 einen Schnitt durch eine zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Filtervorrichtung zur Isolierung von disseminierten Krebszellen;
• 2 eine Aufsicht auf die Verteilerkanäle der Filtervorrichtung der 1;
• 3 eine schematische Darstellung eines automatisierten erfindungsgemäßen Verfahrens zur Isolierung von disseminierten Krebszellen.
• In den 1 und 2 ist eine bevorzugte Ausführungsform der zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Filtervorrichtung zur Isolierung von disseminierten Krebszellen dargestellt. Das Gehäuse der Filtervorrichtung mit den strömungstechnischen Einrichtungen entspricht dem in der deutschen Patentanmeldung DE-A-32 02 330 (Sartorius) dargestellten und dort ausführlicher beschrieben Filtergehäuse. Kurz zusammengefasst weist die Filtervorrichtung 10 zwei im wesentlichen symmetrisch aufgebaute Gehäuseteile 11 und 12 auf, die mit einem Einlassstutzen 13 bzw. einem Auslassstutzen 14 versehen sind. Im dargestellten Beispiel ist der Einlassstutzen als sog. Luer-Lok ausgebildet, während der Auslassstutzen 14 ein Luer-Konus ist. An die Stutzen 13, 14 können Spritzen oder in der Medizintechnik übliche Schlauchsysteme angeschlossen werden. Zwischen den beiden Gehäuseteilen 11, 12 ist ein im wesentlichen flächig ausgebildeter Membranfilter 15 angeordnet. Der Einlassstutzen 13 bzw. der Auslassstutzen 14 endet mit seinem inneren Querschnitt dicht oberhalb des Membranfilters 15 als Sackloch 16 bzw. 17. Im Bereich des Sacklochbodens münden radiale Stichkanäle 18 bzw. 19 in den Stutzen 13 bzw. 14. Die über den Einlassstutzen 13 einströmende zu filtrierende Körperflüssigkeit wird über Verbindungsschlitze 20 zwischen den Stichkanälen 18 und dem Sackloch 16 seitlich in den von dem oberen Gehäuseteil 11 und der Membran 15 definierten einlassseitigen Fluidraum 21 geführt und über mit den Stichkanälen 18 kommunizierende Kreiskanäle 22 über die gesamte Fläche der Filtermembran 15 verteilt (vgl. insbesondere die Unteransicht des Gehäuseteils 11 in 2). Der Boden des Sacklochs 16 weist einen den Fluidstrom in die Verbindungsschlitze 20 ablenkenden kegeligen Strömungsteiler 23 auf, welcher die Strömungsführung der einfließenden Flüssigkeit begünstigt und Stauzonen im Bereich des Sacklochs 16 vermeidet. Ein entsprechender Strömungsteiler 24 ist auch im Sackloch 17 des Auslassstutzens 14 vorgesehen, was einen wirksamen Abtransport des Filtrats aus dem auslassseitigen Fluidraum 25 ermöglicht. Im dargestellten Beispiel ist der innerste Kreiskanal 26 als Kurzschlusskanal ausgebildet, der sämtliche Stichkanäle 18 unmittelbar hinter den Verbindungsschlitzen 20 kurz schließt, was wiederum eine gleichmäßige Strömungsverteilung über die gesamte Fläche des Membranfilters 15 gewährleistet (vergl. insbesondere 2).
• Die erfindungsgemäße Verwendung der Filtervorrichtung ermöglicht auch eine besonders einfache Automatisierung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Isolierung von disseminierten Krebszellen aus einer zellhaltigen Körperflüssigkeit.
