DD286598A5

DD286598A5 - PROCESS FOR THE INTRODUCTION OF PRIMARY AMINO GROUPS IN WATER-SOLUBLE POLYMERS

Info

Publication number: DD286598A5
Application number: DD33016789A
Authority: DD
Inventors: Manfred Kuehn
Original assignee: Adw Der Ddr,Zi F. Mulekularbiologie,De
Priority date: 1989-06-29
Filing date: 1989-06-29
Publication date: 1991-01-31

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Einfuehrung von primaeren Aminogruppen in wasserloesliche Polymere. Durch nukleophile Substitutionsreaktionen von aktivierten, wasserloeslichen Polymeren mit bifunktionellen, organischen Verbindungen mit mindestens einer Merkaptogruppe und zusaetzlichen, primaeren Aminogruppen oder Nitrogruppen, die nachtraeglich reduziert werden unter sauren oder alkalischen Bedingungen, werden modifizierte, wasserloesliche Polymere mit primaeren Aminogruppen aliphatischer und aromatischer Natur erhalten. Die Umsetzungen werden in waeszrigen Loesungen, organischen Loesungsmitteln oder Gemischen beider in Gegenwart saeurebindender Mittel bei Temperaturen von 20C bis 150C ausgefuehrt. Die Isolierung der aminogruppenhaltigen Polymeren geschieht durch Lyophilisierung der dialysierten Reaktionsloesungen oder durch Extraktion und/oder Ausfaellung mit organischen Loesungsmitteln.{Verfahren; nukleophile Substitution; aktivierte und wasserloesliche Polymere; bifunktionelle Reagentien; Merkaptogruppen; Aminogruppen; Nitrogruppen}The invention relates to a process for the introduction of primary amino groups into water-soluble polymers. By nucleophilic substitution reactions of activated, water-soluble polymers with bifunctional, organic compounds having at least one mercapto group and additional, primary amino groups or nitro groups, which are subsequently reduced under acidic or alkaline conditions, modified, water-soluble polymers having primary amino groups of aliphatic and aromatic nature are obtained. The reactions are carried out in aqueous solutions, organic solvents or mixtures of both in the presence of acid-binding agents at temperatures of 20C to 150C. The isolation of the amino-containing polymers is carried out by lyophilization of the dialyzed reaction solutions or by extraction and / or precipitation with organic solvents. {Process; nucleophilic substitution; activated and water-soluble polymers; bifunctional reagents; mercapto; amino groups; Nitro groups}

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Einführung von primären Aminogruppen in wasserlösliche Polymere. Diese Polymere finden Anwendung in der Biotechnologie, Chemie, Biochemie, Pharmazie und Medizin.The invention relates to a method for introducing primary amino groups into water-soluble polymers. These polymers are used in biotechnology, chemistry, biochemistry, pharmacy and medicine.

Characteristic of the known state of the art

Die Modifizierung wasserlöslicher Polymere mit !covalent gebundenen Hydroxylgruppen ist notwendig, um in diesen Polymeren die Hydroxylgruppen durch andere reaktive und wiederum, aber oftmals leichter funktionalisierbare, funktioneile Gruppen zu ersetzen. Unter den funktionellen Gruppen, die zur weiteren Modifizierung dieser Polymeren besondors geeignet sind, spielen primäre Aminogruppen eine herausragende Rolle. Zur Einführung von primären Aminogruppen in wasserlösliche Polymere können verschiedene Synthesereaktionen angewendet werden. Ein geeigneter Reaktionstyp wird als nukleophile Substitutionsreaktion bezeichnet, bei der reaktive Zwischenprodukte der wasserlöslichen Polymeren mit Ammoniak oder Diaminen umgesetzt werden. Die Umsetzungen nach diesem Reaktionstyp geben aber häufig Anlaß zu Nebenreaktionen, so daß in den Polymeren nach auf diesem Wege erfolgter Modifizierung neben den gewünschten primären Aminogruppen auch noch sekundäre bsziehungswoise tertiäre Aminogruppen vorliegen können. Dieser Umstand erfordert aber zusätzlichen, präparativen Aufwand zur Isolierung von wasserlöslichen Polymeren mit ausschließlichem oder überwiegendem Gehalt an primären Aminogruppen.The modification of water-soluble polymers with covalently bonded hydroxyl groups is necessary in order to replace the hydroxyl groups in these polymers with other reactive and in turn, but often easier functionalizable, functional groups. Among the functional groups suitable for further modifying these polymers, primary amino groups play a prominent role. Various synthetic reactions can be used to introduce primary amino groups into water-soluble polymers. One suitable type of reaction is called a nucleophilic substitution reaction in which reactive intermediates of the water-soluble polymers are reacted with ammonia or diamines. However, the reactions according to this type of reaction often give rise to side reactions, so that in addition to the desired primary amino groups secondary tertiary amino groups may also be present in the polymers after the modification has taken place in this way. However, this circumstance requires additional, preparative effort for the isolation of water-soluble polymers with an exclusive or predominant content of primary amino groups.

