[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

CZ2023171A3 - An ester conjugate of sphingolipid and hyaluronan, a method of its synthesis, compositions that contain it, the use of such conjugate or composition - Google Patents

An ester conjugate of sphingolipid and hyaluronan, a method of its synthesis, compositions that contain it, the use of such conjugate or composition Download PDF

Info

Publication number
CZ2023171A3
CZ2023171A3 CZ2023-171A CZ2023171A CZ2023171A3 CZ 2023171 A3 CZ2023171 A3 CZ 2023171A3 CZ 2023171 A CZ2023171 A CZ 2023171A CZ 2023171 A3 CZ2023171 A3 CZ 2023171A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
group
sphingolipid
carbon atoms
conjugate
general formula
Prior art date
Application number
CZ2023-171A
Other languages
Czech (cs)
Inventor
Martin Juhaščik
Gloria Huerta-Angeles
Kateřina Štarmanová
Petr ŠTĚPÁN
Petr Štěpán
Andrea Exnerová
Kristina Nešporová
Andrej Kováčik
Martina Brandejsová
Petra Večeřová
Jana Polášková
Martina Hermannová
Radovan Buffa
Hana Vágnerová
Vladimír Velebný
Original Assignee
Contipro A.S.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Contipro A.S. filed Critical Contipro A.S.
Priority to CZ2023-171A priority Critical patent/CZ2023171A3/en
Priority to PCT/CZ2024/050031 priority patent/WO2024222981A1/en
Publication of CZ2023171A3 publication Critical patent/CZ2023171A3/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/728—Hyaluronic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6903—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being semi-solid, e.g. an ointment, a gel, a hydrogel or a solidifying gel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6907—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a microemulsion, nanoemulsion or micelle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6955—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a plaster, a bandage, a dressing or a patch
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/40—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing nitrogen
    • A61K8/41—Amines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/68—Sphingolipids, e.g. ceramides, cerebrosides, gangliosides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q11/00—Preparations for care of the teeth, of the oral cavity or of dentures; Dentifrices, e.g. toothpastes; Mouth rinses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Řešení se týká esterového konjugátu sfingolipidu a hyaluronanu, včetně kompozice, která je obsahuje a jejich použití. Dále se týká způsobu syntézy tohoto esterového konjugátu.The solution relates to an ester conjugate of sphingolipid and hyaluronan, including a composition containing them and their use. Furthermore, it relates to the method of synthesis of this ester conjugate.

Description

Esterový konjugát sfingolipidu a hyaluronanu, způsob jeho syntézy, kompozice ho obsahující, použití tohoto konjugátu nebo kompoziceEster conjugate of sphingolipid and hyaluronan, method of its synthesis, composition containing it, use of this conjugate or composition

Oblast technikyField of technology

Stávající vynález se týká esterového konjugátu sfingolipidu a hyaluronanu, kompozice obsahující tento konjugát a jeho použití. Dále pojednává o způsobech syntézy tohoto esterového konjugátu.The present invention relates to an ester conjugate of sphingolipid and hyaluronan, a composition containing this conjugate and its use. It also discusses methods of synthesis of this ester conjugate.

Stav technikyState of the art

Sfingolipidy jsou třída lipidů obsahující páteř sfingoidních bází, soustavu alifatických aminoalkoholů. Ceramidy (CER) jsou epidermální sfingolipidy nutné pro správnou bariérovou funkci kůže a jsou složeny z mastné kyseliny a sfingoidní báze, lišící se velikostí a strukturou jejich molekulových řetězců. CER jsou tvořeny až z 50% (hmotn./hmotn.) z lipidové matrice epidermis ve Stratum corneum (SC). Novější přípravky péče o pleť obsahují CER ve svých složeních, s úmyslem exogenně aplikovat CER, aby pomohly bariérové funkci kůže. CER podporují obnovování přirozené ochranné vrstvy kůže a tvoří účinnou epidermální bariéru.Sphingolipids are a class of lipids containing a backbone of sphingoid bases, a system of aliphatic amino alcohols. Ceramides (CER) are epidermal sphingolipids necessary for proper skin barrier function and are composed of a fatty acid and a sphingoid base, differing in the size and structure of their molecular chains. CERs are formed from up to 50% (wt/wt) of the lipid matrix of the epidermis in the Stratum corneum (SC). Newer skin care products include CER in their formulations, with the intention of exogenously applying CER to help the skin's barrier function. CERs support the renewal of the skin's natural protective layer and form an effective epidermal barrier.

Některé kožní nemoci, jako je lupenka, ichtyóza, xeróza a atopická dermatitida, jsou spojené se ztrátou nebo poruchou SC lipidů, jako jsou CER, volné aminokyseliny nebo cholesterol (Uchida & Park, 2021). Ačkoli na trhu roste počet CER obsahujících produktů, existuje limitovaný klinický důkaz ukazující hloubku a pronikání vnějších CER do kůže. Málo dokumentů ukazuje transport vnějších CER do lidské kůže (ex vivo). Také pronikání CER použitím hydrofilní kompozice je nižší než 10% (Tessema, Gebre-Mariam, Paulos, Wohlrab, & Neubert, 2018).Some skin diseases, such as psoriasis, ichthyosis, xerosis, and atopic dermatitis, are associated with loss or disruption of SC lipids, such as CERs, free amino acids, or cholesterol (Uchida & Park, 2021). Although there is a growing number of CER-containing products on the market, there is limited clinical evidence showing the depth and penetration of external CERs into the skin. Few papers show the transport of external CERs into human skin (ex vivo). Also, the penetration of CER using a hydrophilic composition is lower than 10% (Tessema, Gebre-Mariam, Paulos, Wohlrab, & Neubert, 2018).

Pro usnadnění pronikání ceramidů do SC jsou používány povrchově aktivní činidla jako je lecitin nebo polyglyceryl-4-laurát (Sahle, Wohlrab, & Neubert, 2014). Avšak polyglycerol estery mastných kyselin (PEFA) jsou toxické a potencionálně karcinogenní v závislosti na výrobních procesech a nečistotách výchozích materiálů, jako je epichlorhydrin, glycidol, eruková kyselina a trans-mastné kyseliny mohou být přítomny v PEFA. Dále je výzvou zabudovat CER do hydrofilních farmaceutických přípravků kvůli jejich slabé rozpustnosti ve farmaceuticky povolených rozpouštědlech a/nebo excipientech.Surfactants such as lecithin or polyglyceryl-4-laurate are used to facilitate the penetration of ceramides into the SC (Sahle, Wohlrab, & Neubert, 2014). However, polyglycerol esters of fatty acids (PEFA) are toxic and potentially carcinogenic depending on the manufacturing processes and impurities from the starting materials such as epichlorohydrin, glycidol, erucic acid and trans-fatty acids may be present in PEFA. Furthermore, it is a challenge to incorporate CERs into hydrophilic pharmaceutical formulations due to their poor solubility in pharmaceutically acceptable solvents and/or excipients.

Ve stávajícím stavu techniky byl vyvinut přípravek na bázi nanoemulze olej-voda pro transdermální podání obsahující ceramid IIIB s použitím teploty fázové inverze. Kompozice sestávala z ethanolu, propylenglykolu (PG) a glycerolu v kosmetickém oleji Tegosoft® G20 (oktyldodekanol) a Tween® 80 (polysorbát 80). Optimalizovaná kompozice ukázala průměrnou velikost kapky od 11,2 do 40,1 nm a polydisperzita byla stanovena 0,12. Avšak existuje problém související s permeabilitou kůže a pronikáním CER při topickém podávání. Dále určité třídy CER neprostupují přes SC, což nevede k žádným klinickým odpovědím (Su a kol., 2017). Tyto odchylky v propustnosti kůže mohou souviset s přítomností látek usnadňujících penetraci v přípravcích a také se zdravotním stavem kůže.In the current state of the art, a preparation based on an oil-water nanoemulsion for transdermal administration containing ceramide IIIB was developed using a phase inversion temperature. The composition consisted of ethanol, propylene glycol (PG) and glycerol in cosmetic oil Tegosoft® G20 (octyldodecanol) and Tween® 80 (polysorbate 80). The optimized composition showed an average droplet size from 11.2 to 40.1 nm, and the polydispersity was determined to be 0.12. However, there is a problem related to skin permeability and penetration of CER when administered topically. Furthermore, certain classes of CERs do not cross the SC, resulting in no clinical responses (Su et al., 2017). These variations in skin permeability may be related to the presence of substances facilitating penetration in the preparations, as well as to the health of the skin.

- 1 CZ 2023 - 171 A3- 1 CZ 2023 - 171 A3

Licciardi a kol. nasyntetizoval sukcinylový derivát ceramidu (Licciardi, Scialabba, Sardo, Cavallaro, & Giammona, 2014). Autoři nechali reagovat ceramid AP se sukcinanhydridem v bezvodém tetrahydrofuranu (THF). Výsledná směs byla držena při 40 °C 6 h a následně 16 h při 25 °C. Ve druhém kroku autoři nechali reagovat bis-(4-nitrofenyl)karbonát (BNPC) s inulinem v reakci za mikrovlnného ozařování. Avšak tyto podmínky nemohou být aplikovány na chemickou modifikaci HA, která je náchylná k degradaci v přítomnosti vnějšího záření (Dřímalová, Velebný, Sasinková, Hromádková, & Ebringerová, 2005).Licciardi et al. synthesized a succinyl derivative of ceramide (Licciardi, Scialabba, Sardo, Cavallaro, & Giammona, 2014). The authors reacted ceramide AP with succinic anhydride in anhydrous tetrahydrofuran (THF). The resulting mixture was kept at 40 °C for 6 h and then at 25 °C for 16 h. In the second step, the authors reacted bis-(4-nitrophenyl)carbonate (BNPC) with inulin in a reaction under microwave irradiation. However, these conditions cannot be applied to the chemical modification of HA, which is susceptible to degradation in the presence of external radiation (Dřímalová, Velebný, Sasinková, Hromádková, & Ebringerová, 2005).

