CZ281507B6

CZ281507B6 - Syntetické peptidy, biologický aktivní fragment a jejich netoxické soli

Info

Publication number: CZ281507B6
Application number: CS834357A
Authority: CZ
Inventors: Nicholas Chai-Kwan Ling; Frederick Stephen Esch; Peter Bohlen; Paul Ernst Brazeau Jr.; Roger Charles Louis Guillemin
Original assignee: The Salk Institute For Biological Studies
Priority date: 1982-09-15
Filing date: 1983-06-15
Publication date: 1996-10-16
Also published as: SK435783A3; RO88703A; DK162649B; YU186683A; JPH0133118B2; DE3362003D1; DK278383D0; BG37523A3; DK278383A; US4517181A; JPS5916863A; IE55361B1; CZ435783A3; DK162649C; YU44041B; SK278537B6; ZA834051B; IE831415L; ATE17737T1; HU198952B

Abstract

Řešení se týká syntetických peptidů obecného vzorce I, jakož i biologicky aktivních fragmentů těchto látek, obsahujících alespoň prvních 27 zbytků aminokyselin a netoxických solí těchto sloučenin. ŕ

Description

Vynález se týká syntetických peptidů, které ovlivňují funkci hypofýzy u lidí a dalších savců tak, že podporujíí uvolňování růstového hormonu. Vynález se rovněž týká jejich aktivních fragmentů a netoxických solí.

Dosavadní stav techniky

Již po roce 1950 bylo známo, že hypothalamus ovlivňuje všechny sekreční funkce hypofýzy. Šlo o neurohumorální typ řízení, při němž specializované neurosekretorické neurony hypothalamu produkují zvláštní polypeptidy, které řídí krátkodobě i dlouhodobě sekreci každého hypofyzárního hormonu. K dnešnímu dni byl faktor, který řídí uvolňování thyreotropinu a prolaktinu, nazván tripeptidem TRF, sloučenina pro gonadotropiny, a to pro luteinizační hormon a folikulostimulační hormon, je nazývána dekapeptidem LRF, LH-RH, GnRH nebo Gn-RF. Pro hormony beta-endorfin a adrenokortikotropin jde o polypeptid se 41 aminokyselinami, nazývaný CRF. Mimoto byl zjištěn také inhibiční faktor, který působí inhibici sekrece růstového hormonu. Všechny tyto faktory včetně sómatostatinu bylo možno syntetizovat a byly připraveny také analogy přirozených látek, které mají často větší účinnost než látky přírodní.

Až dosud nebyl charakterizován odpovídající faktor pro růstový hormon nebo somatotropin, přestože fyziologické a klinické důkazy pro jeho existenci byly zřejmé. Jedním z hlavních problémů izolace a charakterizace faktoru, který uvolňuje růstový hormon (dále GRF), spočívá v tom, že účinný peptid je patrně přítomen v každé části hypothalamu v nesmírně malém množství, které je patrné řádu 50 až 150 femtomolů. Je to množství daleko nižší než jaké bylo kdy propočítáno pro ostatní faktory. Důvod je patrně ten, že hypothalamický GRF má výjimečně velkou účinnost.

Další problém při izolaci hypothalamického GRF spočívá v tom, že v hypothalamických extraktech se nachází velké množství somatostatinu, který ruší jakékoli biologické pokusy. V průběhu několika minulých let několik laboratoří prohlásilo, že se jim podařilo izolovat hypothalamický GRF. Vždy šlo o artefakty, jak bylo později prokázáno v publikacích Schally A. V. S. a další, J. Biol. Chem., 246, 6647, 1971, Veber D. F. a další, Biochem. Biophys. Res. Commun., 45, 235, 1971. Tyto nesprávné výsledky jsou patrné způsobeny obtížemi při biologickém stanovení.

Nyní byl izolován polypeptid se 44 zbytky aminokyselin z nádoru Langerhansových ostrůvků, tento polypeptid byl čištěn, charakterizován a chemicky syntetizován a zkoušen a bylo prokázáno, že uvolňuje růstový hormon (GH) z hypofýzy. Šlo o peptid s řetězcem

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-1CZ 281507 B6

-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH₂.

Patrné jde o látku pankreatického původu, která uvolňuje růstový hormon, tato látka byla nazvána PGRF a také somatokrinin. Současné byly izolovány také další dva vysoce čištěné peptidy, které rovněž způsobují uvolňování růstového hormonu a které byly označeny jako PGRF (1-37) volná kyselina a PGRF (1-40) volná kyselina. Tyto peptidy je možno užít k podpoře růstu teplokrevných živočichů i studenokrevných živočichů v zemědělství.

PGRF je možno zpracovat na farmaceutické prostředky, užít je možno i jeho analogy nebo biologicky účinné fragmenty, netoxické soli a podobné, dispergované ve farmaceuticky přijatelné kapalině nebo v pevném nosiči. Tyto prostředky je možno užít v lidském i veterinárním lékařství krátkodobé i dlouhodobě k diagnostickým i léčebným účelům.

