CZ299768B6

CZ299768B6 - Farmaceutická kompozice pro lécení fibrózy ledvinnebo jater

Info

Publication number: CZ299768B6
Application number: CZ20000413A
Authority: CZ
Inventors: Huang@Xiaozhu; Sheppard@Dean; Pytela@Robert
Original assignee: The Regents Of The University Of California
Priority date: 1997-08-08
Filing date: 1998-08-07
Publication date: 2008-11-19
Also published as: RU2221589C2; PL341029A1; EE200000068A; CN1267224A; EP1930022B1; WO1999007405A1; EP0996460A1; ATE511850T1; NZ515955A; EP0996460A4; JP2009001587A; HU228900B1; PT1504764E; KR20010022740A; US20070148173A1; PT1930022E; HUP0003547A2; CY1111792T1; ES2311131T3; EP1504764B1

Abstract

Použití protilátky, která se specificky váže k integrinu .alfa..ny..beta.6 a blokuje vazbu ligandu na integrin .alfa..ny..beta.6 pro výrobu léciva na lécení fibrózy ledvin nebo jater u pacienta. Protilátkou je s výhodou monoklonální protilátka. Protilátka je urcena pro terapeutické nebo profylaktické podání. Monoklonální protilátky produkované hybridomem ATCC HB12382 a hybridom ATCC HB12382.

Description

Farmaceutická kompozice pro léčení fibrózy ledvin nebo jater

Oblast techniky

Vynález se týká nových terapeutických přístupů při léčbě poškození plic a pulmonární fibrózy.

Dosavadní stav techniky

K.)

Integriny jsou helerodimérní buněčné adhezní receptory, které tvoří dvě podjednotky a a β, Integrin ανβ6je receptor fíbronektinu a tenascínu. který převážně exprímují epiteliální buňky. Ve zdravých tkáních dospělých primátů se rnRNA a protein [36 detekuje jen vzácně, ačkoli βό se exprimuje během fetálního vývoje, hojení ran a v některých epiteliálních nádorech. V is případě, žc se β6 exprimuje v linii buněk karcinomu tlustého střeva, kde se v normálním případě nevyskytuje, exprese podjednotky propůjčuje schopnost proliferace. Oblast C konce zahrnující aminokyselin, která se vyskytuje pouze v podjednotcc βό, je nutná při zvýšené prolifcraČní aktivitě integrinu ανβ6 (popisuje se v publikaci Agrezet al., J. Cell. Biol. 127:547-5 5 6 (1994)). Expresi βό je možně vyvolat v aveolárníeh epiteliálních buňkách typu 11, když dojde k

2o poškození zavedením živých bakterií injekcí. Expresi β6 je možné pozorovat ve fekálních místech subklinického zánětu, stejně jako u různých klinických preparátů získaných z pacientů s chronickým nebo akutním zánětem plic nebo ledvin (Bruess et al.. J. Cell Se i, 108:224 1 -225 1 (1995))/

V publikaci 1 Iuang et al., J. Cell Biol. 13 3:92 1-928 (1996) se popisují myši homoz.ygotní v případě nulové mutace v genu kódujícího podjednotku β 6, které jsou v mládí holé, což je spojeno s infiltrací makrofágů do kůže a $ hromaděním aktivních lymfocytů v okolí dýchacích cest v plicích.

so Pulmonární fibróza je běžným onemocněním, které je pravděpodobně způsobeno destruktivními účinky produktů uvolněných z leukocytů (popisuje se například v publikaci Marshall et al.. Int. J. Biochem. Cell Bio. 29:107- 120 (1997)). Poranění plic a pulmonární fibróza vyvolaná bleomycinem jsou spojené a mohou záviset na zesílení a aktivaci lymfocytů (popisuje se v publikaci Schrier. D. .1. et al.. Am. .1. Pathol. 116:270-278 (19 84)). Při léčbě parenehymatiekého poranění plic a pulmonární fibrózy je možné použít ..antieytokiiť' (popisuje se v publikaci Coker et al., Thorax 52 (2): 294-296 (1997)),

