DD278478A3 - PROCESS FOR BIOCATALYTIC MANUFACTURE BAD WATER-SOLUBLE SUBSTANCES WITH INTEGRATED EXTRACTIVE PROCESSING - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein biokatalytischos Verfahren mit integrierter extrakt, ver Produktaufbereitung. Das Verfahren ist geeignet für den Umsatz hydrophober und/oder hydrophiler Substrate und die Herstellung von hydrophoben Produkten, die in organischen Lösungsmitteln löslich sind.The invention relates to a biocatalytically process with integrated extract, ver product preparation. The process is suitable for the conversion of hydrophobic and / or hydrophilic substrates and the preparation of hydrophobic products which are soluble in organic solvents.
Biokatalytische Verfahren, die mit einer Produktextraktion gekoppelt sind, besitzen den prinzipiellen Vorteil, daß eine Produktinhibierung umgangen werden kann. Darüber hinaus kann eine hohe Raum-Zeitausbeute durch kontinuierliche und halbkontinuierliche Prozeßführung erreicht werden. Für wäßrige Zweiphasensysteme sind derartige Verfahren gut bekannt./1,2/.Biocatalytic methods coupled with product extraction have the principal advantage that product inhibition can be circumvented. In addition, a high space-time yield can be achieved by continuous and semi-continuous process control. For aqueous two-phase systems, such processes are well known.
Diese Verfahren sind jedoch nur dann praktikabel, wenn die eingesetzten Substrate und Produkte ausreichend wasserlöslichHowever, these methods are only practicable if the substrates and products used sufficiently soluble in water
Zur Extraktion hydrophober Produkte sind zweiphasige flüssige Systeme, bestehend aus organischem Lösungsmittel und einer den Biokatalysator entha'tenden wäßrigen Phase vorgeschlagen worden/3/. Diese Verfahrensweise ist problematisch, da es an der Grenzschicht zwischen organischem Lösungsmittel und Wasser zur Enzymdenaturierung und zur Schädigung der eingesetzten Mikroorganismen und Zellen kommt. Weisen darüber hinaus auch die eingesetztem Substrate nur eine geringe Wasserlöslichkeit auf, lassen sich mit dem Verfahren nur sehr geringe Umsatzraten erzielen.For the extraction of hydrophobic products two-phase liquid systems consisting of organic solvent and an aqueous phase containing the biocatalyst have been proposed / 3 /. This procedure is problematic because it comes at the boundary layer between organic solvent and water for enzyme denaturation and damage to the microorganisms and cells used. Moreover, even if the substrates used have only a low water solubility, only very low conversion rates can be achieved with the process.
Für den Umsatz hydrophober Substrate besitzen reversmizellare Phasen sehr günstige Eigenschaften/4,5/.For the conversion of hydrophobic substrates have reversmizellare phases very favorable properties / 4,5 /.
Ein flüssiges Zweiphasensystem, das eine Extraktion ermöglicht, ist hier jedoch nur in der Form bekannt, daß eine revermizellare Phase mit reinem Wasser koexistiert. Damit ist prinzipiell die Möglichkeit eines Umsatzes hydrophober Substrate und der Extraktion hydrophiler Produkte gegeben.However, a liquid two-phase system which allows extraction is known only in the form that a re-vermicellar phase coexists with pure water. Thus, in principle, the possibility of a turnover of hydrophobic substrates and the extraction of hydrophilic products is given.
Das Ziel der Erfindung besteht in der Kopplung einer Biokatalyse, bei der hydrophile oder hydrophobe Substrate umgesetzt werden, mit einer Extraktion, bei der hydrophobe Produkte durch ein organisches Lösungsmittel kontinuierlich extrahiert werden können, wobei durch die Extraktion keine übermäßige Desaktivierung des Biokatalysators verursacht wird.The object of the invention is the coupling of biocatalysis, in which hydrophilic or hydrophobic substrates are reacted, with an extraction in which hydrophobic products can be continuously extracted by an organic solvent, whereby the extraction does not cause excessive deactivation of the biocatalyst.
