DE10024494A1 - Durchmischbares Gefäß zur Durchführung von Reaktionen oder biologischen Prozessen in flüssiger Phase und Verfahren zu deren Durchführung unter Benutzung des durchmischbaren Gefäßes - Google Patents

Abstract

Ein durchmischbares Gefäß, bestehend aus einem Reaktionsgefäß, mindestens einer Durchmischungsvorrichtung und einer oder mehreren Stoffaustauschvorrichtungen, dadurch gekennzeichnet, daß die Stoffaustauschvorrichtung(en) als Hohlkörper gefertigt sind, die ganz oder teilweise aus porösem Material bestehen oder eine Schicht aus porösem Material enthalten, eignet sich zur Durchführung von Reaktionen in flüssiger Phase und zur Durchführung biologischer Prozesse.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein durchmischbares Gefäß zur Durchführung von Reaktionen oder biologischen Prozessen in flüssiger Phase und Verfahren zu deren Durchführung unter Benutzung des durchmischbaren Gefäßes.

Die schonende Begasung von scherempfindlichen Reaktionsprozessen in durchmischten Gefäßen und die Schaffung von hohen Phasangrenzflächen zur Maximierung des Stoffaustausches ist ein seit langer Zeit bekanntes Problem. Insbesondere in der Zellkulturtechnik wurden hierzu eine Reihe von verschiedenen durchmischten Gefäßen und Verfahren entwickelt.

So wird in DE 197 52 604 A1 eine Vorrichtung zur Begasung von Flüssigkeitssäulen beschrieben, bei der Gas durch eine poröse Sinterglasplatte, welche mit hydrophoben Material beschichtet ist, in die Kultur eingebracht wird. Diese Vorrichtung ist jedoch von der Konstruktion sehr aufwendig und erzeugt aufgrund der großen Porenweite von 10 bis 100 µm relativ und dar schlechten Blasenablösung bei polaren Medien wie z. B. Zellkulturmedium recht große Blasen. Die Folge ist ein verminderte Phasengrenzfläche und das Aufschwemmen der Mikroorganismen an die Oberfläche.

Das Patent US 5 230 838 beschreibt ein Gefäß mit zylindrische Begasungsvorrichtung, die aus Polysulfon Hohlfasern besteht. Mit Ihr können in Wasser Blasen von 0,1 bis 0,3 mm erzeugt werden. Kleinere Durchmesser können jedoch auch durch die Verkleinerung der Poren nicht erreicht werden, da sich die Blasen von dem hydrophoben Polysulfon erst bei Erreichen des Benetzungswinkel ablösen.

Neben einfachen Sintersteinen wie im Patent US 5 034 165 beschrieben werden zur Begasung auch Schläuche aus Polypropylen mit einem Porenbereich kleiner 3 µm angewendet. In der Offenlegungsschrift DE 197 47 662 A1 ist eine solche Begasungsvorrichtung beschrieben. Wie die anderen Membranen auch werden hier allerdings hydrophobe Materialien eingesetzt, so daß aufgrund der Oberflächenspannung mit erheblich größeren Blasen im wäßrigen Medium zu rechnen ist. In Reaktionsgefäßen für die Zellkultur werden nach dem heutigen Stand der Technik meist Sintermetallelemente zu Blasenbegasung eingesetzt.

Die Begasungseinrichtungen nach dem Stand der Technik haben den Nachteil, daß sie aus hydrophoben Materialien bestehen und sich daher abhängig vom Benetzungswinkel verhältnismäßig große Blasen bilden. Die System die Kunststoffmaterialien verwenden weisen in der Praxis niedrigere Standzeiten auf, da Sie durch die Reinigungsprozesse stark altem können. Häufig tritt ein produktionsbedingtes fouling auf. Sintermetallelemente weisen dagegen zwar hohe Standzeiten auf, können aufgrund der Porenverteilung und des relativ großen Benetzungswinkels auch keine dem Porendurchmesser entsprechend kleine Gasblasendurchmesser bzw. gute Stoffaustausch erzeugen. Ansätze zur Lösung der Probleme werden zum Beispiel in EP 0 172 478 sowie EP 0 200 886 beschrieben. Die in den genannten Druckschriften offenbarten durchmischbaren Gefäße sind jedoch sehr aufwendig konstruiert und eignen sich nur für sehr spezielle Reaktionen.