Nomenklatura, užitá při pojmenování peptidů, je v souhlase s publikací Schroder a Lubke, The Peptides, Academie Press (1965), v níž v, souladu s běžným názvoslovím se aminoskupina N-terminálního zakončeni nachází vlevo a karboxylové skupina na C-zakončení vpravo. V případě, že aminokyselina má izomerní formu, běží o L-formu užité aminokyseliny, neni-li výslovně uvedeno jinak.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří syntetické peptidy obecného vzorce I

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R₃₄-Asn-Gln-Glu-R₃₈Gly-R₄Q-R₄^-R, kde

R znamená skupinu OH nebo NH₂,

^R34	znamená	Ser	nebo	Ala,
^R38	znamená	Arg	nebo	Ser,
^R40	znamená	Ala	nebo	Arg a

R₄₁ znamená Arg, Arg-Ala, Arg-Ala-Arg, Arg-Ala-Arg-Leu, nebo chybí, jakož i biologicky aktivní fragmenty těchto látek, obsahují alespoň prvních 27 zbytků aminokyselin a jejich netoxické soli.

Podstatu vynálezu tvoří rovněž biologicky aktivní fragment syntetického peptidu obecného vzorce I podle nároku 1, obsahující řetězec aminokyselin

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-,

-2CZ 281507 B6 zejména sloučeniny ze skupiny biologicky aktivních fragmentů ze skupiny (a) H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Aso-Ile-Met-OH.

(b) H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-OH.

(c) H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-OH.

(d) H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-OH.

(e) H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-OH.

(f) H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-OH.

(g) H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH₂.

(h) H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ala-Asn-Gln-Glu-Ser-Gly-Arg-OH- (i) H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-NH₂.

(j) H-Tyr-Ala-Asp-AIa-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-OH.

(k) H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-NH₂.

a také netoxické soli těchto peptidů a jejich fragmentů.

Peptidy se s výhodou připravují v pevné fázi, tak jak bylo popsáno v publikaci Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85, str. 2149, 1963, přestože je možno užit i jiných způsobů chemické syntézy. Syntéza v pevné fázi se začíná od C-terminálního zakončení tak, že se naváže chráněná alfa-aminokyselina na vhodnou pryskyřici. Tento výchozí materiál je možno získat tak, že se esterovou

-3CZ 281507 B6 vazbou naváže chráněná alfa-aminokyselina Leu nebo Ala na chlormethylovanou nebo hydroxymethylovanou pryskyřici, nebo amidovou vazbou na pryskyřici BHA nebo MBHA.

Volba ochranné skupiny na aminoskupině není kritická, musí však jít o skupinu, která není odstraněna v průběhu odstranění ochranné skupiny na alfa-aminoskupině při syntéze. Znamená to, že ochranná skupina na alfa-aminoskupiné a na postranním řetězci nemůže být totožná.

Při volbě ochranné skupiny na určitém postranním řetězci při syntéze peptidů je třeba zachovávat následující pravidla:

a) ochranná skupina má být stálá vzhledem k reakčnímu činidlu a za reakčních podmínek při odstraňování ochranné skupiny na alfa-aminoskupiné ve všech stupních syntézy,

b) ochranná skupina si musí zachovat své vlastnosti a nesmí být odštěpena v průběhu vazby a

c) ochranná skupina na postranním řetězci musí být odstraněna po ukončeni syntézy za reakčních podmínek, při nichž nebude poškozen peptidový řetězec.

Příprava hydroxymethylováné pryskyřice je popsána v publikaci Bodansky a další, Chem. Ing., (Londýn), 38, 1597 až 1598, 1966. Chlormethylované pryskyřice běžně dodávají Bio-Rad Laboratories Richmond, Kalifornie a Lab. Systems, lne. Příprava této pryskyřice byla popsána v publikaci Stewart a další, Solid Phase Peptide Synthesis, (Freeman a Co., San Francisco 1969, kapitola 1, str. 1 až 6. BHA a MBHA pryskyřice se běžné dodávají a používají se pouze v tom případě, že požadovaný peptid obsahuje alfa-karboxamid na C-terminální zakončení.

Ala, chráněný BOC se naváže na chlormethylovanou pryskyřici způsobem podle publikace Monahan a Gilon, Bipolymer 12, str. 2513 až 2519, 1973 v případě, že je požadován například peptid o 40 aminokyselinách. Po vazbě BOC-Ala na pryskyřici se odstraní ochranná skupina na alfa-aminoskupiné, například kyselinou trifluoroctovou (TFA), v methylenchloridu, TFA samotnou nebo kyselinou chlorovodíkovou v dioxanu. Ochranná skupina se odstraní při teplotě 0 °C až teplotě místnosti. Je možno také užít další běžná činidla k odstranění ochranné skupiny na alfa-aminoskupiné, tak jak byla popsána v publikaci Schroder a Lubke, The Peptides, 1, str. 72 až 75 (Academie Press 1965).

Po odstranění ochranné skupiny na alfa-aminoskupiné Ala se postupně navazují zbývající chráněné aminoskupiny v požadovaném pořadí za vzniku meziproduktu, tak jak byl svrchu definován, nebo je možno některé aminokyseliny vázat před syntézou a teprve potom je připojit k výslednému produktu. Příslušné činidlo pro navázání aminokyselin se volí v souladu s pravidly, která se v oboru běžně dodržuji. Zvláště vhodným činidlem je N,N'-dicyklohexylkarbodiimid (DCCI).

