DE10024788A1 - Stabilitäts-, Biokompatibilitäts-optimiertes Adjuvans (SBA) zur Erhöhung der humoralen und zellulären Immunantwort - Google Patents

Abstract

Die Erfindung beinhaltet ein Stabilitäts- und Biokompatibilitätsoptimiertes Adjuvants (SBA) zur Erhöhung der humoralen und zellulären Immunantwort bei Injektion zusammen mit einem oder mehreren Antigenen. Das Adjuvants besteht aus Partikeln auf der Basis von festen Lipiden oder festen Lipidmischungen. Einsatzmöglichkeiten sind Herstellung effizienterer und verträglicherer Impfstoffe, Impfungen von Menschen und Tieren, aber auch die Gewinnung von Antikörpern. Durch Wahl von Partikelgröße, Partikelladung und Oberflächeneigenschaften kann die Stärke der Immunantwort gezielt moduliert und zusätzlich speziesspezifisch angepaßt werden. Dem SBA können noch andere Adjuvantien, z. B. molekularen Adjuvantien wie GMDP, zugesetzt werden, wobei dadurch die zelluläre Immunantwort zusätzlich gesteigert wird. Das SBA ist leistungsfähiger und kostengünstiger, einfacher zu handhaben als bisherige Produkte und wird in vivo gut vertragen.

Description

1. Hintergrund der Erfindung

Antigene werden Tieren und Menschen appliziert, um Antikörper zu er­ zeugen. Ziele sind dabei zum Beispiel die Immunisierung von Menschen oder Tieren zum Schutz vor Erkrankungen oder die Erzeugung von Anti­ körpern, die nachher isoliert und zu Produkten verarbeitet werden. Der häufigste Applikationsweg für Antigene ist die parenterale Verabreichung; alternative Wege sind z. B. die orale, nasale und topische Applikation.

Ein häufiges Problem ist, daß oft die Stärke der Immunantwort auf das verabreichte Antigen für den beabsichtigten Zweck nicht ausreicht. Manchmal kann das Problem dadurch gelöst werden, daß die verabreichte Dosis des Antigens stark erhöht wird. Ein ernsthaftes Problem ist jedoch, daß Antigene oft sehr teuer sind und die Dosiserhöhung zu einer entspre­ chenden Verteuerung des Impfstoffes führt. Diese Kosten führen zu einer starken Belastung des Gesundheitssystems, für viele Bevölkerungs­ schichten - insbesondere in der Dritten Welt - wird der Impfstoff zu teuer und wünschenswerte Massenimpfungen können nicht durchgeführt wer­ den.

Ein alternativer Lösungsansatz ist die Verabreichung von Antigenen zu­ sammen mit einem Adjuvans, das die Antigenwirkung verstärkt und so zu einem höheren Antikörpertiter führt. Das Adjuvans-Prinzip wurde erstma­ lig 1948 von Jules Freund beschrieben [Freund, J. J. Immunology 1948, 60, 383-398] und durch zwei Emulsionen auf der Basis von Mineralöl rea­ lisiert. Freunds unvollständiges Adjuvans (Freund's Incomplete Adjuvant - FIA) ist eine Mischung von Mineralöl mit Mannide Monooleat (Montanide, Arlacel). Zur Anwendung mischt man es mit der Antigenlösung und inji­ ziert die gebildete Emulsion. Die dadurch hervorgerufene Verstärkung der Immunantwort ist so groß, daß FIA immer noch als "Goldstandard" her­ angezogen wird, wenn neue Adjuvantien entwickelt und getestet werden. Man bewertet ihre Effizienz und Qualität durch Vergleich mit FIA, wobei jedoch viele neu entwickelte Adjuvantien deutlich unterhalb der Effizienz von FIA bleiben (z. B. bei 0,2, FIA = 1,0).

Der Zusatz von abgetöteten Mycobakterien zu FIA (z. B. M. tuberculosis) erhöhte weiterhin die Immunantwort. Diese Mischung wird als Freunds komplettes Adjuvans bezeichnet (Freund's Complete Adjuvant - FCA). Die Ölemulsion nach Freund erzeugt jedoch entzündliche und ulzerierende Geschwülste (Granulome) an der Injektionsstelle, teilweise brechen sie auf und gehen in sich ausbreitende Abszesse über. Nach heutigem Standard steht daher die Anwendung der Ölemulsion nach Freund am Menschen außerhalb jeglicher Frage. Teilweise erfolgt die Anwendung bei Tieren. Oft ist das Allgemeinbefinden der Tiere so stark beeinträchtigt, daß es zu un­ wirtschaftlichen Ausfällen kommt. Die von Freund zur Komplettierung des Adjuvans vorgeschlagenen Mycobakterien M. tuberculosis oder M. buty­ ricum sind ebenfalls schlecht verträglich. Auch sie rufen Granulome und Fieber sowie Abszesse an der Einstichstelle hervor [Brown, E. A. Rev Aller­ gy 1969 23(5): 389-400].

Es besteht daher die Aufgabe, ein verträglicheres Adjuvans zu finden, ins­ besondere unter den Gesichtspunkten kostengünstige Impfstoffe herzu­ stellen, wünschenswerten weltweiten Impfungen gegen bestimmte Er­ krankungen, die nur mit einem kostengünstigen Impfstoff finanziell reali­ sierbar sind und der zunehmenden Bedeutung immunologischer Produk­ tionstechniken und Produkte. Auch unter zunehmendem Bewußtsein für die Schutzbedürftigkeit von Tieren und entsprechendem Druck der Ge­ setzgebung muß ein verträglicheres, (d. h. biokompatibles) gleich effizien­ tes, aber gleichzeitig kostengünstiges Adjuvans gefunden werden. Zusätz­ lich muß es physikalisch stabil sein, damit eine Zumischung vor der In­ jektion entfallen kann und Schwankungen in der Effizienz - z. B. durch unterschiedliche Dispergierung - eliminiert werden.

Das heutzutage am häufigsten eingesetzte Adjuvans mit Zulassung zur Anwendung am Menschen ist eine feine Suspension von Aluminium­ hydroxid, dessen Wurzeln noch archaischer sind als die der Emulsion von Freund [Glenny, A. T. et al. J. Pathol. 1926, 29 31-40]. Es basiert auf der Annahme, daß Antigene vom Immunsystem besser erkannt werden, wenn sie auf der Oberfläche der Aluminiumhydroxid-Partikel adsorbiert sind. Nachteilig ist jedoch, daß Aluminiumhydroxid weniger effizient ist als Freunds Adjuvans und es ebenfalls Granulome bewirken kann.

Ausgehend von Freunds Emulsion wurden neuerdings Emulsionen be­ schrieben, welche aus verträglicheren Materialien bestehen wie z. B. Squalan und Sqalen, [Sanchez-Pestador, L. et al. J. Immunol. 1988 141, 1720-1727, Masihi KN, Lunge, W., Bremer W., Ribi, E. Int. J. Immuno­ pharmacol. 1986 8(3), 339-45, Hunter R. L., Bennett, B. Scand J Immunol. 1986 23(3), 287-300, Allison AC, et al. Semin Immunol. 1990 2(5), 369-74]. Eines dieser Systeme ist MF59 (European Patent Application 0399843A2).

Basierend auf den Suspensionen nach Glenny wurden Partikel aus unter­ schiedlichen Polymeren bis hin zu diversen anorganischen und organi­ schen Partikeln (z. B. Kohlenstoff) eingesetzt [O'Hagan, D. T., Jeffrey, H., Roberts M. J., McGee, J. P., Davies, S. S. Vaccine. 1991 9(10), 68-71, Glenny, A. T. et al. J. Pathol. 1926, 29 31-40]. Nachteile dieser Systeme sind die Zytotoxizität einiger Polymere (z. B. Formaldehydbildung bei Po­ lyalkylcyanoacrylaten), fehlende oder zu langsame Abbaugeschwindigkeit im Organismus (z. B. Polystyrol oder Polymethacrylatderivate), unzurei­ chende Biokompatibilität (z. B. Kapselbildung bei PLA-Partikeln, pH- Verschiebung bis zu pH2) sowie mangelnde Zulassungsfähigkeit durch die Registrierungsbehörden (z. B. Rußpartikel).

Ein alternativer Weg zur Verwendung von partikulären Adjuvantien wie Öltropfen oder Feststoffpartikeln ist der Einsatz von makromolekularen Adjuvantien. Es wurde gezeigt, daß die von Freund beschriebenen My­ cobakterien durch Bausteine aus deren Kapselsubstanz ersetzt werden können, welche größere Körperverträglichkeit aufweisen. Besonders be­ schrieben und synthetisiert wurden MDP (N-acetylmuramyl-L-alanyl-D- isoglutamin) [Adam, A., Lederer, E. Med. Res. Rev. 1984 4, 111-152] Thr- MDP (threonyl Analog des MDP) [Byars NE, et al. Vaccine. 1987 5(3), 223-8] und das aus dem Joghurtbazillus stammende GMDP (N- acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl-dipeptide) [Grubhofer, N. Immunolo­ gy Letters 1995 44, 19-24]. GMDP ist ein Homolog des MDP, für GMDP wurde inzwischen eine gesteigerte immunstimulierende Wirkung nachge­ wiesen (Patentschrift DE 196 11 235 C1).