Im Bestreben ein verbessertes durchmischbares Gefäß bereitzustellen wurde nun gefunden, daß ein durchmischbares Gefäß zur Durchführung von Reaktionen und biologischen Prozessen in flüssiger Phase bestehend aus einem Reaktionsgefäß, mindestens einer Durchmischungsvorrichtung und einer oder mehreren Stoffaustauschvorrichtungen, dadurch gekennzeichnet, daß die Stoffaustauschvorrichtung(en) als Hohlkörper gefertigt sind, die ganz oder teilweise aus porösem Material bestehen oder eine Schicht aus porösem Material enthalten, sich besonders gut für die Durchführung von Reaktionen eignen.

Das erfindungsgemäße durchmischbare Gefäß kann unterschiedliche Formen haben. Es kann zum Beispiel ein zylindrisches, ein kegelförmiges oder sind wannenförmiges Gefäß sein, wobei das zylindrische Gefäß sowohl stehend als auch liegend angeordnet sein kann. Bevorzugt ist die Ausbildung als ein zylindrisches Gefäß, das stehend angeordnet ist.

Die in dem durchmischbaren Gefäß eingesetzten Stoffaustauschvorrichtungen können unterschiedlich in dem Gefäß eingebaut sein. Zum Beispiel ist es möglich, sie als beliebig geformte Hohlkörper in das Gefäß einzubauen, z. B. an der Gefäßwand, am Gefäßboden oder in besonders durchströmten Bareichen des Gefäßes. Bevorzugt sind Stoffaustauschvorrichtungen, die als längliche Hohlkörper, insbesondere in besonders durchströmten Bereichen des Gefäßes angeordnet sind. Mit dem Begriff länglich ist in diesem Zusammenhang gemeint, daß dar Hohlkörper eine Form hat, bei der die Ausdehnung in Richtung einer Koordinatenachse erheblich größer - mindestens doppelt so groß - als in Richtung der anderen Koordinatenachsen. Bevorzugte Beispiele für längliche Hohlkörper sind runde oder vieleckige oder besonders strömungsgünstig geformte Rohre. Ganz besonders bevorzugt sind Stoffaustauschvorrichtungen, die in dem Gefäß so angeordnet sind, daß mindestens eine dar Stoffaustauschvorrichtungen bei der Durchmischung als Strombrecher wirken. Mit der Bezeichnung Strombrecher ist in diesem Zusammenhang gemeint, daß in dem durchmischbaren Gefäß durch die Durchmischung eine Strömung auftritt, die durch die strombrechende Wirkung der Stoffaustauschvorrichtung gezielt beeinflußt oder erzeugt wird.

Die Stoffaustauschvorrichtungen des erfindungsgemäßen Gefäßes können aus unterschiedlichen porösen Materialien bestehen oder eine oder mehrere Schichten aus porösem Material enthalten. Bevorzugt ist Keramik, Kunstoff oder Metall. Besonders bevorzugt ist Keramik. Geeignet ist z. B. Keramik bestehend aus SiC, Al2O3, TiO2, ZrO2 oder Keramik bestehend aus mehreren Schichten aus Keramik, zum Beispiel Trägerstruktur aus Al2O3 und TiO2 als zusätzliche Schicht. Die für die vorliegende Erfindung einsetzbaren porösen Materialien lassen sich nach Methoden des Standes der Technik herstellen. Die Herstellung bevorzugter Materialien ist beschrieben in Forschrittsberichte VDI, Herstellung und Charakterisierung einer Spinellultrafiltrationsmembran, Reihe 5: Grund- und Werkstoffe Nr. 323, US 5,607,586 (EP 0686424), DE 197 31 551 oder DE 41 34 223.