Aktivační činidla, užívaná při syntéze peptidů na pevné fázi, jsou dobře známá. Příkladem vhodným aktivačních činidel mohou být:

-4CZ 281507 B6

1) karbodiimidy, například Ν,Ν'-diisopropylkarbodiimid, N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimid,

2) kyanamidy, například N,N'-dibenzylkyanamid,

3) ketimidy,

4) isoxazoliové soli, například N-ethyl-5-fenylisoxalium-3¹ -sulfonát,

5) monocyklické heterocyklické amidy aromatické povahy s obsahem 1 až 4 atomů dusíku v kruhu, například imidazolidy, pyrazolidy a 1,2,4-triazolidy, specifickými heterocyklickými amidy pro toto použití jsou N,N'-karbonyldiimidazol a N,N'-karbonyl-di-1,2,4-triazol,

6) alkoxylovaný acetylen, například ethoxyacetylen,

7) reakční činidla, která tvoří směsný anhydrid s karboxylovou skupinou aminokyseliny, například ethylchlormravenčan a isobutylchlormravenčan, a

8) reakční činidla, která tvoří s karboxylovou skupinou aminokyseliny aktivní ester, například heterocyklické sloučeniny s obsahem dusíku, které nesou na jednom dusíkovém atomu kruhu hydroxyskupinu, například N-hydroxyftalimid, N-hydroxysukcinimid a 1-hydroxybenzotriazol (HOBT).

Další aktivační činidla a jejich použití při vazbě peptidů jsou popsána v publikaci Schrodera a Lubkeho, tak jak byla svrchu uvedena v kapitole III a v publikaci Kappor J., Pharm. Sci., 59, str. 1 až 27, 1970.

Každá chráněná aminokyselina nebo řetězec aminokyselin se přivádí při syntéze na pevné fázi ve dvojnásobném nebo vyšším přebytku, vazba se provádí v prostředí směsi dimethylformamidu (DMF) a methylenchloridu v poměru 1 : 1, nebo v samotném dimethylformamidu nebo methylenchloridu. V případě, že dojde k neúplné vazbě, je třeba vazbu opakovat před odstraněním ochranné skupiny na alfa-aminoskupině a před vazbou další aminokyseliny. Úspěch reakce v každém stupni je možno sledovat ninhydrinovou reakcí podle publikace E. Kaiser a další, Anal. Biochem., 34, 595, 1970.

Po získání požadovaného řetězce aminokyselin se peptid, který je meziproduktem, odstraní z pryskyřice reakčním činidlem, například fluoridem vodíku, který štěpí peptid od pryskyřice a současně odštěpí všechny zbývající ochranné skupiny na postranním řetězci a také ochrannou skupinu na alfa-aminoskupiné za vzniku výsledného peptidu.

Meziprodukt je možno oddělit od pryskyřice také alkoholem a pak se C-terminální alkylester převede na kyselinu hydrolýzou. Ochranné skupiny na postranním řetězci je možno odštěpit jako svrchu, nebo například katalytickou redukcí při použití palladia nebo síranu barnatého. Při použití fluorovodíku se do reakční směsi přidává anisol a methylethylsulfid jako činidlo, pohlcující kyselinu.

-5CZ 281507 B6

V následujících příkladech bude popsán výhodný způsob syntézy PGRF na pevné fázi. Syntézu kratšího fragmentu peptidu je možno uskutečnit stejně tak, že se oddělí určitý počet aminokyselin na některém konci řetězce, biologicky účinné fragmenty by však měly obsahovat řetězec, uvedený na N-zakončení.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Syntézu PGRF (1 až 44) ve formě volné kyseliny vzorce

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-OH je možno uskutečnit postupně při použití přístroje Beckman 990 Peptide Synthesizer na chlormethylované pryskyřici, tak jak se dodává například z Lab Systems, lne., s obsahem 0,9 Meq Cl/g. Vazba BOC-Leu na pryskyřici se provádí podle publikace Monahana a dalších, Biopolymers, svazek 12 (1973) strany 2513 až 2519, a výsledek je substituce 0,22 mmol Leu na gram pryskyřice. Všechna použitá rozpouštědla se předem promyjí inertním plynem, s výhodou heliem, aby bylo jisté, že neobsahuji kyslík, který by mohl nežádoucím způsobem oxidovat síru na zbytku Met.

