CZ355496A3 - Farmaceuticky přijatelná kompozice pro potlačení růstu nádorových buněk, použití proteinu, majícího doménu, zahrnující syndekanovou doménu pro přípravu farmaceutické kompozice - Google Patents

Description

Vynález se týká oblasti nádorové biologie a terapie. Přesněji, vynález je metodou pro zpomalení nebo normalizaci růstu buněk, zejména maligních buněk, poskytnutím dostatečného množství ektodomenové části syndekanu-1 takovým buňkám. Metoda vynálezu facilituje a vede k normalizaci stupně růstu a diferenciačního stavu nádorových buněk.

Dosavadní stav techniky

Buněčná diferenciace je založena na selektivním využití genetické informace programované extracelulárními stimuly, které například mohou zahrnovat buněčné interakce a vazbu extracelulárních efektorových molekul receptory buněčného povrchu. Stává se zřejmějším, že proteoglykany buněčného povrchu hrají důležitou roli v regulaci chování buněk. Syndekany jsou proteoglykany buněčného povrchu, u kterých se ukázalo, že participují jak na rozpoznávání matrix, tak na vazbě růstových faktorů a tak participují na buněčné regulaci. Sekvence lidských, myších, krysích a křečcích syndekanů jsou známé. Syndekany byly nedávno publikovány (Jalkanen, et al., Receptors for extracellular matrix, j.MacDonald & R.Mecham, Editors, Academie Press, San Diego, str. 1-37 (1991) a Bernfield, O.,et al.. Annu.Rev. Cell Biol., 8:365-393 (1992)).

Syndekan-1 je nejlépe charakterizovaným proteog1ykanem buněčného povrchu (Saunders et al., J.Cell

Biol. 108:1547-1556 (1989), Mali et al., J.Biol. Chem. 265:6884-6889 (1990). Mezinárodní patentová zveřejněná přihláška WO 90/12033 uvádí aminokyselinovou sekvenci a korespondující cDNA sekvenci myší syndekan-1 molekuly. Diagnostická metoda pro detekci transformovaných buněk detekcí změn v expresi syndekanu v transformovaných buňkách je popsána v mezinárodní patentových zveřejněných přihláškách WO 92/13274 a WO 93/05167.

Enhancerový element syndekanového genu stejně jako metoda snížení růstu maligních buněk indukcí exprese syndekanu v maligních buňkách je popsána v Mezinárodní patentové přihlášce (PCT/FI93/00514).

Popis obrázků na připojených výkresech

Obrázek 1 je sekvence lidského syndekanu-1. Kroužky: možná místa pro GAG připojení. Silně podtržené: transmembránové domény. Tence podtržené: aataa polyadenylační signál.

Obrázek 2 je sekvence myšího syndekanu-1.

Obrázek 3 Schematická struktura dřeňového proteinu divokého typu, tail less a ekto transfekčních konstruktů. Konstrukt divokého typu obsahuje kompletní myší syndekan-1 ektodoménu (Mali.M. et al., J.Biol.Chem. 268:24215 (1993)). tail less konstrukt byl generován užitím oligonukleotidy řízené mutagenese vedoucí k delečnímu mutantu s jedním argininovým zbytkem v cytoplasmatické doméně jak je popsáno v příkladech (Miettinen, H.M. et al., J.Cell Sci., v tisku (1994)). Ekto konstrukt byl také generován užitím oligonukleotidy řízené mutagenese jak je popsáno v příkladech, a měl stop kodon v proteása senzitivním místě v těsném sousedství buněčného povrchu. Vertikální linie indikují domnělá místa pro GAG připojení a šipky dibázická proteasa senzitivní místa.

Obrázek 4 Organisace aktinových vláken a imunofluorescenční lokalizace syndekanu-1 na povrchu buněk.

Obrázek 5 Množství secernované ektodomény syndekanu-1 z kondicionovaného media klonů Ecto buněk (Ecto 15, 34, 2 a 23). Buňky byly kultivovány dva dny za přítomnosti 10 nM testosteronu a ektodoména syndekanu-1, která byla akumulována v mediu, byla použita. Kultivační medium bylo použito přímo. Vzorky byly normalizovány na počet buněk a ekvivalentní množství slot-blotted na Hybon-N+ membráně. Ektodomény syndekanu-1 byly detekovány chemilumuniscenční metodou užitím 281-2 jak je popsáno v příkladech (Miettinen,

H.M. et al., J.Cell Sci. v tisku (1994)). Kvantifikace byly provedeny pomocí COMPUTER IMAGE ANALYSIS SYSTEM (Imaging Research lne.). Průměry a SEM dvou paralelních vzorků jsou presentovány.

Obrázek 6 Organizace aktinových vláken klonů Ecto buněk. Ecto buňky byly kultivovány za přítomnosti 10 nM testosteronu a aktinová vlákna byla vizualisována rhodamin-konjugovaným faloidinem.

Obrázek 7 Tvorba kolonií klonů Ecto buněk na měkkém agaru. Buňky byly kultivovány 12 dní v 0,33% měkkém agaru, DMEM + 5% FCS s 10 nM testosteronu jak bylo popsáno dříve (Leppa, S. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:932 (1992)).

Obrázek 8 Efekt DEAE-izolováné ektodomény syndekanu-1 (příklad) z kondiciovaného media Ecto 2 buněk na růst NMuMG a testosteronem (10 nM) ošetřených S115 buněk (S115+). 1500 buněk bylo transferováno do 96 jamkových ploten a buňky byly kultivovány s DEAE-izolovanou ektodomenou syndekanu-1 dokud kontrolní (bez ektodomény syndecanu-1) buňky nedosáhly 75-85% konfluenci (NMuMG buňky čtyři dny, S115+ buňky tři dny). Pak byly buňky fixovány 2% paraformaldehydem, barveny 0,5% krystalovou violetí a promyty destilovanou vodou. Barvené buňky byly suspendovány v 10% kyselině octové a spektrofotometricky měřeny při 595 nm.

Obrázek 9 Efekt ošetření DEAE-izolováné ektodomény syndekanu-1 heparatinasou na inhibici růstu S115+ buňky. S115+ buňky byly kultivovány s 1 nM DEAE-i sol ováným syndekanem-1 z kultivačního media Ecto 2 buněk a z media NMuMG buněk, nebo se stejnými přípravky předem ošetřenými heparatinasou (Seikagaku Kogyo Co.) po 1 hodinu při 37 °C.

Obrázek 10 Efekt imunopurifikované ektodomény syndekanu-1 na růst S115+ a NMuMG buněk. DEAE-izolovaná syndekan-1 ektodoména byla dále purifikována s 281-2 imunoafinitni kolonou (příklady). S115+ a NMuMG buňky byly kultivovány s 1 nM imunoafinitně purifikovanou syndekan-1 ektodomenou.