Die Aufgabe besteht in der Nutzung der biokatalytischen Eigenschaften von isolierton Enzymen sowie von Enzymsystemen pro und eukariotischer Zellen in einem flüssigen System, welches für die kontinuierliche Produktextraktion eine organische Lösungsmittelphase enthält.The object is to utilize the biocatalytic properties of isolated enzymes as well as of enzyme systems pro and eukaryotic cells in a liquid system containing an organic solvent phase for continuous product extraction.
Erfindungsgemäß werden in Tensidphasen solubilisierte Biokatalysatoren in einem Zweiphasengebiet eines Dreikomponentengemisches, bestehend aus Wasser, organischem Lösungsmittel und Tensid, eingesetzt. In diesem Zweiphasengebiet koexistiert die biokatalysatorhaltige Tensidphase mit reinem organischen Lösungsmittel. Die Substratzuführuny kann entweder über die organische Lösung?.nittelphase erfolgen, oder das Substrat wird in fester Form zugeführ und direkt in der Tensidphase gelöf t. Dabei wird das gute und sehr komplexe Lösungsvermögen der Tensidphase sowohl für hydrophile als auch für hydrophobe Substanzen genutzt. Die entstehenden hydrophoben Produkte werden von der koexistierenden organischen Lösungsmittelphase extrahiert und können in einem Folgeschritt aufgearbeitet werden. Als organische Lösungsmittel können unpolare Lösungsmittel wie z. B. Hexan, Heptan, Octan, Cyclohexan, Benzen oder polare Lösungsmittel wie z. B. Dioxan, Aceton, Azetessigester oder Lösungsmittelgemische eingesetzt werden. Als Tenside können anionische Amphiphile wie z. B. Alkalialkylsulfate, Alkalialkylsulfonate, Alkalialkylcarboxylate, Alkalialkylarylsulfonate, Alkalidialkylsulfosuccinate, Erdalkalidialkylsulfosuccinate oder ein kationisches Amphiphil wie Alkylammoniumsalze, Alkylpyridiniumsalze, Alkyltrimethylammoniumsalze oder ein zwitterionisches Amphiphil wie z. B. einAccording to the invention, solubilized biocatalysts are used in surfactant phases in a two-phase region of a three-component mixture consisting of water, organic solvent and surfactant. In this two-phase region, the biocatalyst-containing surfactant coexists with pure organic solvent. The substrate supply may be either through the organic solution, or the substrate is fed in solid form and dissolved directly in the surfactant phase. The good and very complex solvent power of the surfactant phase is used for both hydrophilic and hydrophobic substances. The resulting hydrophobic products are extracted from the coexisting organic solvent phase and can be worked up in a subsequent step. As organic solvents, non-polar solvents such. For example, hexane, heptane, octane, cyclohexane, benzene or polar solvents such. As dioxane, acetone, acetoacetic ester or solvent mixtures. As surfactants anionic amphiphiles such. Alkali metal alkyl sulfates, alkali metal alkyl sulfonates, alkali alkyl carboxylates, alkali alkylarylsulfonates, alkali alkylsulfosuccinates, alkaline earth alkylsulfosuccinates, or a cationic amphiphile such as alkylammonium salts, alkylpyridinium salts, alkyltrimethylammonium salts, or a zwitterionic amphiphile such as e.g. B. a
Phospholipid, Sulfobetain, Carbobetain oder ein nichtionisches Amphiphil wie ζ. B. Polyoxyalkylenether, Polyoxyethylenester, Polyoxyethylensorbitanester, Alkylphenolpolyethylenglykolester oder entsprechende Tensidgemische verwendet werden. Als Biokatalysatoren können neben isolierten Enzymen wie z.B. Alkoholdehydrogenase, Chymotrypsin, Lipase, auch pro- und eukariotische Zellen beispielsweise von E. coli oder Saccaromyces cereviae auch Enzyme und Zellen gleichzeitig eingesetzt werden.Phospholipid, sulfobetaine, carbobetaine or a nonionic amphiphile such as ζ. As polyoxyalkylene ethers, polyoxyethylene esters, Polyoxyethylensorbitanester, Alkylphenolpolyethylenglykolester or corresponding surfactant mixtures are used. As biocatalysts, besides isolated enzymes such as e.g. Alcohol dehydrogenase, chymotrypsin, lipase, also pro- and eukaryotic cells, for example, from E. coli or Saccaromyces cereviae also enzymes and cells are used simultaneously.