Chitosan-ceramidový (CS-CE) graft kopolymer je vhodný pro vznik polymerních nanočástic jako nosič pro hydrofobní léčiva. Konjugát CS-CE tvořený nanočásticemi s mukoadhesivní chitosanovou koronou a jádrem hydrofobně stabilizovaným CER zbytky, do nichž byla enkapsulována hydrofobní léčiva za poskytnutí atraktivního orálního systému dodání léku. V této práci, Battogtokh a Tag Ko provedli aktivaci ceramidu N,Ndisukcinimidyl karbonátem (DSC). Battogtokh spojil chitosan s aktivovaným CER NP ve směsi dimethylsulfoxidu (DMSO)/THF (Battogtokh & Ko, 2014). Aktivační reakce používá bezvodá rozpouštědla, kde je sodná sůl HA nerozpustná. Je také známo, že druhá DSC reakce aktivuje sekundární alkoholy (Z. Li a kol., 2003). Může tedy působit jako sesíťující látka HA.Chitosan-ceramide (CS-CE) graft copolymer is suitable for the formation of polymer nanoparticles as a carrier for hydrophobic drugs. A CS-CE conjugate formed by nanoparticles with a mucoadhesive chitosan corona and a core hydrophobically stabilized by CER moieties encapsulated hydrophobic drugs to provide an attractive oral drug delivery system. In this work, Battogtokh and Tag Ko performed the activation of ceramide with N,Ndisuccinimidyl carbonate (DSC). Battogtokh combined chitosan with activated CER NPs in a dimethyl sulfoxide (DMSO)/THF mixture (Battogtokh & Ko, 2014). The activation reaction uses anhydrous solvents where sodium HA is insoluble. The second DSC reaction is also known to activate secondary alcohols (Z. Li et al., 2003). It can therefore act as a cross-linking agent for HA.

Cho a kol. konjugoval CER-Y30 (ceramid NP 18:1, ceramid 3B; hlavně Noleoylfytosfingosin) k HA oligomerům (4 700 g.mol-1), a tím získal amfifilní polymer (Cho a kol., 2011). Nejprve autoři připravili tetrabutylamoniovou sůl HA (HA-TBA). Ve druhém kroku ceramid reagoval s 4-chlormethyl-benzoyl chloridem, který byl použit jako linker. Ve druhém kroku byl modifikovaný ceramid konjugován ke karboxylovému zbytku HA-TBA za vzniku esterové vazby v reakci provedené ve směsi THF/acetonitril (4:1, obj./obj.). Stupeň substituce (DS) byl udáván jako 2,38%. Autoři uvedli, že DS-Y30 ceramid (8,59 mmol) byl přidán ke 12,21 mmol HA, což znamená, že reakce produkovala nízkou konverzi a potřebovala organická rozpouštědla, což činilo proces nákladným při větších množstvích. Dekompozice produktů aromatického spaceru dále nejsou známy a polysacharid byl modifikován na HA' karboxylovém zbytku, a proto limitoval schopnost konjugátu interagovat s CD44 receptorem. Podobné podmínky byly udávány Jin a kol. pro fyzikochemickou charakterizaci. Kritická micelární koncentrace byla udávána jako 0,042 mg.ml-1 pro HA-CE a byla stanovena fluorescenčně (Jin a kol., 2012).Cho et al. conjugated CER-Y30 (ceramide NP 18:1, ceramide 3B; mainly Noleoylphytosphingosine) to HA oligomers (4,700 g.mol -1 ) to obtain an amphiphilic polymer (Cho et al., 2011). First, the authors prepared the tetrabutylammonium salt of HA (HA-TBA). In the second step, ceramide was reacted with 4-chloromethyl-benzoyl chloride, which was used as a linker. In the second step, the modified ceramide was conjugated to the carboxyl residue of HA-TBA to form an ester bond in a reaction carried out in THF/acetonitrile (4:1, v/v). The degree of substitution (DS) was reported as 2.38%. The authors reported that DS-Y30 ceramide (8.59 mmol) was added to 12.21 mmol of HA, meaning that the reaction produced a low conversion and required organic solvents, making the process expensive at larger amounts. The decomposition products of the aromatic spacer are further unknown and the polysaccharide was modified at the HA' carboxyl residue, therefore limiting the ability of the conjugate to interact with the CD44 receptor. Similar conditions were reported by Jin et al. for physicochemical characterization. The critical micellar concentration was reported as 0.042 mg.ml -1 for HA-CE and was determined by fluorescence (Jin et al., 2012).

Turley a kol. chemicky modifikoval HA fosfolipidy nebo sfingolipidy vybranými ze skupiny sestávající z fosfatidylethanolaminů, fosfatidylserinů, fosfatidylinizitolů, sfingosinů, ceramidů a lipidů na bázi ceramidu. Nejvýhodnějšíje použití fosfatidylethanolaminů. Účinnost modifikace by byla snížena, pokud by reakce byla provedena ve vodě (US20120368373-A1).Turley et al. chemically modified HA with phospholipids or sphingolipids selected from the group consisting of phosphatidylethanolamines, phosphatidylserines, phosphatidylinizitols, sphingosines, ceramides, and ceramide-based lipids. The most advantageous is the use of phosphatidylethanolamines. The efficiency of the modification would be reduced if the reaction was carried out in water (US20120368373-A1).

Obecně, jak je zmíněno výše, existuje několik nevýhod a problémů souvisejících s odlišnou polaritou a rozpustností sfingolipidu a HA, nutností HA konverze na tetrabutylamoniovou sůl (TBA), použití nákladných a bezvodých rozpouštědel, nedostatečnou konverzí a stupni substituce derivátu HA a použití linkeru s neznámými biologickými vlastnostmi.In general, as mentioned above, there are several disadvantages and problems related to the different polarity and solubility of sphingolipid and HA, the necessity of HA conversion to tetrabutylammonium (TBA), the use of expensive and anhydrous solvents, insufficient conversion and degree of substitution of the HA derivative, and the use of a linker with unknown biological properties.

- 2 CZ 2023 - 171 A3- 2 CZ 2023 - 171 A3

Podstata vynálezuThe essence of the invention

Problémy zmíněné výše jsou vyřešeny ve stávajícím vynálezu, který se týká esterového konjugátu sfingolipidu a hyaluronanu, způsobu jeho syntézy, kompozice ho obsahující a použití konjugátu nebo kompozice.The problems mentioned above are solved in the present invention, which relates to an ester conjugate of sphingolipid and hyaluronan, a method of its synthesis, a composition containing it, and the use of the conjugate or composition.

Podstatou stávajícího vynálezu je esterovýo konjugát sfingolipidu a hyaluronanu obecného vzorce I:The essence of the present invention is the ester conjugate of sphingolipid and hyaluronan of general formula I:

kde n je přirozené číslo v rozsahu od 7 do 4000 dimerů,where n is a natural number ranging from 7 to 4000 dimers,

R5 je H+ nebo farmaceuticky přijatelná sůl,R 5 is H + or a pharmaceutically acceptable salt;

R4 je -H nebo sfingolipidový substituent s linkerem obecného vzorce IIR 4 is -H or a sphingolipid substituent with a linker of general formula II

(Π) kde(Π) where

A je CH2-CH2, CH=CH nebo C(H)OH-CH2, pokud je kterýkoli H vázaný na atom C z CH2-CH2 nebo CH=CH nebo C(H)OH-CH2 substituován hydroxylovou skupinou, může být esterifikována R3, který váže hyaluronovou kyselinu nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl kovalentní vazbou,A is CH2-CH2, CH=CH or C(H)OH-CH2, if any H bonded to the C atom of CH2-CH2 or CH=CH or C(H)OH-CH2 is substituted with a hydroxyl group, R can be esterified 3 , which binds hyaluronic acid or its pharmaceutically acceptable salt by a covalent bond,

R1 je přímý řetězec nebo rozvětvená alkylová skupina s 10 až 22 uhlíkovými atomy, která může případně obsahovat jednu nebo více dvojných vazeb, přičemž kterýkoli z H vázaný na C atom uvedené alkylové skupiny je případně substituovaný jednou nebo více hydroxylovými skupinami, s výhodou je to alkylová skupina s přímým řetězcem s 12 až 18 uhlíkovými atomy, výhodněji je to alkylová skupina s přímým řetězcem se 13 uhlíkovými atomy,R 1 is a straight chain or branched alkyl group of 10 to 22 carbon atoms, which may optionally contain one or more double bonds, wherein any of the H bonded to the C atom of said alkyl group is optionally substituted by one or more hydroxyl groups, preferably it is a straight chain alkyl group with 12 to 18 carbon atoms, more preferably a straight chain alkyl group with 13 carbon atoms,

-3CZ 2023 - 171 A3-3CZ 2023 - 171 A3

R6 je H nebo COR2, kdeR 6 is H or COR 2 , where

R2 je přímý řetězec nebo rozvětvená alkylová skupina se 13 až 55 uhlíkovými atomy, s výhodou 15 až 50 uhlíkovými atomy, výhodněji 17 až 23 uhlíkovými atomy, která může případně obsahovat jednu nebo více dvojných vazeb; alkylový řetězec může obsahovat vnitřní esterovou skupinu; nebo H alkylové skupiny může případně být substituován jednou nebo více hydroxylovými skupinami,R 2 is a straight chain or branched alkyl group of 13 to 55 carbon atoms, preferably 15 to 50 carbon atoms, more preferably 17 to 23 carbon atoms, which may optionally contain one or more double bonds; the alkyl chain may contain an internal ester group; or H of the alkyl group may optionally be substituted by one or more hydroxyl groups,

R3 je -H nebo -OC-CH2-CH2-CO- nebo -OC-CH2=CH2-CO-, a s výhradou, že alespoň jeden R3 je -OC-CH2-CH2-CO- nebo -OC-CH2=CH2-CO-, kde volná -OC- část je kovalentně navázána k -O- na R4 pozici konjugátu sfíngolipidu a hyaluronanu obecného vzorce I, s výhradou, že alespoň jeden R4 konjugátu je sfingolipidový substituent s linkerem vzorce Π, a kde stupeň substituce sfingolipidového substituentu s linkerem obecného vzorce II v konjugátu hyaluronanu je v rozsahu od 0,1 do 15 %.R 3 is -H or -OC-CH2-CH2-CO- or -OC-CH2=CH2-CO-, with the proviso that at least one R 3 is -OC-CH2-CH2-CO- or -OC-CH2= CH2-CO-, where the free -OC- part is covalently bound to -O- at the R 4 position of the conjugate of sphingolipid and hyaluronan of general formula I, with the proviso that at least one R 4 of the conjugate is a sphingolipid substituent with a linker of the formula Π, and where the degree of substitution of a sphingolipid substituent with a linker of the general formula II in the hyaluronan conjugate is in the range from 0.1 to 15%.

Hmotnostně střední molekulová hmotnost konjugátu vzorce I podle stávajícího vynálezu je v rozsahu 3 000 g/mol až 1 600 000 g/mol, s výhodou v rozsahu od 3 000 až 20 000 g/mol, výhodněji 5 000 až 7000 g/mol.The weight average molecular weight of the conjugate of formula I according to the present invention is in the range of 3,000 g/mol to 1,600,000 g/mol, preferably in the range of 3,000 to 20,000 g/mol, more preferably 5,000 to 7,000 g/mol.