Současné terapie akutního plicního poškození a pulmonární fibrózy jsou do velké míry' neadekvátní (popisuje se v publikaci King et al., „ídiopathyc Pulmonary l·ibrosis and other Interstitial

Lung Diseases of Unknown Etiology,“ in Tcxtbook of Respirátory Medicine, Murray and Naděl, eds., W. B. Saunders, Philadelphia, PA. pp. 1827-1839 (1994)). Proto je nutné vytvořit léčbu akutního poškození plic a pulmonární fibrózy;

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je použití protilátky, která se specificky váže k integrinu ανβύ a blokuje vazbu ligandu na integrin ανβ6 pro výrobu léčiva na léčení fibrózy ledvin nebo jater u pacienta. Protilátkou je s výhodou monoklonální protilátka. Protilátka je určena pro terapeutické nebo proso fylaklieké podání.

Dále se popisuje monoklonální protilátka, kterou s výhodou produkuje hybridom ATCC HB 12382. Další podstatou vynálezu je tento hybridom ATCC HB 12382.

Takové kompozice je možné aplikovat pacientům, kteří trpí symptomy fíbrózy, nebo u těchto pacientů existuje nebezpečí tohoto onemocnění. Kompozice je možné těmto pacientům aplikovat jako profylaxi nebo terapii. V typickém případě se kompozice podle vynálezu aplikuji denně po dobu nejméně jednoho až pěti dní. Termín „terapeutická dávka” znamená dávku, která u pacienta předchází, zmírňuje, zeslabuje nebo jinak omezuje vážnost symptomů.

Protilátky v kompozicích se specificky váží na ανβό. Protilátky mohou být syntetické, monoklonální nebo polyklonální a mohou se připravovat způsobem dobře známým v oboru. V preferovalo ném provedení vynálezu je antagonista protilátka, která specificky rozeznává cytoplazmatickou oblast podjednotky β6 (popisuje se například v publikaci Wcinacker et al., J, Biol. Chem. 269:

1-9 (1994)). V případě terapeutických aplikací se preferují „lidské“ monoklonální protilátky obsahující lidské konstantní a variabilní oblasti. Preferují sc proto, protože se minimalizuje imunitní odezva pacienta proti protilátkám. Takové protilátky se mohou vytvořit imunizací transgen15 nich zvířat, která nesou geny lidských imunogtobinů (popisuje se v publikaci Jakobovits et al., Ann. NY Acad. Sci. 764: 525-535 (1995)). Ve spojení se syntetickými a semi-syntetickými protilátkami takové termíny zahrnují fragmenty protilátek, protilátky s „přepínacím izotypem, humanizované protilátky (např. tnyší-lidské, lidskc-myší a podobně), hybridy, protilátky vykazující plurální specifitu, plně syntetické molekuly podobné protilátkám a podobně.

Jak sc popisuje dále v textu u protilátek je možné testovat schopnost blokovat navázání ligandu na ανβό a/nebo jiné vlastnosti, jako je schopnost ochrany in vivo proti pulmonární fibróze vyvolané bleomycinem. Příklad anti-βό monoklonálních protilátek je 1005 (ATCC číslo uložení HB 12382, uloženo 6. srpna 1997).

li kandidátů protilátek proti ανβό se může testovat jejich funkce za použití řady metod známých v oboru a/nebo popsaných v uvedené přihlášce. Takovými funkcemi může být ochrana proti fibróze indukované bleomycinem u myšího modelu, inhibice proliferace nádorových buněk (popisuje se v publikaci Agrezet al., J. Cell Bio., 127: 547-556 (1994)) a inhibice migrace buněk

3o a/nebo inhibice buněčné adheze (popisuje se v Příkladech provedení vynálezu),

Velké množství vhodných formulací protilátek podle vynálezu se mohou nacházet ve formulacích, které jsou dobře známy v oboru farmakologie (popisuje se například v publikaci Remingston s Pharmaceutical Sciences, (15^th Edition, Mack Publishing Company. Easton, Pennsylvania (1975)). zvláště v kapitole 87, Blaug, Seymour, Tyto formulace například zahrnují prášek, pasty, masti, gel, vosky, oleje, lipidy, nevhodné absorpční báze. emulze olej ve vodě nebo voda v oleji, emulze carbowax (polyethylenglykol s různými molekulárními hmotnostmi), semi-pevné gely a semi-pevné směsi obsahující carbowax.