Po odstranění ochranné skupiny a neutralizaci se postupně buduje na pryskyřici peptidový řetězec. Odstranění ochranné skupiny, neutralizace a přidání každé aminokyseliny se provádí podle publikace Guillemin a další, US patentový spis č. 3 904 594. Specifické podmínky vazby jsou uvedeny v následující tabulce:

Stupeň Reakční činidlo a postup Doba míšeni v minutách

1	Promytí methylenchloridem (2x)	0,5
2	50% kyselina trifluoroctová (TFA) + 5% 1,2-ethandithiol v methylenchloridu (lx)	0,5
3	50% kyselina trifluoroctová + 5% 1,2-ethandithiol v methylenchloridu (lx)	20,0
4	promytí methylenchloridem (3x)	0,5
5	promytí methanolem (2x)	0,5
6	10% triethylamin (Et^N) v methylenchloridu, neutralizace (2x)	0,5
7	promytí methanolem (2x)	0,5
8	10% triethylamin v methylenchloridu, neutralizace (2x)	0,5
9	promytí methanolem (2x)	0,5

-6CZ 281507 B6 promytí methylenchloridem (2x)0,5

BOC-aminokyselina (1 mmol/g prys- kyřice) a ekvivalentní množství dicyklohexylkarbodiimidu v methylenchloridu120 promytí methylenchloridem (lx)0,5

50% dimethylformamid v methylenchloridu (2x)0,5

10% triethylamin v methylenchloridu (lx)0,5 methanol (2x)0,5 methylenchlorid (2x)0,5

25% anhydrid kyseliny octové v methylenchloridu (2 ml/g pryskyřice)20,0 promytí methylenchloridem (2x)0,5 promytí methanolem (2x)0,5 * Při vazbě Asn a Gin se užije 1,136 molární přebytek 1-hydroxybenzotriazolu v tomto stupni.

Při vazebné reakci se obvykle užívá 1 mol aminokyseliny, chráněné BOC v methylenchloridu na gram pryskyřice a 1 ekvivalent 0,5 molárniho dicyklohexylkarbodiimidu v methylenchloridu nebo 30% dimethylformamid v methylenchloridu po dobu 2 hodin. Při vazbě Arg se užívá směs 10% dimethylformamidu s methylenchloridem. Bzl se užívá jako ochranná skupina na hydroxylové skupině postranního řetězce pro Ser a Thr. 2-Chlorbenzyloxykarbonyl (2C1-Z) se užívá jako ochranná skupina pro postranní řetězec Lys. Tos se užívá k ochraně guanidinové skupiny Arg a karboxylová skupina Glu nebo Asp se chrání jako Bzl ester. Fenolová hydroxylová skupina Tyr se chrání 2,6-dichlorbenzylovou skupinou. Na konci syntézy se získá následující produkt:

X°-Tyr(X²)-Ala-Asp(X³)-Ala-Ile-Phe-Thr(X⁴)-Asn-Ser(X⁵)-Tyr(X²)-Arg(X⁶)-Lys(X⁷)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser(X⁵-Ala-Arg(X⁶)-Lys(X⁷)-Leu-Leu-Gln-Asp(X³)-Ile-Met-Ser-(X⁵)-Arg(X⁶)-Gln-Gln-Gly-Glu(X³)-Ser-(X⁵)-Asn-Gln-Glu(X³-Arg(X⁶)-Gly-Ala-Arg(X⁶)-Ala-Arg(X⁶)-Leu-X⁸

kde
X¹	znamená	BOC,
X²	znamená	2,6-dichlorbenzyl,
X³	znamená	benzylester,
X⁴	znamená	Bzl,

-7CZ 281507 B6

X⁵ znamená Bzl,

X⁶ znamená Tos,

X⁷ znamená 2C1-Z a

Q

X znamena -0-CH₂-benzenpolystyrenová pryskyřice jako pevná fáze.

Po navázání posledního zbytku Tyr na pryskyřici se odstraní skupina BOC působením 45% TFA v methylenchloridu. K odštěpení zbytku řetězce a odstranění ochranných skupin se přidá 1,5 ml anisolu, 0,25 ml methylethylsulfidu a 10 ml fluorovodíku na 1 g peptidú, vázaného na pryskyřici, při teplotě -20 “C se nechá reakční směs stát půl hodiny a pak ještě půl hodiny při teplotě 0 ’C. Fluorovodík se odstraní ve vakuu a zbytek peptidú, vázaného na pryskyřici, se střídavě promývá bezvodým diethyletherem a chloroformem, načež se peptid extrahuje 2 N vodným roztokem kyseliny octové, zbaveným plynů. Lyofilizací tohoto extraktu se získá bílý vločkovitý materiál.

Odštěpený peptid, zbavený ochranných skupin, se pak rozpustí ve 30% kyselině octové a zfiltruje se na vrstvě Sephadexu G-50.

Peptid se pak dále čistí iontoměničovou chromatografii na karboxymethylcelulóze CM-32 (Whatman), sloupec má rozměry 1,8x18 cm, objem vrstvy 50 ml, užije se gradientu, který vzniká tak, že se po kapkách přidává 1 litr 0,4 M octanu amonného o pH 6,5 do mísící baňky s obsahem 400 ml 0,01 M octanu amonného o pH 4,5. Konečné čištění se provádí chromatografií na Sephadexu G-50 (Pharmacia) při použití směsi n-butanolu, ethanolu, pyridinu a 0,2% octanu amonného v objemovém poměru 4:1:1:7. Podrobnosti, týkající se čištěni, jsou obecné uvedeny v publikaci Ling a další, Biochem. Biophys Res. Commun 95, 945 (1980). Chromatograf ické frakce se sledují chromatografií na tenké vrstvě a spojí se pouze frakce s dostatečnou čistotou.