Obrázek 11 DEAE-izolovaná syndekan-1 ektodoména, ale ne HS či CS GAG inhibuje růst SI15+ buněk.

Obrázek 12 Inhibice růstu různých buněčných linií (CarB, MCF-7, S115+, s 10 nM testosteronu, SI15— bez testosteronu, NIH 3T3, NMuMG a HaCaT) 1 nM DEAE izolované syndekan-1 ektodomény (příklady). Buněčný růst byl analyzován na všech panelech stejně jako na panelu (A) a byl srovnáván s buňkami neošetřenými (% kontrol, osa-y). Průměry a SEM ze dvou paralelních vzorků jsou prezentovány.

Obrázek 13 Suprese nádorového růstu na nudě myších syndekan-1 ektodoménou.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález je nejprve zaměřen na farmaceuticky akceptovatelnou komposici obsahující syndekan-1 ektodomenu.

Vynález je dále zaměřen na metodu pro snížení nebo normalizaci růstu nádorových buněk takového proteinu syndekanové ektodomeny nádorovým buňkám, v extracululárním prostředí.

Metody vynálezů jsou využitelné pro jak maligní, tak nemaligní nádorové buňky, a jsou zejmena užitečné u tumorů charakterizovaných ztrátou syndekanu-1, jako jsou gliomy, myelomy, karcinomy, sarkomy nebo adenomy.

Def inice

Pro poskytnutí jasnějšího a důslednějšího pochopení specifikací a nároků, včetně rozsahu danému takovými termíny jsou poskytnuty následující definice:

Buněčný růst: buněčným růstem je míněna buněčná replikace, nebo stupeň buněčného děleni, jak kontrolovaného, tak nekontrolovaného. Proto, buněčný růst je stupeň dělení a replikace.

Maligní: maligním je míněn nekontrolavaný buněčný růst Více diferencovaný fenotyp: Prohlášením, že buňky mají více diferenciovaný fenotyp je míněno, že buňky vlastní fenotyp obvykle vlastněný jistým typem buněk více diferenciovaný než tyto buňky. Fenotyp může být definován jednou nebo více fenotypickými charakteristikami. Například, forma epiteliálních buněk je diferenciovanější fenotyp než forma mesenchymální, proto, v tomto příkladu, více diferenciovaný fenotyp je morfologie epiteliálních buněk, spíše než forma mesenchymální. Terminálně diferencované mesenchymální buňky je více diferenciovaný fenotyp než kondenzované mesenchymální buňky. Stav aktin obsahujícího cytoskeletu může být také použit, dizorganizovaná aktinová vlákna jsou indikátorem méně diferencovaného fenotypu než organizovaná vlákna.

Dostatečné množství: Dostatečné množství agens je množství takového agens, které je dostatečné k dosažení žádoucích výsledků, zejména při podání takového agens lidem nebo zvířatům. Dostatečné množství syndekan-1 ektodomeny v komposicích a metodách předkládaného vynálezu je množství dostatečné k redukci růstu nádorových buněk, preferovaně na úroveň normálního růstu pro specifický typ buněk.

Podání: Termínem podání je míněno zavedení syndekanové ektodomeny podle vynálezu do lidí nebo zvířat jakýmikoli vhodnými prostředky v medicíně známými, včetně, ale ne jenom, injekčního, orálního, enterálního, transdermálního, a parenterálního (t.j. intravenozního) podání.

Vystavení syndekanové ektodoméně: vystavením buněk syndekanové ektodoméně v kompozicích vynálezu je míněno, že externímu prostředí buněk je poskytnuto takové množství syndekanové ektodomeny, které je účiné pro dosažení žádoucího efektu, obyčejně sníženému růstu nádorových buněk.

Farmaceuticky přijatelné soli: Termín farmaceuticky akceptovatelné soli zahrnuje soli syndecanové ektodomény vynálezu. Takové soli mohou být vytvořeny z farmaceuticky akceptovatelných kyselin a zásad, jako například z kyselin jako je sírová, chlorovodíková, dusičná, fosforečná atd., nebo basí jako je hydroxidy kovů alkalických zemin nebo alkalických kovů, hydroxid amonný, alkylamonium hydroxidy, atd.

Farmaceuticky akceptovatelná kompozice: Termín farmaceuticky akceptovatelná kompozice je míněn tak, aby zahrnoval ropouštědla, nosiče , ředidla a podobně, které jsou využívány jako aditiva a vehikula k přípravě syndekan ektodomeny vynálezu tak, aby poskytovala nosič nebo adjuvans pro podání takové sloučeniny pacientům (lidem nebo zvířatům), kteří ji potřebují. Taková aditiva mohou dovolovat jisté funkce, jako je , například, poskytnutí správných iontových podmínek pro podání, stabilizace syndekanové ektodomeny proti inaktivaci nebo degradaci, a/nebo zvýšení poločasu syndekanové ektodomeny. Farmaceuticky akceptovatelná kompozice je medicínsky kompatibilní s hostitelem, kterému je podána.

Léčba: Termín léčba nebo léčení zahrnuje podání farmaceuticky přijatelné kompozice podle vynálezu, obsahující dostatečné množství syndekanové ektodomeny vynálezu pacientům za účelem, který může zahrnovat profylaxi, amelioraci, prevenci nebo léčbu zdravotních poruch, včetně suprese růstu nádorů.

V podstatě prostý přirozených kontaminantú: 0 materiálu je řečeno, že je v podstatě prostý přirozených kontaminantú, jestliže byl důkladně purifikován od materiálů, které jsou normálně a přirozeně nacházeny před takovou purifikací a tyto kontaminanty normálně a přirozeně nacházené v substanci in vivo nebo in vitro jsou významně nepřítomné ve finálně připraveném materiálu. Při podání syndekanové ektodomeny subjektu, který potřebuje léčbu, je tato důkladně prostá přirozených kontaminantů, které jsou asociovány se syndecanovou ektodomenou jak in vivo (t.j. v hostiteli, od kterého byla ektodomena isolována), tak in vitro (v důsledku chemické syntesy). Podstatnou absencí je míněno, že takové kontaminanty jsou bud kompletně nepřítomné, nebo jsou přítomné v tak nízkých koncentracích, že jejich přítomnost (1) neinterferuje s požadovaným terapeutickým efektem aktivního agens (zde schopností syndecknové ektodomeny inhibovat nádorový růst) v terapeuticky přijatelné kompozici, je-li taková kompozice podána pacientovi, který ji potřebuje a (2) a nepoškozuje pacienta v důsledku podání takové kompozice.