Weitere Ansätze bei der Entwicklung eines Adjuvans waren die Verwen­ dung von molekularen Adjuvantien in hoher Konzentration, so daß die Löslichkeit überschritten wurde und man eine Suspension erhielt (z. B. DDA (Dimethyldioctadecylammoniumbromid) [Grubhofer, N. Immunology Letters 1995 44, 19-24] und zur Erhöhung der humoralen Antwort die Mi­ schung von makromolekularen Adjuvantien wie Glykopeptiden mit Fest­ stoffpartikeln (z. B. GMDP mit kolloidalen Partikeln) [Grubhofer, N. Im­ munology Letters 1995 44, 19-24].

Bis jetzt ist jedoch noch keine Lösung gefunden worden, welche eine glei­ che Wirkungseffizienz wie Freunds Adjuvans aufweist und gleichzeitig den übrigen Anforderungen entspricht: Die neuen Emulsionen werden keines­ wegs immer reaktionsfrei vertragen, die synthetischen Makromoleküle wie Glykopeptide haben sich bislang den Mycobakterien nicht überlegen ge­ zeigt, zusätzlich sind sie viel zu teuer. Feststoffpartikel haben Zulas­ sungsprobleme. Viele Adjuvantien zeigen zu hohe Toxizität und somit zu geringe Biokompatibilität. Hinzu kommen Probleme mit der physikali­ schen Stabilität (Vermeidung von Aggregation bzw. Koaleszenz). So muß die FIA-Emulsion frisch hergestellt und injiziert werden, langfristige Lage­ rung ist nicht möglich. Ausreichend physikalische Lagerstabilität ist je­ doch die essentielle Voraussetzung für ein vermarktbares Produkt - insbe­ sondere für Arzneimittel.

Ziele sind somit die Herstellung eines neuen Adjuvans mit:

• 1. ausreichend physikalischer Stabilität,
• 2. geringer Zytotoxizität und ausreichender Biokompatibilität,
• 3. vergleichbarer Wirkungseffizienz zu FIA,
• 4. kostengünstiger Herstellung.

1. Beschreibung der Erfindung

Bisher mußte zur Erhöhung der immunstimulierenden Wirkung GMDP in Mischung mit kolloiddispersen festen Lipidpartikeln in einer Partikelgröße < 200 nm eingesetzt werden (USA Patent Gerbu, Bearbeitungsnummer des US Patentamtes ist 08/816,787). Der Aufbau der Partikel wurde in Unter­ suchungen für diese Erfindung systematisch modifiziert (z. B. eingesetzte Tenside, Stabilisatoren) um Lipidpartikel zu finden, die die immunstimu­ lierende Wirkung von GMDP weiter erhöhen könnten. Überraschender Weise wurde hierbei gefunden, daß Lipidpartikel alleine genau so effizient sind wie die Kombination aus Lipidpartikeln und GMDP (Beispiel 9). Somit kann in der Erfindung auf das teure GMDP verzichtet werden und eine vergleichbar hohe humorale Immunstimulierung durch ein kostengünsti­ ges Lipidpartikel alleine erzielt werden.

Die Stärke der immunstimulierenden Wirkung hängt hierbei von den Oberflächeneigenschaften der Partikel (verwendete Tenside, Partikella­ dung) und von der Partikelgröße ab. Bei negativer Ladung des Lipidparti­ kels beträgt die Wirkungseffizienz ca. 1/3 von FIA, bei Erzeugung eines positiv geladenen Lipidpartikels durch Zusatz von EQ1 ist die Wirkungsef­ fizienz vergleichbar FIA (kein signifikanter Unterschied, t-Test) (Beispiel 9). Über die Zusammensetzung der verwendeten Lipidpartikel kann somit die gewünschte Wirkungsstärke gezielt eingestellt werden. Dies vermeidet Überreaktionen des Organismus.

Aus der bisherigen Adjuvans-Forschung an anorganischen und Polymer- Suspensionen ist bekannt, daß es für jedes Antigen eine Partikelgröße mit maximaler Wirkungseffizenz gibt, ebenso ist eine Speziesabhängigkeit be­ kannt. So wird die am besten geeignete Partikelgröße von Aluminium­ hydroxid-Suspensionen für einen Impfstoff empirisch ermittelt, Polymer­ partikel als Adjuvans zur Immunisierung hatten einen unterschiedlichen Effekt als Funktion ihrer Größe [Kreuter J, et al. Vaccine. 1986, 4, 125-9]. Das gleiche wurde trotz des sehr unterschiedlichen Matrixmaterials überraschenderweise für die Lipidpartikel gefunden, so daß die Wirkungs­ stärke über Veränderung der Partikelgröße antigenspezifisch und spezies­ spezifisch moduliert werden kann.

Die Lipidpartikel-Dispersionen des stabilen biokompatiblen Adjuvans (SBA) bestehen aus in Wasser oder wäßrigen Flüssigkeiten oder nichtwäß­ rigen, z. B. öligen Flüssigkeiten dispergierten Lipidpartikeln, wobei diese durch Tenside oder Polymere stabilisiert werden können, aber nicht müs­ sen. Bei ausreichend hoher Viskosität der äußeren Phase oder Feinheit der Partikel wird eine physikalisch stabile Dispersion erhalten. Gleiches gilt auch bei niedrig viskosen äußeren Phasen, wenn die Partikel eine aus­ reichend hohe gleichsinnige Ladung tragen und somit gebildete Sedimente leicht redispergiert werden können.

Die Herstellung der SBA erfolgt durch Dispergierung oder Präzipitation, wobei in Lehrbüchern der Pharmazie und Verfahrenstechnik beschriebene allgemein bekannte Methoden eingesetzt werden. Bei der Dispergierung zerteilt man grobdisperse Lipide durch mechanische Verfahren. Die Lipide können sich hierbei im festen Aggregatzustand (z. B. Mörsermühle) oder im flüssigen Aggregatzustand befinden (z. B. Emulgierung geschmolzener Lipide durch Rührer). Zur Herstellung der SBA-Dispersion können die Li­ pide zuerst zerkleinert und anschließend in der äußeren (z. B. wäßrigen) Phase dispergiert werden oder alternativ direkt in der äußeren Phase zer­ kleinert werden. Zur Herstellung von SBA-Dispersionen durch Dispergie­ rung können z. B. u. a. eingesetzt werden: Kolben-Spalt-Homogenisatoren (z. B. APV-Homogenisatoren, French Press), Jet-Stream-Homogenisatoren (z. B. Microfluidizer), Rotor-Stator-Rührer (z. B. Ultraturax, Silverson-Homo­ genisatoren), statische Mischer im Mikromaßstab und Makromaßstab (z. B. Mischer der Firma Sulzer), Gasstrahlmühle, Rotor-Stator-Kolloidmühle und Mörsermühle (Beispiel 15).

SBA-Dispersionen zeigen eine ausreichende physikalische Langzeitstabi­ lität. Bestimmung der Partikelgröße mit Photonenkorrelationsspektrosko­ pie (PCS) und Laserdiffraktometrie (LD) zeigten kein oder vernachlässigba­ res Partikelwachstum über Zeiträume von 1-3 Jahren (Beispiel 3). Die Stabilität von SBA-Dispersionen ist der von Freunds unvollständigem Adjuvant (FIA) weit überlegen (Beispiel 1); auch gegenüber neueren Adju­ vans-Emulsionen zeigt sich eine höhere Stabilität (Beispiel 2).

Stabilität

SBA-Dispersionen stellen ein einfaches System dar. Im Gegen­ satz zu Glykopeptiden sind die eingesetzten Hilfsstoffe chemisch einfach strukturiert und robust. Anwendung von Hitze bei Sterilisationsprozessen führt zu keiner chemischen Zersetzung, die Dispersion bleibt physikalisch stabil und Partikelaggregation tritt nicht ein. Ein Beispiel für die Sterilisa­ tion von SBA-Dispersionen durch Autoklavieren (121°C, 15 Minuten, 2 bar) zeigt Beispiel 4. FIA zeigt unter gleichen Bedingungen Phasensepara­ tion.

Viele Impfstoffe werden bei niedriger Temperatur gelagert (4-6°C). Bei optimierten SBA-Dispersionen ist auch Lagerung bei Raumtemperatur und auch noch höheren Temperaturen möglich, ohne daß physikalische Destabilisierung auftritt (Beispiel 11). Dies vereinfacht die Handhabung der Produkte auf der Basis von SBA, insbesondere für heißere Klimazonen (z. B. Einsatz als Adjuvans bei Massenimpfungen in Ländern der Dritten Welt).

Biokompatibilität

Essentiell für ein breit einsetzbares Adjuvans ist geringe Toxizität und gute Biokompatibilität. In einer Schaf-Studie wurden nach Applikation von SBA-Dispersion keine Auffälligkeiten am Applikationsort beobachtet (Beispiel 6). Die gute Verträglichkeit wird erklärt mit der in vi­ tro in Zellkulturen beobachteten extrem geringen Toxizität von Lipiden. Im Vergleich zu von den deutschen Zulassungsbehörden und von der FDA zur parenteralen Applikation zugelassenen Polymeren zeigen sie eine um mindestens ca. Faktor 20 höhere Viabilität bei hohen Partikelkonzentra­ tionen (Beispiel 5). Die gute Biokompatibilität wird darauf zurückgeführt, daß allgemein Körperproteine nur zu einem geringen Ausmaß auf die Par­ tikeloberfläche adsorbieren - im Gegensatz zu anderen Partikeln (Beispiel 7). Hinzu kommt, daß auf der Oberfläche keine Proteine nachgewiesen wurden, die Unverträglichkeitsreaktionen fördern.