Analýza aminokyselin se provádí hydrolýzou v uzavřených trubicích způsobem podle Anal. Biochem., 126, 144 až 156 (1982) při použití analyzátoru aminokyselin Liquimat III k ověřeni správného sledu s následujícím výsledkem:

Asx(2,63), Thr(0,75), Ser(3,5), Glx(6,83), Gly(2,87), Ala(5,10), Val(0,9), Met(l,23), Ile(l,84), Leu(5,045), Tyr(2,09), Phe(0,91), Lys(2,31) a Arg(6,61).

Analýza ověřila správnost sledu.

Příklad 2

Syntéza PGRF (1 až 40) vzorce:

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-OH

-8CZ 281507 B6 se provádí postupné při použiti zařízení Beckman 990 Peptide Synthesizer na chlormethylované pryskyřici způsobem podle příkladu 1. Při chromatografii na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografii je získaný peptid v podstatě čistý.

Analýza aminokyselin byla prováděna po hydrolýze k ověření správnosti sledu s následujícím výsledkem:

Asx(3,89), Thr(0,88), Ser(3,66), Glx(7,04), Gly(3,07),

Ala(4,02), Val(0,96), Met(l,01), Ile(l,86), Leu(4,28), Tyr(2,0), Phe(0,86), Lys(2,24) a Arg(4,15).

Analýza potvrdila správnost sledu.

Příklad 2A

Syntéza PGRF (1 až 34) ve formě volné kyseliny vzorce:

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-OH se provádí postupně způsobem podle příkladu 1 při použití přístroje Beckman 990 Peptide Synthesizer na chlormethylované pryskyřici. Při chromatografii na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografii je produkt v podstatě čistý.

Asx(2,87), Thr(0,78), Ser(3,78), Glx(5,ll), Gly(l,93),

Ala(3,03), Val(0,88), Met(0,96), Ile(l,88), Leu(4,14), Tyr(2,05), Phe(l,07), Lys(2,29) a Arg(3,22).

Analýza potvrdila správnost sledu.

Přiklad 2B

Syntéza PGRF (1 až 31) ve formě volné kyseliny vzorce

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-OH se provádí postupně při použití přístroje Beckman 990 Peptide Synthesizer na chlormethylované pryskyřici způsobem podle příkladu 1. Při chromatografii na tenké vrstvě a při vysokotlaké kapalinové chromatografii je peptid v podstatě čistý.

Analýza aminokyselin se provádí po hydrolýze k ověření správného sledu s následujícím výsledkem:

Asx(2,73), Thr(0,75), Ser(2,77), Glx(3,95), Gly(0,98),

-9CZ 281507 B6

Ala(3,06), Val(0,80), Met(0,98), Ile(l,77), Leu(4,28),

Tyr(2,23), Phe(l,14), Lys(2,34) a Arg(3,22)

Analýza potvrdila správnost sledu.

Příklad 2C

Syntéza PGRF (1 až 28) ve formě volné kyseliny vzorce

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-OH se provádí postupně způsobem podle příkladu 1 při použití přístroje Beckman 990 Peptide Synthesizer na chlormethylované pryskyřici. Při chromatografií na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografii je peptid v podstatě čistý.

Analýza aminokyselin byla prováděna po hydrolýze k ověření správného sledu s následujícím výsledkem:

Asx(2,66), Thr(o,83), Ser(2,6S), Glx(l,98), Gly(0,81),

Ala(2,89), Val(0,90), Met(l,15), Ile(l,72), Leu(4,14), Tyr(2,43), Phe(l,58), Lys(2,15) a Arg(2,19).

Analýza potvrdila správnost sledu.

Příklad 3

Syntéza PGRF (1 až 44) amidu vzorce:

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH₂ se provádí postupné při použití přístroje Beckman 990 Peptide Synthesizer na pryskyřici MBHA způsobem podle příkladu 1. Při chromatografii na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatograf ii je výsledný peptid v podstatě čistý.

Analýza aminokyselin se provádí po správnosti sledu s následujícím výsledkem:

hydrolýze k ověření

Asx(3,75), Thr(0,80), Ser(3,60), Glx(6,98), Gly(3,16), Ala(5,04), Val(0,77), Met(l,02), Ile(l,79), Leu(5,41), Tyr(2,03), Phe(0,84), Lys(2,39) a Arg(6,43).

Analýza potvrdila správnost sledu.

-10CZ 281507 B6

Příklad 4

Syntéza PGRF analogu vzorce:

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ala-Asn-Gln-Glu-Ser-Gly-Arg-OH se provádí postupné při použití přístroje Beckman 990 Peptide Synthesizer na chlormethylované pryskyřici (například Lab. Systems, lne.) způsobem podle příkladu 1. Při chromatografii na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografii je výsledný peptid v podstatě čistý.

Asx(4,35), Thr(l,06), Ser(3,80), Glx(7,53), Gly(2,96),

Ala(4,05), Val(0,97), Met(0,86), Ile(l,94), Leu(3,70), Tyr(2,05), Phe(l,06), Lys(2,06) a Arg(3,53).

Analýza potvrdila správnost sledu.