Stupeň substituce v konjugátu hyaluronanu podle stávajícího vynálezu je v rozsahu od 0,4 do 15 %, s výhodou je stupeň substituce v rozsahu od 5,5 do 10,5 %, výhodněji je stupeň substituce v rozsahu od 6,5 do 8,5 %.The degree of substitution in the hyaluronan conjugate according to the present invention is in the range from 0.4 to 15%, preferably the degree of substitution is in the range from 5.5 to 10.5%, more preferably the degree of substitution is in the range from 6.5 to 8.5 %.

Farmaceuticky přijatelná sůl konjugátu hyaluronanu podle stávajícího vynálezu je vybraná ze skupiny obsahující jakékoli ionty alkalických kovů nebo iontů kovů alkalických zemin, s výhodou Na+, K+ nebo Mg2+.A pharmaceutically acceptable salt of the hyaluronan conjugate according to the present invention is selected from the group containing any alkali metal ions or alkaline earth metal ions, preferably Na + , K + or Mg 2+ .

Další provedení stávajícího vynálezu je způsob syntézy esteru konjugátu sfíngolipidu a hyaluronanu podle stávajícího vynálezu, kde sfingolipid obecného vzorce IIIAnother embodiment of the present invention is a method of synthesizing a conjugate ester of sphingolipid and hyaluronan according to the present invention, where the sphingolipid of general formula III

(III), kde(III) where

A je CH2-CH2, CH=CH nebo C(H)OH-CH2,A is CH2-CH2, CH=CH or C(H)OH- CH2 ,

-4CZ 2023 - 171 A3-4CZ 2023 - 171 A3

R1 je přímý řetězec nebo rozvětvená alkylová skupina s 10 až 22 uhlíkovými atomy, která může případně obsahovat jednu nebo více dvojných vazeb, přičemž kterýkoli H vázaný na atom C uvedené alkylové skupiny je případně substituovaný jednou nebo více hydroxylovými skupinami, s výhodou je to alkylová skupina s přímým řetězcem s 12 až 18 uhlíkovými atomy, výhodněji je to alkylová skupina s přímý řetězcem s 13 uhlíkovými atomy,R 1 is a straight chain or branched alkyl group of 10 to 22 carbon atoms, which may optionally contain one or more double bonds, wherein any H bonded to the C atom of said alkyl group is optionally substituted by one or more hydroxyl groups, preferably alkyl a straight chain group with 12 to 18 carbon atoms, more preferably a straight chain alkyl group with 13 carbon atoms,

R6 je H nebo COR2, kdeR 6 is H or COR 2 , where

R2 je přímý řetězec nebo rozvětvená alkylová skupina se 13 až 55 uhlíkovými atomy, s výhodou 15 až 50 uhlíkovými atomy, výhodněji 17 až 23 uhlíkovými atomy; alkylový řetězec může obsahovat vnitřní esterovou skupinu; může případně obsahovat jednu nebo více dvojných vazeb, a může být případně substituovaný jednou nebo více hydroxylovými skupinami;R 2 is a straight chain or branched alkyl group of 13 to 55 carbon atoms, preferably 15 to 50 carbon atoms, more preferably 17 to 23 carbon atoms; the alkyl chain may contain an internal ester group; may optionally contain one or more double bonds, and may optionally be substituted with one or more hydroxyl groups;

je připojený k linkeru, který je zbytkem jantarové kyseliny nebo zbytkem maleinové kyseliny přidáním sukcinanhydridu nebo maleinanhydridu v polárním rozpouštědle v přítomnosti organické báze nebo jejich směsí za vzniku sfingolipidu s linkerem obecného vzorce IVis attached to a linker that is a succinic acid residue or a maleic acid residue by addition of succinic anhydride or maleic anhydride in a polar solvent in the presence of an organic base or a mixture thereof to form a sphingolipid with a linker of general formula IV

kdewhere

A je CH2-CH2, CH=CH nebo C(H)OH-CH2,A is CH2-CH2, CH=CH or C(H)OH- CH2 ,

R1 je přímý řetězec nebo rozvětvená alkylová skupina s 10 až 22 uhlíkovými atomy, která může případně obsahovat jednu nebo více dvojných vazeb, přičemž kterýkoli z H navázaných na C atomu uvedené alkylové skupiny je případně substituovaný jednou nebo více hydroxylovými skupinami, s výhodou je alkylová skupina s přímým řetězcem s 12 až 18 uhlíkovými atomy, výhodněji je alkylová skupina s přímým řetězcem s 13 uhlíkovými atomy,R 1 is a straight chain or branched alkyl group with 10 to 22 carbon atoms, which may optionally contain one or more double bonds, wherein any of the H attached to the C atom of said alkyl group is optionally substituted by one or more hydroxyl groups, preferably alkyl a straight chain group with 12 to 18 carbon atoms, more preferably a straight chain alkyl group with 13 carbon atoms,

R6 je H nebo COR2, kdeR 6 is H or COR 2 , where

R2 je přímý řetězec nebo rozvětvená alkylová skupina se 13 až 55 uhlíkovými atomy, s výhodou 15 až 50 uhlíkovými atomy, výhodněji 17 až 23 uhlíkovými atomy; alkylový řetězec může obsahovat vnitřní esterovou skupinu; může případně obsahovat jednu neboR 2 is a straight chain or branched alkyl group of 13 to 55 carbon atoms, preferably 15 to 50 carbon atoms, more preferably 17 to 23 carbon atoms; the alkyl chain may contain an internal ester group; may optionally contain one or

- 5 CZ 2023 - 171 A3 více dvojných vazeb, a může případně být substituovaný jednou nebo více hydroxylovými skupinami;- 5 CZ 2023 - 171 A3 more double bonds, and may optionally be substituted by one or more hydroxyl groups;

R7 je -H nebo -OC-CH2-CH2-COOH nebo -OC-CH=CH-COOH, a s výhradou, že alespoň jedna R7 je -C-CH2-CH2-COOH nebo -OC-CH=CH-COOH, která je aktivovaná aktivačním činidlem vybraným ze skupiny zahrnující 1,1'karbonyldiimidalzol nebo tetramethyl-O-(;V-sukcinimidyl)uronium hexafluorofosfát nebo benzoylchlorid, v přítomnosti organického rozpouštědla za vzniku aktivovaného sfíngolipidu s linkerem obecného vzorce VR 7 is -H or -OC-CH2-CH2-COOH or -OC-CH=CH-COOH, with the proviso that at least one R 7 is -C-CH2-CH2-COOH or -OC-CH=CH-COOH , which is activated by an activating agent selected from the group comprising 1,1'carbonyldiimidazole or tetramethyl-O-(;V-succinimidyl)uronium hexafluorophosphate or benzoyl chloride, in the presence of an organic solvents to form an activated sphingolipid with a linker of the general formula V

kdewhere

A je CH2-CH2, CH=CH nebo C(H)OH-CH2,A is CH2-CH2, CH=CH or C(H)OH- CH2 ,

R1 je přímý řetězec nebo rozvětvená alkylová skupina s 10 až 22 uhlíkovými atomy, která může případně obsahovat jednu nebo více dvojných vazeb, přičemž kterýkoli H vázaný na atom C uvedené alkylové skupiny je případně substituován jednou nebo více hydroxylovými skupinami, s výhodou je to alkylová skupina s přímým řetězcem s 12 až 18 uhlíkovými atomy, výhodněji je to alkylová skupina s přímým řetězcem s 13 uhlíkovými atomy,R 1 is a straight chain or branched alkyl group of 10 to 22 carbon atoms, which may optionally contain one or more double bonds, wherein any H bonded to the C atom of said alkyl group is optionally substituted by one or more hydroxyl groups, preferably alkyl a straight chain group with 12 to 18 carbon atoms, more preferably a straight chain alkyl group with 13 carbon atoms,

R6 je H nebo COR2, kdeR 6 is H or COR 2 , where

R2 je přímý řetězec nebo rozvětvená alkylová skupina s 13 až 55 uhlíkovými atomy, s výhodou 15 až 50 uhlíkovými atomy, výhodněji 17 až 23 uhlíkovými atomy; alkylový řetězec může obsahovat vnitřní esterovou skupinu; může případně obsahovat jednu nebo více dvojných vazeb a může případně být substituován jednou nebo více hydroxylovými skupinami;R 2 is a straight chain or branched alkyl group of 13 to 55 carbon atoms, preferably 15 to 50 carbon atoms, more preferably 17 to 23 carbon atoms; the alkyl chain may contain an internal ester group; may optionally contain one or more double bonds and may optionally be substituted with one or more hydroxyl groups;

R7 je -H nebo -OC-CH2-CH2-COOH nebo -OC-CH=CH-COOH, a s výhradou, že alespoň jeden R7 je -OC-CH2-CH2-COOH nebo -OC-CH=CH-COOH,R 7 is -H or -OC-CH2-CH2-COOH or -OC-CH=CH-COOH, with the proviso that at least one R 7 is -OC-CH2-CH2-COOH or -OC-CH=CH-COOH ,

-6CZ 2023 - 171 A3-6CZ 2023 - 171 A3

R9 je substituent vybraný ze skupiny substituentů zahrnující substituent obecného vzorce VI nebo substituent obecného vzorce VII nebo substituent obecného vzorce VIII, kde R8 je jeden nebo více substituentů vybraných ze skupiny zahrnující Η, -NO2, -COOH, halogenidy, Ci-Ce alkyloxy, s výhodou halogenidy, methoxy nebo ethoxy, výhodněji Cl,R 9 is a substituent selected from the group of substituents including a substituent of the general formula VI or a substituent of the general formula VII or a substituent of the general formula VIII, where R 8 is one or more substituents selected from the group including Η, -NO2, -COOH, halides, Ci-Ce alkyloxy , preferably halides, methoxy or ethoxy, more preferably Cl,

'N 'ŇZ I I (VIII), který reaguje s hyaluronovou kyselinou nebo její farmaceuticky přijatelnou solí v přítomnosti směsi vody a vodou mísitelného organického rozpouštědla nebo v přítomnosti organického rozpouštědla, vs výhodou dimethylsulfoxidu.'N 'Ň Z II (VIII) which reacts with hyaluronic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof in the presence of a mixture of water and a water-miscible organic solvent or in the presence of an organic solvent, preferably dimethyl sulfoxide.

Koncentrace sfingolipidu obecného vzorce III je s výhdou v rozsahu od 0,88 % do 2,5 % (hmotn./obj.) a molámí ekvivalent sukcinanhydridu nebo maleinanhydridu je v rozsahu od 1,0 do 2,0, s výhodou 1,5 ekvivalentů vzhledem ke sfingolipidu obecného vzorce III.The concentration of the sphingolipid of general formula III is advantageously in the range from 0.88% to 2.5% (w/v) and the molar equivalent of succinic anhydride or maleic anhydride is in the range from 1.0 to 2.0, preferably 1.5 of equivalents relative to the sphingolipid of general formula III.