Für einen breiten Einsatz eines Adjuvans bietet es sich aus Kostengrün­ den an, ein Adjuvans-Präparat herzustellen, das vor der Anwendung der Antigenlösung zugemischt wird. Idealerweise sollte dabei das Adjuvans in seinen Eigenschaften so hergestellt sein, daß es bei einer Reihe unter­ schiedlicher Antigene zugemischt werden kann. Zur Verringerung des In­ jektionsschmerzes sollte die Mischung in physiologischer Kochsalzlösung oder anderweitig isotonisierter Lösung appliziert werden. Physiologische Kochsalzlösung führt aufgrund der Reduktion des Zetapotentials zu einer Destabilisierung in bispersionen und nachfolgender Aggregation [Lucks, J. S. et al., Int. J. Pharm 1990 58, 229-235]. Das SBA-Adjuvans sollte nach Zumischung zum Antigen in isotonischer Lösung ausreichend lange physikalisch stabil sein. Beispiel 8 zeigt, daß die Lipidpartikel nach Zumi­ schung zu physiologischer Kochsalzlösung sogar über 6 Stunden stabil sind; meßbare Aggregation tritt nicht auf.

Neben der Partikelgröße können auch Oberflächeneigenschaften wie La­ dung gezielt eingestellt und so das SBA-Adjuvans in Wirkungsstärke spe­ ziesspezifisch hergestellt werden. Positive und negative Ladungen können durch Zumischung entsprechend geladener Tenside oder Stabilisatoren erzeugt werden. Über die Konzentration des Zusatzes kann die Stärke der Ladung eingestellt werden. Idealer Zusatz sind dabei geladene Substan­ zen, die wie Cetylpyridiniumchlorid als Konservierungsmittel für die pa­ renterale Appliktion zugelassen sind (Beispiel 12).

Eine Vielzahl unterschiedlicher Lipide kann zur Herstellung von SBA- Dispersionen eingesetzt werden. Dies sind sowohl chemisch einheitliche Lipide als auch ihre Mischungen. Charakterisiert sind die Lipide dadurch, daß sie im Endprodukt SBA-Dispersion im kristallinen Zustand (z. B. β-, βi-Modifikation) oder im flüssig-kristallinen Zustand (α-Modifikation) vor­ liegen bzw. in deren Mischung. Bei eingesetzten Lipidmischungen können auch flüssige Lipide (z. B. Öle, lipophile Kohlenwasserstoffe, lipophile orga­ nische Flüssigkeiten wie Oleylalkohol) den festen Lipiden (z. B. Glyceride, lipophile Kohlenwasserstoffe wie Hartparaffin) zugemischt werden (sog. "lipid blends").

Einsatz finden z. B. folgende Lipide als dispergierte Phase und können als individuelle Komponente oder als Mischung angewendet werden: Natürli­ che oder synthetische Triglyceride bzw. Mischungen derselben, Monogly­ ceride und Diglyceride, alleine oder Mischungen derselben oder mit z. B. Triglyceriden, selbst-emulgierende modifizierte Lipide, natürliche und synthetische Wachse, Fettalkohole, einschliesslich ihrer Ester und Ether sowie in Form von Lipidpeptiden, oder irgendwelche Mischungen dersel­ ben. Besonders geeignet sind synthetische Monoglyceride, Diglyceride und Triglyceride als individuelle Substanzen oder als Mischung (z. B. Hartfett), Imwitor 900, Triglyceride (z. B. Glyceroltrilaurat, Glycerolmyristat, Gly­ cerolpalmitat, Glycerolstearat und Glycerolbehenat) und Wachse wie z. B. Cetylpalmitat und weisses Wachs (DAB). Außerdem Kohlenwasserstoffe, wie z. B. Hartparaffin.

Der Anteil der inneren oder Lipidphase bezogen auf die Gesamtformulie­ rung ist 0,1% bis 80% (m/m) und liegt vorzugsweise im Bereich von 1% bis 40% (m/m). Sollte der Zusatz von dispersionsstabilisierenden Additi­ ven notwendig oder gewünscht sein, z. B. Emulgatoren, um stabile Disper­ sion zu produzieren zu können, so können diese in Form von reinen Sub­ stanzen oder in Form von Mischungen eingearbeitet sein, um die Partikel zu stabilisieren.

Die Menge an solchen Additiven, die im Verhältnis zu der gesamten Ein­ waage der wäßrigen Dispersion zugesetzt werden können, liegt im Bereich von 0,01% bis 30% und vorzugsweise im Bereich von 0,5% bis 20%. Zur Stabilisierung der SBA-Dispersionen oder zu ihrer gezielten Oberflä­ chenmodifikation können die Tenside, Stabilisatoren und Polymere einge­ setzt werden, die allgemein aus der Herstellung von Dispersionen bekannt sind. Beispiele dafür sind:

• 1. sterisch stabilisierende Substanzen wie Poloxamere und Poloxamine. (Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Block-Copolymere), ethoxylierte Sorbi­ tanfettsäure-Ester, besonders Polysorbate (z. B. Polysorbat 80 bzw. Tween 80®), ethoxylierte Mono- und Diglyceride, ethoxylierte Lipide, ethoxylierte Fettalkohole oder Fettsäuren, und Ester und Ether von Zuckern oder von Zuckeralkoholen mit Fettsäuren oder Fettalkoholen (z. B. Sucrose Mono­ stearat, Sucrose Distearat, Sucrose Cocoat, Sucrose Stearat, Sucrose Di­ palmitat, Sucrose Palmitat, Sucrose Laurat, Sucrose Octanoat, Sucrose Oleat).
• 2. geladene ionische Stabilisatoren so wie Diacetylphosphate, Phosphati­ dylglycerin, Lecithine unterschiedlicher Herkunft (z. B. Eilecithin oder So­ jalecithin), chemisch modifizierte Lecithine (z. B. hydrierte Lecithine), ge­ nauso wie Phospholipide und Sphingolipide, Mischung von Lecithinen mit Phospholipiden, Sterolen (z. B. Cholesterol und Cholesterol-Derivate, ge­ nauso wie Stigmasterin) und ebenfalls gesättigte und ungesättigte Fett­ säuren, Natriumcholat, Natriumglycocholat, Natriumtaurocholat, Natri­ umdeoxycholat oder ihrer Mischungen, Aminosäuren oder Anti- Flokkulantien, wie z. B. Natriumcitrat, Natriumpyrophosphat, Natriumsor­ bat [Lucks, J. S. et al. Int. J. Pharm., 1990, 58, 229-235]. Zwitterionische Tenside wie z. B. (3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-2-hydroxy-1- propanesulfonate) [CHAPSO], (3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]- 1-propanesulfonate) [CHAPS] und N-dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio- 1-propansulfonat. Kationische Tenside, insbesondere als Konservierungs­ mittel eingesetzte Verbindungen, wie z. B. Benzyldimethylhexadecylammo­ niumchlorid, Methylbenzethoniumchlorid, Benzalkonium-chlorid, Cetylpy­ ridiniumchlorid.
• 3. Viskositätserhöhende Substanzen wie z. B. Cellulose-Ether und Cellulo­ se-Ester (z. B. Methylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcel­ lulose, Natriumcarboxymethyl-cellulose), Polyvinylderivate sowie Po­ lyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylacetat, Alginate, Polyacrylate (z. B. Carbopol), Xanthane und Pektine.

Die geladenen Stabilisatoren sind, wenn notwendig oder gewünscht, vor­ zugsweise mit 0,01% bis 20% (m/m) und insbesondere in einer Menge von 0,05% bis zu 10% in der SBA-Dispersion enthalten. Viskositätserhöhende Substanzen sind, wenn notwendig oder erwünscht, im ähnlichen Verhält­ nis in der Formulierung eingearbeitet, vorzugsweise in einer Menge von 0,01-20% und insbesondere in einer Menge von 0,1% bis 10% (m/m) und vorzugsweise im Bereich zwischen 0,5% und 5%.

Als äußere Phase (Dispersionsmedium, kontinuierliche Phase) können Wasser, wässrige Lösungen oder Flüssigkeiten mischbar mit Wasser, so­ wie Glycerin oder Polyethylenglykol und ölige Flüssigkeiten wie Miglyole (medium chain triglycerides - MCT) und andere Öle (Rizinus-, Erdnuß-, Soja-, Baumwollsamen-, Raps-, Leinsamen-, Oliven-, Sonnenblumen-, Di­ stelöl eingesetzt werden.

Tensidfreie SBA werden hergestellt durch Dispergierung der Lipidphase in einer wäßrigen Lösung, die eine oder mehrere viskositätserhöhende Sub­ stanzen enthält, entweder allein oder in Kombination mit anderen Sub­ stanzen, sowie Zucker, Zuckeralkohole, besonders Glukose, Mannose, Trehalose, Mannitol, Sorbitol sowie andere. Desweiteren ist es möglich, eine Kombination der viskositätserhöhenden Stoffe oder die Kombination dieser mit Zuckern oder Zuckeralkoholen, oder in einer weiteren Kombi­ nation mit Ladungsstabilisatoren oder Anti-Flokkulantien zu gebrauchen.