Příklad 5

Syntéza PGRF (1 až 40) amidu vzorce:

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-NH₂ se provádí postupné při použiti přístroje Beckman 990 Peptide Synthesizer na pryskyřici MBHA způsobem podle příkladu 1. Při chromatografii na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatograf ii je peptid v podstatě čistý.

Analýza aminokyselin byla prováděna po hydrolýze k ověření správnosti sledu. Byly získány následující výsledky:

Asx(3,76), Thr(0,88), Ser(3,68), Glx(6,89), Gly(3,12), Ala(4,08), Val(0,88), Met(l,36), Ile(l,76), Leu(4,24), Tyr(2,00), Phe(0,80), Lys(2,32) a Arg(4,16).

Analýza potvrdila správnost sledu.

Příklad 6

Syntéza PGRF (1 až 37) ve formě volné kyseliny vzorce

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-OH

-11CZ 281507 B6 se provádí postupně při použití přístroje Beckman 990 Peptide Synthesizer na chlormethylované pryskyřici způsobem podle příkladu 1. Při chromatografii na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografii je peptid v podstatě čistý.

Aminokyselinová analýza se provádí po hydrolýze k ověření správnosti sledu s následujícím výsledkem:

Asx(3,92), Thr(o,79), Ser(3,62), Glx(7,05), Gly(l,97),

Ala(3,17), Val(1,03), Met(1,0), Ile(l,91), Leu(4,37), Tyr(l,86), Phe(0,76), Lys(2,15) a Arg(3,40).

Analýza potvrdila správnost sledu.

Příklad 6A

Syntéza PGRF (1 až 37) amidu vzorce:

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-NH₂ se provádí postupné při použití přístroje Beckman 990 Peptide Synthesizer na pryskyřici MBHA způsobem podle příkladu 1. Při chromatografii na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatograf ii je peptid v podstatě čistý.

hydrolýze k ověření

Asx(4,02), Thr(0,80), Ser(3,49), Glx(6,90), Gly(l,92), Ala(3,08), Val(l,05), Met(l,01), Ile(l,77), Leu(4,05), Tyr(2,02), Phe(1,14), Lys(2,50) a Arg(3,27).

Analýza potvrdila správnost sledu.

Příklad 7

Ke stanovení účinnosti uvedených peptidů při uvolňování růstového hormonu byly prováděny pokusy in vitro při použití syntetického PGRF (1 až 40) z příkladu 2 a současně s ekvimolární koncentrací extrahovaného a čištěného nativního PGRF (1 až 40) a GRF standardu se známým účinkem. GRF standard je popsán a definován v publikaci Brazeau a další, Endocrinology, sv. 110, A538 (1982) jako to množství preparátu krysího hypotalamu, které vyvolává polovinu maximální odpovědi ve smyslu uvolnění růstového hormonu z buněk hypofýzy, pěstované v jedné vrstvě. Užívají se kultury buněk krysí hypofýzy, odebrané před čtyřmi nebo pěti dny. Užívají se pro srovnání kultury v definovaném standardním prostředí a kultury, které jsou považovány za optimální pro sekreci růstového hormonu, způsob byl popsán v publikaci Brazeau a další, Regulátory Peptides, 1, 255, 1981. Zkoumaná látka se inkubuje s buňkami 3 až 4 hodiny, pak se odebere určitá část živného prostředí a méří se obsah imunoreaktivního GH (ir GH) radioimunologickým způsobem.

-12CZ 281507 B6

Výsledky tohoto srovnáni ukazuji, že při použití v ekvimolárním množství má syntetický PGRF (1 až 40) plnou biologickou účinnost nativního peptidu, jak je zřejmé z tabulky I. ED₅₀ pro syntetický peptid je přibližně 113 pikogramů, to znamená, že tato látka je daleko účinnější než jakákoli jiná molekula, dříve uznávaná za faktor, uvolňující růstový hormon.

Tabulka I

GRF standard Sekrece růstového hormonu in

(j ednotky)	vitro (%	kontrol)
0,63	173 ±	0,4
1,25	230 ±	5
2,50	347 ±	13
5,00	474 ±	3
10,00	674 ±	6
Nativní PGRF (1	až 40)
(femtomoly)
12,5	234 ±	17
25	351 ±	7
50	528 ±	16
100	720 ±	32
200	748 ±	7
Syntetický PGRF	(1 až 40)
(femtomoly)
10	269 ±	20
100	701 ±	6
1000	990 ±	42

Kromě pokusů in vitro byly prováděny také pokusy in vivo tak, že byl syntetický peptid injekčné podán normálním krysím samcům o hmotnosti 200 g, v pentobarbitálové narkóze. Výsledky, uvedené v následující tabulce II ukazují, že syntetický peptid PGRF je silným stimulátorem sekrece hypofyzářního růstového hormonu.