Die Tonsidphase, die in der ko'loidchemischen Literatur/6/ auch als Mittelphase bezeichnet wird, ist flüssig und niedrigviskos. In einigen Fällen bilden Tensidphase und reversmizellare bzw. mizellare Phase makroskopisch ein einheitliches Zustandsgebiet aus/G, 7/. Auch in dieser Phase kann der Biokatalysator solubilisiert werden. Biokatalysatoren, d. h. isolierte Enzyme oder ganze Zellen, zeigen in diesen Phasen eine bemerkenswert hohe biokatalytische Aktivität, die auch nach längerer Lagerzeit erhalten bleibt. Eine Zelivermehrung findet unter diesen Umständen in der Regel nicht oder nur in sehr eingeschränktem Maße statt. Bei Verwendung des zweiphasigen Reaktionssytems, bestehend aus biokatalysatorhaltigen Tensidphase und organischer Lösungsmittelphase, werden die praktischen Möglichkeiten für die biokatalytische Synthese von schlecht wasserlöslichen Substanzen wie Steroiden, Lipiden, langkettigen aliphatischen und aromatischen Alkoholen, Aldehyden, Carbonsäuren und Estern wesentlich erweitert. Darüber hinaus ergibt sich auch die Möglichkeit einer Phasentransferkatalyse bei der Peptidsyn'hese.The Tonsidphase, which is referred to in the ko'loidchemischen literature / 6 / as the middle phase, is liquid and of low viscosity. In some cases, surfactant phase and reversmicellar or micellar phase macroscopically form a uniform state domain / G, 7 /. Also in this phase, the biocatalyst can be solubilized. Biocatalysts, d. H. isolated enzymes or whole cells show in these phases a remarkably high biocatalytic activity, which is retained even after prolonged storage. A Zelivermehrung takes place under these circumstances usually not or only to a very limited extent. When using the biphasic Reaktionssytems, consisting of biocatalyst-containing surfactant phase and organic solvent phase, the practical possibilities for the biocatalytic synthesis of poorly water-soluble substances such as steroids, lipids, long-chain aliphatic and aromatic alcohols, aldehydes, carboxylic acids and esters are significantly expanded. In addition, there is also the possibility of phase-transfer catalysis in peptide synthesis.
Die Biokatalyse ist in jedem Falle vom Verteilungsgleichgewicht der Substrate und Produkte zwischen den koexistierenden Phasen bzw. vom Lösungsverhalten der Substrate in der Tensidphase beeinflußt.In each case, the biocatalysis is influenced by the distribution equilibrium of the substrates and products between the coexisting phases or by the solution behavior of the substrates in the surfactant phase.
Technische Synthesen auf Basis des vorgeschlagenen Verfahrens können in einfachen Reaktions- und Extraktionsapparaten wie z. B. Rührkesseln, Extraktionskolonnen, Mixer-Settler-Einheiten ausgeführt werden. Dabei ist auch die kontinuierliche Prozeßführung möglich.Technical syntheses based on the proposed method can be used in simple reaction and extraction apparatuses such. As stirred tanks, extraction columns, mixer-settler units are performed. In this case, the continuous process control is possible.
Ausführungsbeispieleembodiments
Ein zweiphasiges flüssiges System kann auf folgende Weise hergestellt werden:A two-phase liquid system can be prepared in the following way:
Eine 8gew.-%ige Lösung von Polyoxyethylcn (9,7) nonylphenylether in Cyclohexan wird hergestellt. 114ml dieser Lösung werden mit 20 ml Wasser versetzt. Nach dem Schütteln und Zentrifugieren bilden sich zwei klare flüssige Phasen - die obere besteht aus nahezu reinem Hexan, die untere ist die Tensidphase.An 8% by weight solution of polyoxyethylcn (9,7) nonylphenyl ether in cyclohexane is prepared. 114 ml of this solution are mixed with 20 ml of water. After shaking and centrifuging, two clear liquid phases are formed - the upper one consists of nearly pure hexane, the lower one is the surfactant phase.