Množství aktivní složky nezbytné pro účinnou terapii závisí na mnoha různých faktorech, které zahrnují způsoby aplikace, cílové místo, fyziologický stav pacienta a aplikace jiných medikamentů. Léčebná dávka by sc měla určit títrací, aby se optimalizovala bezpečnost a účinnost. V typickém případě dávky používané in vitro mohou být dobrým základem pro množství aktivních látek použitelných při aplikaci in šitu. Pro stanovení správné dávky jc také možné použít hodnoty stanovené testováním na zvířatech. Další úvahy sc popisují například v publikaci Goodman and Gílman's the Pharmacological Basis of Terapeutics, 7 th Edition (1985), MacMillan Publishing Company, New York, a Remington s Pharmaceutical Science 18 th Edition, (1990) Mack Publishing Co, Easton Penn. Způsob aplikace zahrnují orální, intravenózní, intraperitoneální, intramuskulámí, transdermální, nasální, intoforetickou aplikaci a podobně.

Kompozice podle vynálezu se mohou aplikovat v různých formách jednotkové dávky v závislosti na způsobu aplikace. Jednotkové dávkové formy vhodné pro orální aplikaci existují například

-2CZ 299768 B6 v pevné formě, jako je prášek, tablety, pilulky, kapsle a draže, a v kapalné jednotkové formě, jako je elixír, sirup a suspenze. Aktivní složky se mohou aplikovat parenterálnc, jako sterilní kapalná dávková forma. Želatinové kapsle obsahují aktivní složku a dále jako neaktivní složku obsahují práškové nosiče, jako je glukóza, laktóza. sacharóza, manitol, škrob, celulóza nebo deriváty celulózy, stearát horečnatý, kyselinu stearovou, sacharin sodný, talek, uhličitan horečnatý a podobně. Příklady dalších aktivních složek, které se mohou přidat, aby vznikla požadovaná barva, chuť, stabilita, tlumicí kapacita, disperze nebo jiné požadované rysy, zahrnují červený oxid železitý, silikagcl, laurylsulfát sodíku, oxid titaničity, poživatelná bílá barva a podobně. Podobná ředidla sc mohou použít při přípravě lisovaných tablet. Tablety i kapsle se io mohou vyrábět jako kapsle s prodlouženým účinkem, které uvolňují aktivní látku bez přerušení po dobu několika hodin. Lisované tablety mohou být potažené cukrem, aby se překryla nepříjemná chuť a aby se tableta ochránila před působením okolních podmínek. Tablety mohou být ve formě enterosolventníeh tablet, aby došlo k selektivnímu uvolnění v gastrointcstinálním traktu. Kapalné dávkové formy vhodné pro orální aplikaci mohou obsahovat barvivo a příchutě, aby byly pro pacienta přijatelnější.

Koncentrace kompozic podle vynálezu ve farmaceutických formulacích značně kolísá. Koncentrace se pohybuje v rozsahu méně než asi 0.1 %. obvykle alespoň asi 2 %, stejně jako 20 až 50 % nebo více hmotnostních procent. Vhodná koncentrace se vybírá primárně na základě objemu

2d a viskozity kapaliny v souladu s určitým modem vybrané aplikace.

Kompozice podle vynálezu se může aplikoval pomocí liposomů. Liposomy zahrnují emulze, pěny, micela, nerozpustné monovrstvy. kapalné krystaly, fosfolipidové disperze, lamelámí vrstvy a podobně. V těchto přípravcích kompozice podle vynálezu, která má být zavedena, je součástí liposomů, jenž je sám neboje spojen s molekulou, která se váže na požadovaný cíl, jako je protilátka, nebo s terapeutickou nebo imunogenní kompozicí. Liposomy buď naplněné, nebo obalené požadovanou kompozicí podle vynálezu se mohou aplikovat systémově nebo se mohou zavést přímo do tkáně. Liposomy tak zavádějí vybrané lerapeutické/imunogenní peptidové kompozice.