Ziel dar ErfindungAim of the invention

Ziel der Erfindung ist es, in wasserlös liehe, hydroxylgruppenhaltige Polymere durch einfache chemische Reaktionen primäre Aminogruppen einzuführen und mit diesen funktionellen Gruppen modifizierte Polymere für die Immobilisierung von biologisch aktiven Veibindungen bereitzustellen.The aim of the invention is to introduce water-soluble, hydroxyl-containing polymers by simple chemical reactions primary amino groups and provide polymers modified with these functional groups for the immobilization of biologically active Veibindungen.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Einführung von primäien Aminogruppen in wasserlösliche Polymere, bei denen Hydroxylgruppen durch primäre Aminogruppen substituiert werden sollen. Erfindungsgemäß erreicht man das dadurch, daß man die aus hydroxylgruppenhaltigen, wasserlöslichen Polymeren erhältlichen Halogenderivate, Schwefelsäureester,The object of the invention is a process for the introduction of primary amino groups into water-soluble polymers in which hydroxyl groups are to be substituted by primary amino groups. According to the invention, this is achieved by obtaining the halogenated, water-soluble polymers available halogen derivatives, sulfuric acid esters,

Salpetersäureester oder Sulfonsäureester mit bifunktionellen, organischen Verbindungen mit mindestens einer Merkaptogruppe und einer aliphatischen oder aromatischen, primären Aminogruppe beziehungsweise einer Merkaptogruppe und einer oder mehrerer, aromatischer Nitrogruppe(n) in wäßrigen Lösungen oder organischen Lösungsmitteln oder Gemischen beider in Gegenwart von Alkalihydroxiden, Alkalikarbonaten oder Alkalialkoholaten und im Falle der Verwendung von Verbindungen mit aromatischen Nitrogruppen auch in Anwesenheit von Reduktionsmitteln bei 20"C bis 1PO°C in Zeiten von 1 Stunde bis 10 Stunden umsetzt. Als Sulfonsäureester werden dabei Alkyl· oder substituierte A.kyl-, Aryl- oder Hetaryl-, substituierte Aryl- oder Hetaryl·, kondensierte und/oder substituierte Aryl- oder Hetarylsulfonsäureester eingesetzt. Geeignete, bifunktionelle, organische Verbindungen für die Umsetzungen mit den aktivierten Dei ivaten der wasserlöslichen Polymeren sind zum Beispiel Cysteamin oder Cystein beziehungsweise Aminothiophenole oder Nitrothiophenole. Die Reaktionstemperaturbn liegen bei den nukleophilen Substitutionsreaktionen zwischen 2O⁰C und 15O⁰C, und als organische Lösungsmittel - auch in Gemischen mit wäßrigen Lösungen -werden vorzugsweise Alkohole, Ketone, cyclische Ether wie Tetrahydrofuran beziehungsweise Dioxan oder aprottsche Lösungsmittel wie Acetonitril, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid, in manchen Fällen aber auch In Wasser nicht lösliche oder mischbare, organische Lösungsmittel wie Chloroform, Methylenchlorid, Benzen oder Toluen verwendet.Nitric acid esters or sulfonic acid esters with bifunctional, organic compounds having at least one mercapto group and an aliphatic or aromatic, primary amino group or a mercapto group and one or more aromatic nitro group (s) in aqueous solutions or organic solvents or mixtures of both in the presence of alkali metal hydroxides, alkali metal carbonates or alkali metal and in the case of the use of compounds having aromatic nitro groups, also in the presence of reducing agents at 20 ° C. to 1 ° C. in times of 1 hour to 10 hours substituted, substituted aryl or hetaryl, condensed and / or substituted aryl- or hetarylsulfonic acid esters Suitable, bifunctional, organic compounds for the reactions with the activated Dei ivates of the water-soluble polymers are, for example, cysteamine or Cyst or aminothiophenols or nitrothiophenols. The Reaktionstemperaturbn are in the nucleophilic substitution reactions between 2O ⁰ C and 15O ⁰ C, and as organic solvents - also in mixtures with aqueous solutions - are preferably alcohols, ketones, cyclic ethers such as tetrahydrofuran or dioxane or aprotic solvents such as acetonitrile, dimethylformamide or dimethyl sulfoxide, but in some cases also water-insoluble or miscible, organic solvents such as chloroform, methylene chloride, benzene or toluene used.