SBA-Dispersionen können als Adjuvans zu vielen unterschiedlichen Anti­ genen zur Impfung gegen unterschiedliche Erkrankungen eingesetzt wer­ den. Beispiele dafür sind:
Glykoproteine wie z. B. Gonococcal Protein I, Brucella abortus Antigen, Tetanus toxoid, Diphteria toxoid, Listeria monocytogenes,
Virusantigene wie Z. B. Semliki Forest Virus, Enceohalomyocarditis Virus, Porcine rarovirus, Pseudorabiesvirus, Newcastle desease Virus, Bovine vi­ ral diarrhea, HIV, Influenza, Cytomegalievirus, Herpes Simplex, Hepatitis- C, Masern,
Parasiten, wie z. B. Malaria, Eimeria Spp.

Zusammenfassend ist zu sagen, daß mit den SBA-Dispersionen ein Adju­ vans zur Verfügung steht, das:

• 1. eine ausreichende physikalische Stabilität besitzt, um als Produkt und speziell als Arzneimittel hergestellt zu werden,
• 2. eine niedrige Toxizität und gute Biokompatibilität besitzt, insbesondere wenn biologisch abbaubare Lipide wie Glyceride eingesetzt werden,
• 3. eine vergleichbare Wirkung wie Freunds unvollständiges Adjuvans (FIA) besitzt und
• 4. kostengünstig aus niedrigpreisigen Hilfsstoffen mit kostengünstigen Herstellungsverfahren produziert werden kann.

SBA-Dispersionen können breite Anwendung finden, um mit toxikologisch akzeptablen Hilfsstoffen die Antigendosis und damit die Kosten zu redu­ zieren, da durch Zusatz von SBA bei niedriger Antigendosis die gleiche immunstimulierende Wirkung erzielt wird.

Antigene mit bisher unzureichender Antigenität für einen Impfstoff kön­ nen durch Zusatz von Immunantwort stimulierendem SBA in einen effizi­ enten Impfstoff überführt werden.

Aufgrund der kostengünstigen Herstellung bei vorhandener vergleichbarer Effizienz zu FIA eignen sich SBA-Dispersionen als Adjuvans für Impfungen im Veterinärbereich, wo aus Rentabilitätsgründen nur sehr niedrigpreisige Impfstoffe eingesetzt werden können.

Bisher eingesetzte Adjuvantien haben sich fokussiert auf die Steigerung der humoralen Immunantwort. Angesichts der Wirkungseffizienz von SBA- Dispersionen ist es nicht mehr notwendig, ein weiteres Adjuvans den SBA- Lipidpartikeln zuzusetzen bzw. Zusatz von Adjuvantien wie GMDP bringen keine weitere Steigerung der humoralen Immunantwort. Offensichtlich ist das Immunsystem an seiner maximalen Kapazität der Antwort, zusätzli­ ches Adjuvans kann keinen zusätzlichen Effekt mehr bringen. Somit brin­ gen Zusätze zu SBA für die humorale Antwort keinen Vorteil, Zusätze wie in dem Patent der Firma Gerbu (Patentschrift DE 196 11 235 C1) beschrie­ ben, werden durch die überraschend gefundene Wirkstärke der in der Er­ findung beschriebenen SBA überflüssig.

Überraschenderweise wurde jedoch festgestellt, daß es nach Applikation von GMDP in Kombination mit SBA-Dispersionen bei einer erneuten spä­ teren Impfung zu einer deutlich gesteigerten zellulären Immunantwort kam als wenn vorher nur SBA-Dispersion alleine als Adjuvans eingesetzt wurde. Somit wurde neu gefunden, daß eine Kombination von SBA- Dispersion spezifisch zur Steigerung der zellulären Immunantwort bei er­ neuter Impfung geeignet ist. Es kommt zu einer erhöhten Immunantwort bei späterer Zweitimpfung, wenn vorher ein zusätzliches Adjuvans wie GMDP in Mischung mit SBA-Dispersion verwendet wurde (Beispiel 13).

Zur Herstellung eines Adjuvans mit Ziel einer Erhöhung der zellulären Immunantwort ist es somit vorteilhaft, die SBA-Dispersion mit einem weiteren Adjuvans zu kombinieren. Mögliche Adjuvantien für eine Kombi­ nation sind: N-Acetylglucosaminyl-(β1-4)-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D- isoglutamin [GMDP], Dimethyldioctadecylammoniumbromid [DDA], N- acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin [MDP], N,N Di-(β-Stearoylethyl)- N,N-dimethylammoniumchlorid [EQ1], Glykopeptide, Bestandteile der Zellwand von Mycobakterien, Saponine, quaternäre Amine, wie z. B. Cetyl­ pyridiniumchlorid und Benzalkoniumchlorid, zwitterionische Amine wie CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate), Dextransulfat, Dextran, 3-Odesacyl-4'-monophosphoryl lipid A [MPL®], N- Acetyl-L-Alanyl-Disoglutaminyl-L-Alanin-82)-1,2 dipalmitoyl-sn-glycero--3-(hydroxy-phosphoryloxy))ethylamid, Mononatriumsalz [MTP-PE], Gra­ nulocyten-Makrophagen-Kolonien stimulierender Faktor [GM-CSF], Block­ copolymere, z. B. P1205, Poloxamer 401 (Pluronic L121), Dimyristoyl­ phosphatidylcholin [DMPC], Dehydroepiandrosterone-3β-01-17-on [DHEA], Dimyristoylphosphatidylglycerol [DMPG], Deoxycholsäure-Natriumsalz, Cytokine, Imiquimod, DTP-GDP, Saponine, 7-Allyl-8-Oxoguanosin, Mon­ tanide ISA 51, Montanide ISA 720, MPL, Murametid, Murapalmitin, D- Murapalmitin, 1-Monopalmitoyl-rac-glycerol, Dicetylphosphat, Polyme­ thylmethacrylat [PMMA], PEG-Sorbitanfettsäureester wie Polysorbat 80 (TWEEN® 80), Quil A Saponin, Sorbitanfettsäureester wie Sorbitantrioleat (SPAN®85, Arlacel85), DTP-DPP, Stearyl-Tyrosin, N,N dioctadecyl-N',N'- bis(2-hydroxyethyl) Propandiamin, Calcitriol.

Neben der Steigerung der humoralen Immunantwort durch SBA- Dispersionen eröffnet sich durch die Erfindung die Möglichkeit zur Steige­ rung der zellulären Immunantwort bei Zweitimpfung durch Kombination von SBA-Dispersionen mit anderen Adjuvantien.

Anstelle einer Zumischung von Adjuvantien zur Erhöhung der zellulären Immunantwort können die Adjuvantien auch in die Lipidpartikel inkorpo­ riert werden. Inkorporation ist möglich durch Einlagerung in die feste Partikelmatrix, Anreicherung in der Grenzfläche im Falle von amphiphilen Adjuvantien oder durch einfache Adsorption auf die Partikeloberfläche. Die Inkorporation von Adjuvantien kann während der Partikelherstellung oder nachträglich erfolgen (z. B. im Falle der Inkorporation, Beispiel 16). Zur Inkorporation während der Herstellung werden Adjuvantien in der ge­ schmolzenen Lipidphase gelöst, solubilisiert oder dispergiert und die Ad­ juvans beinhaltende Lipidphase dann weiterverarbeitet. Im Falle von am­ phiphilen Adjuvantien können diese auch in der äußeren Phase der SBA- Dispersion gelöst werden und reichern sich dann in der Partikelgrenzflä­ che oder durch Adsorption auf der Oberfläche an. Durch Inkorporation von Adjuvantien kommt es zu einer verlängerten Freisetzung durch die Diffusion oder im Zuge des Partikelabbaus durch Enzyme. Eine verzögerte Freisetzung über einen längeren Zeitraum erhöht die Immunantwort.

Ein weiteres attraktives Anwendungsgebiet ist die Antikörperproduktion im Tier. Durch Zusatz des Adjuvans kann die Antikörperausbeute deutlich erhöht werden.

Beispiele Beispiel 1 Bestimmung der physikalischen Stabilität von SBA-versus- Freunds-Incomplete-Adjuvant (FIA)

Eine wäßrige SBA-Dispersion wurde durch Hochdruckhomogenisation bei 95°C aus 20% Bienenwachs, 2% Tween 80 hergestellt (PCS-Durchmesser 289 nm Polydispersitätsindex 0,101). FIA wurde nach der von Freund beschriebenen Methode herge­ stellt [Freund, J. J. Immunology 1948, 60, 383-398]. SBA und FIA wurden bei den Temperaturen der Klimazonen gelagert, die bei der Stabili­ tätsprüfung von Arzneimitteln eingesetzt werden [EMEA-Richtlinie CPMP/QWP/159/96, Januar 1998)]. Die Lagertemperaturen waren: 5°C, 25°C, 40°C. Bestimmung der physikalischen Stabilität erfolgte über Mes­ sung der Partikelgröße mit Laserdiffraktometrie, Charakterisierungspara­ meter waren der Durchmesser 50% und der Durchmesser 95% (50% bzw. 95% der Partikel sind unter der angegebenen Größe, sensitiver Pa­ rameter für Partikelaggregation). FIA zeigte bereits nach wenigen Minuten Lagerung - sogar bei Raumtemperatur - ein deutliches Partikelwachstum, FIA ist somit kein lagerstabiles Adjuvans. Demgegenüber bleiben die Par­ tikelgrößen von SBA unter den 3 Lagerbedingungen über einen Zeitraum von 1 Jahr unverändert (Tabelle 1).