Das für die Stoffaustauschvorrichtungen zu verwendende Material sollte einen mittleren Porendurchmesser von 1 nm bis 100 µm, vorzugsweise von 0,1 µm bis 10 µm, insbesondere von 1 µm bis 5 µm haben. Das Material mit einem derartigen Porendurchmesser eignet sich besonders zur Begasung des durchmischbaren Gefäßes. Ganz besonders eignet sich eine Stoffaustauschvorrichtung, die die Form eines zylindrischen insbesondere keramischen Hohlkörpers hat, der mit Hilfe einer Stützkonstruktion aus Metall oder Kunststoff gehalten wird und von mindestens einer Seite verschraubbar ist (siehe Zeichnung).

An Stelle oder zusätzlich zu den genannten Stoffaustauschvorrichtungen, die sich besonders zur Begasung des durchmischbaren Gefäßes eignen, kann das erfindungsgemäße durchmischbare Gefäß weitere Stoffaustauschvorrichtungen enthalten, die sich besonders zum Austausch nichtgasförmiger Stoffe eigenen. Derartige Stoffaustauschvorrichtungen können z. B. zum Abzug von Reaktionsprodukt, von Viren, zum Abzug von Reaktionsflüssigkeit unter gleichzeitiger Sterilfiltration eingesetzt werden. Der bevorzugte Porendurchmesser dieser Stoffaustauschvorrichtungen liegt im Bereich von 1 nm bis 10 µm. Zum Beispiel eignen sich poröse Materialien mit einem Porendurchmesser von 1 nm bis 0,2 µm zur Zuführung von Nährstoffen für biologische Prozesse unter gleichzeitiger Sterilfiltration. Zum Abzug von Schadstoffen oder Produkt ist zum Beispiel ein Porendurchmesser von 1 nm bis 0,2 µm geeignet, zum Abzug von monoklonalen Antikörpern ist ein Porendurchmesser im Bereich von 0,1 µm bis 0,3 µm brauchbar. Zum Abzug von Viren eignet sich ein Porendurchmesser von 5 µm bis 10 µm. Zum Erfindungsgegenstand gehört demzufolge ein durchmischbares Gefäß das dadurch gekennzeichnet ist, daß das durchmischbare Gefäß zwei oder mehr Stoffaustauschvorrichtungen oder zwei oder mehr Gruppen von Stoffaustauschvorrichtungen enthält, die unterschiedliche Porendurchmesser des porosen Materials aufweisen.

Das Verhältnis von Flüssigkeitsvolumen des durchmischbaren Gefäßes zu Oberflächengröße der zur Begasung benutzten Stoffaustauschvorrichtung kann einen weiten Bereich überstreichen. Für die Begasung des durchmischbaren Gefäßes ist ein Verhältnis von 0,1 bis zu 100 (Flächeneinheit zu Volumeneinheit) besonders geeignet.

Die Durchmischung des Gefäßes kann auf unterschiedliche Weise erfolgen. So ist es beispielsweise möglich, das Gefäß zu durchmischen mittels unterschiedlich angeordneter mechanischer Rührer oder durch Schüttelbewegungen des Gefäßes. Bevorzugt ist die Durchmischung mittels mechanischer Rührer. Besonders bevorzugt ist die Durchmischung in einem zylindrischen Gefäß, in dem mechanische Rührer die Reaktionsflüssigkeit in Bewegung versetzen. Bevorzugt setzt man dazu Schrägblattrührer, 3-Blatt Segmentrührer oder Propellerrührer ein. Besonders bevorzugt sind Propellerrührer, ganz besonders bevorzugt Propellerrührer, die mittels einer parallel zur Zylinderachse angeordneten Welle angetrieben werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das durchmischbare Gefäß mehrere Propellerührer unterschiedlicher Form und/oder Größe, die zur Optimierung einer schonenden Durchmischung des Gefäßes auf die Geometrie des Gefäßas und die durchzuführende Reaktion aufeinander abgestimmt sind. Zum Erfindungsgegenstand gehört deshalb ein durchmischbares Gefäß gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Gefäß ein zylindrischer Rührkessel ist, der mit einem oder mehreren Propellerrührern ausgestattet ist und indem die Stoffaustauschvorrichtung(en) längliche Hohlkörper sind, die derart angeordnet sind, daß deren Längsachsen annähernd parallel zur Längsachse des Rührkessels ausgerichtet sind und strombrechende Wirkung haben.