Die Nitrogruppen in mit Nitrothiophenolen modifizierten, wasserlöslichen Polymeren werden nach den Substitutionsreaktionen noch reduziert, um wasserlösliche Polymere mit primären, aromatischen Aminogruppen zu erhalten. Die Reduktion der Nitrogruppen erfolgt mit Vorteil gleichzeitig mit der Substitutionsreaktion, wenn Natriumdithionit unter alkalischen Bedingungen als Reduktionsmittel eingesetzt wird. Eine Reduktion dieser aromatischen Nitrogruppen enthaltenden Polymeren unter sauren Bedingungen ist auch möglich, zum Beispiel mit Zinndichlorid in konzentrierter Salzsäure. Die Polymeren werden dabei aber zunächst isoliert und danach reduziert. Die, salzsauren Reduktionslösungen werden nach der Reduktion alkalisiert, filtriert und wie unten beschrieben aufgearbeitet.The nitro groups in nitrothiophenol-modified, water-soluble polymers are still reduced after the substitution reactions to obtain water-soluble polymers having primary, aromatic amino groups. The reduction of the nitro groups is advantageously carried out simultaneously with the substitution reaction when sodium dithionite is used under alkaline conditions as a reducing agent. A reduction of these aromatic nitro groups-containing polymers under acidic conditions is also possible, for example with tin dichloride in concentrated hydrochloric acid. The polymers are initially isolated and then reduced. The hydrochloric acid reducing solutions are alkalized after reduction, filtered and worked up as described below.

Unter den gewählten Reaktionsbedingungen verlaufen die Reaktionen wegen der höheren Nukleophilie des Mercaptidschwefels gegenüber dem Stickstoff in den primären Aminogruppen und den Nitrogruppen in den bifunktionellen, organischen Verbindungen eindeutig unter Ausbildung von Thioethern wasserlöslicher Polymere, die zusätzlich noch ausschließlich freie, primäre Aminogruppen als reaktive funktioneile Gruppen enthalten.Under the reaction conditions chosen, because of the higher nucleophilicity of the mercaptide sulfur relative to the nitrogen in the primary amino groups and the nitro groups in the bifunctional organic compounds, the reactions clearly proceed to form thioethers of water-soluble polymers which additionally contain only free, primary amino groups as reactive functional groups ,

Zur Isolierung der mit primären Aminogruppen modifizierten, wasserlöslichen Polymeren werden die Reaktionslösungen zunächst mit einer ausreichenden Menge destilliertem Wasser versetzt und dann entweder durch Dialyse gegen destilliertes Wasser, sich anschließender Ultrafiltration und Lycphilisierung oder durch Extraktion mit in Wasser nicht löslichen oder mischbaren, organischen Lösungsmitteln wie Chloroform, Methylenchlorid, Benzen oder Toluen und nachfolgendem Verdampfen des Lösungsmittels in fester Form erhalten. Auch eine Verringerung des Lösungsmittelvolumens und Vernetzen des Restes mit Ether oder Petrolether zur Ausfällung ist eine geeignete Methode zur Isolierung der aminogruppenhaltigen Polymeren. Die erfindungsgemäße Einführung von primären Aminogruppen in wasserlösliche Polymere ist einfach durchführbar und führt zu weiter modifizierbaren, reaktiven Polymeren, die für die Immobilisierung biologisch aktiver Verbindungen eingesetzt werden könnenTo isolate the water-soluble polymers modified with primary amino groups, the reaction solutions are first treated with a sufficient amount of distilled water and then either by dialysis against distilled water, followed by ultrafiltration and lycrophilization or by extraction with water-insoluble or miscible organic solvents such as chloroform , Methylene chloride, benzene or toluene and then evaporating the solvent in solid form. A reduction in the volume of solvent and crosslinking of the residue with ether or petroleum ether for precipitation is a suitable method for isolating the amino-containing polymers. The introduction according to the invention of primary amino groups into water-soluble polymers is easy to carry out and leads to further modifiable, reactive polymers which can be used for the immobilization of biologically active compounds