Tabelle 1

Untersuchung der Stabilität von SBA (20% Bienenwachs, 2% Tween 80) im Vergleich mit Freunds unvollständigem Adjuvans (FIA)

Beispiel 2 Bestimmung der physikalischen Stabilität von SBA-versus- Squalen-Adjuvans

SBA wurde hergestellt wie unter 1 beschrieben; es enthielt 10% Cetylpalmitat und 1,2% Miranol (PCS-Durchmesser 210 nm, PCS-Polydispersitätsindex 0,189). Squalen-Adjuvans wurde hergestellt nach der Beschreibung in der europäischen Patentanmeldung 0 399 843 mit Anmeldedatum 25. Mai 1990 (Adjuvans MF59). Partikelgrößenmes­ sung erfolgte mit Laserdiffraktometrie; Lagerung wurde wie in Beispiel 1 bei 3 Temperaturen durchgeführt (Tabelle 2). Zusätzlich wurde ein be­ schleunigter Stabilitätstest durchgeführt, SBA- und MF59-Dispersionen wurden bei 40° mit einer Frequenz von 50 Hz geschüttelt (Tabelle 3). So­ wohl bei normaler Lagerung, als auch im Streßtest zeigt SBA eine erhöhte Stabilität.

Tabelle 2

Untersuchung der Stabilität von SBA (10% Cetylpalmitat, 1,2% Miranol) im Vergleich mit MF59

Tabelle 3

Stabilität von MF 59 gegen SBA bei 40°C und einer Schüttelfre­ quenz von 50 Hz

Beispiel 3 Langzeitstabilität von SBA

SBA-Dispersion, bestehend aus 20% Bienenwachs, 2% Tween 80 wurde bei 4-6°C ein Jahr gelagert. Die PCS- Daten und Laserdiffraktometer-Durchmesser zeigten wenig oder keine Veränderung (Tabelle 4).

Tabelle 4

Langzeitstabilität von SBA: SBA-Dispersion bestehend aus 20% Bienenwachs, 2% Tween 80 wurde bei 4-6°C ein Jahr gelagert

Beispiel 4 Hitzestabilität von SBA bei Autoklavierung (Hitze, Druck) ver­ sus FIA und MF59

Die SBA-Dispersion war zusammengesetzt aus 18% Hartparaffin, 4% Tween 80/Span 85 (7/3) und Wasser. Sterilisation von jeweils 20 mL erfolgte in Injektionsfläschchen nach den Standardbedin­ gungen des europäischen Arzneibuches (121°C, 2 bar, 15 Minuten). Parti­ kelgrößenbestimmung erfolgte mit PCS und Laserdiffraktometrie (LD 95%) (P. I.: Polydispersitätsindex, Maß für die Breite der Partikelverteilung, MW: Mittelwert aus 3 Messungen, Stabw.: Standardabweichung, P. I. Polydis­ persitätsindex) (Tabelle 5). Die FIA-Emulsion zeigte nach Autoklavieren Phasentrennung, MF59 ein deutliches Partikelwachstum. SBA ist physi­ kalisch stabil und kann durch Autoklavieren sterilisiert werden.

Tabelle 5 Hitzestabilität von SBA bei Autoklavierung (Hitze, Druck) versus FIA und MF59

Die SBA-Dispersion war zusammengesetzt aus 18% Hart­ paraffin, 4% Tween 89/Span 85, 7/3 und Wasser. Sterilisation von je­ weils 20 mL in Injektionsfläschchen bei 121°C, 2 bar, 15 Minuten. Parti­ kelgrößenbestimmung erfolgte mit PCS und Laserdiffraktometrie.

Beispiel 5 Physiologische Verträglichkeit

Zur Abschätzung der Verträg­ lichkeit wurde die Zytotoxizität von SBA in Zellkulturen bestimmt (humane Granulozyten, HL60-Zellen). Zur Quantifizierung der Toxizität wurde die Viabilität der Zellen mit dem MTT-Test [Mosmann, T., J. Immu­ nol. Meth. 1993, 65, 55-63] bestimmt. Die SBA-Dispersion war zusam­ mengesetzt aus 10% Cetylpalmitat, 0,5% Poloxamer 188 und Wasser. Die Zellzahl pro well betrug 200.000 bei Humangranulozyten und 200.000 bei HL60-Zellen. Inkubation erfolgte für 12 Stunden. Bei SBA betrug die Via­ bilität 80% bei den Granulozyten und 85% bei den HL60-Zellen. Bei Nanopartikeln aus PLA betrug die Viabilität lediglich 5%, bei Nanoparti­ keln aus PLA/GA sank sie auf 0%. Die Verträglichkeit von SBA ist in den Zellkulturen um mindestens Faktor ca. 20 besser als die der FDA zugelas­ senen Polymere zur parenteralen Applikation.

Beispiel 6 Verträglichkeit nach parenteraler Applikation

Eingesetzt wurde wäßrige SBA-Dispersion mit der Zusammensetzung 5% Hartparaffin, 5% Tween 80/Span 85 (7/3) und Wasser. Es erfolgte parenterale Injektion in Schafe (n = 30), Injektionsort war die seitliche Brustwand, das Injektions­ volumen betrug 5 mL verteilt auf 4 Injektionsorte. Die Schafe zeigten keine Auffälligkeiten, weder am Injektionsort, noch in ihrem Verhalten.

Beispiel 7 Biokompatibilität - Interaktion mit Körperproteinen

Die SBA- Dispersion war zusammengesetzt aus 10 Compritol, 2,5% Poloxamer 407 und Wasser. Herstellung erfolgte mit Hochdruckhomogenisation. Die Par­ tikel wurden 5 Minuten inkubiert mit humanem Plasma, anschließend vom Plasma abgetrennt und die auf der Partikeloberfläche adsorbierten Körperproteine mit zweidimensionaler Polyacrylamidgelelektrophorese [Blunk, T et al. Electrophoresis 14, 1382-1387 (1993)] bestimmt. Bei ver­ gleichbaren Partikeloberflächen adsorbierte auf SBA mit 96,41 cpm (counts per minute) im Vergleich zu Emulsionen eine sehr geringe Pro­ teinmenge (Vergleichswerte: 472 cpm auf Emulsion, 390 cpm auf Polysty­ rolpartikeln [Harnisch, S. et al. Elektrophoresis 1998, 19, 349-354, Blunk, T., Electrophoresis 1993, 14, 1382-1387]. Komplementfaktoren, die eine Unverträglichkeit fördern, wurden auf der SBA-Oberfläche nicht detek­ tiert.

Beispiel 8 Stabilität in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlö­ sung (PBS)

SBA zusammengesetzt aus 20% Hartparaffin, 5% Tween 80/Span85 (7/3) und Wasser wurden mit PBS gemischt (2 mL SBA + 2 mL Salzlösung). Die physikalische Stabilität in der physiologischen Kochsalz­ lösung wurde mit Laserdiffraktometrie als Funktion der Zeit bestimmt. Über 6 Stunden kam es zu keinem Anstieg der Partikelgröße (Durchmesser 90% und 95%, Tabelle 6) (Stabw.: Standardabweichung).

Tabelle 6

Stabilität in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlö­ sung (PBS) SBA (20% Hartparaffin, 5% Tween 80/Span85 (7/3)) wurden mit PBS gemischt (2 mL SBA + 2 mL Salzlösung). Bestimmung der physi­ kalischen Stabilität in der physiologischen Kochsalzlösung mit Laserdif­ fraktometrie als Funktion der Zeit.

Beispiel 9 Adjuvans-Effekt im Vergleich zu molekularem Adjuvant (GMDP - N-acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl-dipeptide) und FIA

Schafe wur­ den geimpft mit dem Stamm Mycoplasma Bovis PG 45 R9. Die Kultivie­ rung des Impfantigens erfolgte in Standkultur über 72 Stunden unter mi­ kroaerophilen Bedingungen in Hayflick-Medium. Inaktivierung erfolgte durch Zugabe von 0,1% β-Propiolacton. Die Zellen wurden separiert, mit Phosphatpuffer pH 7,4 gewaschen und auf einen Gehalt von 1 × 10¹⁰ CFU/mL eingestellt. Die Sterilität der Präparation wurde gemäß Deut­ schem Arzneibuch, Ausgabe 10, geprüft. Die Trockenmassebestimmung er­ gab einen Gehalt 1 mg/mL Mycoplasma-Bovis-Antigen. Das Adjuvans SBA, GMDP und FIA wurde zu gleichen Teilen mit dem Antigen in Puffer gemischt. Injektionsvolumen war 5 mL, verteilt auf 4 Injektionsorte.

Zusammensetzung von SBA war 4% Hartparaffin, 1% EQ1 (N,N Di-(β- Stearoylethyl)-N,N-dimethylammoniumchlorid) und 4% Tween 80/Span 85 (7/3). Zusammensetzung des GMDP-Adjuvans war 5% Lipid und 0,5% Tensid. FIA wurde wie in Beispiel 1 hergestellt.

Blutentnahme erfolgte am Tag 0 vor Impfung, am Tag 35 und am Tag 63. Bestimmung der Antikörper erfolgte mit ELISA. Für den ELISA-Test wurde ein handelsüblicher markierter Anti-IgG-Sheep der Firma Sigma einge­ setzt.

SBA zeigte dabei eine vergleichbare Wirkintensität wie die Kombination von Lipidpartikeln mit GMDP. Weiterhin war SBA von vergleichbarer Ef­ fektivität wie FIA (Abb. 1). Es bestand kein signifikanter Unterschied in der Wirkintensität zwischen den drei Adjuvantien.