Weiterhin gehört zum Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Durchführung von Reaktionen oder zur Durchführung biologischer Prozesse, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein erfindungsgemäßes durchmischbares Gefäß benutzt wird.

Eins besondere Bedeutung hat das erfindungsgemäße Verfahren bei der Durchführung von Reaktionen oder bei dar Durchführung von biologischen Prozessen, bei denen scherempfindliche Stoffe beteiligt sind. Unter scherempfindlichen Stoffen sind in diesem Zusammenhang Stoffe zu verstehen, die durch Scherkräfte beim Bewegen innerhalb einer Flüssigkeit beeingträchtigt, beschädigt oder zerstört werden. Beispiele für scherempfindliche Stoffe können polymere Partikeln, Mikrokapseln, biologische Organismen, insbesondere tierische Zellen, pflanzliche Zellen oder Trägerstoffe sein.

Eine besondere Bedeutung hat das erfindungsgemäße Verfahren bei der Durchführung von Reaktionen oder biologischen Prozessen, bei denen die Zuführung eines gasförmigen Stoffes nötig oder vorteilhaft ist Beispielhafte Reaktionen oder biologische Prozesse sind die Kultivierung von Madin Darby Canin Kidney (MDCK) Zellen zur Herstellung von Virusimpfstoffen, Baby Hamster Kidney (BHK) Zellen zur Herstellung von rekombinanten Proteinen, zum Beispiel Faktor 8 Prozeß, Chinese Hamster Overrays (CHO) Zellen zur Herstellung von rekombinanten Proteinen.

Weiterhin eine ganz besondere Bedeutung besitzt das erfindungsgemäße Verfahren bei der Kultivierung von biologischen Zellen insbesondere tierischen Zellen, die auf suspendierten Trägem kultiviert werden. Beispielhafte Kultivierungen sind die Kultivierung von Madin Darby Bovine Kidney Zellen (MDBK, zum Beispiel ATCC CCL 22 oder DSM ACC 65) zur Herstellung von viralen Antigenen. Für das erfindungsgemäße Verfahren besonders geeignete Träger sind zum Beispiel Dextrancarrier mit Collagenschicht (wie das Produkt Cytodex 3). Die genannten Träger sind kommerziell erhältlich bei der Firma Amersham Pharmacia Biotech GmbH, Freiburg, Deutschland.

Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß die in dem durchmischbaren Gefäß befindliche Flüssigkeit sehr effektiv und gleichzeitig sehr schonend gleichmäßig durchmischt und begast werden kann; dabei hat das Verfahren für die Durchmischung von. Flüssigkeiten, die scherempfindliche Stoffe, wie zum Beispiel Mikrokapseln, biologische Zellen, insbesondere tierische Zellen, eine ganz besondere Bedeutung. Tierische Zellen verfügen nicht über eine schützende Zellwand und können schon bei geringen mechanischen Belastungen irreversibel geschädigt werden deshalb müssen die Scherkräfte, die auf Zellen wirken, gering gehalten werden. Erreicht wird dies durch den Einsatz schonender Rührer und der Kultivierung bei niedrigen Rührerdrehzahlen. Die beschriebenen Zusammenhänge gehen besondere für adhärente Zellen, die auf Mikrocarriern kultiviert werden. Ein weiterer wichtiger Faktor bei der Kultivierung von Zellen ist häufig die Versorgung mit Sauerstoff. Einschlägige Probleme bei Begasung und Durchmischung mit üblichen Methoden wie zum Beispiel Unterversorgung der Zellen, Bildung von zellschädigendem-Schaum oder zellschädigender Flotation von Mikrocarriern werden zum Beispiel in Griffith, B., Lobby, D: Scale-up of Suspension and Ancnoraga-dependent Animal Cells, Methods in Molecular Biology, Humane Press Inc. Otawa, 1989 beschrieben. Das erfindungsgemäße Verfahren löst die Probleme des Standes der Technik besonders wirksam dadurch, daß die durch poröse Materialien eingetragenen gasförmigen Stoffe zu besonders kleinen Blasen führen, die sich nicht zu größeren Blasen vereinigen und die duch geringen Auftrieb auch nicht oder nur sehr langsam zur Füssigkeitsobergrenze aufsteigen wobei gleichzeitig durch die intensive Verteilung der Mikroblasen durch Einbringen über strombrechende Stoffaustauschvorrichtungen die Blasen optimal verteilt werden und den nötigen Stoffaustausch bewirken.