Připojení linkeru je s výhodou provedeno v rozsahu teplot od 0 °C do 50 °C po dobu 4 až 20 hodin, výhodněji 6 až 8 hodin v rozsahu teplot od 0 °C do 40 °C, a potom následuje míchání při teplotě v rozsahu od 0 °C do 29 °C, s výhodou při teplotě místnosti 5 až 24 hodin, výhodněji 16 až 20 hodin.Linker attachment is preferably carried out at a temperature range of 0°C to 50°C for 4 to 20 hours, more preferably 6 to 8 hours at a temperature range of 0°C to 40°C, followed by stirring at a temperature in the range of 0°C to 29°C, preferably at room temperature for 5 to 24 hours, more preferably 16 to 20 hours.

Organická báze je s výhodou vybraná ze skupiny zahrnující sekundární nebo terciární amin s lineární nebo rozvětvenou nebo cyklickou nebo aromatickou, nasycenou nebo nenasycenou C3-C30 alkylovou skupinou a polární rozpouštědlo je vybrané ze skupiny zahrnující tetrahydrofuran (THF), dioxan, dimethylsulfoxid, dichlormethan a chloroform nebo jejich směsi.The organic base is preferably selected from the group comprising a secondary or tertiary amine with a linear or branched or cyclic or aromatic, saturated or unsaturated C3-C30 alkyl group and the polar solvent is selected from the group comprising tetrahydrofuran (THF), dioxane, dimethylsulfoxide, dichloromethane and chloroform or mixtures thereof.

CZ 2023 - 171 A3CZ 2023 - 171 A3

Organická báze je s výhodou vybraná ze skupiny zahrnující pyridin, trimethylamin, Nmethylmorfolin, dimethylaminopyridin nebo jejich směsi a polární rozpouštědlo je s výhodou dichlormethan nebo tetrahydrofuran (THF) nebo jejich směs.The organic base is preferably selected from the group consisting of pyridine, trimethylamine, Nmethylmorpholine, dimethylaminopyridine or mixtures thereof, and the polar solvent is preferably dichloromethane or tetrahydrofuran (THF) or a mixture thereof.

Aktivační činidlo je s výhodou benzoylchlorid, který je substituovaný nebo nesubstituovaný benzoylchlorid nebo jeho deriváty obecného vzorce IXThe activating agent is preferably benzoyl chloride, which is substituted or unsubstituted benzoyl chloride or its derivatives of general formula IX

(ix), kde R8 je jeden nebo více substituentů vybraných ze skupiny zahrnující Η, -NO2, -COOH, halogenidy, Ci-Ce alkyloxy, s výhodou halogenidy, methoxy nebo ethoxy, výhodněji Cl.(ix) where R 8 is one or more substituents selected from the group consisting of Η, -NO2, -COOH, halides, Ci-Ce alkyloxy, preferably halides, methoxy or ethoxy, more preferably Cl.

Vznik aktivovaného sfingolipidu s linkerem obecného vzorce Vje s výhodou provedena při teplotě v rozsahu od 5 °C do 60 °C, výhodněji 40 °C, 0,5 až 24 hodin.The formation of the activated sphingolipid with a linker of the general formula V is preferably carried out at a temperature in the range from 5°C to 60°C, more preferably 40°C, for 0.5 to 24 hours.

Molární množství aktivačního činidla je s výhodou v rozsahu od 0,03 do 2 molámích ekvivalentů, výhodněji 1 molární ekvivalent na sfíngolipid s linkerem obecného vzorce IV.The molar amount of the activating agent is preferably in the range from 0.03 to 2 molar equivalents, more preferably 1 molar equivalent per sphingolipid with a linker of general formula IV.

Organické rozpouštědlo je s výhodou vybráno ze skupiny zahrnující isopropanol, tercbutanol, dioxan, dimethylsulfoxid, acetonitril a tetrahydrofuran.The organic solvent is preferably selected from the group including isopropanol, tert-butanol, dioxane, dimethylsulfoxide, acetonitrile and tetrahydrofuran.

Koncentrace aktivovaného sfingolipidu s linkerem obecného vzorce V, který reaguje s hyaluronovou kyselinou nebo její farmaceuticky přijatelnou solí, je s výhodou v rozsahu od 0,25 % do 7,0 % (hmotn./obj.) v roztoku.The concentration of the activated sphingolipid with a linker of general formula V, which reacts with hyaluronic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof, is preferably in the range of 0.25% to 7.0% (w/v) in the solution.

Reakce aktivovaného sfingolipidu s linkerem obecného vzorce V a hyaluronové kyseliny nebo její farmaceuticky přijatelné soli je s výhodou provedena v rozsahu teplot od 5 °C do 37 °C, výhodněji při 25 °C, po dobu 2 hodiny.The reaction of the activated sphingolipid with the linker of the general formula V and hyaluronic acid or its pharmaceutically acceptable salt is preferably carried out in a temperature range from 5°C to 37°C, more preferably at 25°C, for 2 hours.

S vodou mísitelné organické rozpouštědlo je s výhodou vybrané ze skupiny zahrnující isopropanol, terc-butanol, dioxan, dimethylsulfoxid a tetrahydrofuran.The water-miscible organic solvent is preferably selected from the group including isopropanol, tert-butanol, dioxane, dimethylsulfoxide and tetrahydrofuran.

Molární množství aktivovaného sfingolipidu s linkerem obecného vzorce V je 0,01 až 2,0 ekvivalenty, s výhodou 0,03 až 0,5 ekvivalentu vzhledem k dimeru hyaluronové kyseliny.The molar amount of the activated sphingolipid with a linker of the general formula V is 0.01 to 2.0 equivalents, preferably 0.03 to 0.5 equivalents relative to the hyaluronic acid dimer.

Podle jiného provedení stávajícího vynálezu kompozice zahrnuje esterový konjugát podle stávajícího vynálezu, s výhodou je esterový konjugát ve formě samouspořádané polymemí částice.According to another embodiment of the present invention, the composition includes an ester conjugate according to the present invention, preferably the ester conjugate is in the form of a self-assembled polymer particle.

Koncentrace esterového konjugátu podle obecného vzorce I v kompozici podle stávajícího vynálezu je v rozsahu od 0,001 do 50 % (hmotn./hmotn.), s výhodou od 0,001 do 5 % (hmotn./hmotn.), výhodněji od 0,001 do 1 % (hmotn./hmotn.).The concentration of the ester conjugate according to general formula I in the composition according to the present invention is in the range from 0.001 to 50% (wt/wt), preferably from 0.001 to 5% (wt/wt), more preferably from 0.001 to 1% ( wt/wt).

-8CZ 2023 - 171 A3-8CZ 2023 - 171 A3

Kompozice podle stávajícího vynálezu je s výhodou ve formě vybrané ze skupiny obsahující emulzi, sérum, hydrogel nebo bukální náplast.The composition according to the present invention is preferably in a form selected from the group containing emulsion, serum, hydrogel or buccal patch.

Kompozice podle stávajícího vynálezu je ve formě emulze, přičemž koncentrace esterového konjugátu podle obecného vzorce I je v rozsahu od 0,001 do 5 % (hmotn./hmotn.), s výhodou od 0,001 do 1 % (hmotn./hmotn.).The composition according to the present invention is in the form of an emulsion, while the concentration of the ester conjugate according to the general formula I is in the range from 0.001 to 5% (wt/wt), preferably from 0.001 to 1% (wt/wt).

Kompozice podle stávajícího vynálezu s výhodou obsahuje vodu a alespoň jeden kosmetický nebo farmaceutický excipient vybraný ze skupiny obsahující olej, vosk, máslo, emulgátor, pomocnou aktivní složku, zahušťovadlo a konzervant.The composition according to the present invention preferably contains water and at least one cosmetic or pharmaceutical excipient selected from the group containing oil, wax, butter, emulsifier, auxiliary active ingredient, thickener and preservative.

Olej je s výhodou vybraný ze skupiny zahrnující kokosový, olivový, avokádový, sezamový, mandlový, ricinový, slunečnicový, konopný, jojobový, arganový, meruňkový, brutnákový, marulový, bavlníkový, pupalkový, hroznový, lískoořechový, lněný, lzrcadlovky bílé, moringový, švestkový, makový, rýžový, šípkový, ze světlice barvířské, z pšeničných klíčků, makadamový olej a skvalen; máslo je vybrané ze skupiny zahrnující kakaové máslo, ilipové máslo, kakaové máslo, murumuru máslo, mangové máslo, cupuacu máslo, avokádové máslo a bambucké máslo; vosk je vybraný ze skupiny zahrnující lanolin, včelí vosk karnaubový vosk, kandelilový vosk a vazelínu.The oil is preferably selected from the group including coconut, olive, avocado, sesame, almond, castor, sunflower, hemp, jojoba, argan, apricot, borage, marula, cotton, evening primrose, grape, hazelnut, linseed, white mirror, moringa, plum , poppy, rice, rose hip, safflower, wheat germ, macadamia oil and squalene; the butter is selected from the group consisting of cocoa butter, ilipa butter, cocoa butter, murumuru butter, mango butter, cupuacu butter, avocado butter and shea butter; the wax is selected from the group consisting of lanolin, beeswax, carnauba wax, candelilla wax and petroleum jelly.

Emulgátor je s výhodou vybraný ze skupiny zahrnující glyceryl stearát, glyceryl kaprylát, behenyl alkohol, glyceryl behenát, cetearyl glukozid, methylglukóza sekvistearát, glyceryl stearát citrát, polyglyceryl-3 stearát, cetearyl olivát, lecitin, stearyl alkohol, sorbitan oleát, polysorbáty, stearovou kyselinu, cetylalkohol a cetearylalkohol, akrylát sodný, akryloyldimethyltaurát sodný nebo jejich směsi.The emulsifier is preferably selected from the group comprising glyceryl stearate, glyceryl caprylate, behenyl alcohol, glyceryl behenate, cetearyl glucoside, methylglucose sestearate, glyceryl stearate citrate, polyglyceryl-3 stearate, cetearyl olivate, lecithin, stearyl alcohol, sorbitan oleate, polysorbates, stearic acid , cetyl alcohol and cetearyl alcohol, sodium acrylate, sodium acryloyldimethyltaurate or their mixtures.