Abb. 1 Adjuvans-Effekt im Vergleich zu molekularem Adjuvant (GMDP - N-acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl-dipeptide) und FIA

Zu­ sammensetzung von SBA war 4% Hartparaffin, 1% EQ1 (N,N Di-(β- Stearoylethyl)-N,N-dimethylammoniumchlorid) und 4% Tween 80/Span 85 (7/3). Zusammensetzung des GMDP-Adjuvans war 5% EQ1 und 0,5% Montanide 888. FIA lt. Beispiel 1.

Beispiel 10 Effekt von SBA-Zusammensetzung auf Immuntiter

SBA- Dispersionen wurden mit identischem Lipid, aber unterschiedlichen Ten­ siden auf der Oberfläche hergestellt, d. h. sie unterscheiden sich in ihren Oberflächeneigenschaften. Die Formulierung SBA-1 besteht aus 4% Hart­ paraffin, 4% Tween 80/Span 85 (7/3) und Wasser, die Formulierung SBA- 2 enthält 4% Hartparaffin, 1% EQ1 und 4% Tween 80/ Span 85 (7/3) und Wasser. Die Effizienz zur Steigerung des Immuntiters wurde analog Bei­ spiel 9 getestet; als Vergleich diente FIA. In Abhängigkeit von den Oberflä­ cheneigenschaften ergeben sich unterschiedlich hohe Immunantworten für die beiden SBA-Dispersionen (Abb. 2). Die Stärke der ge­ wünschten Immunantwort kann somit durch Variation der Oberflächenei­ genschaften (Tenside, Stabilisatoren, Ladung etc.) eingestellt werden.

Abb. 2 Effekt der SBA-Zusammensetzung auf Immuntiter

Formu­ lierung SBA-1 besteht aus 4% Hartparaffin, 4% Tween 80/Span 85 (7/3) und Wasser, Formulierung SBA-2 enthält 4% Hartparaffin, 1% EQ1 und 4% Tween 80/Span 85 (7/3) und Wasser.

Beispiel 11 Lagerstabilität von SBA-2

Die SBA-Dispersion SBA-2 aus Beispiel 11 wurde bei verschiedenen Temperaturen gelagert und die phy­ sikalische Stabilität über Messung der Partikelgröße mit PCS bestimmt. Ein Partikelwachstum trat nicht auf (Abb. 3).

Abb. 3 Lagerstabilität von SBA-2

Die SBA-Dispersion SBA-2 aus Beispiel 11 wurde bei verschiedenen Temperaturen gelagert und die phy­ sikalische Stabilität über Messung der Partikelgröße mit PCS bestimmt.

Beispiel 12 Oberflächenmodifikation von SBA-Dispersionen

Zur Modifi­ kation der Oberflächenladung wurden SBA-Dispersionen mit grenzflä­ chenaktiven positiv geladenen Stabilisatoren (EQ1 - Distearoylethyldia­ moniumchlorid, Cetylpyridiniumchlorid) und negativ geladenen Stabilisa­ toren (Natriumlaurylsulfat, (SDS)) hergestellt. Die Zusammensetzung der SBA-Dispersionen war: SBA-EQ1 (20% Cetylpalmitat, 4% Tween 80/Span 85 (7/3), 1% EQ1), SBA-CPC (18% Lipid, 10% Tensid, 0,1% Cetylpyridi­ niumchlorid) und SBA-SDS (20% Cetylpalmitat, 1% SDS 80. Als Maß für die Ladung wurde das Zetapotential in Millivolt (mV) gemessen (Elektrophorese-Messung), Zetasizer4 (Malvern Instruments, UK). Um­ wandlung der elektrophoretischen Mobilität in das Zetapotential erfolgte mit der Helmholtz-Smoluchowski-Gleichung. Die Zetapotentiale betrugen +40 mV, +28 mV und -35 mV für die 3 SBA-Dispersionen.

Beispiel 13 Erhöhte zelluläre Immunantwort bei Hühnern bei Auffri­ schungsimpfung, die bei der Erstimmunisierung mit GMDP enthaltendem Adjuvans (SBA) behandelt worden waren

SBA (5% EQ1, 0,5% Montanide 888 wurde 1 : 1 mit dem Antigen (IgG vom Kaninchen) gemischt und subcutan injiziert. SBA enthielt 5 µg GMDP, und das Immunisierungs­ schema war wie folgt: Erstimmunisierung und zwei Auffrischungsimpfun­ gen an Tag 14 und Tag 28. Die Antikörperbestimmung fand am Tag 42 statt, und gemessen wurde der IgY-Titer im Eigelb. Zur Untersuchung auf eine verstärkte zelluläre Immunantwort fand an Tag 100 ein erneuter An­ tigenkontakt statt (erneute Auffrischungsimpfung) und am Tag 120 die Antikörperbestimmung. Die Ergebnisse zeigen, daß im Falle der Erstim­ munisierung (Tag 14 und 28) mit GMDP enthaltendem SBA bei erneutem Antigenkontakt eine deutlich verstärkte Antikörperproduktion stattfindet. Säulen 2, 3 und 4, Abb. 4.

Abb. 4 Antikörperproduktion in Hühnern nach erfolgter Grundim­ munisierung und erneutem Antigenkontakt am Tag 100

Die letzte Anti­ körperbestimmung der Grundimmunisierung fand am Tag 42 statt, die der Auffrischungsimpfung (Tag 100) am Tag 120. Die Zusammensetzung der Impfstoffe der Beispiele 1-5 ist wie folgt:

• 1. Tag 42: Antigen in PBS, Tag 100: Antigen in PBS (k. A.: kein Adjuvant, Antigen in PBS).
• 2. Tag 42: Antigen in SBA mit GMDP, Tag 100: Antigen in SBA.
• 3. Tag 42: Antigen in SBA mit GMDP, Tag 100: Antigen in FCA (FCA = Freunds komplettes Adjuvans).
• 4. Tag 42: Antigen in SBA mit GMDP, Tag 100: Antigen in PBS.
• 5. Tag 42: Antigen in FCA, Tag 100: Antigen in PBS.

Beispiel 14

Die Adsorption von GMDP auf SBA-Partikel wurde mittels PCS untersucht. GMDP wurde mit SBA gemischt (4% Hartparaffin, 4% Tween 80/Span 85 (7/3) und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen, um eine Adsorption des GMDP an die Partikel zu ermöglichen. Die End­ konzentration betrug 1,435 mg/ml. Der Größenzuwachs beträgt 3,9 nm. (PCS-Durchmesser ohne GMDP: 99,4 nm, Standardabweichung: 0,764, Durchmesser mit GMDP: 103,3 nm, Standardabweichung: 0,755).

Beispiel 15 Modifikation der Partikelgröße

Die SBA-Dispersion mit EQ1 aus Beispiel 12 (SBA-EQ1) wurde mit verschiedenen Herstellungsverfah­ ren produziert, um die Partikelgröße zu variieren. Die Messung der Parti­ kelgröße erfolgte mit Laserdiffraktometrie (Laserdiffraktometer LS 230, Firma Coulter Electronics,Germany, Meßbereich: 40 nm-2000 µm). Als Charakterisierungsparameter ist der Durchmesser 50% der Partikel ange­ geben. Folgende Herstellungsmethoden wurden eingesetzt:

• a) Hochdruckhomogenisation:
  Das Lipid wurde geschmolzen, in die wäßrige Tensidlösung gegeben, mit einem Rührer dispergiert und die erhaltene Rohemulsion bei 80°C mit einem Hochdruckhomoge­ nisator homogenisiert (Micron LAB 40, APV Gaulin Homogeniser GmbH, Germany). Homogenisationsparameter waren 500 bar Druck, 3 Homogenisationszyklen. Der Partikeldurchmesser 50% betrug 0,15 µm.
• b) Die Rohemulsion wurde wie unter a) beschrieben hergestellt und mit einem Microfluidizer homogenisiert (Gerättyp 110-Y, Microflui­ dix Inc., USA).
  Homogenisationsparameter waren 700 bar, 10 Minuten Zirkulati­ onszeit. Der mittlere Partikeldurchmesser betrug 0,452 µm.
• c) Rotor-Stator-Dispergierung:
  Die Rohemulsion wurde wie unter a) beschrieben hergestellt und anschließend mit einem Ultraturrax (Typ T25, Firma Jahnke und Kunkel, Staufen, Germany) bei einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 10000 Umdrehungen pro Minute für 1 Minute und 10 Minuten dispergiert, Dispergiertemperatur 80° C. Die Partikeldurchmesser betrugen 7,5 und 1,2 µm
• d) Statischer Mischer:
  Lipid und wäßrige Tensidlösung aus a) wurden auf 80°C erhitzt und in einem statischen Mischer (Firma Sulzer, Germany) gemischt. Die Partikelgröße betrug 15,8 µm.
• e) Gasstrahlmühle:
  Behensäure Triglycerid wurde luftstrahlgemahlen (Jetmill, Mosokawa Alpine AG) und anschließend unter Rühren in der wäßrigen Tensidlösung bei Raumtemperatur dispergiert. Der Partikeldurchmesser 50% betrug 37,03 µm.
• f) Mörsermühle:
  Das grob gepulverte Lipid wurde in einer Mörser­ mühle unter Zusatz von flüssigem Stickstoff für 3 Minuten und 15 Minuten gemahlen (Retsch Mörsermühle, Firma Reetsch, Germany). Das Lipid wurde wie in e) in Wasser dispergiert. Die mittlere Parti­ kelgröße betrug 40 µm.