Durch die nachfolgenden Ausführungsbeispiele sowie durch den Inhalt der Patentansprüche soll die vorliegende Erfindung näher erläutert werden.

Beispiele Beispiel zur direkten Begasung von Medien und Zellkulturmedien mit Serum und Carriern

Der Versuchsreaktor ist ein zylindrisches Gefäß mit folgenden Abmessungen: Höhe H = 1200 mm, Durchmesser 400 mm. Die Füllhöhe des Gefässes betrug 600 mm (= 75 l) bzw. 800 mm (= 100 l). Vier Keramikmembranen in Form zylindrischer Keramikrohrs (Durchmesser 10 mm, Innendurchmesser 7 mm) sind senkrecht zum Reaktorboden als Strombrecher an der Reaktorwandung eingebaut. Entsprechende Keramikrohre sind erhältlich bei Hermsdorfer Institut für Technische Keramik e. V., Hermsdorf, BRD oder Atech Innovations GmbH, Gladback, BRD. Das verschlossene Ende der 400 (2) bzw. 600 mm (2) langen Keramikmembranen befindet sich etwa 50 mm oberhalb des Reaktorbodens. Die Begasungszuluft wird über einen Silikonschlauch, der mit dem oberen Membreneingang verbunden ist, den Keramikmebranen zugeführt. Die mittlere Porengröße der Keramikmembranen beträgt 3 µm. Die Keramikmembran sind aus Al₂O₃ gefertigt. Eingestellt werden zunächst Gasvolumenströme zwischen 40 und 140 ml/min. Die Durchmischungsvorrichtung besteht aus 2 Propellerrührern, mit 299 mm Durchmesser und 200 mm Durchmesser, wobei der Rührer R₂₉₉ oben (bei 75 l Füllmenge 360 mm über dem Reaktorboden und bei 100 l Füllmenge 460 mm über dem Reaktorboden) und R₂₀₀ unten (120 mm über dem Reaktorboden) angebracht wird. Die Rührerdrehzahlen betragen 33 rpm bzw. 50 rpm und die Carrierkonzentration 3 bzw. 6 g/l.

Ermittelt werden die Blasengrößen, dar Sauerstoffübergangskoeffizient k_la, die Schaumhöhe und das Flotationeverhalten der Carrier. Die Ergebnisse werden mit mehreren handelsüblichen Systemen (Sinterplatten, Sparger, Begasungsteller) zur direkten Begasung von Zellkulturmedien verglichen.

Beispiel 1 Direkte Begasung von Zellkulturmedien mit Serum und Carriern

Zur Begasung des serumhaltigen Kulturmediums (Dulbecco's modified Eagle Medium DMEM, Gibco Life Technologies GmbH, Karlsruhe BRD; totales Kälberserum FKS, Sigma GmbH, Deisenhofen, BRD) wurden zwei 40 cm lange Keramikmembranen gegenüberliegend als Strombrecher angeordnet bei Carrierkonzentrationan von 3 g/l und 6 g/l (C3, Pharmacia) eingesetzt. Bei kontinuierlicher Begasung mit Keramikbegasung bei einem Volumenstrom von 70 ml/min stellte sich eine stabile Schaumkrone von etwa 8-10 cm Höhe ein. Bei der Begasung mit Keramikmembranen war im Gegensatz zur Begasung mit handelsüblichen Systemen die Schaumschicht überraschenderweise weitgehend frei von Carriern. In der Tabelle sind die K_La-Werte, die mit den beiden 40 cm Keramikmembranen erhalten denen gegenübergestellt, die mittels Spargen (handelsübliches System für die Kultivierung tierischer Zellen (Bezugsquelle: Applicon Biotec GmbH, Knüllwald-Remsfeld BRD) erhalten wurden. Eine homogene Verteilung von Carriern und Gasblasen und die beste Durchmischung wurde mit der Rührerkonfiguration R200 + 299 (Rührer mit Durchmesser 299 mm oben und Rüher mit Durchmesser 200 mm unten angeordnet) erreicht.