Pomocná aktivní složka je s výhodou vybraná ze skupiny zahrnující vitamíny A, D, E, K, C a skupiny vitamínů B; kurkumin, koenzym Q10, alantoin, bisabolol, kyselina mléčná, aminokyseliny, α-hydroxy a β-hydroxy kyseliny, ceramidy, peptidy, s výhodou acetyl hexapeptid-8, palmitoyl tripeptid-1, palmitoyl tetrapeptid-7, měďný tripeptid-1, palmitoyl pentapeptid-4, Saccharomyces peptidy, hexapeptid-1 a protein, s výhodou rýžový protein, sójový protein, quinoa protein nebo pšeničný protein; polysacharidy, kyselina hyaluronová nebo její farmaceuticky a kosmeticky přijatelná sůl, karboxymethyl glukan, schizofilan, glukomannan; panthenol; močovina; glycerin; pentylenglykol; rostlinné extrakty, s výhodou extrakt z aloe vera, extrakt z heřmánku, extrakt z acai, extrakt ze zeleného čaje, řasový extrakt, ovesný extrakt, konopný extrakt a brusinkový extrakt, bakuchiol, resveratrol; extrakty, fermenty, lyzáty nebo filtráty z bakterií s výhodou z Lactobacillus, Thalassospira, Bifidobacterium, Halobacterium; nebo z hub s výhodou ze Saccharomyces, Agaricus subrufescens, Choiromyces meandriformis, Cordyceps sinensis, Ganoderma lucidum, Grifola frondosa, Hypsizygus ulmarium, Inonotus obliquus, Lentinula edodes, Polyporus, Trametes versicolor, Tremella fuciformis, Tuber, Schizophyllum commune.The auxiliary active ingredient is preferably selected from the group comprising vitamins A, D, E, K, C and the group of B vitamins; curcumin, coenzyme Q10, allantoin, bisabolol, lactic acid, amino acids, α-hydroxy and β-hydroxy acids, ceramides, peptides, preferably acetyl hexapeptide-8, palmitoyl tripeptide-1, palmitoyl tetrapeptide-7, copper tripeptide-1, palmitoyl pentapeptide-4, Saccharomyces peptides, hexapeptide-1 and protein, preferably rice protein, soy protein, quinoa protein or wheat protein; polysaccharides, hyaluronic acid or its pharmaceutically and cosmetically acceptable salt, carboxymethyl glucan, schizophyllan, glucomannan; panthenol; urea; glycerine; pentylene glycol; plant extracts, preferably aloe vera extract, chamomile extract, acai extract, green tea extract, algae extract, oat extract, hemp extract and cranberry extract, bakuchiol, resveratrol; extracts, ferments, lysates or filtrates from bacteria, preferably from Lactobacillus, Thalassospira, Bifidobacterium, Halobacterium; or from mushrooms preferably from Saccharomyces, Agaricus subrufescens, Choiromyces meandriformis, Cordyceps sinensis, Ganoderma lucidum, Grifola frondosa, Hypsizygus ulmarium, Inonotus obliquus, Lentinula edodes, Polyporus, Trametes versicolor, Tremella fuciformis, Tuber, Schizophyllum commune.

Konzervant je s výhodou vybraný ze skupiny zahrnující aromatické kyseliny a jejich deriváty, výhodněji kyselinu benzoovou, kyselinu salicylovou, kyselinu dehydrooctovou, sorbát draselný, parabeny; alkoholy s výhodou ethanol, isopropanol, benzylalkohol, fenoxyethanol, fenethyl alkohol; imidazolové deriváty s výhodou hydantoin, imidazolidinyl močovina; kationtové povrchově aktivní látky s výhodou benzalkonium chlorid.The preservative is preferably selected from the group comprising aromatic acids and their derivatives, more preferably benzoic acid, salicylic acid, dehydroacetic acid, potassium sorbate, parabens; alcohols preferably ethanol, isopropanol, benzyl alcohol, phenoxyethanol, phenethyl alcohol; imidazole derivatives preferably hydantoin, imidazolidinyl urea; cationic surfactants, preferably benzalkonium chloride.

- 9 CZ 2023 - 171 A3- 9 CZ 2023 - 171 A3

Kompozice podle stávajícího vynálezu je ve formě séra, a koncentrace esterového konjugátu podle obecného vzorce I je v rozsahu od 0,001 do 5 % (hmotn./hmotn.), s výhodou od 0,001 do 1 % (hmotn./hmotn.); a obsahuje vodu a alespoň jednu ve vodě rozpustnou pomocnou aktivní složku; alespoň jedno zahušťovadlo a alespoň jeden konzervant, jak je uvedeno výše.The composition according to the present invention is in the form of a serum, and the concentration of the ester conjugate according to the general formula I is in the range from 0.001 to 5% (w/w), preferably from 0.001 to 1% (w/w); and contains water and at least one water-soluble auxiliary active ingredient; at least one thickener and at least one preservative as mentioned above.

Koncentrace esterového konjugátu podle obecného vzorce I je v kompozici podle stávajícího vynálezu s výhodou v rozsahu od 0,001 do 1 % (hmotn./hmotn.).The concentration of the ester conjugate according to general formula I in the composition according to the present invention is preferably in the range from 0.001 to 1% (wt/wt).

Ve vodě rozpustná pomocná aktivní složka je vybraná ze skupiny obsahující vitamín C; B vitamíny; aminokyseliny, α-hydroxy a β-hydroxy kyseliny, peptidy; s výhodou acetyl hexapeptid-8, palmitoyl tripeptid, měďný tripeptid-1, peptidy Saccharomyces, hexapeptid1; a proteiny, s výhodou rýžový protein, sójový protein, quinoa protein nebo pšeničný protein; a ve vodě rozpustné polysacharidy, s výhodou kyselina hyaluronová nebo její farmaceuticky a kosmeticky přijatelná sůl, karboxymethyl glukan, schizofilan, glukomannan; močovina; glycerin; pentylen glykol; rostlinné extrakty, s výhodou extrakt z aloe vera, extrakt z heřmánku, extrakt z acai, extrakt ze zeleného čaje, řasový extrakt, ovesný extrakt, konopný extrakt a brusinkový extrakt, extrakty; fermenty, lyzáty z bakterií s výhodou z Lactobacillus, Thalassospira, Bifidobacterium, Halobacterium; nebo z hub s výhodou ze Saccharomyces, Agaricus subrufescens, Choiromyces meandriformis, Cordyceps sinensis, Ganoderma lucidum,Grifola frondosa, Hypsizygus ulmarium, Inonotus obliquus, Lentinula edodes, Polyporus, Trametes versicolor, Tremella fuciformis, Tuber, Schizophyllum commune.The water-soluble auxiliary active ingredient is selected from the group containing vitamin C; B vitamins; amino acids, α-hydroxy and β-hydroxy acids, peptides; preferably acetyl hexapeptide-8, palmitoyl tripeptide, copper tripeptide-1, Saccharomyces peptides, hexapeptide 1; and proteins, preferably rice protein, soy protein, quinoa protein or wheat protein; and water-soluble polysaccharides, preferably hyaluronic acid or its pharmaceutically and cosmetically acceptable salt, carboxymethyl glucan, schizophyllan, glucomannan; urea; glycerine; pentylene glycol; plant extracts, preferably aloe vera extract, chamomile extract, acai extract, green tea extract, algae extract, oat extract, hemp extract and cranberry extract, extracts; ferments, lysates from bacteria preferably from Lactobacillus, Thalassospira, Bifidobacterium, Halobacterium; or from mushrooms preferably from Saccharomyces, Agaricus subrufescens, Choiromyces meandriformis, Cordyceps sinensis, Ganoderma lucidum, Grifola frondosa, Hypsizygus ulmarium, Inonotus obliquus, Lentinula edodes, Polyporus, Trametes versicolor, Tremella fuciformis, Tuber, Schizophyllum commune.

Kompozice podle stávajícího vynálezu dále obsahuje alespoň jednu hydrofobní sloučeninu vybranou ze skupiny zahrnující kanabidiol, tokoferol, kurkumin, koenzym Q10, ethylferulát, resveratrol, bakuchiol, retinyl palmitát, který je enkapsulován v samouspořádaných polymerních částicích esterového konjugátu podle stávajícího vynálezu.The composition according to the present invention further contains at least one hydrophobic compound selected from the group including cannabidiol, tocopherol, curcumin, coenzyme Q10, ethyl ferulate, resveratrol, bakuchiol, retinyl palmitate, which is encapsulated in self-assembled polymer particles of the ester conjugate according to the present invention.

Kompozice podle stávajícího vynálezu dále obsahuje zahušťovadlo, které je vybráno ze skupiny obsahující xantanovou gumu, sklerotiovou gumu, guarovou gumu, celulózovou gumu, karbomer, hydroxyethylcelulózu, extrakt z kořene Amorphophallus konjac, karagenan, pululan, lecitin, lyzolecitin, akrylát sodný, akryloyldimethyl taurát sodný kopolymer nebo jejich směsi.The composition according to the present invention further contains a thickener selected from the group containing xanthan gum, sclerotia gum, guar gum, cellulose gum, carbomer, hydroxyethyl cellulose, Amorphophallus konjac root extract, carrageenan, pullulan, lecithin, lysolecithin, sodium acrylate, sodium acryloyldimethyl taurate copolymer or mixtures thereof.

Kompozice podle stávajícího vynálezu obsahuje esterový konjugát podle stávajícího vynálezu ve formě bukální náplasti.The composition according to the present invention contains the ester conjugate according to the present invention in the form of a buccal patch.

Kompozice podle stávajícího vynálezu s výhodou obsahuje další pomocný excipient, s výhodou kyselinu hyaluronovou nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl.The composition according to the present invention preferably contains another auxiliary excipient, preferably hyaluronic acid or its pharmaceutically acceptable salt.

Použití esterového konjugátu sfinoglipidu a hyaluronanu podle stávajícího vynálezu a kompozice podle stávajícího vynálezu pro ošetření bukální sliznice. Esterový konjugát sfingolipidu a hyaluronanu podle stávajícího vynálezu; nebo kompozice podle stávajícího vynálezu pro použití pro ošetření kůže.Use of a sphingolipid ester conjugate and hyaluronan according to the present invention and a composition according to the present invention for the treatment of the buccal mucosa. Ester conjugate of sphingolipid and hyaluronan according to the present invention; or compositions of the present invention for use in the treatment of skin.

Esterový konjugát sfingolipidu a hyaluronanu a kompozice podle stávajícího vynálezu pro použití v medicínském ošetření kožní nemoci vybrané ze skupiny zahrnující atopickou dermatitidu, lupénku, ichtyózu a růžovku.A sphingolipid hyaluronan ester conjugate and composition according to the present invention for use in the medical treatment of a skin disease selected from the group consisting of atopic dermatitis, psoriasis, ichthyosis and rosacea.