Es wird eine 10gew.-%ige Lösung von Polyoxyethylen (9) heptylphenylether in Hexan hergestellt. Zu 11 dieser Lösung werden 10 ml einer 21 mM wäßrigen NAD+-Lösung gegeben. Dann werden weitere 5ml einer wäßrigen Lösung von Hefe-Alkoholdehydrogenase eingespritzt. Die Enzymkonzentration beträgt dabei lOg/l.A 10% by weight solution of polyoxyethylene (9) heptylphenyl ether in hexane is prepared. To 11% of this solution is added 10 ml of a 21 mM aqueous NAD + solution. Then another 5 ml of an aqueous solution of yeast alcohol dehydrogenase are injected. The enzyme concentration is thereby lOg / l.
Nach kurzem Schütteln entsteht daraus ein zweiphasiges flüssiges System, wobei der Abset;:vorgang durch Zentrifugation beschleunigt werden kann.After a brief shaking, this results in a two-phase liquid system, whereby the settling process can be accelerated by centrifugation.
Werden in die Hexanphase etwa 10ml Decanol eingespritzt, so ist nach etwa 2min die Bildung von NADH gemäß der ReaktionsgleichungIf about 10 ml of decanol is injected into the hexane phase, the formation of NADH after about 2 minutes is according to the reaction equation
Decanol + NAD+ <=* Decanal + NADH + H + Decanol + NAD + <= * Decanal + NADH + H +
spektralphotometrisch bei einer Wellenlänge von 339nm in der Tensidphase nachweisbar. Nach etwa 1 h ist auch das gebildete Decanal in der Hexanphase gut gaschromatographisch naclr>voisbar.spectrophotometrically detectable at a wavelength of 339 nm in the surfactant phase. After about 1 h, the decanal formed in the hexane phase is also readily available by gas chromatography.
Es wird in gleicher Weise verfahren, wie in Beispiel 2. An Stelle der 5ml wäßriger Enzymlösung wird dem System eine Suspension von Saccharomyces cerevisiae der Konzentration 10g/l (bezogen auf Trockenmasse) zugesetzt. Bei Zugabe von 15ml Propanol in die Hexanphase ist, entsprechend Beispiel 1, die Bildung von NADH in der Tensidphase und von Propanol in der Hexanphase nachweisbar.The procedure is the same as in Example 2. Instead of the 5 ml aqueous enzyme solution, a suspension of Saccharomyces cerevisiae concentration 10 g / l (based on dry matter) is added to the system. When 15 ml of propanol are added to the hexane phase, the formation of NADH in the surfactant phase and of propanol in the hexane phase can be detected, as in Example 1.
Es wird eine 10gew.-%igp'.ösung von Tetraethylenglykoldode«-ylether in einem organischen Lösungsmittelgemisch, bestehend aus 90VoI. % Hexan und 10Vol.-% Aceton, hergestellt. Zu 143r. I dieser Stammlösung werden 6ml einer 21 mM wäßrigen NAD+-Lösung gegeben. Anschließend werden 3ml einer wäßrigen Lösung von Hefe-Alkoholdehydrogenase der Konzentration 10g/lzugospritzt.It is a 10gew .-% igp'.ösung of Tetraethylenglykoldode "-yl ether in an organic solvent mixture consisting of 90VoI. % Hexane and 10% by volume acetone, prepared. To 143r. I of this stock solution is added 6 ml of a 21 mM aqueous NAD + solution. Subsequently, 3 ml of an aqueous solution of yeast alcohol dehydrogenase of concentration 10 g / l are sprayed.
Nach kurzem Schütteln und anschließender Zentrifugation entsteht ein zweiphasiges flüssiges System. Werden in die Hexanphase 200μΙ Benzylalkohol eingespritzt, so ist nnch etwa 3min die Bildung von NADH gemäß der ReaktionsgleichungAfter shaking briefly and then centrifuging, a two-phase liquid system is formed. If 200μΙ benzyl alcohol is injected into the hexane phase, the formation of NADH according to the reaction equation is about 3 min
Benzylalkohol + NAD* ** Benz?!dehyd -; iMADH + H*Benzyl alcohol + NAD * ** benzo! Dehyd -; iMADH + H *
spektralphotometrisch bei einer Wellenlänge von 365nm in der unteren Phasen, der Tensidphase, nachweisbar. Die Zunahme der Benzaldehydkonzentration in der Hexanphase kann ebenfalls spektralphotometrisch bei einer Wellenlänge von 325nm verfolgt werden.spectrophotometrically at a wavelength of 365 nm in the lower phase, the surfactant phase, detectable. The increase in benzaldehyde concentration in the hexane phase can also be monitored spectrophotometrically at a wavelength of 325 nm.
