CZ281269B6 - Biologicky aktivní kryt rozsáhlých ranných ploch a způsob jeho přípravy - Google Patents

Abstract

Podstata biologicky aktivního krytu rozsáhlých ranných ploch podle vynálezu spočívá v tom, že sestává z nosiče na bázi hydrofilních polymerů 2-hydroxyethylmethakrylátu vybraných ze skupiny zahrnující poly(2-hydroxyethylmethakrylát), kopolymer 2-hydroxyethylmethakrylátu s diethylglykolmethakrylátem, kopolymer 2-hydroxyethylmethakrylátu s diethylglykolmethakrylátem a kyselinou methakrylovou obsahujících do 1 % síťovadla s nakultivovanými keratinocyty. Použité polymery jsou obecně označovány jako hydrogely. ŕ

Description

Biologicky aktivní kryt rozsáhlých ranných ploch a způsob jeho přípravy

Oblast techniky

Vynález se týká biologicky aktivního krytu rozsáhlých ranných ploch a způsobu jeho přípravy.

Stav techniky

Pro krytí rozsáhlých kožních defektů, jako jsou popáleniny, bércové vředy a jiné, jsou využívány kultivované autologní keratinocyty. Tato metoda je založena na odběru malého kousku kůže (3 cm²), z něhož jsou izolovány kožní buňky (keratinocyty). Tyto buňky jsou v podmínkách tkáňových kultur pomnoženy, enzymaticky uvolněny ode dna kultivační nádobky, v podobě souvislého porostu uchyceny na mastný tyl a následně přeneseny na kožní defekty. Lze tedy z relativně malých odběrů pokrývat rozsáhlé plochy poškozené kůže (Green et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 76, 5665-5668, 1979). Problémem zůstává vlastní přenos, který je technicky náročný a může být zdrojem neúspěchu.

Nyní jsme zjistili, že je možné kultivovat keratinocyty na hydrogelovém nosiči a použit k následnému přenesení na kožní defekty jako dočasný biologicky aktivní kryt.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je biologicky aktivní kryt rozsáhlých ranných ploch, jehož podstata spočívá v tom, že sestává z nosiče na bázi hydrofilních polymerů 2-hydroxyethylmethakrylátu, vybraných ze skupiny, zahrnující póly(2-hydroxyethylmethakrylát), kopolymer 2-hydroxyethylmethakrylátu s diethylglykolmethakrylátem, kopolymer 2-hydroxyethylmethakrylátu s diethylglykolmethakrylátem a kyselinou methakrylovou, obsahujících do 1 % síťovadla s nakultivovanými keratinocyty.

Použité polymery jsou obecně označovány jako hydrogely.

Způsob přípravy biologicky aktivního krytu rozsáhlých ranných ploch podle vynálezu spočívá v tom, že se na preinkubovaném nosiči z hydrofilních polymerů přímo kultivují keratinocyty.

Při použití biologicky aktivního krytu podle vynálezu jsou keratinocyty, nakultivované na nosiči, přímo přeneseny na kožní defekt tak, že kryt je k povrchu defektu přiložen stranou, porostlou keratinocyty. Ty potom migrují z povrchu nosiče a kolonizuji povrch defektu. Odpadá tedy nutnost izolace buněk ze dna kultivační nádobky, jejich přenos na transplantační nosič, čímž se transplantace buněk velmi zjednoduší.

Při práci se postupuje tak, že se pacientovi odebere jemný dermo-epidermální štěp o tloušťce 0,2-0,3 mm, z něhož jsou keratinocyty uvolněny působením roztoku trypsinu. Na dno kultivační misky se položí hydrogelový nosič ve formě disku, preinkubovaný 24 až 48 hodin 10 až 25% bovinním sérem. Na dno misky, obsahující

-1CZ 281269 B6 nosič, se nasadí letálně ozářené (6000 rad) 3-T-3 myší fibroblasty, podporující adherenci a první fáze růstu keratinocytů (Green et al., 1979), v koncentraci 1,3 x 10⁶ buněk na 50 cm² . Po adherenci fibroblastů jsou nasazeny keratinocyty v hustotě 2 x 10⁶ na 50 cm². Buňky se kultivují při 37 ’C v atmosféře 3,3% CO₂.