5o Liposomy vhodné pro použití podle vynálezu jsou vytvořeny ze standardních lipidů tvořících vesikula, které v obecném případě zahrnují neutrální a negativně nabité fosfolipidy a sterol, jako je cholesterol. Výběr lipidů probíhá na základě velikosti liposomů. odolnosti liposomů vůči kyselinám v krevním řečišti. V publikaci Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467 (1980). patenty US 4 235 871, US 4 501 728. US 4 837 028 a US 5 019 369 se popisujímetody přípravy liposomů.

Suspenze liposomů obsahující kompozici podle vynálezu se může aplikovat intravenózně, lokálně. povrchově atd. v dávkách, které kolísají podle způsobu aplikace, podle způsobu cílení kompozice a stádia léčeného onemocnění,

4(1

V případě pevných kompozic se mohou použít běžné netoxické pevné nosiče, které zahrnují například man i to 1, laktózu, škrob, stearát horečnatý, sacharin sodný, , talek. celulózu, glukózu, sacharózu, uhličitan horečnatý a podobně ve stupni čistoty, který je nutný pro farmaceutické použití. V případě orální aplikace se farmaceuticky přijatelná netoxická kompozice připravuje spojením normálně používaného ekcipientu, jako jsou popisované nosiče, a 10 až 95 % aktivní složky, kterou je jedna nebo více kompozic podle vynálezu. Upřednostňuje se koncentrace aktivní složky 25 až 75 %.

Při aplikaci aerosolem kompozice podle vynálezu zahrnuje povrchově aktivní činidlo a hnací lát5o ku. V typickém případě procentuální zastoupení kompozic podle vynálezu je 0,01 až 20% hmotn.. upřednostňuje se I až 10%. Povrchově aktivní činidlo nesmí samozřejmě být toxické a je výhodné, když je rozpustné v hnací látce. Představitelé takových činidel jsou estery nebo parciální estery mastných kyselin obsahující 6 až 22 atomů uhlíku, jako je kyselina kapronová, kyselina kaprylová. laurová, palmitová, stearová, linolová, linolenová, olestarová nebo olejová s

alifatickým vícemocným alkoholem nebo s jeho cyklickým anhydridem. Mohou sc také použít smíšené estery , jako jsou smíšené a přirozené glyceridy. Povrchově aktivní činidlo může tvořit OJ až 20% (hmotn.) kompozice, upřednostňuje se 0,25 až 5%. Zbytek kompozice tvoří obyčejná hnací látka. Je-li to nutné může se do kompozice zahrnout nosič, jako je například lecitin v případě nasální aplikace.

Konstrukty podle vynálezu se mohou navíc zavádět depotnírn způsobem, ve formě kapslí nebo ve formě implantátů, přičemž metody jsou dobře známy v oboru. Podobně lze konstrukty zavést do tkání pumpou.

Libovolné formulace jsou vhodné pro ošetření a léčbu podle vynálezu v případě, že aktivní látka obsažená ve formulaci jí není deaktivována a formulace je fyziologicky kompatibilní.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek č. 1A zobrazuje graf porovnávající obsah plicního hydroxy pro linu u myší, které exprimují nulovou mutaci v genu jednotky integrinu β6. a u kontrolních myší v přítomnosti bleomycinu (blm) nebo fyziologického roztoku (sal).

Na obrázku č. 1 B je fotografie sekcí plic obarvených triehromem. která demonstruje masivní akumulaci kolagenní extraeelulární matrice v plicích myší divokého typu (β6+/+). ale nikoli (βό-Λ), léčených bleomyeinem, 30 dní po léčbě.

Na obrázku č. 2 je graf porovnávající zvýšené množství vody na plících u myší divokého typu (β6i/+) a u myší (β6-/-) v přítomnosti bleomycinu (blm) nebo fyziologického roztoku (sal).

Na obrázku č. 3 je graf porovnávající reeruitment lymfocytů u myší divokého typu (β6+/+) a (β6-Λ) po aplikaci bleomycinu (blm) nebo fyziologického roztoku (sal).