Detailní popis preferovaných provedení

Vynález je objevem, že ektodomeny syndekanů vlastní jisté biologické funkce a jsou schopné poskytnout takové funkce buňkám, když jsou presentovány zevnímu povrchu buňky odlišné od buňky, která syntetizuje takovou syndekanovou ektodomenu. Syndeckny jsou membránové vazebné proteiny. Překvapivě bylo zjištěno, že extracelulárně poskytnuté syndekanové ektodomeny, samy o sobě, jsou suficientní k navození více diferenciované morfologie nádorových buněk a k supresi růstu maligních buněk. Vynález je zde doložen příkladem syndekanu-1.

Všechny syndekany obsahují cytoplasmatickou doménu, transmembránovou doménu a extracelulární doménu.

Extracelulární doména je ektodoména. Jak bylo diskutováno

Jalkanenem,et al., v Receptors for extracellular matrix, J.MacDonald & R.Mecham, Edittors, Academie Press, San Diego, str. 1-37 (1991)), syndekany vykazují vysoce konzervované homologní sekvence ve třech separátních regionech jejich ektodomén. Dibasická sekvence je přímo sousedící s N-terminálním koncem hydrofobní transmembránové domény, což naznačuje, že je umístěna za vnější částí plasmatické membrány, a může sloužit jako proteasa-sensitivní místo, které dovoluje, že ektodomena může být štěpena intaktně od buněčného povrchu.

Dřeňový protein lidského syndekanu-1 obsahje 310 aminokyselinových zbytků. Je zde vysoký stupeň strukturální a funkční homologie mezi myším a lidským syndecanem-1. Lidský syndekan-1 mástejnou velikost, náboj, buyoant hustotu a GAG kompozici jako myší syndekan-1. Lidská syndekan-1 ektodoména, stejně jako myší, se váže na typ I kolageních fibril a fibronectin, ale ne na laminin nebo vitronectin.

Sekvence lidského syndecanu-1 je známa a byla klonována (Mali et al., J.Biol.Chem. 265:6884-6889 (1990)). Počítáno podle Obrázku 2 v Mali et al., J.Biol.Chem. 265:6884-6889 (1990), aminokyseliny 1 až 251 jsou ektodomenou lidského syndecanu-1 ( s připojeným sekrečním signálem), hydrofobní membránu překlenující doména obsahuje dalších 25 aminokyselinových zbytků (aminokyseliny 252-276), a cytoplasmatická doména obsahuje zbývajících 34 aminokyselinových zbytků (aminokyseliny 277-310).

Signální peptidovou sekvencí je prvních 17 aminokyselinových zbytků ektodomeny. Ačkoliv užitek k navození sekrece syndekanu-1 v syntetizujících buňkách je stejný, sekreční signál není nezbytný pro supresi nádorového růstu nebo diferenciační funkci ektodomeny vynálezu.

Proto, sekvence ektodomeny vynálezu zahrnují ty fragmenty syndekanových aminokyselinových zbytků 1-251, která obsahují místa pro GAG příslušenství a žádoucí funkce ektodomeny, tak jako, například , ektodomeny mající aminokyseliny 1-251 (se sekrečním signálem a štěpené v RK místě), 18-251 (minus sekreční signál a štěpené v RK místě), 1-231 (se sekrečním signálem, ale štěpené v RR místě) a 18-251 ( minus sekreční signál, ale štěpené v RR místě). Ektodomény, které mají karboxylový konec kdekoliv mezi aminokyselinovými zbytky 231-251, nebo sekreční signální fragment menší než aminokyseliny 1-17 jsou také využitelné, protože o tomto provedení se předpokládá, že si uchovává biologické vlastnosti ektodomény.

Ačkoliv lidské a myší ektodomeny jsou na úrovni aminokyselin identické pouze ze 70 %, všechna domnělá místa pro glykosaminoglykanové (GAG) příslušenství jsou identická mezi myšími a lidskými sekvencemi. Pět možných míst pro glykosaminoglykanové příslušenství lidské syndekanové ektodomeny jsou v polohách 37, 45, 47, 206 a 216. Dvě z těchto míst patří konsensu sekvence SGXG a tři další (E/D)GSG(E/D). Identická jsou u myšího a lidského syndekanu také jednotlivá místa pro N-glykosylaci a proteinasa - senzitivní dibasické RK místo připojené k extracelulárnímu povrchu transmembránové domény.Lidský syndekan také obsahuje druhou dibasickou RR sekvenci pouze 18 zbytků od RK sekvence. Proteolytické štěpení v tomto místě by mělo také uvolňovat ektodomenu vynálezu, která obsahuje všechna GAG místa intaktní.

Transmembránové domény lidského a myšího syndekanu-1 jsou z 96% identické (jedinou změnou v lidském syndekanu je alterace alaninu na glycin) a cytoplasmatické domény v lidském a myším syndekanu jsou identické ze 100%.

Syndekanové ektodomeny, jako je lidská syndekanová ektodomena, mohou být produkovány rekombinantními technikami v jakémkoliv požadovaném hostiteli. Nicméně, je preferováno, ale není to nezbytné, využívat hostitele, kteří jsou podobného buněčného typu jako je tumor, než buněk v nenádorovém stavu.

Je dosažitelné množství deponovaných buněčných linií, které jsou specifické pro lidské tkáně nebo charakteristické pro různé buněčné typy.

Například, myší syndekan-1 klony vynálezu byly konstruovány užitím liposomové transfekce a geneticinu k následné selekci stabilně transfektovaných buněčných klonů. Klony Sl15 buněčné linie (viz.Obrázek 3) exprivující jak divoký typ myšího syndekanu-1 (wild typ), tak deleční mutant s pouze jedním argininovým residuem v cytoplasmatické doméně ( tail-less), nebo prostou ektodomenu syndekanu-1 (ekto) . Divoký typ syndekanu-1 a cytoplasmatický deleční mutant (tail-less) byly klonovány do EcoRI místa pBGS eukaryotního expresního vektoru. Ektodoménový konstrukt byl klonován do pMAMneo vektoru tak, aby se získala dostatečná úroveň exprese také v přítomnosti hormonů, protože MMT LTR promotor je indukován stejným steroidním hormonem jako buňky. Není nezbytné užít tento vektor, jelikož mnoho podobných expresních vektorů je v oboru známo. Syndekan-1 exprese na buněčném povrchu byla detegována užitím monoklonální protilátky, konkrétně užitím dříve popsané mAb 281-2, která rozpoznává ektodomenu myšího syndekan-1 dřeňového proteinu, a aktinová filamenta byla vizualisována užitím rhodamin-konjugovaného faloidinu jako indikace diferenciačního stavu růstového stavu buňky.