Beispiel 16 Molekulares Adjuvans zur Erhöhung der zellulären Im­ munantwort, inkorporiert in SBA

GMDP wurde in Span 85-(W/O)Emul­ gator gelöst und Cetylpalmitat dazugegeben. Die Mischung wurde bei 70 °C geschmolzen und nach dem Wiederererkalten in der Mörsermühle un­ ter Zugabe von flüssigem Stickstoff gemahlen. Die gemahlene Lipid- GMDP-Mischung wurde in einer 2,5 prozentigen Tween-80-Lösung dis­ pergiert und mit dem Ultraturrax 1 Minute bei 8000 U/min vordispergiert. Diese Dispersion wurde bei 4°C mittels Hochdruckhomogenisation in 3 Zyklen bei 1000 bar homogenisiert. Der PCS-Durchmesser beträgt 260 nm mit einem Polydispersitätsindex von 0,430.

Beispiel 17 Molekulares Adjuvans zur Erhöhung der zellulären Im­ munantwort, inkorporiert in die Grenzfläche

Saponine sind allgemein be­ kannt zur Erhöhung der zellulären Immunantwort. Die Herstellung der Partikel erfolgte mit einem Rotor-Stator analog zu Beispiel 15. Die Zu­ sammensetzung der SBA-Dispersion ist 5% Cetylpalmitat, 0,5% Saponin (Quil-A-Saponin) und Wasser. Das Saponin wurde in der wäßrigen Phase gelöst, diese auf 80° erhitzt und das geschmolzene Lipid zugegeben. Her­ stellung erfolgte mit einem Ultraturrax, Rühren mit 10000 RPM für 5 Mi­ nuten. Der mit dem Laserdiffraktometer bestimmte Durchmesser 50% betrug 2,28 µm.

Beispiel 18 Produktion von SBA in Gegenwart eines amphiphilen Adju­ vant

Das amphiphile Tensid CHAPS ist in der Literatur beschrieben als Mittel zur Erhöhung der Immunantwort. Die Partikel bestehen aus 5% Cetylpalmitat und 0,5% CHAPS. Die Herstellung der Partikel erfolgte ana­ log Beispiel 20. Der Durchmesser 50%, mittels Laserdiffraktometrie be­ stimmt, beträgt 1,897 µm.

Beispiel 19 Vergleich SBA-versus reines molekulares-Adjuvant

Die SBA- Dispersion Nr. 2 aus Beispiel 10 (SBA-2) wurde in Schafen getestet (Bedingungen wie in Beispiel 9) gegen molekulares Adjuvant, d. h. reines GMDP (N-acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl-dipeptid). Die Konzentra­ tion an GMDP (0,1 mg/ml) war analog zu Beispiel 9. Die in-vivo-Testung erfolgte wie in Beispiel 9 beschrieben. SBA 2 zeigt eine höhere Wirkinten­ sität als reines GMDP (Abb. 5).

Zusammensetzung von SBA 2

4% Hartparaffin, 1% EQ1 (N,N Di-(β- Stearoylethyl)-N,N-dimethylammoniumchlorid) und 4% Tween 80/Span 85 (7/3).

Beispiel 20 Effekt der Ladung (Oberflächeneigenschaft) auf die Im­ munantwort (Schaf-Studie analog Beispiel 9)

Zwischen den positiv gela­ denen Partikeln SBA 4 und SBA 2 ist kein Unterschied in der Wirkstärke feststellbar. EQ1 aus SBA 2 kann ohne Wirkungsverlust durch das toxi­ kologisch untersuchte und als pharmazeutisches Konservierungsmittel zugelassene Cetylpyridiniumchlorid ersetzt werden (SBA 4). Gegenüber den negativ geladenen Partikeln der Formulierung SBA 5 beobachtet man eine stärkere Wirkung der positiv geladenen Partikelformulierungen (Abb. 6).

Die SBA-Formulierungen haben die folgende Zusammensetzung: SBA 4:
4% Hartparaffin, 4% Tween 80/Span 85 (7/3), 0,5% Cetylpyridiniumchlo­ rid. SBA 5: 4% Hartparaffin, Natriumdeoxycholat 0,2%, Natriumcholat 0,2%, Natriumoleat 1%, Lipoid E80 2%. SBA 2: 4% Hartparaffin, 1% EQ1 und 4% Tween 80/Span 85 (7/3). Die Oberflächenladungen (Zetapotential) wurde in Leitfähigkeitswasser mit einer Leitfähigkeit von 50 µS/cm bestimmt: SBA 4: +41,2 mV, SBA 2: +40,5 mV, SBA 5: -36,4 mV. Die Größen (PCS-Durchmesser und Polydispersitätsindex (P. I.)) wa­ ren: SBA 4: 103 nm (P. I. 0,110), SBA 5: 107 nm (P. I. 0,115), SBA 2: 101 nm (P. I. 0,101).

Beispiel 21 Speziesunabhängigkeit des Effektes (Hühner)

Das Antigen aus Beispiel 9 wurde mit SBA 1 und SBA 2 im Verhältnis 1 : 1 gemischt und 0,5 ml je Huhn injiziert. Die Antikörpertiter wurden aus den Hühner­ eiern bestimmt. Zur Quantifizierung diente ein ELISA-Test. Im Gegensatz zur Beschreibung in Beispiel 9 wurde im ELISA-Test ein markierter Anti- IgG-chicken verwendet. Die erste Immunisierung fand am Tag 0 stattt. Eine Boosterung mit den gleichen Zubereitungen erfolgte an Tag 31. Ana­ log zu den Ergebnissen in Beispiel 10 zeigt sich eine stärkere Wirkung der Formulierung SBA 2 (Abb. 7).

Zusammensetzung SBA 1: 4% Hartparaffin und 4% Tween 80/Span 85 (7/3), PCS-Durchmesser: 107 nm (P. I. 0,112) und SBA 2: 4% Hartparaf­ fin, 1% EQ1 und 4% Tween 80/Span 85 (7/3), PCS Durchmesser: 101 nm (P. I. 0,101).

Beispiel 22 Einfluß der Lipidmatrix auf die Adjuvanswirkung

Bei der Formulierung SBA 2 wurde das nicht bioabbaubare Hartparaffin gegen das bioabbaubares Glyceroltribehenat ausgetauscht (SBA 3). Die Intensi­ tät der Wirkung unterscheidet sich nicht; Hartparaffin kann durch Gly­ ceroltribehenat ersetzt werden (Abb. 8).

Zusammensetzung SBA 2: 4% Hartparaffin, 1% EQ1 und 4% Tween 80/Span 85 (7/3), PCS-Durchmesser: 101 nm (P. I. 0,101) SBA 3: 4% Gly­ ceroltribehenat, 1% EQ1 und 4% Tween 80/Span 85 (7/3), PCS-Durch­ messer: 105 nm (P. I. 0,112).

Beispiel 23

Die Formulierungen SBA 1 und SBA 2 wurden im Vergleich zu Aluminiumhydroxid getestet (Durchführung analog Beispiel 9). Die Wirkung von SBA 1 und von SBA 2 ist gleich der Wirkung von Alumini­ umhydroxid (Kontrolle: Antigen in PBS). Analog Beispiel 9 ist SBA 2 stär­ ker wirksam als SBA 1 (Abb. 9).

Zusammensetzung SBA 2: 4% Hartparaffin, 1% EQ1 und 4% Tween 80/Span 85 (7/3), PCS-Durchmesser: 101 nm (P. I. 0,101) SBA 1: 4% Hart­ paraffin, 4% Tween 80/Span 85 (7/3), PCS-Durchmesser: 107 nm (P. I. 0,112).

Liste der Abbildungen

Abb. 1: Adjuvans-Effekt im Vergleich zu molekularem Adjuvant (GMDP - N-acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl-dipeptide) und FIA.

Abb. 2: Effekt der SBA-Zusammensetzung auf Immuntiter.

Abb. 3: Lagerstabilität von SBA 2.

Abb. 4: Antikörperproduktion in Hühnern nach erfolgter Grundim­ munisierung und erneutem Antigenkontakt an Tag 100, die letzte Anti­ körperbestimmung der Grundimmunisierung fand am Tag 42 statt, die der Auffrischungsimpfung (Tag 100) an Tag 120.

Abb. 5: Adjuvans-Effekt von SBA im Vergleich zu molekularem Adju­ vans GMDP (Beispiel 19).

Abb. 6: Wirkung unterschiedlicher Partikelladung (Beispiel 20).

Abb. 7: Adjuvanswirkung in Hühnern (Beispiel 21).

Abb. 8: Einfluß der Lipidmatrix auf die Adjuvanswirkung (Beispiel 22).

Abb. 9: Vergleich der Wirkung von SBA 1 und SBA 2 mit Alumini­ umhydroxid (Beispiel 23).

Claims (22)

1. Mittel zur Steigerung der Immunantwort bei Impfungen von Men­ schen und Tieren sowie zur Steigerung der Ausbeute von Antikörpern in der Immunologie und Antikörperproduktion, dadurch gekenn­ zeichnet, daß es sich um bei Raumtemperatur (= 20°C) feste Li­ pidpartikel handelt, welche in einer für das jeweilige zu immunisie­ rende Subjekt charakteristischen Optimaldosis, sowie optimaler Par­ tikelgröße, Partikelladung sowie Oberflächeneigenschaften (stabilisierende Tensidschicht) appliziert werden, wobei sie der Lö­ sung des Antigens einfach zugemischt werden.