Následující příklady ilustrují určité aspekty předkládaného vynálezu a pro podstatu vynálezu nejsou zamýšlen) jako limitující.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Úvod

Pulmonámí fibróza je běžné onemocnění způsobené destruktivními účinky produktů uvolňujících se z leukocytů. Ačkoli dochází během vývoje fibrózy k porušení respiračního epitclu, samotné epiteliální buňky se tohoto procesu neúčastní. Na myších cxprimujících nulovou mutaci v genu podjednotky integrinu (βό). která je v epiteliáIních buňkách zcela redukována, se testovaly účinky bleomycinu, což je aktivní látka způsobující pulmonámí fibrózu. Myši β6-Λ se dramaticky bránily fi brože vyvolané bleomyeinem. Terapie používající tento integrin proto mohou přinést nové přístupy léčby velmi vážného onemocnění. Integrin ανβό se exprimuje pouze na epiteliálnich buňkách během organogeneze a jako odezva na poškození. Myši β 6-/vy kazu jí nadměrné zánětlivé odezvy na podkožní poranění a poranění dýchacích cest, ale vyvíjejí se a rozmnožují se normálním způsobem (popisuje se v publikaci lluang. X. Z. et al., J.

Cell Biol. 133:921-928(1996)).

-4CZ 299768 Bó

Příklad 2: Deaktivace genu podjednotky integrinu p6 chrání myši před pulmonární fibrózou vyvolanou bleomycinem

Pulmonární toxicita bleomycinu (0,03 jednotek (U) v 60 μΙ fyziologického roztoku) nebo fyziologického roztoku (60 μΐ) aplikovaného intratracheální injekcí se testovala na myších divokého typu (βό+/+) a p6-/- kmen I29SVEMS/ler s porovnatelnými charakteristikami věku a pohlaví. Pulmonární fibróza se hodnotila 15, 30 a 60 dní po ošetření, testem sledování morfologie plic a měřením obsahu hydroxy prolinu a indexem ukládání kolagenu. Fibróza byla podstatná u myší i« divokého typu ošetřených bleomycinem po 30 dnech a zhoršovala se až do 60-tého dne (obrázky č. 1A až 1B). Naopak morfologie plic u myší β6-/- zůstávala skoro normální v průběhu celého experimentu. Vznikly jen malé oblasti fíbrózy, Obsah hydroxyprolinu v plicích se podstatně nelišil od hodnot dosažených u myší, kterým se aplikoval fyziologický roztok v libovolném uvedeném čase. Toto zjištění neplatí pouze pro myši jednoho druhu 129, protože podobných výsledků i? se dosáhlo u mláďat po křížení myší 129 a C57B1/6. Tyto neočekávané výsledky ukazují, že exprese integrinu ανβ6 je nutná pro vyvolání pulmonární fíbrózy.

Aby se stanovila úloha ανβό v časných stádiích fíbrózy vyvolané bleomycinem, měřil se 1. 5 a 15 dní po aplikaci bleomycinu nebo fyziologického roztoku obsah vody na plicích, jako znak pulmonárního edčniu, ke kterému dochází zvýšenou vaskulární permeabi litou. U myši divokého typu by! obsah vody nejvyšší pátý den po aplikaci bleomycinu a zůstal zvýšený až do 15-ého dne (obrázek č. 2). Stejně jako je tomu v případě pulmonární fíbrózy. myši β6~/-jsou chráněny před časnými účinky bleomycinu, což ukazuje úloha epiteliálního ανβ6 před vývojem vaskulárního úniku vyvolaného bleomycinem.