Es wird eine 10gew.-%ige Lösung von Heptaoxyethylentetradecylether in Benzin (Kp = 42 bis 8O0C) hergestellt. In 11 dieser Lösung werden zuerst 10ml einer 21 mM wäßrigen NAD*-Lösung und danach 10ml einer wäßrigen Hefe-Alkoholdehydrogenase-Lösung der Konzentration 10g/l gegeben. Nach kurzem Schütteln und Stehenlassen entsteht ein zweiphasiges flüssiges System. Werden in die Benzinphase 10ml n-Dodecanol gegeben, ist nach etwa 5min die Bildung von NADH gemäß der ReaktionsgleichungIt is prepared a 10 wt .-% solution of Heptaoxyethylentetradecylether in gasoline (K p = 42 to 8O 0 C). In 11 of this solution, 10 ml of a 21 mM aqueous NAD * solution and then 10 ml of a 10 g / l aqueous yeast alcohol dehydrogenase solution are added first. After shaking briefly and allowing to stand, a two-phase liquid system results. If 10 ml of n-dodecanol are added to the gasoline phase, the formation of NADH is complete after about 5 minutes according to the reaction equation
n-Dodecanol + NAD* «=± n-Dodecanal + NADH + H*n-dodecanol + NAD * "= ± n-dodecanol + NADH + H *
in der Tensidphase spektralphotometrisch bei einer Wellenlänge von 339nm nachweisbar. Nach etwa 10min läßt sich ebenfalls das entstehende n-Dodecanal in der Hexanphase gaschromatographisch gut nachweisen.detectable in the surfactant phase spectrophotometrically at a wavelength of 339 nm. After about 10 minutes, the resulting n-dodecanal in the hexane phase can likewise be detected by gas chromatography.
Es wird eine 10gcw.-%ige Lösung von Polyoxyethylen (7) nonylphenylether in Hexan hergestellt. Zu 11 dieser Lösung werden zunächst 9 ml einer 21 mM wäßrigen NAD*-Lösung und anschließend 4 ml einer wäßrigen Hefe-Alkoholdehydrogenaselösung mit einer Enzymkonzentration voi· 'Og/I gegeben. Nach kurzem Schütteln und Zentrifugation entsteht ein zweiphasiges flüssiges System. Gibt man 10ml Zimtalkohol zu diesem System, so läßt sich die Bildung von NADH in der Tensidphase innerhalb von etwa 10min gut nachweisen. Der gebildete Zimtaldehyd kann ebenfalls nach etwa 10 min in der Hexa/iphase spektralphotometrisch bei einer Wellenlänge von 325nm nachgewiesen werden.A 10 gcw .-% solution of polyoxyethylene (7) nonylphenyl ether in hexane is prepared. To 11 of this solution are first added 9 ml of a 21 mM aqueous NAD * solution and then 4 ml of an aqueous yeast alcohol dehydrogenase solution having an enzyme concentration of 10 mg / l. After shaking briefly and centrifuging, a two-phase liquid system is formed. If 10 ml of cinnamyl alcohol are added to this system, the formation of NADH in the surfactant phase can be detected well within about 10 minutes. The cinnamaldehyde formed can also be detected in the hexa / iphase after about 10 min spectrophotometrically at a wavelength of 325 nm.
Es wird eine 10gew.-%ige Lösung von Tetraethylenglykoldodecylether in Hexan hergestellt. In einer Lösung von 20VoI.-% Methylglykol in Wasser werden 10g/l NAD* und 10g/l Hefe-Alkoholdehydrogenase gelöst.A 10% by weight solution of tetraethylene glycol dodecyl ether in hexane is prepared. In a solution of 20VoI .-% methyl glycol in water 10g / l NAD * and 10g / l yeast alcohol dehydrogenase are dissolved.