- 10 CZ 2023 - 171 A3- 10 CZ 2023 - 171 A3

Esterový konjugát sfingolipidu a hyaluronanu a kompozice podle stávajícího vynálezu pro použití v medicínském ošetření bukální sliznice nemoci vybrané ze skupiny obsahující aftovou stomatitidu a Behcetovu nemoc.A sphingolipid hyaluronan ester conjugate and composition according to the present invention for use in the medical treatment of a buccal mucosal disease selected from the group consisting of aphthous stomatitis and Behcet's disease.

Aplikace kompozice podle stávajícího vynálezu je topická, bukální, sublingvální subjektu, s výhodou člověku.The application of the composition according to the present invention is topical, buccal, sublingual to the subject, preferably to a person.

Použití esterového konjugátu sfingolipidu a hyaluronanu podle stávajícího vynálezu a kompozice podle stávajícího vynálezu pro kosmetické ošetření kůže.Use of the ester conjugate of sphingolipid and hyaluronan according to the present invention and the composition according to the present invention for cosmetic skin treatment.

Hyaluronová kyselina (HA, hyaluronan) je glykosaminoglykan s vysokou molekulovou hmotností složený z D-glukuronové kyseliny (GlcA) a N-acetyl-D-glukozaminu (GlcNAc) jednotek spojených střídajícími se β-(1-4) a β-(1-3)-glykosidickými vazbami. HA se nachází hojně v lidském těle a je biodegradovatelná a biokompatibilní. Amfifilní HA složená z ceramidů nebo sfingoidních bazických lipidů spojených k polysacharidové páteři zvýšila penetraci modifikované HA přes kožní bariéru do epidermálních a dermálních vrstev kůže, čímž umožňuje kožní podávání konjugátu bez injekce nebo jiného poškození kůže. Díky jejich schopnosti dodat HA k epidermálním a dermálním vrstvám ve stávajících formulacích je vhodná pro použití při dermální rejuvenaci, doplnění hyaluronanu a ceramidů a ochrannou terapii. Ceramidy jsou použity hlavně jako zvlhčovače v různých kosmetických výrobcích (Choi & Lee, 2015). Očekává se tedy synergismus po kovalentní vazbě na HA.Hyaluronic acid (HA, hyaluronan) is a high molecular weight glycosaminoglycan composed of D-glucuronic acid (GlcA) and N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) units linked by alternating β-(1-4) and β-(1- 3)-glycosidic bonds. HA is found abundantly in the human body and is biodegradable and biocompatible. Amphiphilic HA composed of ceramides or sphingoid basic lipids attached to the polysaccharide backbone increased the penetration of the modified HA across the skin barrier into the epidermal and dermal layers of the skin, thereby enabling dermal delivery of the conjugate without injection or other skin damage. Their ability to deliver HA to the epidermal and dermal layers in existing formulations makes them suitable for use in dermal rejuvenation, hyaluronan and ceramide supplementation, and protective therapy. Ceramides are mainly used as humectants in various cosmetic products (Choi & Lee, 2015). Thus, synergism is expected after covalent binding to HA.

Podle stávajícího vynálezu jsou také esterové konjugáty užitečné jako prostředek dodání pro usnadnění dermálního a transdermálního dodání kosmeticky a farmaceuticky aktivních látek přes kožní bariéru, které mohou být enkapsulovány do hydrofobního jádra. Samouspořádávání esterových konjugátů podle stávajícího vynálezu, jak je zde uvedeno, je tvoření samouspořádaných polymerních částic, které mohou enkapsulovat hydrofobní sloučeniny. V dříve publikovaném stavu techniky bylo publikováno, že pronikání do kůže je řízeno velikostí, nanostrukturou a viskozitou mikroemulzí. Menší kapénky a méně viskózní ME pronikaly do hlubších vrstev kůže a ve větším měřítku (Sahle a kol., 2014). Esterové konjugáty podle stávajícího vynálezu se mohou samouspořádávat ve vodě nebo ve vodných roztocích, zatímco tvoří samouspořádané polymerní částice (velikostní průměr 65,1 nm a polydisperzita pdi=0,384 (viz Obr. 13)). Navíc potlačuje produkci prozánětlivého cytokinu IL-6 až o 95,3 %. (viz Obr. 15). Esterové konjugáty podle stávajícího vynálezu mohou být také mrazově vysušeny a vytvořit bukální náplasti pro vnitřní aplikaci na bukální sliznici. V jednom aspektu je spodní limit hmotnostní průměrné molekulární hmotnosti hyaluronanu zde užitečné od 3 000 g/mol, 6 000 g/mol, 10 000 g/mol, 20 000 g/mol, 50 000 g/mol, 60 000 g/mol, 70 000 g/mol, 80 000 g/mol, 90 000 g/mol nebo 100 000 g/mol a horní limit je 200 000 g/mol, 300 000 g/mol, 400 000 g/mol, 500 000 g/mol, 600 000 g/mol, 700 000 g/mol a 1 600 000 g/mol. V jednom aspektu má HA molekulární hmotnost od 6 000 g/mol do 20 000 g/mol.According to the present invention, ester conjugates are also useful as a delivery vehicle to facilitate dermal and transdermal delivery of cosmetically and pharmaceutically active substances across the skin barrier, which can be encapsulated in a hydrophobic core. Self-assembly of the ester conjugates of the present invention, as described herein, is the formation of self-assembled polymer particles that can encapsulate hydrophobic compounds. In the previously published state of the art, it has been reported that skin penetration is controlled by the size, nanostructure and viscosity of microemulsions. Smaller droplets and less viscous ME penetrated deeper skin layers and on a larger scale (Sahle et al., 2014). The ester conjugates of the present invention can self-assemble in water or aqueous solutions while forming self-assembled polymer particles (size diameter 65.1 nm and polydispersity pdi=0.384 (see Fig. 13)). In addition, it suppresses the production of the pro-inflammatory cytokine IL-6 by up to 95.3%. (see Fig. 15). The ester conjugates of the present invention may also be freeze-dried to form buccal patches for internal application to the buccal mucosa. In one aspect, the lower limit of the mass average molecular weight of hyaluronan useful herein is from 3,000 g/mol, 6,000 g/mol, 10,000 g/mol, 20,000 g/mol, 50,000 g/mol, 60,000 g/mol, 70,000 g/mol, 80,000 g/mol, 90,000 g/mol or 100,000 g/mol and the upper limit is 200,000 g/mol, 300,000 g/mol, 400,000 g/mol, 500,000 g/mol , 600,000 g/mol, 700,000 g/mol and 1,600,000 g/mol. In one aspect, the HA has a molecular weight of from 6,000 g/mol to 20,000 g/mol.

Výhodné jsou takové sfingolipidy, které se mohou nacházet v lidské kůži, jako je N-oleoylfytosfíngosin - Ceramid NP 18:1Sphingolipids that can be found in human skin are preferred, such as N-oleoylphytosphingosine - Ceramide NP 18:1

- 11 CZ 2023 - 171 A3- 11 CZ 2023 - 171 A3

OHOH

nebo A^-(2-hydroxyoctadecanoyl)phytosphingosine - Ceramid AP 18or A^-(2-hydroxyoctadecanoyl)phytosphingosine - Ceramide AP 18

OHOH

Dále mohou být použity jiné sfingolipidy podle obecného vzorce III. R1 je s výhodou vybraný ze skupiny zahrnující dodecyl, tridecyl, pentadecyl, hexadecyl, heptadecyl, oktadecyl, výhodněji tridecyl.Furthermore, other sphingolipids according to general formula III can be used. R 1 is preferably selected from the group comprising dodecyl, tridecyl, pentadecyl, hexadecyl, heptadecyl, octadecyl, more preferably tridecyl.

R2 je s výhodou vybraný ze skupiny obsahující (Z)-heptadec-8-en-1 -yl (6Z,9Z)-heptadeca6,9-dien-l-yl, pentakosyl, trikosyl, henikosyl, nonadecyl, heptadecyl, pentadecyl; 1hydroxyalkyl nebo ω-hydroxyalkyl, výhodněji vybraný ze skupiny obsahující 1hydroxypentakosyl, 1-hydroxytrikosyl, 1-hydroxyhenikosyl, 1-hydroxynonadecyl, 1hydroxyheptadecyl, 1-hydroxypentadecyl, ω-hydroxyheptakosyl, ω-hydroxynonakosyl, ω-hydroxyhentriakontyl. Nejlepší je (Z)-heptadec-8-en-l-yl, 1-hydroxyheptadecyl, 1hydroxytrikosyl, 1 -hydroxypentadecyl.R 2 is preferably selected from the group containing (Z)-heptadec-8-en-1-yl (6Z,9Z)-heptadeca6,9-dien-1-yl, pentacosyl, tricosyl, henicosyl, nonadecyl, heptadecyl, pentadecyl; 1-hydroxyalkyl or ω-hydroxyalkyl, preferably selected from the group containing 1-hydroxypentacosyl, 1-hydroxytricosyl, 1-hydroxyhenicosyl, 1-hydroxynonadecyl, 1-hydroxyheptadecyl, 1-hydroxypentadecyl, ω-hydroxyheptacosyl, ω-hydroxynonacosyl, ω-hydroxyhentriacontyl. Best is (Z)-heptadec-8-en-1-yl, 1-hydroxyheptadecyl, 1-hydroxytricosyl, 1-hydroxypentadecyl.

ω-Hydroxyl alkylových řetězců může být dále esterifikován jinou, typicky nenasycenou karboxylovou kyselinou. Tato modifikace vytvoří vnitřní esterovou skupinu v řetězci mastné kyseliny, jak lze vidět v Ceramides EOS, EOP, EOdS; zatímco výhodný R2 podle obecného vzorce III je 29-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dienoyloxy]nonacosyl. Příklady dalších ceramidových tříd jsou ukázány na následujícím obrázku.ω-Hydroxyl of alkyl chains can be further esterified with another, typically unsaturated carboxylic acid. This modification creates an internal ester group in the fatty acid chain, as seen in Ceramides EOS, EOP, EOdS; while the preferred R 2 of formula III is 29-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoyloxy]nonacosyl. Examples of other ceramide classes are shown in the figure below.