Die Erfindung wird durch Beispiele weiter erläutert. The invention will be further explained by examples.

embodiments example 1

1 g Dextransulfat (MG 500000) wird in 15ml destilliertem Wasser gelöst. Zu dieser Lösung werden 10ml einer alkoholischen Lösung addiert, die 0,5g aufgelöstes Natriumsalz des C' steamins enthält. Das Roaktionsgemisch wird 10 Stunden bei 8C⁰C gerührt. Das Volumen der dialysierten Lösung wird auf 5ml eingeengt, und daraus wird das aminogruppenhaltige Polymere durch Lyophilisierung gewonnen. Der Test mit Trinitrobenzensulfonsäure auf primäre Aminogruppen ist positiv. Ausbeute: 0,75g1 g of dextran sulfate (MW 500000) is dissolved in 15 ml of distilled water. To this solution is added 10 ml of an alcoholic solution containing 0.5 g of dissolved sodium salt of C'-steamin. The crude mixture is stirred at 8 C ⁰ C for 10 hours. The volume of the dialyzed solution is concentrated to 5 ml, and from this, the amino group-containing polymer is obtained by lyophilization. The test with trinitrobenzenesulfonic acid on primary amino groups is positive. Yield: 0.75g

Example 2

1 g Tosylester des Polyvinylalkohole wird in einem Gemisch aus 10ml destilliertem Wasser und 15ml frisch destilliertem1 g of tosyl ester of the polyvinyl alcohols is freshly distilled in a mixture of 10 ml of distilled water and 15 ml

Dissolved dimethyl sulfoxide. 10 ml of dimethyl sulphoxide are added to this solution, in the 0.8 g sodium salt of cysteine

aufgelöst waren. Das Reaktionsgemisch wird 6 Stunden bei 60⁰C gerührt und nach dem Abkühlen gegen destilliertes Wassordialysiert. Nach dem Einengen der dialysierten Lösung auf etwa 5ml wird das aminogruppenhaltige Polymere durchwere dissolved. The reaction mixture is stirred for 6 hours at 60 ⁰ C and dialyzed after cooling against distilled Wass. After concentration of the dialyzed solution to about 5ml, the amino group-containing polymers by

Recovered lyophilization. The test with trinitrobenzenesulfonic acid on primary amino groups is positive.

Ausbeute: 0,6gYield: 0.6g

Example 3

3g Schwefelsäureester des Polyethylenglykols (MG 6000) werden in 20ml frisch destilliertem Acetonitril gelöst. Zu dieser Lösung wird 1 g Natriumsalz des p-Nitrothiophenols addiert, das in 10ml absolutem Alkohol gelöst war. Das Reaktionsgemisch wird 4 Stunden am Rückfluß erhitzt, und danach wird bei dieser Reaktionstemperatur eine Lösung zum Reaktionsgemisch zugetropft, die aus 10ml destilliertem Wassor, 1 ml konzentriertem Ammoniak und 1 g Natriumdithionit hergestellt wurdo. Nach weiterem, zweistündigem Erhitzen am Rückfluß wird die Lösung mit 50 ml destilliertem Wasser verdünnt und dreimal mit jeweils 15ml Chloroform extrahiert. Die Chloroformlösung wird mit Natriumsulfat getrocknet, eingeengt auf etwa 5ml und mit 50ml Petrolether versetzt. Beim Aufbewahren der Lösung bei 4⁰C fällt das aminogruppenhaltigo Polymere aus. Es wird abfiltriert und bei Zimmertemperatur getrocknet. Der Test mit Trinitrobenzensulfonsäure auf primäre Aminogruppen ist positiv. Ausbeute: 2,8bg3 g of sulfuric acid ester of polyethylene glycol (MW 6000) are dissolved in 20 ml of freshly distilled acetonitrile. To this solution is added 1 g of sodium salt of p-nitrothiophenol dissolved in 10 ml of absolute alcohol. The reaction mixture is heated at reflux for 4 hours, and then at this reaction temperature, a solution is added dropwise to the reaction mixture made from 10 ml of distilled water, 1 ml of concentrated ammonia and 1 g of sodium dithionite. After further refluxing for two hours, the solution is diluted with 50 ml of distilled water and extracted three times with 15 ml of chloroform each time. The chloroform solution is dried with sodium sulfate, concentrated to about 5 ml and treated with 50 ml of petroleum ether. When the solution is stored at 4 ^° C., the amino group-containing polymer precipitates. It is filtered off and dried at room temperature. The test with trinitrobenzenesulfonic acid on primary amino groups is positive. Yield: 2.8bg