Zu 1,361 Tensidlösung werden 100ml der NAD*- und 50ml der Hefe-Alkoholdehydrogenaselösung gegeben. Nach leichtem Schütteln entsteht ein zweiphasiges flüssiges System, das sich nach kurzem Stehen gut absetzt. Gibt man in die Hexanphase etwa 10ml Butanol, läßt sich das entstehende NADH in dr Tensidphase nach etwa 5min gut nachweisen. Das entstehende Butanol läßt sich in der Hexanphase nach etwa 10min gaschromatographisch nachweisen.To 1.361 surfactant solution are added 100 ml of the NAD * and 50 ml of the yeast alcohol dehydrogenase solution. After gentle shaking, a two-phase liquid system is formed, which settles well after standing for a short time. If about 10 ml of butanol are added to the hexane phase, the resulting NADH can be readily detected in the surfactant phase after about 5 minutes. The resulting butanol can be detected by gas chromatography in the hexane phase after about 10 minutes.
Es wird eine Lösung von 10Vol.-% Aceton in Hexan hergestellt. Damit wird eine 10gew.-%ige Lösung von Tetraethylenglykoldodecylether hergestellt. Zu 11 dieser Lösung werden zuerst 20ml einer 21 mM wäßrigen NAD'-Lösung und dann 20ml einer wäßrigen Hefe-Alkoholdehydrogenaselösung mit einer Enzymkonzentration von 10g/l gegeben. Nach leichtem Schütteln entsteht ein zweiphasiges flüssiges System.A solution of 10% by volume of acetone in hexane is prepared. This produces a 10% strength by weight solution of tetraethylene glycol dodecyl ether. To 11% of this solution are added first 20 ml of a 21 mM aqueous NAD 'solution and then 20 ml of an aqueous yeast alcohol dehydrogenase solution having an enzyme concentration of 10 g / l. After gentle shaking, a two-phase liquid system is formed.
Werden in die Hexan-Aceton-Phase 10ml Butanolgegeben, ist nach etwa 5min die Bildung von NADH in der Tensidphase nachweisbar. Das entstehende Butanal läßt sich nach etwa 10min in der Hexan-Aceton-Phase gaschromatographisch nachweisen.If 10 ml of butanol are added to the hexane-acetone phase, the formation of NADH in the surfactant phase can be detected after about 5 min. The resulting butanal can be detected by gas chromatography after about 10 min in the hexane-acetone phase.
In gleicher Weise reagieren Ethanol, Hexanol, Heptanol und Decanol.Ethanol, hexanol, heptanol and decanol react in the same way.
Gibt man nach dieser Reaktion 10ml Zimtaldehyd zu, wird in der Tensidphase das entstehende NADH wieder zu NAD* zurückgebildet. Die Abnahme des Zimtaldehyds läßt sich in beiden Phasen spektralphotometrisch bei einer Wellenlänge von 325nm nachweisen.If 10 ml of cinnamaldehyde are added after this reaction, the NADH formed in the surfactant phase is re-formed back to NAD *. The decrease of cinnamic aldehyde can be detected in both phases spectrophotometrically at a wavelength of 325nm.
Das Schema veranschaulicht das Gesamtsystem.The schema illustrates the overall system.
Outanol- r NAD+* * ZimtalkoholOutanol- r NAD + * * cinnamic alcohol
3 u tonal N1ADH v Zimt al floh yd3 u tonal N 1 ADH v cinnamon al floh yd
Der entstehende Zimtalkohol kann in einfacher Weise z. B. mit Wasser, aus der abgetrennten Hexanphase extrahiert werden.The resulting cinnamyl alcohol can be easily z. B. with water, are extracted from the separated hexane phase.