Bedingungen

Gasvolumenstrom: 70 ml/min
Schlankheitsgrad: 1,5
Begasungssystem: Keramikmembranen 2.400 mm und Sparger
Carrierkonzentration: 3 g/l bzw. 6 g/l

Die Erhöhung der Carrierkonzentration von 3 auf 6 g/l führte bei den Keramikmembranen zu einer Verbesserung des K_La-Wertes. Die Werte der Keramikmembranen liegen etwa um den Faktor 4 höher als die des Spargers. Dies ist neben der längeren Verweilzeit vermutlich auf die erhöhte Austauschfläche der kleineren Blasen zurückzuführen. Da die Verweilzeiten mit etwa 40 Sekunden doppelt so hoch lagen wie die durch den Sparger erzeugten Blasen, kann ein größerer Anteil des Luftsauerstoffes in die Flüssigkeit übergehen.

Ein weiteres überraschendes Ergebnis ist die Tatsache, daß die K_La-Werte, die bei den Keramikmembranen ermittelt wurden, für die Drehzahlen 33 und 50 nahezu identisch waren.

Als Grund hierfür kann die gute Blasenverteilung bereits bei geringen Drehzahlen vermutet werden. Schon bei der Drehzahl von 33 mm wurden die Blasen frühzeitig von dar Keramik gelöst und homogen im Reaktor verteilt.

Ein weiteres überraschendes Ergebnis ist, daß sich die K_La-Werte bei der Begasung unter Verwendung der Keramikmembranen in serumhaltigern Medium bei einer Carrierkonzentration von 3 g/l etwa doppelt so hoch lagen, wie in einem bezüglich der Leitfähigkeit dem Zellkulturmedium angepassten koaleszenzhemmenden Medium. Eine Erhöhung der Carrierkonzentration führte überraschenderweise zu einer weiteren k_La-Wart Verbesserung.

Einen Beitrag zur Verbesserung des Sauerstoffeintrages bei den Keramikmembranen leisten vermutlich die vergleichsweise kleinen Gasblasen mit einer Größe von etwa 0,2 mm, die sich an die Carrier anlagern und somit die Verweilzeiten im Medium weiter erhöhen.

Die Blasen sind mit ca. 0,2 mm so klein, daß ihre Auftriebskräfte nicht ausreichen, um die Carrier an die Oberfläche zu flotieren. Dies belegt die nahezu carrierfreie Schaumschicht, die bei der Begasung mit Keramikmembranen auch über einen längeren Zeitraum konstant bleibt.

Kontrollierbare Schaumschichten haben nach Untersuchungen von Fraune et al. (Agitation; aeration and perfusion modules for cell culture bioreactors, Cytotechnology 11, Luver Academic Publishers, Netherlands 1993) keinen zellschädigenden Einfluß und werden in der Praxis toleriert.

Der theoretische Sauerstoffbedarf z. B. von MDBK-Zellen beträgt ca. 5 mg O₂/(l.h) für 1.10⁶ Zellen/ml. Hiermit kann die theoretisch zu erreichende maximale Zellzahl berechnet werden. Die mit den Keramikmembranen unter Kultivierungsbedingungen ermittelten k_La-Werte von 2,3 h^-1 und 2,6 h^-1 reichen bei Begasung mit Luft theoretisch aus, um 2,5.10⁶-2,8.10⁶ Zellen/ml mit Sauerstoff zu versorgen. Für Carrierkonzentrationen von 3 g/l kann so die Sauerstoffversorgung gewährleistet werden, da die maximale Zellzahl hier bei 2,4.10⁶ Zellen/ml liegt. Bei Hochzelldichten, d. h. höheren Carrierkonzentrationen kann gegen Kultivierungsende das Zumischen von Sauerstoff hilfreich sein, um den O₂-Bedarf der Zellen zu decken.