-13CZ 281507 B6

Tabulka II

Účinky syntetického PGRF (1 až 40) na uvolňování růstového hormonu hypofýzy po nitrožilní injekci normální kryse (4 zvířata na jednu dávku)

Dávka v pg Odpověď jako hladina ir-GH v séru v ng/ml v uvedenou dobu před a po injekci

-1 min +5 min +10 min +15 min +30 min +60 min

0	173 +	47	251 i	81	339 + 139	396 + 121	749 + 440	316 +	76
0,01	173 +	23	284 +	20	238 + 51	201 + 47	261 + 50	299 +	25
0,1	276 +	126	694 +	246	582 + 290	758 + 562	280 + 70	424 +	129
1,0	142 +	24	4551 +	1825	1748 + 564	730 + 158	234 + 53	267 +	129
10,0	234 +	76	7077 +	1943	4676 + 585	2464 + 378	616 + 112	223 i	26

Další pokusy ukázaly, že syntetický analog PGRF z příkladu 4 má přibližně stejnou biologickou účinnost jako nativní PGRF (1 až 40) a totéž platí pro syntetické fragmenty z příkladů 6 a 6a. Mimoto PGRF (1 až 40) peptid s α-karboxamidovou skupinou na C-terminálním konci z příkladu 5 má v podstatě dvojnásobnou biologickou účinnost než syntetický peptid, zkoumaný v příkladu 7.

Příklad 8

Byly opakovány pokusy in vitro z přikladu 7 při použiti nativního PGRF (1 až 40) a nativního PGRF (1 až 44) a výsledky prokázaly, že nativní PGRF (1 až 44) má více než dvojnásobnou biologickou účinnost.

Další pokusy prokázaly, že volný syntetický PGRF (1 až 44) podle příkladu 1 má poněkud nižší účinnost než nativní PGRF (1 až 44), avšak syntetický PGRF (1 až 44) amid má v podstatě tutéž účinnost jako nativní PGRF (1 až 44). Syntetický PGRF (1 až 44) amid při podání laboratorním zvířatům (krysám) parenterálně má tentýž typ účinnosti jako PGRF (1 až 40) v tabulce II příkladu 7, je však 2,5 až 3,0 x účinnější než PGRF (1 až 40) ve formě volné kyseliny.

V USA se ročně narodí jeden hypofyzární trpaslík na 7000 až 15 000 narozených dětí, což znamená, že tyto děti jsou příliš malé z toho důvodu, že mají příliš nízkou hladinu hypofyzárního růstového hormonu v krvi. Podle klinických výsledků je možno předpokládat, že většina těchto nemocných dětí má normální hypofýzu a vada spočívá v tom, že nedochází v dostatečné míře k syntéze nebo sekreci hypotalamického faktoru, který řídi uvolňování růstového hormonu. Syntetický PGRF by mohl být ideálním prostředkem pro tyto nemocné, kteří byli dříve léčeni injekcemi lidského hypofyzárního růstového hormonu, který je nesmírně drahý a obtíž

-14CZ 281507 B6 ně se získává, protože je možno jej získat pouze z lidského pitevního materiálu. Lidský růstový hormon bude patrně možno také v budoucnosti připravit při použití rekombinantní DNA, dosud však není dostupný. Syntetický PGRF má daleko jednodušší molekulu a mohl by vyřešit problém všech lidí s nedostatečnou činností hypofýzy na světě, kterých se odhaduje na několik set tisíc.

Syntetický PGRF je první známou molekulou, která specificky ovlivňuje činnost hypofýzy, pokud jde o vylučování růstového hormonu a znamená tedy také možnost prvního běžného testu na sekreci růstového hormonu ve všech případech, kde se předpokládá specifická nedostatečnost hypofýzy v tomto smyslu. Tato látka by tedy mohla nahradit dosavadní pracné metody, jako je zjišťování možnosti sekrece růstového hormonu pomocí infuzí argininu, hypoglykemie, injekcí L-DOPA a podobně.

Syntetický PGRF by měl být použit ve všech případech, kdy je žádoucí dosáhnout pozitivní dusíkové bilance, například při léčení ran, léčbě rozsáhlých popálenin, v období po velkých operačních výkonech a také ve stáří, stejně jako u předčasně narozených děti. Zvyšování sekrece růstového hormonu má význam také u nemocných po ozáření při léčbě nádorů, v tomto případě zvýšení hladiny růstového hormonu podporuje krvetvorný systém. Při podávání u lidí mají mít syntetické peptidy PGRF čistotu alespoň 93 %, s výhodou 98 %. Tato čistota znamená, že zbytek tvoří pouze podobné peptidy nebo jejich fragmenty.

Většina biologicky aktivních peptidů má obvykle kromě požadované účinnosti ještě další biologický účinek. Je tedy možné, že PGRF bude mít ještě další účinek, který by mohl mít praktický význam. Přestože však byl PGRF extrahován a izolován z nádoru lidské slinivky břišní, je zcela zřejmé, že sled aminokyselin v PGRF (1 až 44) amidu je tentýž, jako sled v lidském hypotalamickém faktoru pro uvolňování růstového hormonu.

Chronické podávání syntetického PGRF hospodářským zvířatům nebo jiným teplokrevným zvířatům patrné zvýší jejich anabolismus a zvýší tedy jejich hmotnost ve prospěch svalové hmoty. Výhledově by bylo patrné možné také užití u ryb a dalších studenokrevných živočichů. U zvířat je možno připustit nízkou čistotu, dostačuje například pouze 5 %.