Dříve se publikovalo, že myši β6-/- vykazují silné jednojaderné buněčné zánětlivé odezvy na kůži a v dýchacích cestách (popisuje se v publikaci Huang. X. Z. et al., .1. Cell Biol. 133: 921928 (1996)). Poškození plic vyvolané bleomycinem a pulmonární fibróza jsou spojeny a mohou záviset na zesílení a aktivaci lymfocytů (popisuje se v publikaci Schricr. D, J, et al.. Am. J. pathol. 116: 270-278 (1984)). Za účelem zjištění, zda rezistence myší vůči poškození vyvolanému bleomycinem a fibróze je způsobena změnou zesílení lymfocytů nebo změnou aktivace, se stanovil počet CD4+ a CD8+ lymfocytů a hodnotila se aktivace lymfocytů měřením exprese receptorů interleukinu 2 (CD25) v buňkách získaných z rozsekaných plic myší, kterým se aplikoval fyziologický roztok nebo bleomyein, 5 a 15 dní po ošetření. Výsledky odpovídají dříve stanoveným hodnotám. V plicích myší β6-/- existuje vc srovnání se zvířaty divokého typu více buněk CD41, CD8+ a CD25U Bleomyein vyvolal velké zvýšení počtu lymfocytů exprim ujíeích CD4 a CD8 a značné zvýšení procenta lymfocytů expriinujíeích CD25 (obr. č. 3) u obou typů myší. U obou typů myší maximálního zesílení a aktivace plicních lymfocytů se dosáhlo 5 dní po aplikaci bleomycinu a začala klesat po 15-ti dnech po ošetření. Tato data

4o naznačují, že není pravděpodobné, aby nedostatečnost zesílení a aktivace leukoeytú u myší β6-/byla příčinou ochrany před poškozením účinky bleomycinu.

Interakce integrinu s jejich matricovými ligandv moduluje několik důležitých buněčných funkcí, které zahrnují prolíferaci (Agrcz. M. et al., J. Cell Biol. 127: 547-556 (1994)). možnost přežití (Eusacs, N. W. et al., Eur. J. Immunol. 25: 245-251 (1995)) a expresi cytokinů (Miyake. S. el al., J. Exp. Med. 177; 863-868 (1993)) a metaloprotcinas (Werb. Z. et al., J. Cell Biol. 109: 877-889 (1989)), Uvádí se, že pouze podjednotka β6 tvoří jediný integrinový heterodimer ανβό. který se vyskytuje v epiteliálních buňkách pouze omezeně. Spolu s rychlou indukcí exprese ανβό, která následuje po poškození epitelu, se zvyšuje místní koncentrace alespoň dvou ligandů vhodných

5(i pro uvedenč integriny (fíbronektin a tenascin). Dříve se uvádí, že exprese ανβό má důležitou úlohu při ukončení zánětlivých odezev jednojaderných buněk kůže a dýchacích cest plic (Huang, X. Z. et al., J. Cell Biol. 133: 921-928 (1996)). Zde uvedené výsledky ukazují, že tento integrin

- 5 CZ 299768 Bó také hraje kritickou úlohu při indukci plicního poškození a pulmonámí fibrózy jako odezvy na aplikaci bleomycinu.

Respirační epiteliálni buňky se považují za komponenty pasivní bariéry oddělující jiné plicní buňky od potenciálně toxických komponentu inhalovaného vzduchu. Na tomto rozhraní však mají tyto buňky dobrou polohu k iniciaci a modulací místní odezvy na poškození. Jisté důkazy naznačují, že respirační epitcliální buňky mají kapacitu syntetizovat a vylučovat řadu proteinů, které mohou iniciovat a upravil odezvu na poškození. Jsou to chernokiny (např, interleukin-8, GROa, RAN TES, GMCSF, ΜΙΡ-la a MCP-1), jiné cytokiny (např. IE-6, IL-1 a JE 15) a růstové io faktory (např. fGFp). Jedním možným mechanizmem, který se podílí ανβό na vývoji poškození plic a pulmonámí fibrózeje modulace exprese jednoho nebo více proteinů.

Současné terapie pulmonámí fibrózy jsou velmi neadekvátní. Výsledky uvedené studie ukazují, že respirační epitcliální buňky a epitcliální integrin ανβό má důležitou roli v patogenezi paren15 chymatického poškození plic a pulmonámí fibrózy a žc terapie, které jsou specificky navrženy tak. aby interferovaly s funkcí integrinu, jsou použitelné pro léčbu těchto většinou těžko léčitelných onemocnění plic.