Bez testosteronu vykazovaly S115 buňky organizovaná aktinová filamenta typická pro epiteliální buňky. Za přítomnosti testosteronu byl aktin disorganisovaný a globulární, a exprese syndekanu-1 na povrchu buněk byla také suprivována. Divoký typ a tail-less klony exprivující syndekan-1 na buněčném povrchu znovu vytvořily organizaci aktinových filament v důsledku léčby testosteronem. Protože tail-less mutanty také indukovaly stejné změny jako divoký typ syndekanu-1, byly S115 buňky transfektovány prostou ektodomenou a bylo získáno více než 50 nezávislých klonů secernujících rozdílné hladiny ektodomeny do kultivačního media. Buněčný povrch těchto buněk se barvil pouze slabě na syndekan-1, ale i tyto buňky vykazovaly dobře organizovaná aktinová filamenta a epiteloidní morfologii.

Tento výsledek indikuje, že ektodomena syndekanu-1 je suficientní k navození epiteloidní morfologie testosteronem ošetřených S115 buněk směrem k více diferencovanému fenotypu a je užitečným protinádorovým lékem.

V nenádorových buňkách je syndekan exprivován v epiteliálních buňkách, mesenchymálních buňkách, pre-B buňkách a plasmatických buňkách, ale ne v B buňkách.

Syndekan je také exprivován ve tkáních obsahujících buňky tohoto typu, včetně lidské mozkové tkáně. Proto jsou metody vynálezu zejmena užitečné proti nádorům z epiteliálních, mesenchymálních, pre-B a plasmatických buněk. Přesněji, metody vynálezu jsou užitečné ve zpomalení růstu tumorů odpovídajících na steroidy, zejména estrogen nebo androgen odpovídajících tumorů (tumorů, které rostou lépe za přítomnosti steroidů, estrogenů, nebo androgenů) včetně nádorů prsu, endometria, a nádorů prostaty.

Vynález se týká farmaceuticky přijatelné kompozice pro potlačení růstu nádorových buněk, obsahující protein, mající doménu, zahrnující syndekanovou ektodoménu.

Výhodně syndekan obsažený ve farmaceutické kompozici je syndekan-1, syndekan-2, syndekan-3 nebo syndekan-4.

V dalším výhodném provedení je uvedený syndekan je lidský a má sekvenci uvedenou na obrázku 1.

V dalším výhodném provedení farmaceuticky přijatelná kompozice obsahuje protein, kde uvedená ektodoména obsahuje aminokyseliny l až 251 z obrázku 1, aminokyseliny 1 až 231 z obrázku 1, aminokyseliny 18 až 251 z obrázku 1, aminokyseliny 18 až 231 z obrázku 1 neb doménu, mající karboxylový konec na jakémkoliv místě mezi aminokyselinami 231 a 251 obrázku 1 a sekreční signální fragment menší než aminokyseliny 1 až 17 z obrázku 1.

Dalším aspektem vynálezu je použití proteinu definovaného ve kterémkoliv z nároků 1 až 4 pro přípravu farmaceutické kompozice pro léčení k. redukci nebo potlačení růstu nádorových buněk.

Při výše uvedeném použití je nádorová buňka charakterizována ztrátou syndekanu-1.

V dalším aspektu vynálezu je farmaceutická kompozice podávána do extracelulárního prostředí nádorové buňky, kde uvedená buňka je vybrána ze skupiny, zahrnující epithelíální buňky, mesenchymální buňky, pre-B buňky a plasmové buňky, nebo kde uvedená buňka je vybrána ze skupiny, zahrnující buňky prsu, vaječníkové buňky a prostatové buňky, které jsou steroid-responzivní a uvedený steroid je estrogen nebo androgen a uvedenou buňkou je buňka lidská.

Množství kompozice syndekanové ektodomeny-1 vynálezu, které podáno pacientovi, a trvání takového podání může být určeno monitorováním nádorového růstu u pacienta během období podávání, a upravováno podle odpovědi pacienta.Syndekanová ektodomena vynálezu je preferovaně poskytnuta cílovým nádorovým buňkám v extracelulární koncentraci okolo 0.7 nM-1 nM (viz.Obrázek 11), ale jakékoliv koncentrace dostatečné ke snížení růstu tumoru mohou být užity. Ektodomena může být poskytnuta bud lokálně (v koncentrovaném podání přímo do cílového orgánu), nebo systémově (jako podání krevním řečištěm). Dávka syndecanu podaná pacientovi ( lidskému nebo zvířecímu) bude proto počítána do objemu (jako je krevní objem), do kterého je ektodoména podávána, a typu tumoru, který je cílem. Například pokud je nezbytná kontinuální exposice syndekanové ektodoméně, pak bude žádoucí častější dávkování, než je-li nezbytná pouze přechodná exposice tumoru syndekanové ektodoméně. Například, množství 1 nM syndekanové ektodomeny mající aminokyseliny 1-251 odpovídá 0.2 mg/1 (200 pg/l), jak v krvi, tak při lokální koncentraci v místě akce. Typická systémová dávka syndekanové ektodomeny užívaná v metodách vynálezu při léčbě lidí nebo zvířat zahrnuje množství, které poskytuje finální

Množství kompozice syndekanové ektodomeny-1 vynálezu, které podáno pacientovi, a trvání takového podání může být určeno monitorováním nádorového růstu u pacienta během období podávání, a upravováno podle odpovědi pacienta.Syndekanová ektodomena vynálezu je preferovaně poskytnuta cílovým nádorovým buňkám v extracelulární koncentraci okolo 0.7 nM-1 nM (v i. z. Obráz ek 11), ale jakékoliv

13b koncentrace dostatečné ke snížení růstu tumoru mohou být užity. Ektodomena může být poskytnuta bud lokálně (v koncentrovaném podání přímo do cílového orgánu), nebo systémově (jako podání krevním řečištěm). Dávka syndecanu podaná pacientovi ( lidskému nebo zvířecímu) bude proto počítána do objemu (jako je krevní objem), do kterého je ektodoména podávána, a typu tumoru, který je cílem. Například pokud je nezbytná kontinuální exposice syndekanové ektodomeně, pak bude žádoucí častější dávkování, než je-li nezbytná pouze přechodná exposice tumoru syndekanové ektodomeně. Například, množství l nM syndekanové ektodomeny mající aminokyseliny 1-251 odpovídá 0.2 mg/1 (200 pg/l), jak v krvi, tak při lokální koncentraci v místě akce. Typická systémová dávka syndekanové ektodomeny užívaná v metodách vynálezu při léčbě lidí nebo zvířat zahrnuje množství, které poskytuje finální krevní koncentraci nej výhodně ji 0.2 mg syndekanové ektodomény na litr krve. Objem krve u lidí je 6 % tělesné hmotnosti, z toho 70 kg osoba má asi 4.2 litru krve. Nicméně, jelikož efekty syndekanové ektodomeny jsou pravděpodobně lokálně (t.j. účinkující na specifické buněčné membráně), sekvestrovaně nebo kineticky determinované, teoreticky minimální podaná dávka musí být taková, aby dosáhla dobrých terapeutických efektu.