Používá se kultivační médium, obsahující obvykle 1) Eaglovo MEM s neesenciálními aminokyselinami a pyruvátem sodným (ÚMG, AV ČR, Praha), 2) 0,3 mg/ml Glutamin (ÚSOL, Praha), 3) 10% bovinní sérum (Bioveta, Opava), 4) Hydrocortison (0,5 μιη/ιηΐ) (Hydrocortison Spofa rozpustný), 5) Penicilín (200 jednotek/ml), Streptomycin (10^_4g/ml), 6) Insulin (5 μg/ml) (Actrapid MC NOVO Dánsko), 7) Choleratoxin (10~¹⁰M) (Sigma), 8) 10 ng/ml epidermálního růstového faktoru (Sigma).

Dále je vynález objasněn na příkladu.

Příklad provedení vynálezu

Na dno kultivační misky byl položen nosič ve formě nabotnalého disku či sítě o průměru 25 mm z kopolymerů 2-hydroxyethylmethakrylátu (70 hm. %) s diethylglykolmethakrylátem (30 hm. %), síťovaný ethylenglykoldimethakrylátem (0,3 hm. %), obsahujícím 47 % vody. Nabotnalý disk byl 24 hodin preinkubován s 25 % (v/v) bovinnim sérem. Na dno misky, obsahující nosič, byly nasazeny letálné ozářené (6000 rad) 3-T-3 myší fibroblasty, podporující adherenci a první fáze růstu keratinocytů, v koncentraci 1,3 x 10⁶ buněk na 50 cm². Po adherenci fibroblastů byly nasazeny keratinocyty v hustotě 2 x 10⁶ na 50 cm². Buňky byly kultivovány při 37 °C v atmosféře 3,3% C0₂.

Keratinocyty pro kultivaci se získají tak, že pacientovi je odebrán jemný dermo-epidermálni štěp o tloušťce 0,2-0,3 mm, z něhož jsou keratinocyty uvolněny působením roztoku trypsinu.

Kultivační médium obsahovalo 1) Eaglovo MEM s neesenciálními aminokyselinami a pyruvátem sodným (ÚMG, AV ČR, Praha), 2) 0,3 mg/ml Glutamin (ÚSOL, Praha), 3) 10% bovinní sérum (Bioveta, Opava), 4) 0,5 μιη/ml Hydrocortison (Hydrocortison Spofa rozpustný), 5) Penicilín 200 jednotek/ml, Streptomycin 10‘⁴g/ml, 6) 5 μg/ml Insulin (Actrapid MC NOVO Dánsko), 7) 10^-10M Choleratoxin (Sigma), 8) 10 ng/ml epidermálního růstového faktoru (Sigma).

Claims (2)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Biologicky aktivní kryt rozsáhlých ranných ploch, vyznačený tím, že sestává z nosiče na bázi hydrofilních polymerů 2-hydroxyethylmethakrylátu, vybraných ze skupiny, zahrnující poly(2-hydroxyethylmethakrylát), kopolymer 2-hydroxyethylmethakrylátu s diethylglykolmethakrylátem, kopolymer 2-hydroxyethylmethakrylátu s diethylglykolmethakrylátem a kyselinou methakrylovou, obsahujících do 1 % síťovadla s nakultivovanými keratinocyty.
2. 2. Způsob přípravy biologicky aktivního krytu rozsáhlých ranných ploch podle nároku 1, vyznačený tím, že se na preinkubovaném nosiči z hydrofilních polymerů přímo kultivují keratinocyty.