Es wird eine Tensidlösung entsprechend Beispiel 6 hergestellt. Zu 11 dieser Lösung werden 20ml einer Natriumphosphatpufferlösung (5mM; pH 7,5), die 1,0Gew.-% Meerrettich-Peroxidase und 3 · 10"3mol/l Wasserstoffperoxid enthält, gegeben. Nach Schütteln entsteht ein zweiphasiges flüssiges System. Werden dem System 10g p-Phenylendiamin zugegeben, so läßt sich das nach der ReaktionsgleichungA surfactant solution according to Example 6 is prepared. To this solution is added 20 ml of a sodium phosphate buffer solution (5 mM, pH 7.5) containing 1.0% by weight of horseradish peroxidase and 3 × 10 -3 mol / l of hydrogen peroxide, after shaking to form a biphasic liquid system added to the system 10g p-phenylenediamine, this can be according to the reaction equation
p-Phenylendiamin + H2O2->p-Phenylendiimin + 2H2Op-phenylenediamine + H 2 O 2 -> p-phenylenediimine + 2H 2 O
entstehende Diimin spektralphotometrisch bei einer Wellenlänge von 485 nm nach etwa 5 min in der Tensidphase und nach etwa 10min auch in der Hexanphase nachweisen.Detecting diimine spectrophotometrically at a wavelength of 485 nm after about 5 min in the surfactant phase and after about 10min also detect in the hexane phase.
In 2ml einer 10gew.-%igen Lösung von Tetraethylenglykoldodecylether werden ΙΒΟμΙ Methylglykol eingespritzt. Anschließend werden ΙΟΟμΙ einer wäßrigen Lösung von Dipeptidyl Peptidase IV (E.C. 3.4.14.5.) in Natriumphosphatpufferlösung (5mM; pH 7,5) zugegeben. Die Enzymkonzentration beträgt dabei 0,4g/l. Nach Schütteln und Stehenlassen (3min) entsteht ein zweiphasiges flüssiges System. Werden zu diesem System etwa 3mg Glycyl-Prolin-4-Nitroanilid in fester Form als Substrat zugegeben, so ist nach 2min die Bildung von gelb gefärbtem p-Nitroanilin in der Tensidphase zu erkennen. Nach etwa 7min erscheint das Reaktionsprodukt auch in der überstehenden Hexanphase. Ein quantitativer Nachweis kann spektralphotometrisch bei einer Wellenlänge von 390 nm erfolgen.In 2 ml of a 10 wt .-% solution of tetraethylene glycol dodecyl ether are injected ΙΒΟμΙ methyl glycol. Subsequently, ΙΟΟμΙ of an aqueous solution of dipeptidyl peptidase IV (E.C. 3.4.14.5.) In sodium phosphate buffer solution (5 mM, pH 7.5) are added. The enzyme concentration is 0.4 g / l. After shaking and standing (3 min), a two-phase liquid system is formed. If about 3 mg of glycyl-proline-4-nitroanilide in solid form are added to this system as substrate, the formation of yellow-colored p-nitroaniline in the surfactant phase can be recognized after 2 min. After about 7 minutes, the reaction product also appears in the supernatant hexane phase. Quantitative detection can be carried out spectrophotometrically at a wavelength of 390 nm.
1 H.Hustedt, U.Menge, K.H.Kroner, N.Papamichael: Bio Engineering 1 (1987) 12-29.1 H.Hustedt, U.Menge, K.H.Kroner, N.Papamichael: Bio Engineering 1 (1987) 12-29.
2 H.Hustedl,K.H.Kroner,H.Schütte,U.Menge,N.Papamichael: Bio Engineering 1 (1986) 12-27.2 H.Hustedl, K.H.Kroner, H. Schütte, U.Menge, N.Papamichael: Bio Engineering 1 (1986) 12-27.
3 USA Patent Nr.3926726.3 USA Patent No. 3926726.
4 P.l.Luisi:4 P.l.Luisi:
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5 K. Martinek, A. V. Levashov, N.K1,, chko, Y. L. Khmelnitzki, I. V.Bere/in: Eur. J. Biochem. 155 (1986) 453-468.5 K. Martinek, AV Levashov, NK 1 ,, chko, YL Khmelnitzki, IV. In: Eur. J. Biochem. 155 (1986) 453-468.
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| DD88317055A DD278478A3 (en) | 1988-06-23 | 1988-06-23 | PROCESS FOR BIOCATALYTIC MANUFACTURE BAD WATER-SOLUBLE SUBSTANCES WITH INTEGRATED EXTRACTIVE PROCESSING |
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ID=5600263
Family Applications (1)
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