Syndekanové ektodomeny mohou být podány jakoukoliv cestou, která umožňuje vytvoření dostatečné hladiny léku v žádoucím aktivním místě, například injekcí.Pro parenterální podání mohou být preparáty obsahující syndecanové ektodomeny poskytnuty pacientům vyžadujícím takovou léčbu v kombinaci s farmaceuticky akceptovatelnou sterilní vodou nebo nevodnými rozpouštědly, suspenzemi nebo emulzemi.

Příklady nevodných rozpouštědel jsou propylenglykol, polyethylenglykol, rostlinný olej, rybí olej, a injektovatelné organické estery. Vodné nosiče zahrnují vodu, roztoky alkoholu ve vodě, emulze nebo suspenze, včetně fyziologického roztoku a pufrovaných medicinálních parenterálních vehikulí jako je roztok chloridu sodného, Ringerův dextrosový roztok, dextrosa plus roztok chloridu sodného, Ringerův roztok obsahující laktosu, nebo fixované oleje. Intravenózní vehikula zahrnují tekutiny a nutriční náhrady, elektrolytové náhrady, jako jsou ty, na základě Ringerovy dextrosy a podobně.

Syndekanové ektodomeny, obsahující medikament (farmaceuticky akceptovatelný roztok obsahující terapeuticky aktivní syndekan-1 ektodomenu) může být podán prostřednictvím katetrů nebo pump, ze jména je-li žádoucí podat ektodomenu v lokálně vysoké koncentraci. Syndecan-1 ektodomenu obsahující medikament může být podán subkutáně nebo přímo do měkkých tkání prostřednictvím implantace prostředků inertních k tělesným tekutinám. Takové prostředky a implantační systémy jsou v oboru známé. Keramický systém pro podání proteinů je popsán například v WO 92/00109.

Syndekan-1 ektodomenu obsahující medikament může být podán poskytnutím takové molekuly jako části chimérické molekuly (nebo komplexu), která je namířena k jednotlivým specifickým orgánům, například jako část protilátky, která rozpoznává determinanty na cílových tkáních nebo orgánech nebo buňkách, v nádorovém nebo nenádorovém stavu.

Farmaceuticky akceptovatelné roztoky, které obsahují syndekan-1 ektodomenu mohou být podány topicky. Ačkoliv syndekan-1 ektodomena může být podána pacientům v režimu zahrnujícím jiné protinádorové léky, optimální podání syndekan obsahujících kompozic podle vynálezu jsou zejmena užitečná v tomto smyslu.

Topické podání je výhodně spojeno s jedno nebo dvěma cestami. První, terapeuticky aktivní syndekanová ektodomena může být smísena s vhodným farmaceuticky aktivním nosičem a (volitelně), penetračními enhancery k nápomoci v průniku aktivního agens přes kůži, za vytvoření masti, emulse, lotia, roztoků, krémů, gelů a podobně, a přípravek samotný je pak aplikován na jistou oblast kůže. Alternativně, terapeuticky aktivní syndekanová ektodomena může být inkorporována do náplasti nebo trandermálního dodávacího systému v souladu se známými technologiemi pro přípravu takových náplastí a dodávacích systémů.

Podání ve formě se zvýšeným uvolňováním je vhodnější pro pacienty tehdy, jsou-li zapotřebí opakované injekce po prolongovanou dobu, nebo je-li žádoucí kontinuální expozice nádorových buněk syndekanové ektodoméně. Ve formě intravenózního dávkování má kompozice podle vynálezu dostatečně rychlý nástup účinku využitelný v akutní terapii nádorového růstu.

Podání může být lokalizováno přímo do buněk, jestliže jsou buňky asociovány s tkáněmi nebo tělesnými orgány, nebo může být podání systémové, do media, ve kterém se buňky nacházejí, jako je krev nebo mozkomíšní mok. Systémové podání do těla pacienta, jako je podání do krevního řečiště, usnadňuje léčbu pacienta, u kterého mohou být nádorové buňky ve více než jednom místě v těle.

Poskytnutí syndekanové ektodomeny jako produktu expresního konstruktu pro syndekanovou ektodomenu, který secernuje ektodomenu v dostatečném množství je také považováno za podání. Například, podání přes hematoencefalickou barieru může být dosaženo využitím známého virového vektorového systému k dopravení DNA syndekanové ektodomeny tak, aby exprivoval ektodomenu a secernoval jí do extracelulárního prostředí, tak jako například retrovirové systémy popsané v WO 93/03743, WO 90/09441, Breakefield, X.A. et al., The New Biologist 3:203-218 (1991) a Huang, Q., et al., Exp. Neurol. 115:303-316 (1992).

Farmaceuticky akceptovatelné kompozice podle vynálezu obsahující syndekan-1 ektodomenu mohou být zpracovány způsobem, který je nám známý, například prostřednictvím konvenčního míšení, rozpouštění, lyofi 1 izování nebo podobnými procesy. Kompozice podle předkládaného vynálezu, které poskytují syndecan-1 ektodomenu mají význam pro svou schopnost zpomalovat nebo předcházet nádorovému růstu nebo nádorové recidivě, a jejich schopnosti měnit fenotyp buněk směrem k více diferencovanému stavu, a to jak u lidských, tak u zvířecích pacientů. Syndekan-1 ektodomenové kompozice vynálezu utilizují tělu vlastní mechanismy pro navození diferenciace specifických typů buněk k jejich maximálnímu potenciálu.

Není míněno omezení kompozic a metod vynálezu na syndekan-1. Syndekan-1, syndekan-2, syndekan-3 a syndekan-4 obsahují podobné doménové struktury. Je známo, že diferenciace jistých buněčných typů je asociována se ztrátou syndekanu-1, ale zároveň s objevením se jiného člena syndekanové rodiny (Bernfield, 0., et al., Annu. Rev. Cell Biol. 8:365-393 (1992)). Například, vytváří-li bronchiální epitel pupeny, plicní mesenchym ztrácí syndekan-1, ale získává syndekan-2. V nádorech z buněčných typů, které ztrácí syndekan-1 při diferenciaci, ale exprivují jiný syndekan,bude indikováno využití ektodomeny ze syndekanu, který je exprivován v diferencovaném stavu.