Example 4

3g Tosylester des Polyethylenglykols (MG 6000) werden in SOmI Tcluen gelöst und 1 g Natriumsalz des p-Aminothiophenols in 20ml absolutem Äthanol. Beide Lösungen werden vereinigt, und bei 80*C wird das Reaktionsgomisch 5 Stunden gerührt. Nach dem Abkühlender Lösung werden 50ml destilliertes Wasser zum Toluen addiert. Das Lösungsmittelgemisch wird noch mit 10ml 1 normale Natronlauge versetzt und gut durchgeschüttelt. Dieser Vorgang wird noch zweimal wiederholt, aber nur mit destilliertem Wasser. Die organische Phase wird gesammelt, mit Natriumsulfat getrocknet und auf etwa 5 ml eingeengt. Nach Zugabe von 50ml Petrolether fällt das aminogruppenhaltige Polymere aus. Es wird abfiltriert und bei Zimmertemperatur getrocknet. Der Test mit Trinitrobenzensulfonsäure auf primäre Aminogruppen isi positiv3 g Tosylester of polyethylene glycol (MW 6000) are dissolved in SOmI Tcluen and 1 g of sodium salt of p-aminothiophenol in 20 ml of absolute ethanol. Both solutions are combined and the reaction mixture is stirred at 80 ° C. for 5 hours. After cooling the solution, add 50 ml of distilled water to the toluene. The solvent mixture is mixed with 10 ml of 1 normal sodium hydroxide solution and shaken well. This process is repeated twice more, but only with distilled water. The organic phase is collected, dried with sodium sulfate and concentrated to about 5 ml. After addition of 50 ml of petroleum ether, the amino-containing polymer precipitates. It is filtered off and dried at room temperature. The test with trinitrobenzenesulfonic acid on primary amino groups is positive

Ausbeute: 2,2g Yield: 2.2g

Claims

1. A process for the introduction of primary amino groups in water-soluble polymers, characterized in that Halogenderivato, sulfuric acid esters, nitric esters or sulfonic acid esters of water-soluble polymers with bifunctional, organic compounds having at least one Merkaptogruppe and an aliphatic or aromatic, primary amino group or a mercapto group and one or more aromatic nitro group (s) in aqueous solutions, organic solvents or mixtures of both in the presence of alkali metal hydroxides, alkali metal carbonates or alkali metal and optionally in the presence of reducing agents, at 20 ⁰ C to 150 ⁰ C within 1 hour to 10 hours and reacted with primary Amino-modified, water-soluble polymers, optionally after alkalization and filtration of acidic reaction solutions, by dialysis, ultrafiltration and Lyophilisierüng or precipitation with organic solvents or extraction with organic solvents and precipitation of these with other organic solvents can be isolated from the reaction solutions.

2. The method according to claim 1, characterized in that are used as the sulfonic acid alkyl or substituted alkyl, aryl or hetaryl, substituted aryl or hetaryl, fused and / or substituted aryl or Hetarylsulfonsäureester.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that are used as bifunctional, organic compounds cysteamine, cysteine, Aminothiopheno'a or nitrosophenols.

4. The method according to claim 1 to 3, characterized in that for the reactions as organic solvents alcohols, ketones, cyclic ethers such as tetrahydrofuran or dioxane or aprotic solvents such as acetonitrile, dimethylformamide or dimethyl sulfoxide or water-insoluble or miscible, organic solvents such as chloroform , Methylene chloride, benzene or toluene.

5. The method according to claim 1 to 4, characterized in that are used as the reducing agent sodium dithionite under alkaline conditions or tin (II) chloride in hydrochloric acid.