2. Mittel nach Anspruch 1, wobei es sich um Partikel im Bereich von 10-1000 nm handelt.

3. Mittel nach Anspruch 1, wobei es sich um Partikel im Bereich von 1-10 µm handelt.

4. Mittel nach Anspruch 1, wobei es sich um Partikel im Bereich von 10-200 µm, insbesondere um Partikel im Bereich von 10-100 µm handelt.

5. Mittel nach Anspruch 1, wobei es sich um Partikel im Bereich von 200-1000 µm, insbesondere um Partikel im Bereich von 200-500 µm handelt.

6. Mittel nach den Ansprüchen 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Herstellung der Lipidpartikel eingesetzten Lipide bei Raumtempe­ ratur fest sind, beispielsweise Ethylstearat, Octadecan, DDA, Natürli­ che oder synthetische Triglyceride bzw. Mischungen derselben, Mo­ noglyceride und Diglyceride, alleine oder Mischungen derselben oder mit z. B. Triglyceriden, selbst-emulgierende modifizierte Lipide, natür­ liche und synthetische Wachse, Fettalkohole, einschliesslich ihrer Ester und Ether sowie in Form von Lipidpeptiden, oder irgendwelche Mischungen derselben. Besonders geeignet sind synthetische Mono­ glyceride, Diglyceride und Triglyceride als individuelle Substanzen oder als Mischung (z. B. Hartfett), Imwitor 900, Triglyceride (z. B. Gly­ ceroltrilaurat, Glycerolmyristat, Glycerolpalmitat, Glycerolstearat und Glycerolbehenat) und Wachse wie z. B. Cetylpalmitat und weisses Wachs (DAB), wobei sie einzeln oder in Mischungen verwendet wer­ den können, außerdem Kohlenwasserstoffe, wie z. B. Hartparaffin.

7. Mittel nach dem Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß den zur Herstellung der Lipidpartikel eingesetzten festen Lipiden flüssige Li­ pide wie flüssige Gyceride (Miglyole), Erdnußöl, Rizinusöl, Sojaöl, Baumwollsamenöl, Rapsöl, Leinsamenöl, Olivenöl, Sonnenblumenöl, Distelöl zugemischt werden, wobei die daraus hergestellten Partikel bei Raumtemperatur (20°C) fest sind.

8. Mittel nach den Ansprüchen 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß sie positiv geladen sind.

9. Mittel nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erzeugung der positiven Ladung bei der Herstellung der Lipidpartikel die Sub­ stanzen Benzyldimethylhexadecylammoniumchlorid, Methylbenze­ thoniumchlorid, Benzalkoniumchlorid, Cetylpyridiniumchlorid, N,N-Di-(β-Stearoylethyl)-N,N-dimethylammoniumchlorid, Dimethyldiocta­ decylammoniumbromid einzeln oder in Mischung miteinander zuge­ setzt werden.

10. Mittel nach den Ansprüchen 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß sie negativ geladen sind.

11. Mittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erzeu­ gung der negativen Ladung bei der Herstellung der Lipidpartikel die folgenden Verbindungen: Diacetylphosphate, Phosphatidylglycerin, Lecithine unterschiedlicher Herkunft (z. B. Eilecithin oder Sojalecit­ hin), chemisch modifizierte Lecithine (z. B. hydrierte Lecithine), ge­ nauso wie Phospholipide und Sphingolipide, Mischung von Lecithi­ nen mit Phospholipiden, Sterolen (z. B. Cholesterol und Cholesterol- Derivate, genauso wie Stigmasterin) und ebenfalls gesättigte und un­ gesättigte Fettsäuren, Natriumcholat, Natriumglycocholat, Natrium­ taurocholat, Natriumdeoxycholat, einzeln oder in Mischung mitein­ ander zugesetzt werden.

12. Mittel nach den Ansprüchen 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß sie ungeladen oder nur gering geladen sind.

13. Mittel nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß zur ihrer Er­ zeugung bei der Herstellung der Lipidpartikel ungeladene Substanzen wie Polyethylenglykol-Sorbitanfetsäureester (insbesondere die Tween Reihe wie Tween 80), Polyoxyethylenpolyoxypropylenkopolymere (insbesondere die Poloxamer-Reihe und die Poloxamine-Reihe), ethoxylierte Mono- und Diglyceride, ethoxylierte Lipide, ethoxylierte Fettalkohole oder Fettsäuren, und Ester und Ether von Zuckern oder von Zuckeralkoholen mit Fettsäuren oder Fettalkoholen (z. B. Saccha­ rose-Monostearat) einzeln oder in Mischung miteinander zugesetzt werden.

14. Mittel nach den Ansprüchen 1-13, dadurch gekennzeichnet, daß ih­ nen ein oder mehrere Adjuvantien zugesetzt sind.

15. Mittel nach dem Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es mo­ lekulare Adjuvantien wie N-Acetylglucosaminyl-(β1-4)-N- acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin [GMDP], Dimethyldioctadecy­ lammoniumbromid [DDA], N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin [MDP], N,N Di-(β-Stearoylethyl)-N,N-dimethylammoniumchlorid [EQ1], Glykopeptide, Bestandteile der Zellwand von Mycobakterien, Saponine, quaternäre Amine, wie z. B. Cetylpyridiniumchlorid und Benzalkoniumchlorid, zwitterionische Amine wie CHAPS (3-[(3- cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate), Dextran­ sulfat, Dextran, 3-Odesacyl-4'-monophosphoryl lipid A [MPL®], N- Acetyl-L-Alanyl-Disoglutaminyl-L-Alanin-82)-1,2 dipalmitoyl-sn-glycero-3-(hydroxy-phosphoryloxy))ethylamid, Mononatriumsalz [MTP-PE], Granulocyten-Makrophagen-Kolonien stimulierender Fak­ tor [GM-CSF], Blockcopolymere, z. B. P1205, Poloxamer 401 (Pluronic L121), Dimyristoylphosphatidylcholin [DMPC], Dehydroepiandro­ sterone-3β-01-17-on [DHEA], Dimyristoylphosphatidylglycerol [DMPG], Deoxycholsäure-Natriumsalz, Cytokine, Imiquimod, DTP- GDP, Saponine, 7-Allyl-8-Oxoguanosin, Montanide ISA 51, Montani­ de ISA 720, MPL, Murametid, Murapalmitin, D-Murapalmitin, 1- Monopalmitoyl-rac-glycerol, Dicetylphosphat, Polymethylmethacrylat [PMMA], PEG-Sorbitanfettsäureester wie Polysorbat 80 (TWEEN® 80), Quil A Saponin, Sorbitanfettsäureester wie Sorbitantrioleat (SPAN®85, Arlacel85), DTP-DPP, Stearyl-Tyrosin, N,N dioctadecyl- N',N'-bis(2hydroxyethyl) Propandiamin, Calcitriol, enthält.

16. Mittel nach dem Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es par­ tikuläre Adjuvantien wie z. B. Aluminiumhydroxid, Polymerpartikel, Liposomen, sind.

17. Mittel nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß ihnen die Wirksamkeit von Adjuvantien steigernde Substanzen aus der Gruppe der zweiwertigen Übergangsmetallionen, quaternären Aminen, Dex­ tran, Dextransulfat, Vitamin-E-Derivate wie Vitamin-E-Phosphat und Vitamin-E-Hemisuccinat, und Isoprinosin zugestzt wurden.

18. Mittel nach den Ansprüchen 1-17 dadurch hergestellt, daß die Li­ pidpartikel durch Zerkleinerung von Lipiden im festen Aggregatzu­ stand hergestellt wurden, z. B. Mörsermühle, Gasstrahlmühle, Elek­ trosputtering, Hochdruckhomogenisation, Mikrofluidisation.

19. Mittel nach den Ansprüchen 1-17 dadurch hergestellt, daß die Li­ pidpartikel durch Zerkleinerung von Lipiden im geschmolzenen Zu­ stand unter Dispergierung in einer äußeren Phase (z. B. hochtourige Rührer, statische Mischer im Mikromaßstab und Makromaßstab, Rotor-Stator-Mühlen, Kolloidmühlen, Hochdruckhomogenisation, Mi­ krofluidisation, Sprühverfahren wie Sprühtrocknung und Elektro­ sprayverfahren) hergestellt werden, wobei die äußere Phase flüssig (Wasser, organische Flüsigkeiten, Öle oder deren Mischungen) oder gasförmig (Luft, Stickstoff, Edelgas) sein kann.

20. Mittel nach den Ansprüchen 1-19, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipidpartikel und ggf. das zusätzliche Adjuvants in einer äußeren Phase dispergiert sind, z. B. wäßrige Flüssigkeiten wie Wasser, isoto­ nische Zuckerlösungen und isotonischer Natriumchloridlösung, nichtwäßrige Flüssigkeiten wie PEG 400 oder 600, organische Flüs­ sigkeiten wie Öle (Miglyole, Erdnußöl, Rizinusöl, Sojaöl, Baumwoll­ samenöl, Rapsöl, Leinsamenöl, Olivenöl, Sonnenblumenöl, Distelöl und andere Öle oder deren Mischungen.

21. Mittel nach dem Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der äu­ ßeren Phase viskositätserhöhende Substanzen zugestezt wurden, z. B.

22. Mittel nach den Ansprüchen 1-19, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipidpartikel und ggf. das zusätzliche Adjuvants in einer trockenen Form vorliegen, z. B. als Lyophilisat, sprühgetrocknetes Produkt, feste Dispersion, Pellet oder Tablette.