Následující příklady jsou pouze ilustrativní a neomezují rozsah vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady jsou pouze ilustrativní a neomezují rozsah vynálezu.

Příklad 1

Deleční mutanty svndekanových konstruktů

Užitím liposomové transfekce a následné selekce stabilně transfektovaných buněčných klonů geneticinem jak popisuje Leppa et al., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A.

89:932 (1992) byly produkovány klony S115 buněčných linií (viz. Obr.3), které exprivovaly bud divoký typ myšího syndekanu-1 (wild-typ), nebo deleční typ s pouze jedním argininovým zbytkem v cytoplasmatické doméně (tail-less), nebo pouze ektodomenu syndekanu-1 (Ekto 2, viz Obr.3).

Tyto tři formy a hostitelé byly konstruovány následovně:

Kompletní cDNA myšího syndekanu-1, jak popisuje Mali et al., Biol. Chem. 268:24215-24222 (1993) byla klonována do EcoRI místa Bluescript SK+ (Promega).

1) EcoRI insert Bluescript konstruktu byl klonován do EcoRI místa pBGS vektoru (Mali et al., J.Biol. Chem. 268:24215-24222 (1993)) a orientace byla potvrzena. Tento konstrukt byl označen Wild typ.

2) Mutagení 25-bázový oligonukleotid mající sekvenci :

5|G CTG TAC CGC TAG CAG AAG AAG GAC-3| [SEQ ID No.l], obsahující stop kodon a Nhel restrikční místo (podtržené) byl použit k přeměně kodonu pro druhou aminokyselinu (methionin) cytoplasmatické domény následující transmembránovou doménu ke stop kodonu. Mutace byla potvrzena restrikční digescí a dideoxy sekvencováním. EcoRI insert Bluescript konstruktu byl klonován do EcoRI místa amplifikovaatelného pBGS vektoru (Mali et al., J.Biol. Chem. 268:24215-24222 (1993)).Tento mutantní syndekan-1 obsahující pouze jednu aminokyselinu (arginin) ve své cytoplasmatické doméně byl označen tail 1 ess .

Mutagení 33-basový oligonukleotid 5| GACACCTCCCAGTACTCACTTCCTGTCCAAAAG-3| [SEQ ID No.2] obsahující stop kodon (silně) a Seal místo (podtržené) byl použit k přeměně prvního kodonu (E) po dibasickém proteasa senzitivním místě ektodomeny ke stop kodonu. Mutace byla potvrzena restrikční digescí a dideoxy sekvencováním. Toto byl Bluescript- ecto konstrukt. EcoRI insert Bluescript-ecto konstruktu byl klonován do EcoRI místa pJC119R vektoru (Miettinen et al., J. Cell Sci. 107, v tisku,(1994)). Xhol trávený ekto insert z pJC119R-ekto konstruktu byl ligován do Xhol místa pMAMneo eukaryotního transfektního vektoru, dosažitelného od Clontech, Palo Alto (Leppa et al., Proč.

Nati. Acad. Sci. U.S.A. 89:932 (1992)), a orientace byla potvrzena restrikční digescí.

Příklad 2

Exprese mutantního syndekanu-1 normalizuje maligní růst Sl15 buněk.

Divoký typ syndekanu-1 a cytoplasmatický deleční mutant (tail-less) byly klonovány do EcoRI místa pBGS eukaryotního expresního vektoru (Mali et al., J.Biol. Chem. 268:24215 (1993), ale ektodomenové konstrukty byly klonovány do pMAMneo vektoru, aby se získala dostatečná expresní úroveň také v přítomnosti hormonů (osobní komunikace, S. Ala-Uoti, Turku Centre for Biotechnology). pBGS systém není reprivován testosteronem. Syndekan-1 exprese na povrchu buněk byla detekována užitím mAb 281-2 (Jalkanen et al., J.Cell Biol. 101:976 (1985)), která rozpoznává ektodomenu myšího syndekan-1 dřeňového proteinu, a aktinová filamenta byla vizualisována užitím rhodamin-konjugovaného faloidinu.

Buňky (S115+, wild typ, tail-less a Ecto-2) byly kultivovány čtyři dny na potažených plotnách v DMEM-5%

FCS-lmM Na-pyruvátu s lOnM testosteronu, kromě S115— buněk, které byly kultivovány bez testosteronu v DMEM-4% DCC-FCS (Dextran-Coated-Charcoal ošetření eliminuje endogení steroidy ze séra) s 1 mM Na-pyruvátu. Buňky byly fixovány 0,1%

Triton-X-100, 2% paraformaldehydem a inkubovány s rhodamin-konjugovanéhým faloidinem (Sigma).

Syndekan-1 exprese na povrchu buněk byla vizualisována inkubací živých buněk po 1 hodinu na ledu s krysí mAb 281-2 (rozpoznávající myší syndekan-1 ektodomenu), pak byly fixovány 2% paraformaldehydem a navázaná mAb 281-2 byla visualisována FITC-konjugovanou králičí anti-krysí IgG.

Bez testosteronu vykazovaly S115 buňky organizovaná aktinová filamenta, která jsou typická pro tyto buňky, jsou-li epiteliální. V přítomnosti hormonů byl aktin dizorganizovaný a globulární, a povrchová exprese syndekanu-1 byla také suprivována, jak ukázal dříve Leppa et al., Cell Reg. 2,1 (1991), (Obr.4).

Wild typ a Tail less klony, exprivující syndekan-1 na buněčném povrchu znovu, získaly organizaci aktinových filament v důsledku ošetření testosteronem, Obr.4.

Příklad 3

Efekt syndekan-1 ektodomeny na kultivované SI15 buňky

Protože transfekce Tail-less mutantů indukovala podobné změny jako transfekce wild typem syndekanu-1 byly S115 buňky transfektovány ektodomenou. Bylo produkováno více než 50 nezávislých klonů secernujících rozdílné hladiny ektodomen do kultivačního media (viz. Obrázky 5,6 a 7).

Buněčný povrch těchto buněk se barvil pouze slabě na syndekan-1, ale tyto buňky jevily dobře organizovaná aktinová filamenta a epiteloidní morfologii (Obr.4). Tyto výsledky napovídají, že ektodoména syndekanu-1 dostatečně schopná navodit epiteloidní morfologii u testosteronem ošetřených SI15 buněk.

K detailnímu analyzování Ekto klonů, množství secernované syndekan-1 ektodomény bylo měřeno zesílenou chemoluminiscenční metodou užitím mAb 281-2 proti dřeňovému proteinu syndekan-1 ektodomény. Dva separátní stabilně transfektované buněčné klony, secernující velké množství syndecanu-1 do kultivačního media (Ecto 2 a Ecto 23) a dva buněčné klony s nízkou expresí (Ecto 15 a Ecto 34) byly selektovány pro další analýzu.