Příklad 3: tvorba blokačních protilátek

A. Tvorba monoklonálních protilátek

Aby došlo k vytvoření protilátek proti ανβό. myši βό-/- sc imunizovaly buď keratinocyty získa25 nými z myší divokého typu nebo rekombinantními vylučovanými lidskými ανβό (Weinacker et al., J. Biol. Chem. 269: 6940-6948 (1994)) ve Freundově adjuvans. Izolovaly se myší splenocyty a fúzovaly se s myšími buňkami myelomu SP2/0 podle standardních postupů. Buňky SW480 transfekované βό nebo falešně transfekované buňky SW480 sloužící jako kontroly se použily k testování výsledného supematantu průtokovou cytometrií. Protilátky, které rozeznávají buňky .to SW480 transfekované βό nikoli buňky falešně transfekované se použily v pozdějších experimentech.

B. Charakterizace monoklonálních protilátek

Aby vznikly protilátky proti myšímu ανβό, použily se u myší β67- 129/C57 jako imunogeny vylučované lidské ανβό a myší keratinocyty. U supematantu vytvořených hybridomň se sledovalo odlišné obarvení falešně transfekovaných buněk SW480 a bunčk transfekovaných βό. Výsledné protilátky ίΈβό a 1005 obarvily jak lidský βό exprimovaný v buňkách SW480 a myší βό na keratinocytech divokého typu. 05βό se dále charakterizovaly imunopreeipitací lyzátu lidských

4(i keratinoeytů značených (S). Tyto protilátky srážely jako heterodiméry o vhodné molekulové hmotnosti, přičemž z keratinoeytů βό+/+, ale nikoli z keratinoeytů βό-/-, vzniká ανβό, eož indikuje, že tyto protilátky jsou specifické pro integrin ανβό.

U protilátek CSpó a 1 ODS se testovala blokační aktivita, pomocí testu buněčné adheze s β6 transfekovanými buňkami SW480 a myšími keratinocyty, fibronektinu. Protilátky 1005 inhibovaly migraci keratinoeytů divokého typu na fibroncktin stejně, jako je možné spatřit u keratinoeytů βό-/-.

C. Test buněčné adheze

51)

Polystyrénové mikrotitrační destičky s 96 prohlubněmi, které nejsou určeny pro tkáňové kultury', se potáhly vitronektinem, fibronektinem nebo kolagenem, (popisuje se v publikaci Linbro/Titertek, Fknv Laboratories, McLean. VA), Do každé prohlubně se přidalo 100 ul roztoku, který

-6CZ 299768 B6 obsahuje různé množství matrice, a vše se inkubovalo při teplotě 37 °C po dobu jedné hodiny. Po inkubaci se prohlubně promyly PBS, pak se blokovaly 1 % BSA v DMEM bez séra při teplotě 37 °C po dobu 30 minut. Kontrolní prohlubně se naplnily 1 % BSA v DMEM. Buňky se sklidily stejným způsobem, jako při migračním testu a resuspendovaly se v KGM bez séra a pak se přidaly do každé prohlubně potažené proteinem v přítomnosti nebo za nepřítomnosti PMA. V případě blokačního experimentu se buňky před nanesením na plotnu inkubovaly s protilátkami po dobu 5 minut při teplotě 4 °C. Destičky se před inkubací po dobu I hodiny při teplotě 37 °C v atmosféře 7 % CO₂ centrifugovaly (horní stranou nahoru) při 10 x g po dobu 5 minut. Nepřiehyeené buňky odstranily eentrifugaeí při 48 x g po dobu 5 minut, přičemž destičky jsou uloženy ío horní stranou dolů. Přichycené buňky se fixovaly 1 % formaIdehydem a obarvily sc 0,5 % krystalickou violetí, pak se buňky promyly PBS. Relativní počet buněk v každé prohlubni se hodnotil stanovením absorbance při vlnové délce 595 nm na zařízení Microplate Reader (Bio-Rad).