- 12 CZ 2023 - 171 A3- 12 CZ 2023 - 171 A3

Ceramide EOS (d18:1/h30:0/18:2)Ceramide EOS (d18:1/h30:0/18:2)

OO

První krok ve způsobu syntézy esterového konjugátu sfingolipidu a hyaluronanu podle stávajícího vynálezu je reakce sfingolipidu obecného vzorce II s linkerem, což je zbytek 5 kyseliny jantarové nebo zbytek kyseliny maleinové, a který je přidán do reakční směsi ve formě sukcinanhydridu nebo maleinanhydridu. V tomto kroku je sfingolipid obecného vzorce II rozpuštěn v organických rozpouštědlech THF nebo DMSO nebo dichlormethan, s výhodou v přítomnosti inertní atmosféry poskytnuté plyny dusík nebo argon. Potom je přidána organická báze a sukcinanhydrid nebo maleinanhydrid. Reakce je provedena při ίο 0 °C až 50 °C po dobu 4 až 20 hodin, s výhodou 6 až 8 hodin v rozsahu teplot od 0 °C do 40 °C, a následuje míchání při teplotě v rozsahu od 0 °C do 29 °C, s výhodou při teplotě místnosti 5 až 24 hodin, výhodněji 16 až 20 hodin. Avšak inertní atmosféra není nutná pro úspěšné provedení reakce.The first step in the method of synthesizing the ester conjugate of sphingolipid and hyaluronan according to the present invention is the reaction of the sphingolipid of the general formula II with the linker, which is a succinic acid residue or a maleic acid residue, and which is added to the reaction mixture in the form of succinic anhydride or maleic anhydride. In this step, the sphingolipid of general formula II is dissolved in organic solvents THF or DMSO or dichloromethane, preferably in the presence of an inert atmosphere provided by nitrogen or argon gases. An organic base and succinic anhydride or maleic anhydride are then added. The reaction is carried out at 0°C to 50°C for 4 to 20 hours, preferably 6 to 8 hours in the temperature range of 0°C to 40°C, followed by stirring at a temperature in the range of 0°C to 29 °C, preferably at room temperature for 5 to 24 hours, more preferably 16 to 20 hours. However, an inert atmosphere is not necessary for the reaction to be successful.

- 13 CZ 2023 - 171 A3- 13 CZ 2023 - 171 A3

Druhý krok (aktivace) zahrnuje přípravu aktivovaného sfingolipidu s linkerem obecného vzorce VI v organickém rozpouštědle. Výhodná rozpouštědla použitá v reakci jsou isopropanol, terc.butanol, THF, 1,4-dioxan, acetonitril a DMSO. Teplota aktivace je klíčová pro vznik meziproduktu. Aktivační reakce je provedena mezi 0 až 70 °C. Reakce je provedena v době od 1 do 30 minut. S výhodou je aktivační reakce provedena mezi 35 až 60 °C. Výhodněji je aktivační reakce provedena při 40 °C. Aktivace sfingolipidů může být provedena aktivačními činidly popsanými ve stavu techniky, tj. 1,1’carbonyldiimidazole (CDI), tetramethyl-O-(N-succinimidyl)uronium hexafluorofosfát (HSTU) nebo benzoylchlorid. Aktivační činidla CDI a HSTU produkovaly nízký stupeň chemické modifikace HA (do 2,8 %). Také tyto aktivátory reagovaly za bezvodých podmínek, jak je ukázáno v Příkladech. Aktivační činidlo benzoylchlorid poskytuje pozoruhodné výhody. Výhodou benzoylchloridu v aktivační reakci je krátká doba aktivace.The second step (activation) involves the preparation of an activated sphingolipid with a linker of general formula VI in an organic solvent. Preferred solvents used in the reaction are isopropanol, tert-butanol, THF, 1,4-dioxane, acetonitrile and DMSO. The activation temperature is key to the formation of the intermediate product. The activation reaction is carried out between 0 and 70 °C. The reaction is carried out within 1 to 30 minutes. Advantageously, the activation reaction is carried out between 35 and 60 °C. More preferably, the activation reaction is carried out at 40°C. Activation of sphingolipids can be carried out by activating agents described in the state of the art, i.e. 1,1'carbonyldiimidazole (CDI), tetramethyl-O-(N-succinimidyl)uronium hexafluorophosphate (HSTU) or benzoyl chloride. Activators CDI and HSTU produced a low degree of chemical modification of HA (up to 2.8%). Also, these activators reacted under anhydrous conditions as shown in the Examples. The activator benzoyl chloride provides remarkable benefits. The advantage of benzoyl chloride in the activation reaction is the short activation time.

Třetí krok je esterifikace HA aktivovaným sfingolipidem s linkerem obecného vzorce VI, která pokračuje za nízkých teplot (od 0 do 25 °C). Tato reakce je provedena ve vodě smísené s organickým rozpouštědlem mísitelným s vodou nebo ve s vodou mísitelném organickém rozpouštědle.The third step is the esterification of HA with an activated sphingolipid with a linker of general formula VI, which proceeds at low temperatures (from 0 to 25 °C). This reaction is carried out in water mixed with a water-miscible organic solvent or in a water-miscible organic solvent.

Mezi výhodami tohoto způsobu podle stávajícího vynálezu jsou vysoká účinnost ve druhém kroku aktivace a třetím kroku esterifikace a možnost provedení HA esterifikace ve směsi vody a s vodou mísitelným organickým rozpouštědlem (1:1 obj./obj.), což umožňuje rozpuštění hyaluronátu sodného přímo ve vodě. Konverzi hyaluronátu sodného na TBA sůl nebo kyselou formu před modifikací se tedy dá vyhnout.Among the advantages of this method according to the present invention are high efficiency in the second step of activation and the third step of esterification and the possibility of carrying out HA esterification in a mixture of water and a water-miscible organic solvent (1:1 v/v), which allows the dissolution of sodium hyaluronate directly in water . Thus, conversion of sodium hyaluronate to the TBA salt or acid form prior to modification can be avoided.

Podle způsobu stávajícího vynálezu je esterifikační reakce udržována za konstantního míchání 1 až 72 hodin, s výhodou 2 hodiny. Tato reakce je vysoce selektivní a finální esterifikační produkty se vyznačují tím, že alespoň jedna z hydroxylových skupin HA je esterifikována aktivovaným sfingolipidem s linkerem obecného vzorce VI. Esterifikací HA s aktivovaným sfingolipidem s linkerem obecného vzorce VI lze dosáhnout DS až 15% (mol/mol) použitím aktivačního činida benzoylchloridu. Naopak jiné zmíněné aktivační činidla vyžadují přeměnu hyaluronátu sodného na kyselou formu kyseliny hyaluronové, aby byla rozpuštěna v bezvodém DMSO.According to the method of the present invention, the esterification reaction is maintained under constant stirring for 1 to 72 hours, preferably 2 hours. This reaction is highly selective and the final esterification products are characterized by the fact that at least one of the hydroxyl groups of HA is esterified with an activated sphingolipid with a linker of general formula VI. By esterifying HA with an activated sphingolipid with a linker of general formula VI, a DS of up to 15% (mol/mol) can be achieved using the activating agent benzoyl chloride. Conversely, other mentioned activation agents require the conversion of sodium hyaluronate to the acidic form of hyaluronic acid to be dissolved in anhydrous DMSO.

Esterový konjugát sfingolipidu a hyaluronanu podle stávajícího vynálezu usnadňuje jeho pronikání v 1 až 15% (mol/mol) přes kožní bariéru do vrstev dermis a epidermis. Zejména tyto esterové konjugáty obsahují sfingolipidy, které jsou kovalentně připojeny na hyaluronan. Stávající vynález poskytuje chemickou modifikaci hyaluronanu provedenou ve vodu-obsahujícím rozpouštědle aplikovatelnou průmyslově. Esterové konjugáty připravené způsobem podle stávajícího vynálezu se mohou samouspořádávat ve vodě nebo vodných rozpouštědlech do samouspořádaných polymerních částic. Samouspořádávací esterové konjugáty podle stávajícího vynálezu mohou také tvořit samouspořádané polymerní částice s enkapsulovanými aktivními látkami vybranými ze skupiny zahrnující kurkumin, tokoferol, kanabidiol, koenzym Q10, ethylferulát a mikonazol. Aktivní látka je enkapsulovaná do konjugátů s výhodou v propan-2-ol vodných roztocích. Průměrná velikost samouspořádaných polymerních částic ve vodě nebo vodných roztocích solí je v rozsahu od 10 nm do 10 000 nm objemu. Výhodná průměrná velikost samouspořádaného esterového konjugátu je v rozsahu od 10 nm do 100 nm objemu.The ester conjugate of sphingolipid and hyaluronan according to the present invention facilitates its penetration in 1 to 15% (mol/mol) through the skin barrier into the dermis and epidermis layers. In particular, these ester conjugates contain sphingolipids that are covalently attached to hyaluronan. The present invention provides an industrially applicable chemical modification of hyaluronan carried out in a water-containing solvent. Ester conjugates prepared by the method according to the present invention can self-assemble in water or aqueous solvents into self-assembled polymer particles. The self-assembled ester conjugates of the present invention can also form self-assembled polymer particles with encapsulated active substances selected from the group including curcumin, tocopherol, cannabidiol, coenzyme Q10, ethyl ferulate and miconazole. The active substance is encapsulated in conjugates preferably in propan-2-ol aqueous solutions. The average size of self-assembled polymer particles in water or aqueous salt solutions ranges from 10 nm to 10,000 nm in volume. A preferred average size of the self-assembled ester conjugate is in the range of 10 nm to 100 nm in volume.

- 14 CZ 2023 - 171 A3- 14 CZ 2023 - 171 A3

Dále je esterový konjugát podle stávajícího vynálezu schopen potlačit produkci prozánětlivého cytokinu IL-6 až o 95 %. Připravené esterové konjugáty by mohly být použity v různých kapalných (například sérum) nebo polopevných (například obličejový krém) nebo pevných (například bukální náplast) formách.Furthermore, the ester conjugate according to the present invention is capable of suppressing the production of the pro-inflammatory cytokine IL-6 by up to 95%. The prepared ester conjugates could be used in a variety of liquid (eg serum) or semi-solid (eg facial cream) or solid (eg buccal patch) forms.