• In 3 ist eine Ausführungsform einer Vorrichtung 40 zur automatisierten Isolierung von Krebszellen schematisch dargestellt. Kernstück der Vorrichtung 40 ist eine Einmal-Kartusche 30, die einen Probenbehälter 31, die erfindungsgemäße Filtervorrichtung 10 und einen Auffangbehälter 32 enthält. Eine Leitung 33 führt vom Probenbehälter 31 zum Einlassstut zen 13 des Filters 10. Über ein T-Stück führt eine Leitung 34 von der Leitung 33 zum Auffangbehälter 32. Vom Auslassstutzen 14 des Filters 10 führt eine Leitung 35 weg, in die, ebenfalls über ein T-Stück, eine Leitung 36 mündet. Die Einmal-Kartusche 30 wird so in die Isoliervorrichtung 40 gesetzt, dass die Leitungen 33, 34, 35 und 36 durch steuerbare Schlauchklemmen 41, 42, 43 und 44 laufen. Die Vorrichtung 40 umfasst ein steuerbares 6-fach Ventil 45 und ein steuerbares 4-fach Ventil 46, mit deren Hilfe Wasser aus einem Behälter 47, Pufferlösung aus einem Behälter 48 und ein organisches Lösungsmittel, wie Trizol^®, aus einem Behälter 49 entweder über den Einlassstutzen 13 oder den Auslassstutzen 14 durch die Filtervorrichtung 10 geleitet werden können. Die die zu isolierenden Krebszellen enthaltende Körperflüssigkeit oder Teile bzw. Fraktionen davon, beispielsweise eine Fraktion menschlichen Blutes, wird in den Probenbehälter 31 gefüllt. Durch entsprechende Schaltung des Ventils 45 und mittels nicht dargestellter Förderpumpen wird Pufferlösung aus dem Behälter 48 über die Leitungen 50 und 51 in den Behälter 31 gepumpt, so dass die Körperflüssigkeit über geöffnete Ventile 41 und 43 aus dem Behälter 31 durch den Filter 10 gefördert wird. Im dargestellten Beispiel wird das Filtrat in einem Abfallbehälter 52 gesammelt. Nach Filtrieren der gesamten Probe wird der über dem Filter 10 verbleibende Rückstand vom Filter gelöst und in dem Auffangbehälter 32 gesammelt. Dazu werden die Ventile 41 und 43 geschlossen und die Ventile 42 und 44 geöffnet. Durch entsprechende Schaltung der Ventile 45 und 46 wird nun Pufferlösung über die Leitungen 50, 53 und 36 im Gegenstrom zur ursprünglichen Förderrichtung der Körperflüssigkeit durch den Filter 10 gepumpt. Dabei lösen sich die am Filter anhaftenden Krebszellen und werden über die Leitung 34 in den Auffangbehälter 32 transportiert. Es ist auch möglich, zum Ablösen der Zellen anstelle von Pufferlösung ein flüssiges Kulturmedium zu verwenden.
• Aus den im Behälter 32 gesammelten vitalen Zellen lassen sich beispielsweise Zelllinien kultivieren. Für Anwendungszwecke, bei denen die Gewinnung von vitalen Zellen nicht erforderlich ist, kann auch ein organisches Lösungsmittel oder eine Lösungsmittelgemisch, wie Trizol^®, zum Ablösen der Zellen verwendet werden. In diesem Fall fördert man vorzugsweise eine bestimmte Menge Trizol^® aus dem Behälter 49 über die Leitungen 54 und 36 in den Filter 10. Man kann dann die (nicht dargestellte) Förderpumpe anhalten und die auf dem Filter gesammelten Krebszellen eine gewisse Zeit in dem Lösungsmittel inkubieren, was zur Auflösung der Zellen führt. Man kann aber auch durch alternierenden Betrieb einer Förderpumpe eine Hin- und Herbewegung des Lösungsmittels in der Filtervorrichtung 10 induzieren. Bei manuellem Betrieb kann man an den Stutzen 13 und 14 (hier nicht dargestellte) Spritzenkolben anschließen und eine gewisse Menge Lösungsmittel durch den Filter 10 hin und her bewegen. Im dargestellten Beispiel werden die Zellfragmente schließlich mit weiterem Trizol^® über die Leitung 34 in den Auffangbehälter gefördert. In diesem Fall kann der Auffangbehälter aber auch hinter dem Auslassstutzen 14 angeordnet sein, wobei man dann Trizol^® über die Leitungen 53 und 51 und den Probenbehälter 31 über die Einlassseite in den Filter 10 fördert. Über Leitungen 55 und 56 kann das System mit Reinigungsmitteln, Luft oder Wasser gespült werden.
• Bei einer weitgehenden Automatisierung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann man auch (hier nicht dargestellte) computergesteuerte Greifarme vorsehen, welche die Kartuschen 30 nach Beendigung eines Filtrationsvorgangs gegen Reinigungskartuschen oder gegen neue Einmal-Kartuschen 30 austauschen. Die Kartuschen können über Transportbänder an die Vorrichtung 40 herangeführt werden.