Jasná korelace mezi syndekan-1 ektodomenovou expresí a reorganizací aktinových filament byla detekována za přítomnosti 10 nM testosteronu: Ecto 15 a Ecto 34 s nízkou expresí syndekanu-1 měly disorganizovaný, zejména globulární aktin, ale Ecto 2 a Ecto 23 klony exprivující syndecan-1 ektodomenu vykazovaly epiteloidní morfologii s organizovanými svazky aktinových vláken (Obr.6). U zvýšené exprese intaktního syndekanu-1 byla již dříve ukázána suprese nádorového růstu u testosteronem ošetřených S115 buněk (Leppa et al.,supra) a nyní také Ecto 2 a Ecto 23 klony s vysokou expresí syndekan-1 ektodomény omezovaly jejich růst na měkkém-agaru. Klony Ecto 15 a Ecto 34 s nízkou expresí syndekan-1 ektodomény nicméně demonstrovaly růst na měkkém-agaru typický pro parenterální S115 buňky (Obr.7). Experiment na měkkém agaru ukazuje, že kromě morfologie je syndekan-1 ektodomenová exprese suficientní také k restrikci tumorogeního růstu S115 buněk.

Příklad 4

Izolace a purifikace syndekanové ektodomeny z kultur Ekto buněk

Protože se syndekan-1 ektodomena zdá být odpovědná za supresi maligního růstu androgeny ošetřených S115 buněk, odebrali jsme kondicionované medium z kultur Ecto buněk pro isolaci ektodomen. Kondicionované kultivační medium bylo denaturováno 2M močovinou a varem, před zavedením do DEAE-sephacel kolon bylo přidáno 50 mM Na- acetátu (pH=4.5) a medium bylo ochlazeno na +4 °C. Kolony byly pak promyty 0.2 M NaCl, 2M močoviny, 50 mM Na-acetátu (pH=4.5) a vazba materiálu byla eluována užitím IM NaCl, 2M močoviny, 50 mM Na acetátu (pH=4.5). Frakce obsahující syndekan-1 ektodomenu byla dialyzována proti fosfátovému pufrovacímu salinickému roztoku (PBS) při 4 °C. Množství syndecan-1 ektodomeny ve frakci bylo hodnoceno slot-blottingem a následnou zesílenou chemoluminiscenční metodou za užití mAb 281-2 (Příklad 2 a Miettinen, H.M. et al., J.Cell Sci. v tisku (1994)) a srovnáno s množstvím známého syndekan-1 standardu.

Ektodomena syndekan-1 z kultivačního media Ecto buněk byla biochemicky podobná syndekan-1 ektodomeně izolované z normálních myších mamárních epiteliálních buněk (NMuMG). Po isolaci byl obsah syndekanu-1 v preparátu měřen a preparát byl testován na hormonálně ošetřené S115 buňky. Jak ukazuje Obrázek 8, koncentrace DEAE-izolované syndekan-1 ektodomeny nižší než 1 nM suprivovaly růst testosteronem ošetřených S115 buněk (Obr.8). Stejné koncentrace pouze mírně inhibovaly růst NMuMG buněk, které sloužily jako normální epiteliální buňky (Obr.8). Syndekan-1 ektodomena byla také izolována z kultivačního media NMuMG buněk, a také s tímto preparátem nM koncentrace inhibovaly růst hormonálně ošetřených Sí15 buněk (Obr.9). Ošetření DEAE-izolováných ektodomen heparitinasou totálně zrušila aktivitu inhibice růstu u těchto preparátů (Obr.9), naznačujíc tak, že dřeňový protein syndekanu-1 jako takový nebyl zahrnut.

DEAE-izolované syndekan-1 ektodomeny byly dále purifikovány užitím mAb 281-2 imunoafinitnich kolon:

DEAE-izolované syndekan-1 ektodomeny v PBS byly zavedeny do mAb 281-2 Sepharosa CL-4B imunoafinitnich kolon, jak popisuje Jalkanen et al., J.Cell Biol. 105: 3087 (1987), a vazba materiálu byla eluována 50 mM trietylaminu (pH 11.5). Frakce obsahující syndekan-1 ektodomenu byly dialyzovány proti destilované vodě a následně lyofi 1izovány. Poté, co byla syndekan-1 ektodomena suspendována v DMEM (Gibco) bylo množství zhodnoceno jak je popsáno výše. Opět, při 1 nM koncentracích této imunoafinitně purifikované syndekan-1 ektodomeny byla pozorována inhibice růstu testosteronem ošetřených SI15 buněk, a pouze mírný efekt na byl zřejmý na NMuMG buňkách (Obr.10). Na druhou stranu, heparin sulfát (HS) nebo chondroitin sulfát (CS) glykosaminoglykanové řetězce samotné nesuprivovaly růst S115 buněk, ani když byly použity v tisíckrát vyšších koncentracích než syndekan-1 ektodomena (Obr.11).

Přiklad 5

Efekt izolované syndekan-1 ektodomeny na kultury buněčných linii

Inhibiční efekt izolované syndekan-1 ektodomeny byl také testován na mnoha dalších buněčných liniích. Tyto zahrnovaly špatně diferenciované buňky spinocelulárního karcinomu (CarB), lidské mammární nádorové buňky (MCF-7, ATCC HTB 22), S115 buňky s (S115+) nebo bez (S115-) hormonů, NIH 3T3 fibroblasty (ATCC CRL 1658), normální mammární epiteliální buňky (NMuMG, ATCC CRL 1636), a lidské keratinocytové buňky (HaCaT, Obr.12).

Buňky byly kultivovány a analyzovány jak popisuje Obr.

v následujících médiích po určenou časovou periodu: CarB buňky (M.Quintani1la, K.Brown, M.Ramsden, A. Balmain, Nátuře 322,78 (1991)) byly kultivovány v HAM-F12-10% FCS po čtyři dny, MCF-7 buňky v DMEM-5% FCS supiementovaném 10 nM estradiolu (E2) a 10 pg/ml insulinu po 4 dny, SI15+ a S115— byly kultivovány jak je na obrázku 3 po tři dny, NIH 3T3 buňky v DMEM-5% FCS po 4 dny, NMuMG a HaCaT buňky v 10% FCS-DMEM po 4 dny. Protože S115-buňky měly o něco pomalejší rychlost růstu než SI15+ buňky, 3000 SI15— buněk (ostatní buněčné linie 1500 buněk) bylo proporcionálně přidáno do jamek tak, aby byly poskytnuty srovnatelné výsledky s S115+ buňkami. Proto pro S115- buňky bylo 3000 buněk transferováno do ploten oproti 1500 buňkám u jiných vzorků.