Syntetický PGRF nebo jeho netoxické soli je možno zpracovávat s nosiči, přijatelnými z farmaceutického hlediska, na farmaceutické prostředky, které je možno podávat savcům včetně lidí nitrožilné, podkožně, nitrosvalové nebo perorálně. Potřebná dávka se stanoví v závislosti na závažnosti chorobného stavu, na jeho povaze a také s ohledem na trvání léčby.

Svrchu uvedené peptidy je možno podávat také ve formě netoxických solí, přijatelných z farmaceutického hlediska, například adičních soli s kyselinami, nebo komplexů s kovy, například zinkem, železem a podobně, tyto komplexy jsou rovněž považovány za soli. Příkladem adičních soli s kyselinami mohou být hydrochloridy, hydrobromidy, sírany, fosforečnany, maleáty, octany, citronany, benzoáty, jantarany, jablečnany, askorbáty, vinnany a podobné. V případě, že se účinná látka zpracovává na tablety, mohou tyto tablety obsahovat pojivo, například tragakant, kukuřičný

-15CZ 281507 B6 škrob nebo želatinu, činidlo, napomáhající vzniku rozpadu, například kyselinu alginovou, a kluzné látky, například stearan hořečnatý. Při podání v kapalné formě je možno použít sladidla a/nebo jiné chuťové látky, při nitrožilním podání se látka rozpustí v isotonickém roztoku chloridu sodného, v roztoku fosfátového pufru nebo v jiném vhodném injekčním prostředí.

Uvedené peptidy by měly být podávány pod vedením lékaře, farmaceutické prostředky obsahují tyto peptidy obvykle spolu s nosičem, přijatelným z farmaceutického hlediska. Obvyklá dávka se pohybuje v rozmezí 20 až 2000 ng uvedeného peptidu na 1 kg hmotnosti.

Přestože byl vynález popsán v souvislosti s výhodnými provedeními, je zřejmé, že odborník může provést různé změny a modifikace, které nevybočují z oboru vynálezu. Je například možno provést některé modifikace řetězce, který obsahuje 44 zbytků, zvláště je možno vynechat některé části sledu v blízkosti koncové karboxylové skupiny uvedeného peptidu, tak jak se to v současné době běžné provádí, v tomto případě se získávají fragmenty o kratší délce než 40 zbytků, jde například o PGRF (1 až 27), tyto fragmenty obvykle nesou na C-terminálním zakončení skupinu NH₂ nebo OH a uchovávají si velmi podstatnou část účinnosti svrchu uvedených peptidů. Tyto peptidové fragmenty rovněž spadají do oboru vynálezu. Mimoto je možno přidávat zbytky na kterémkoli konci nebo na obou koncích a/nebo je možno obecně ekvivalentní zbytky zavést místo přírodně se vyskytujících zbytků, tak jak je to dobře známo v chemii peptidů za vzniku analogických sloučenin, které mají alespoň podstatnou část účinnosti nativního polypeptidu. Všechny tyto modifikace rovněž spadají do oboru vynálezu.

Claims

1. Syntetické peptidy obecného vzorce I

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp- (I) -Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R₃₄”Asn-Gln-Glu-R₃₈Gly~R₄Q-R₄₃-R, kde

R znamená skupinu OH nebo NH₂,

R₃₄ znamená Ser nebo Ala,

R₃₈ znamená Arg nebo Ser,

R₄₀ znamená Ala nebo Arg a

R₄₁ znamená Arg, Arg-Ala, Arg-Ala-Arg, Arg-Ala-Arg-Leu, nebo chybí, jakož i biologicky aktivní fragmenty těchto látek, obsahující alespoň prvních 27 zbytků aminokyselin a jejich netoxické soli.

2. Syntetické peptidy obecného vzorce I podle nároku 1, v nichž R₃₄ znamená Ser, R₃₈ znamená Arg a R₄₀ znamená Ala.

3. Syntetické peptidy obecného vzorce I podle nároku 1, v nichž R₃₄ znamená Ala, R₃₈ znamená Ser a R₄₀ znamená Arg.

4. Syntetické peptidy obecného vzorce I podle některého z nároků 1 až 3, v nichž R₄₁ znamená Arg-Ala-Arg-Leu.

5. Syntetické peptidy obecného vzorce I podle některého z nároků 1 až 4, v nichž R znamená skupinu NH₂.

6. Syntetické peptidy obecného vzorce I podle některého z nároků 1 až 4, v nichž R znamená hydroxyskupinu.

7. Syntetický peptid obecného vzorce I podle nároku 1,

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-OH.

8. Biologicky aktivní fragment syntetického peptidu obecného vzorce I podle nároku 1, obsahující řetězec aminokyselin

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-.

9. Biologický aktivní fragment podle nároku 8, ze skupiny (a) H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Aso-Ile-Met-OH.

-17CZ 281507 B6 (b) H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-OH.

(h) H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ala-Asn-Gln-Glu-Ser-Gly-Arg-OH.

(i) H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-NH₂.

(j) H-Tyr—Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr—Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-OH.

(k) H-Tyr—Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser—Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser—Asn-Gln-Glu-NH₂.

10.Syntetické peptidy podle některého z nároků 2 až 7 nebo jejich biologicky aktivní fragmenty podle některého z nároků 8 nebo 9 ve formě netoxických solí.