• Nachgereichtes Vergleichsbeispiel:
• 1. Nachweis von Tumorzellen bei gesunden Spendern mit dem erfindungsgemäßen Verfahren:
• Bei 13 gesunden, weiblichen Spendern wurde jeweils ca. 20 ml heparinisiertes Blut entnommen und Kontrollzellfraktion und Filterzellfraktion isoliert. Aus diesen Fraktionen wurden DNS und RNS mittels der Trizol-Methode extrahiert. Zur Detektion von Tumorzellen wurde ein Panel von 15 DNS-Parametern benutzt (c-MycAmplifikation, c-erbB2-Amplifikation, p53-LOH, RB-LOH, DCC-LOH, APC-LOH, E-Cadherin-LOH, D9S171-LOH, D9S126-LOH, D17S926-LOH, D17S960-LOH, D16S265-LOH, D17S849-LOH, D11S528-LOH, D-17S695-LOH).
• Es wurden keine DNS-Veränderungen gefunden, d.h. das erfindungsgemäße Verfahren erzeugt keine falsch-positiven Ergebnisse.
• 2. Nachweis von Tumorzellen bei Krebspatienten
• Vergleich MRCC(minimale residual cancer cells)-Detektion des erfindungsgemäßen Filter-Verfahrens mit dem Sieb-Verfahren des Standes der Technik gemäß WO 00/06702:
• Es wurden insgesamt 46 Patienten untersucht. Bei 28 Patienten wurden die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren isolierten Zellaggregate auf den Filtern, die Tumorzellen enthalten, direkt mit Trizol behandelt und die Nukleinsäuren extrahiert ("Analytischer Filter"). Bei 18 weiteren Patienten wurden die Filter nach dem Durchlauf der Zellen umgedreht, die Aggregate mit PBS vom Filter gespült, abzentrifugiert und das Zellpellet mit Trizol lysiert und die Nukleinsäuren isoliert ("Reflux-Filter, präparativ").
• In Vergleichsversuchen wurde die Zellaggregate mit dem Siebverfahren gemäß WO 00/067 gewonnen.
• In beiden Fällen wurden die gleichen DNA-Parameter parallel analysiert. Die Anzahl und Kombination der zu untersuchenden DNS-Parameter richtete sich nach den Krebsarten.
• Unter den ersten 28 Patienten waren 13 Brustkrebspatienten (15 DNS-Parameter), 3 Darmkrebspatienten (12 DNS-Parameter), 1 Prostatakrebspatient (11 DNS-Parameter), 3 Cervixkarzinompatienten (9 DNS-Parameter), 2 Patienten mit Blasenkarzinom (13 DNS-Parameter), 2 Patienten mit Ovarialkarzinom (10 DNS-Parameter), 2 Patienten mit Lungenkarzinom (10 DNS-Parameter), 2 Patienten mit Pankreaskarzinom (10 DNS-Parameter). Als Kriterium für Tumorzellen wurden 1 DNS-Veränderung bzw. mehr als 1 DNS-Veränderung als Bewertungsmaßstab genommen (= positiv).
  Ergebnis 1: Mit dem erfindungsgemäßen analytischen Filterverfahren wurden 14 der 28 Fälle als positiv bewertet, gegenüber 11 der 28 Fälle mit dem Siebverfahren des Standes der Technik.
• Beim Vergleich der erfindungsgemäßen Filterverfahrens mit Rückspülung (Reflux-Filter, präparativ) wurden die zweite, aus insgesamt 18 Patienten bestehende Patientengruppe untersucht. Dabei wurden 8 Brustkrebspatienten, 4 Darmkrebspatienten, 1 Prostatakrebspatient, 1 Kopf- und Nackenkrebspatient (10 DNS-Parameter), 3 Patienten mit Ovarialkarzinom und 1 Patient mit Uteruskrebs (12 DNS-Parameter) analysiert.
  Ergebnis 2: Mit dem erfindungsgemäßen präparativen Reflux-Filterverfahren wurden 8 der 18 Fälle als positiv bewertet, mit dem Siebverfahren 4 der 18 Fälle.
• Zusammengefasst konnten also mit dem erfindungsgemäßen Filterverfahren in 22 von 46 Fällen minimale Krebszellen im peripheren Blut identifiziert werden, während dies mit dem konventionellen Siebverfahren nur in 15 von 46 Fällen möglich war.