D. Migrační test festy migrace buněk sc uskutečnily na destičkách potažených matricí s prostupnými prohlubněmi (póry o velikosti 8 μιη, Costar, Cambridge, MA). Spodní povrch membrány se potáhl kolagenem (10 pg/ml). fíbronektineni (10 pg/ml) nebo vitronektinem (10 μg/ml) v PB S po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C a blokoval se 1 % BSA. Primární kultivované keratinocyty se sklidily za použití trypsinu/EDTA a trypsin se deaktivoval sojovým inhibitorem trypsinu. Buňky se suspendovaly v KGM bez séra a nanesly se na destičky do horní komory' při hustotě 3,6 x 10⁴buněk do jedné prohlubně ve 100 μΙ kultivačního média v přítomnosti nebo v nepřítomnosti forbolmcristatacetatu (PMA. 10 ng/ml). Při inhibičních experimentech se do horní a spodní komory přidaly protilátky v přítomnosti PMA. Po 6 hodinách inkubace se buňky fixovaly 2 %

2? para forma Idehydem a obarvily se 0.5 % krystalickou violetí v 1 % forma Idehydu, Buňky v horní komoře se odstranily a určil se počet buněk na spodním povrchu při velkém zvětšení (40x). Počítalo se velké množství polí v mřížce a pro každé studované podmínky se určila průměrná hodnota.

Příklad 4: Myši $ deaktivovaným β6 vykazují omezený výskyt meta stáž v plicích.

Transgenní myší linie, u které se spontánně vyvinuly metastázy karcinomu prsu (myši MMTVmTAg) se křížily s myšmi s deaktivovaným β6. U mláďat křížených myší, kterým chybí β6. se í5 vyvinuly rychle rostoucí primární nádory prsní žlázy, ale došlo k značnému omezení výskytu a rozsahu melastáz plic ve srovnání s mláďaty, které exprimují βό. Imunohistochemie ukázala, že βύ se silně exprimuje na okrajích lézí metastáz. To naznačuje, že β6 je v tomto modelu nutný pro maximální tvorbu metastáz.

4o Protože myši s deaktivovaným β6 mají chronický záněty plic, je možné, že omezení metastáz je způsobené přítomností zánětu v plicích, což interferuje s růstem metastáz. Aby se prozkoumala tato otázka provedly se dva experimenty:

1. Buněčné linie exprimující β6 získané z primárního nádoru se zavedly injekcí do syngenních myší, které jsou buď divokého typu, nebo mají deaktivovaný β6. Metastázy plic se objevily rychle u obou typů myší, což naznačuje, že přítomnost zánětu u myší s deaktivovaným β6 neinterferuje s růstem nádorových buněk v plicích.

2. Buněčné linie získané z myší bud' s deaktivovaným β6, nebo myší divokého typu se zavedly

5(i injekcí do syngenních myší divokého tvpu. U myší, kde se zavedly buněčné linie divokého typu bez rozdílu vznikly plicní nádory, zatímco u myší, kam se zavedla buněčná linie s deaktivovaným β6, se uvedené nádory neobjevily. Tento experiment naznačuje, že β6 nádorových buněk jc v tomto systému nutný pro maximální tvorbu metastáz.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

5 1. Použití protilátky, která se specificky váže k integrinu ανβό a blokuje vazbu ligandu na íntegrin ανβό, pro výrobu léčiva na léčení fibrózy ledvin nebo jater u pacienta.
2. Použití podle nároku 1, kde protilátka se specificky váže k integrinu ανβό a blokuje vazbu ligandu na íntegrin ανβό. pro výrobu léčiva na léčení fibrózy ledvin.

o
3. Použití podle nároku 1, kde protilátka se specificky váže k integrinu ανβό a blokuje vazbu ligandu na Íntegrin ανβό. pro výrobu léčiva na léčení fibrózy jater.
4. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3. kde protilátkou je monoklonální protilátka.
5. Použití podle kteréhokoliv z nároků ! až 4, kde protilátka je určena pro terapeutické podání.
6. Použili podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, kde protilátka je určena pro profylaktické podání, o
7. Monoklonální protilátka, kterou produkuje hybridotn ATCC HB 12382.
8. Hybridom ATCC HB 12382.