Ty buněčné linie, které formují tumory (CarB, MCF-7,

SI15+) jevily silnou supresi růstu, když byly vystaveny syndecan-1 ektodomeně v 1 nM koncentraci (Obr.12). Oproti tomu, pouze mírná nebo žádná inhibice byla pozorována u zbylých testovaných buněčných linií (S115-, NIH 3T3, NMuMG, HaCaT, Obr.12), které jsou všechny považovány za nenádorové. Exposice hormonům zdvojuje stupeň růstu S115 buněk (Leppa et al., supra), ale je-li syndekan-1 ektodomena přítomna v kultuře, je růst SI15 buněk bez androgenů 5.4 krát vyšší než růst stejných S115 buněk s testosteronem (Obr.12). Toto je díky inhibici maligního chování S115+ buněk a neporušeného růstu epiteloidních SI15— buněk.

Příklad 6

Suprese nádorového in vivo růstu syndekan-1 ektodomenou

Ecto konstrukt byl vyroben jak je popsáno v dřívějších příkladech užitím kompletní myší syndekan-1 cDNA klonované do Bluescript SK+ vektoru (10) a mutageního oligonukleotidu o 33 basích

5| GACACCTCCCAGTACTCACTTCCTGTCCAAAAG-3| [SEQ ID No.2] obsahující stop kodon (silně) a Seal místo (CAGTAC) k přeměně první aminokyseliny (E) po dibasickém proteasa senzitivním místě ektodomeny ke stop kodonu.Mutace byla selektována restrikční digescí a potvrzena dideoxy sekvencováním. Wild typ syndekanu-1 a cytoplasmatický deleční mutant byly klonovány do EcoRI místa pBGS eukaryotního expresního vektoru (Mali et al., J.Biol.Chem. (1993) 268:24215-24222). Ekto mutant byl ligován do Xhol místa pMAMneo eukaryotního transfekčního vektoru (Leppa et al., PNAS (1992) 89:932-936), protože víme, že pMAMneo transfektované SI15 buňky pracují lépe v bioreaktorovém systému (osobní komunikace, Sari Ala-Uotila, Turku Centre for biotechnology). SI15 buňky byly transfektovány užitím liposomové transfekce a následně selektovány Geneticinem jak bylo popsáno dříve (Leppa et al., PNAS (1992) 89, 932-936).

SI15 buňky a transfekční buněčné klony byly kultivovány v DMEM-5% FBS-1 mM Na-pyruvátu s 10 nM testosteronu, s výjimkou SI15— buněk, které byly kultivovány bez testosteronu v DMEM-4% DCC-FBS (Dextran Coated Charcoal ošetřené fetální hovězí sérum, eliminující endogenní steroidy ze séra) s 1 mM Na-pyruvátu.

Pro nádorový růst byly subkonfluentní kultury odděleny trypsinem, promyty v DMEM a počítány Coulter Counterem (Coulter Electronics). Buňky byly resuspendovány v DMEM v hustotě 5 x 10⁷ a udržovány na ledu do injekce. Samci atymických nudě myší (nu/nu-BALB/cABom) mezi 6-8 týdnem věku (Bomholtgard, Rye, Denmark) byli injektováni subcutálně 0.2 ml buněčné suspense. Silastické testosteronové kapsle byly simultáně implantovány. Nudě myši byly pozorně sledovány na vývoj nádorů a velikost tumorů byla v intervalech ve dvou kolmých rozměrech. Když byla zvířata usmrcena, byly plíce a játra hodnoceny na možnou přítomnost metastas. Velikosti tumorů byly měřeny 6, 11 a 15 dní po injekci a jsou uvedeny jako průměry pěti individuálních tumorů na Obr.13. Ektodomenou transfektované buňky formovaly pouze akutní zánětlivou reakci a nejevily nádorový růst, oproti divokému typu buněk, které vytvářely rychle rostoucí tumory. Tento experiment vykazuje účinost syndekan-1 ektodomeny jako tumor supresivního agens in vi vo.

Všechny odkazy zde citované jsou zde plně brány jako odkazy. I když by odborníci neměli plný popis vynálezu, bude jim jasné, že rozsah vynálezu může být proveden v širokém a ekvivalentním rozsahu podmínek, parametrů a podobně, bez narušení smyslu nebo rozsahu vynálezu nebo jakéhokoliv jeho provedení.

Claims (12)

1. Farmaceuticky přijatelná kompozice pro potlačení růstu nádorových buněk, vyznačující se tím, že obsahuje protein, mající doménu, zahrnující syndekanovou ektodoménu.

2. Farmaceuticky přijatelná kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že syndekan je syndekan-1, syndekan-2, syndekan-3 nebo syndekan-4.

3. Farmaceuticky přijatelná kompozice podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že vedený syndekan je lidský a má sekvenci uvedenou na obrázku 1.

4. Farmaceuticky přijatelná kompozice podle nároku 3, kde uvedená ektodoména obsahuje aminokyseliny 1 až 251 z obrázku 1, aminokyseliny 1 až 231 z obrázku 1, aminokyseliny 18 až 251 z obrázku 1, aminokyseliny 18 až 231 z obrázku 1 neb doménu, mající karboxylový konec na jakémkoliv místě mezi aminokyselinami 231 a 251 obrázku 1 a sekreční signální fragment menší než aminokyseliny 1 až 17 z obrázku 1.

5. Použití proteinu definovaného ve kterémkoliv z nároků 1 až 4 pro přípravu farmaceutické kompozice pro léčení k redukci nebo potlačení růstu nádorových buněk.

6. Použití podle nároku 5, kde nádorová buňka je charakterizována ztrátou syndekanu-1.

7. Použití podle nároku 5 nebo 6, kde farmaceutická kompozice je podávána do extracelulárního prostředí nádorové buňky.

8. Použití podle kteréhokoliv z nároků 5 až 7, kde uvedená buňka je vybrána ze skupiny, zahrnující epitheliální buňky, mesenchymální buňky, pre-B buňky a plasmové buňky.

9. Použití podle nároku 8, kde uvedená buňka je vybrána ze skupiny, zahrnující buňky prsu, vaječníkové buňky a prostatové buňky.

10. Použití podle nároku 9, kde uvedená buňka je steroid-responzivní.

11. Použití podle nároku 10, kde uvedený steroid je estrogen nebo androgen.

12. Použití podle kteréhokoliv z nároků 5 až 11, kde uvedená buňka je lidská buňka.