• Trotz der höheren Selektivität ist das erfindungsgemäße Verfahren gleichzeitig so schonend, dass praktisch keine DNS-Veränderungen, die zu falsch-positiven Ergebnissen führen könnten, induziert werden.

Claims (14)

1. Verfahren zur Isolierung von disseminierten Krebszellen aus einer zellhaltigen Körperflüssigkeit, wobei man die zellhaltige Körperflüssigkeit oder Teile davon in einen Einlassstutzen eines Filtergehäuses senkrecht zu einem im Filtergehäuse angeordneten Flachfilter einleitet, kurz vor dem Erreichen der Filteroberfläche mit Hilfe von Umlenkmitteln die Körperflüssigkeit seitlich aus dem Einlassstutzen in einen einlassseitigen Fluidraum des Filtergehäuses, welches eine geringe Höhe über dem Filter und ein geringes Volumen aufweist, führt über einem in dem Filtergehäuse angeordneten Flachfilter mit einer Maschen- bzw. Porenweite von 10 bis 200 μm parallel zur Oberfläche des Flachfilters verteilt, die Körperflüssigkeit in einen auf dem Flachfilter verbleibenden Rückstand und ein Filtrat auftrennt, das Filtrat in einem auslassseitigen Fluidraum sammelt und über einen Auslassstutzen abführt, und anschließend den Rückstand gewinnt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Körperflüssigkeit über radial angeordnete Stichkanäle und eine Vielzahl konzentrischer, mit den Stichkanälen kommunizierender Kreiskanäle über dem Flachfilter verteilt.
3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man zunächst eine zellhaltige Fraktion aus der Körperflüssigkeit isoliert und anschließend filtriert.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man den Rückstand von dem Flachfilter ablöst und sammelt.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man den Rückstand durch Rückspülen einer Flüssigkeit von dem auslassseitigen Fluidraum in den einlassseitigen Fluidraum ablöst.
6. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man den Rückstand in Guanidinisothiocyanat und Phenol enthaltenden Lösungen inkubiert.
7. Verwendung einer Filtervorrichtung, die ein Filtergehäuse (11, 12) mit wenigstens einem senkrecht zu einem Flachfilter (15) mit einer Maschen- bzw. Porenweite von 10 bis 200 μm angeordneten Einlassstutzen (13) und wenigstens einem Auslassstutzen (14) aufweist, wobei der Flachfilter (15) einen einlassseitigen Fluidraum (21) mit geringer Höhe über dem Filter und geringem Volumen von einem auslassseitigen Fluidraum (25) trennt, wobei das Filtergehäuse (11, 12) zumindest in dem einlassseitigen Fluidraum (21) Umlenkmittel (20, 23) aufweist, welche die zu filtrierende Flüssigkeit parallel zur Oberfläche des Flachfilters verteilen, zur Isolierung von disseminierten Krebszellen aus einer zellhaltigen Körperflüssigkeit.
8. Verwendung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Filtergehäuse (11, 12) zumindest in dem einlassseitigen Fluidraum (21) erste Verteilerkanäle (18, 22) aufweist, die zu dem Flachfilter (15) hin offen sind.
9. Verwendung gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Verteilerkanäle (18, 22) eine Vielzahl konzentrischer Kreiskanäle (22) aufweisen, welche durch mehrere radial verlaufende und in dem Einlassstutzen (13) endende Stichkanäle (18) geschnitten sind.
10. Verwendung gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass zweite Verteilerkanäle, welche zweite Kreiskanäle (27) und zweite Stichkanäle (19) aufweisen, in dem auslassseitigen Fluidraum (25) vorgesehen sind, wobei die zweiten Stichkanäle (19) in dem Auslassstutzen (14) enden.
11. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Einlassstutzen (13) und/oder der Auslassstutzen (14) mit seinem inneren Querschnitt dicht oberhalb einer von den Kanalsohlen der Kreiskanäle (22) gebildeten Ebene als Sackloch (16 bzw. 17) endet.
12. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Filtergehäuse (11, 12) als zweiteiliges Kunststoffgehäuse ausgebildet ist.
13. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Flachfilter (15) eine Maschen- bzw. Porenweite von 15 bis 30 μm, bevorzugt von 17-27 μm und besonders bevorzugt von etwa 20 μm aufweist.
14. Verwendung gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Flachfilter (15) ein Membranfilter ist.