Der mittlere Durchmesser der mit den Keramikmembranen erzeugten Gasblasen in einem koaleszenzhemmenden Medium lag überraschenderweise im Vergleich mit handelsüblichen Systemen wie z. B. einem Edelstahlsparger (Applikon) um den Faktor 5 niedriger im Bereich von ca. 0,2 mm. Die Verwendung der Rührerkombination R_200+299 ermöglichte eins homogene Blasenverteilung im gesamten Reaktor. Es wurden im gerührten Zustand bei 100 l Füllvolumen Blasenverweilzeiten von ca. 40 Sekunden erreicht. Im ungerührten Zustand erreichten die Blasen nach etwa 10 Sekunden die Oberfläche.

Beispiel 2 Direkte Begasung von koaleszenzhemmenden Lösungen

Die in einer koaleszenzhemmenden Lösung (Bicarbonatpuffer mit vergleichbarer Leitfähigkeit des DMEM Zellkulturmediums) bei einem Gasvolumenstrom von 70 ml/min ermittelten K_La-Werte sind in der folgenden Tabelle für unterschiedliche Keramikmembranlängen in Abhängigkeit von der Rührdrehzahl aufgeführt.

Tabelle 2.1

k_La-Werts für verschiedene Keramikmembranlängen bei 75 l Füllvolumen

Bedingungen

Gasvolumenstrom: 70 ml/min
Schlankheitsgrad: 1,5 (600 mm Füllhöhe 75 l)
Durchmischungsvorrichtung: Propellerrührerkombination R_200+299

Begasungssystem: Keramikmembranen

Bei den längeren Modulen stiegen einige Blasen direkt auf ohne durch den Rührer verteilt zu werden

Tabelle 2.2

k_La-Werte für verschiedene Membranlängen bei 100 l Füllvolumen.

Bedingungen

Gasvolumenstrom: 70 ml/min
Schlankheitsgrad: 2 (800 mm Füllhöhe = 100 l)
Durchmischungsvorrichtung: Propellerrührerkombination R_200+299

Begasungssystem: Keramikmembranen

Die k_La-Werte sind im Bereich bis zu 50 rpm unabhängig von Drehzahl und Membranlänge konstant.

Tabelle 2.3

K_La-Werte für vier Keramikmembranen bei erhöhter Begasungsrate

Bedingungen

Gasvolumenstrom: 140 ml/min
Schlankheitsgrad: 2 (800 mm Füllhöhe = 100 l)
Durchmischungsvorrichtung: Propellerrührerkombination R_200+299

Begasungssystem: Keramikmembranen

Beim Einsatz von vier Keramikmembran-Modulen als Strombrecher war im Vergleich zu zweien eine Verbesserung des K_La-Wertes um etwa 60% bei der Drehzahl von 50 rpm zu erkennen.

Allgemeine Schlußfolgerungen

Mit den Karamikmembranen integriert als Strombrecher in ein Rührksselreaktionssystem wurde ein schonendes direktes Begasungsverfahren gefunden, das die Kultivierung adhärenter Zellkulturen im Produktionsmaßstab erlaubt. Ein großer Vorteil liegt im Vergleich zu den blasenfreien indirekten Begasungssystamen wie Silikonschläuchen oder Accurelmembranen in der geringen benötigten Begasungsoberfläche. Für einen Produktionsreaktor mit 100 l Reaktionsvolumen wären beispielsweise 250 m Silikonschlauch in 25 Segmenten erforderlich, um den Sauerstoffbedarf der Zellen decken zu können. Durch den einfachen Einbau als Strombrecher, die zur Vermeidung von Thromben ohnehin erforderlich sind, verursachen die Keramikmembranen keine weiteren Toträume im Reaktor und können definierte Strömungen ermöglichen. Ein Vorteil der erfindungsgemäßen durchmischbaren Gefäße besteht darin, daß die Gefäße gereinigt und sterilisiert werden können ohne daß sie zerlegt werden müssen, was die Reaktorstandzeiten und den apparativen Aufwand entscheidend reduziert.

Mit dem Einsatz von Keramikmembranmodulen als begasande Strombrecher wurde eine elegante und praktische Methods gefunden, die gleich mehrere Vorteile vereint;

• - Versorgung von Zellzahlen bis 2-3 × 10⁶/ml bei Luftbagasung
• - kleine Gasblasen sowie geringe Blasenaustragung Verhindern Carrierflotation
• - möglicher Einsatz als Strombrecher
• - Reinigung und Sterilisation ohne Zerlegung einfach realisierbar
• - geringe Scherbelastung durch sehr niedrige Rührdrehzahlen
• - zusätzlicher Einsatz als Perfusionsmodul möglich
• - variable Auslegung bei relativ geringen Kosten

Claims (12)

1. Durchmischbares Gefäß zur Durchführung von Reaktionen und biologischen Prozessen in flüssiger Phase bestehend aus einem Reaktionsgefäß, mindestens einer Durchmischungsvorrichtung und einer oder mehreren Stoffaustauschvorrichtungen, dadurch gekennzeichnet, daß die Stoffaustauschvorrichtung(en) als Hohlkörper gefertigt sind, die ganz oder teilweise aus porösem Material bestehen oder eine Schicht aus porösem Material enthalten.

2. Durchmischbares Gefäß gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Stoffaustauschvorrichtung(en) derart in dem Gefäß angeordnet sind, daß sie eine strombrechende Wirkung haben.

3. Durohmischbares Gefäß gemäß den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das poröse Material Keramik ist und als zylindrischer Hohlkörper vorliegt.

4. Durchmischbares Gefäß gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Poren des porösen Materials einen mittleren Durchmesser von 1 nm bis 100 µm, vorzugsweise von 0,1 µm bis 10 µm, insbesondere von 1 µm bis 5 µm haben.

5. Durchmischbares Gefäß gemäß Anspuch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das durchmischbare Gefäß zwei oder mehr Stoffaustauschvorrichtungen oder zwei oder mehr Gruppen von Stoffaustauschvorrichtungen enthält, die unterschiedliche Porendurchmesser des porösen Materials aufweisen.

6. Durchmischbares Gefäß gemäß einem oder mehreren dar Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Durchmischungsvorrichtung ein oder mehrere mechanische Rührer sind, wobei im Falle mehrerer mechanischer Rührer die mechanischen Rührer unterschiedliche Form und/oder Größe aufweisen können.

7. Durchmischbares Gefäß gemäß einem oder mehreren dar Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Gefäß ein zylindrischer Rührkessel ist, der mit einem oder mehreren mechanischen Rührern ausgestattet ist und in dem die Stoffaustauschvorrichtung(en) längliche Hohlkörper sind, die derart angeordnet sind, daß deren Längsachsen annähernd parrallel zur Längsachse des Rührkessels ausgerichtet sind und strombrechende Wirkung haben.

8. Durchmischbares Gefäß gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Stoffaustauschvorrichtung(en) längliche keramische Hohlkörper sind, die von einer aus Edelstahl oder Kunststoff bestehenden auf mindestens einer Seite einschraubbaren Stützvorrichtung gehalten werden, die im inneren des Hohlkörpers verläuft.

9. Verfahren zur Durchführung von Reaktionen oder zur Durchführung von biologischen Prozessen, dadurch gekennzeichnet, daß ein durchmischbares Gefäß gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8 benutzt wird.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß an der Reaktion oder dem biologischen Prozeß scherempfindliche Stoffe beteiligt sind.

11. Verfahren zur Durchführung von biologischen Prozessen gemäß den Ansprüchen 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß bei dem biologischen Prozeß tierische Zellen kultiviert werden.

12. Verfahren zur Durchführung von biologischen Prozessen gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die tierischen Zellen auf suspendierten Trägem kultiviert werden.