Připravené esterové konjugáty sfingolipidu a hyaluronanu podle stávajícího vynálezu jsou ve vodě rozpustné, a proto mohou být zahrnuty ve vodné fázi kapaliny, polopevné látky nebo pevných kompozic v množstvích od 0,001 až 7,5 % (hmotn./hmotn.), s výhodou od 0,001 do 5 % (hmotn./hmotn.); a také mohou být použity s enkapsulovanou hydrofobní aktivní látkou. Kompozice je s výhodou vybraná ze skupiny zahrnující emulzi (olej-vévodě, voda v oleji, mikro- nebo nano-emulzi, sérum (vodný nebo hydro-alkoholový roztok nebo gel, sterilní nebo nesterilní), bezvodý gel, pasta, disperze vezikul, prášek, nanovlákna, makro-, mikro- nebo nano-kapsule, makro-, mikro nebo nanosféry, lipozomy, oleosomy nebo chylomikrony, makro-, mikro- nebo nano-houby, které mohou být adsorbovány na organické polymerní prášky, mastky, bentonity a další anorganické nebo organické podpory. Kompozice obsahuje alespoň jeden kosmetický nebo farmaceutický excipient vybraný ze skupiny obsahující olej, vosk, máslo, emulgátor, pomocnou aktivní složku, konzervant nebo zahušťovadlo.The prepared ester conjugates of sphingolipid and hyaluronan according to the present invention are water soluble and therefore can be included in the aqueous phase of a liquid, semi-solid or solid compositions in amounts from 0.001 to 7.5% (w/w), preferably from 0.001 up to 5% (w/w); and can also be used with an encapsulated hydrophobic active ingredient. The composition is preferably selected from the group comprising an emulsion (oil-in-oil, water-in-oil, micro- or nano-emulsion, serum (aqueous or hydro-alcoholic solution or gel, sterile or non-sterile), anhydrous gel, paste, vesicle dispersion, powder , nanofibers, macro-, micro- or nano-capsules, macro-, micro- or nanospheres, liposomes, oleosomes or chylomicrons, macro-, micro- or nano-sponges that can be adsorbed on organic polymer powders, talc, bentonite and others inorganic or organic support The composition contains at least one cosmetic or pharmaceutical excipient selected from the group consisting of oil, wax, butter, emulsifier, auxiliary active ingredient, preservative or thickener.

DefiniceDefinition

DS = stupeň substituce =100 % * molární množství navázaného substituentu/molární množství polysacharidových dimerů. Stanovení stupně substituce bylo provedeno NMR.DS = degree of substitution = 100% * molar amount of attached substituent/molar amount of polysaccharide dimers. The degree of substitution was determined by NMR.

Hmotnostně střední molekulární hmotnost nativní použité HA byla stanovena SECMALLS metodou před chemickou modifikací.The weight average molecular weight of the native HA used was determined by the SECMALLS method before chemical modification.

Termín „teplota místnosti“ označuje teplotní rozsah od 22 °C do 25 °C.The term "room temperature" refers to the temperature range from 22 °C to 25 °C.

Ekvivalent (ekv.) se vztahuje k dimeru hyaluronové kyseliny nebo sfingolipidu s linkerem obecného vzorce V. Je to molární ekvivalent, pokud není uvedeno jinak.Equivalent (eq) refers to a dimer of hyaluronic acid or sphingolipid with a linker of general formula V. It is a molar equivalent unless otherwise stated.

Termín „samouspořádaná polymerní částice“ označuje organizované makromolekulární jednotky esterového konjugátu podle stávajícího vynálezu uspořádané do struktur nekovalentními interakcemi s průměrem částic v rozsahu od 10 do 10 000 nm, objemu. Výhodný průměr samouspořádaných částic esterového konjugátu je v rozsahu 10 nm až 100 nm objemu.The term "self-assembled polymer particle" refers to the organized macromolecular units of the ester conjugate of the present invention arranged into structures by non-covalent interactions with particle diameters ranging from 10 to 10,000 nm, volume. The preferred diameter of the self-assembled particles of the ester conjugate is in the range of 10 nm to 100 nm in volume.

Detailní popis obrázkůDetailed description of images

Obr. 1. Editované 1H NMR 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4oxobutanové kyseliny v CDCl3.fig. 1. Edited 1H NMR of 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4oxobutanoic acid in CDCl 3 .

Obr. 2. FT-IR spektrum 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4oxobutanové kyseliny.fig. 2. FT-IR spectrum of 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4oxobutanoic acid.

Obr. 3. (A) Derivát 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4oxobutanové kyseliny rozpuštěný v D2O a (B) 1H NMR spektra nativního 6 000 g/mol hyaluronanu sodného rozpuštěného v D2O.fig. 3. (A) 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4oxobutanoic acid derivative dissolved in D2O and (B) 1 H NMR spectrum of native 6,000 g/mol sodium hyaluronan dissolved in D2O.

- 15 CZ 2023 - 171 A3- 15 CZ 2023 - 171 A3

Obr. 4. Editované NMR spektrum heteronukleární singletové kvantové koherence derivátu 4-(((2 k ,3 k ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobutanové kyseliny a hyaluronanu sodného (15 000 g/mol) se signály přiřazenými struktuře.fig. 4. Edited heteronuclear singlet quantum coherence NMR spectrum of the derivative 4-(((2 k ,3 k ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanoic acid and sodium hyaluronan (15,000 g/ mol) with signals assigned to the structure.

Obr. 5. FT-IR spektrum (A) nativního hyaluronanu sodného (6 000 g.mol-1), (B) derivátu 4-(((2 k ,3 k ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobutanové kyseliny a hyaluronanu sodného a (C) 4-(((2k,3k,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4oxobutanové kyseliny.fig. 5. FT-IR spectrum of (A) native sodium hyaluronan (6,000 g.mol -1 ), (B) derivative 4-(((2 k ,3 k ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl )oxy)-4-oxobutanoic acid and sodium hyaluronan and (C) 4-(((2k,3k,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4oxobutanoic acids.

Obr. 6. Editované 1H NMR spektrum 4-(((2 k ,3 k,4 R )-3,4-dihydroxy-2oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobutanové kyseliny v DMSO-de se signály přiřazenými struktuře.fig. 6. Edited 1H NMR spectrum of 4-(((2 k ,3 k ,4 R )-3,4-dihydroxy-2oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanoic acid in DMSO-de with signals assigned to the structure.

Obr. 7. FT-IR spektrum 4-(((2k,3k,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4oxobutanové kyseliny.fig. 7. FT-IR spectrum of 4-(((2k,3k,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4oxobutanoic acid.

Obr. 8. Editované 1H NMR spektrum derivátu 4-(((2k,3k,4R)-3,4-dihydroxy-2oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobutanové kyseliny a hyaluronanu sodného.fig. 8. Edited 1H NMR spectrum of a derivative of 4-(((2k,3k,4R)-3,4-dihydroxy-2oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanoic acid and sodium hyaluronan.

Obr. 9. DOSY NMR spektrum derivátu 4-(((2 k ,3 k,4 R )-3,4-dihydroxy-2oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobutanové kyseliny a hyaluronanu sodného (15 000 g.mol-1) v deuterované vodě: acetonitril (4:1). Signály seřazeny přibližně v jedné linii (zejména methylen a methylové skupiny) ukazují modifikaci hyaluronanu.fig. 9. DOSY NMR spectrum of the derivative 4-(((2 k ,3 k,4 R )-3,4-dihydroxy-2oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanoic acid and sodium hyaluronan (15,000 g.mol -1 ) in deuterated water: acetonitrile (4:1). Signals aligned approximately in one line (mainly methylene and methyl groups) indicate hyaluronan modification.

Obr. 10. (A) FT-IR spektrum nativního hyaluronanu sodného a (B) derivátu 4(((2k,3k,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobutanové kyseliny a hyaluronanu sodného.fig. 10. (A) FT-IR spectrum of native sodium hyaluronan and (B) a derivative of 4(((2k,3k,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanoic acid and sodium hyaluronan.

Obr. 11. Buněčná viabilita NIH-3T3 fibroblastů po treatmentu derivátem 4-(((2 k ,3 k ,4 R)3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanové kyseliny a hyaluronanu sodného připraveným podle Příkladů 12, 13, 14, 18 a 17 (zleva doprava) po 24 h, 48 h, a 72 h.fig. 11. Cell viability of NIH-3T3 fibroblasts after treatment with a derivative of 4-(((2 k ,3 k ,4 R )3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanoic acid and sodium hyaluronan prepared according to Examples 12, 13, 14, 18 and 17 (from left to right) after 24 h, 48 h and 72 h.

Obr. 12. Penetrace derivátů 4-(((2 k ,3 k ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4oxobutanové kyseliny a hyaluronanu sodného s nekovalentně navázanou Nilskou červení v prasečí kůži.fig. 12. Penetration of derivatives of 4-(((2 k ,3 k ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4oxobutanoic acid and sodium hyaluronan with non-covalently bound Nile red in pig skin.

Obr. 13. Stanovení velikosti samouspořádaných polymerních částic esterového konjugátu ve vodě, připravených podle Příkladu 10 s použitím dynamického rozptylu světla.fig. 13. Determination of the size of the self-assembled polymer particles of the ester conjugate in water, prepared according to Example 10, using dynamic light scattering.

Obr. 14. Populace velikostí několika připravených sodných solí esterových konjugátů připravených podle Příkladu 12 až Příkladu 14.fig. 14. Size population of several prepared sodium salts of ester conjugates prepared according to Example 12 to Example 14.

Obr. 15. Imunomodulační vlastnosti sodné soli esterového konjugátu připraveného podle Příkladů 14 a 17 v porovnání s odpovídajícím volným ceramidem NP 18:1 a nativním hyaluronátem sodným (6 kDa).fig. 15. Immunomodulatory properties of the sodium salt of the ester conjugate prepared according to Examples 14 and 17 compared to the corresponding free ceramide NP 18:1 and native sodium hyaluronate (6 kDa).

Poznámky k Obr. 15:Notes on Fig. 15:

Koncentrace volného ceramidu NP 18:1 odpovídající ceramidu NP 18:1 navázanému na konjugát připravený podle Příkladu 14.Concentration of free ceramide NP 18:1 corresponding to ceramide NP 18:1 bound to the conjugate prepared according to Example 14.

- 16 CZ 2023 - 171 A3- 16 CZ 2023 - 171 A3

Koncentrace volného ceramidu NP 18:1 odpovídající ceramidu NP 18:1 navázanému na konjugát připravený podle Příkladu 11.Concentration of free ceramide NP 18:1 corresponding to ceramide NP 18:1 bound to the conjugate prepared according to Example 11.

PříkladyExamples

Příklad 1Example 1

Příprava 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobutanové kyselinyPreparation of 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanoic acid

K roztoku (Z) - N-[(2 S ,3 S ,4 R )-1,3,4-trihydroxyoktadekan-2-yl]oktadec-9-enamid (200 mg, 0,344 mmol) v 2.2 ml THF a triethylaminu (TEA, 20 μl, 0,148 mmol), byl po kapkách přidán roztok sukcinanhydridu (51,6 mg, 0,516 mmol) v 0,5 mL THF pod dusíkem. Výsledná směs byla zahřáta na 40 °C 6 h a následně za míchání 16 h při 25 °C. Reakční směs byla zakoncentrována za sníženého tlaku, rozpuštěna v CHCh (10 ml) a propláchnuta demineralizovanou vodou (4x 10 ml). Organická frakce byla zakoncentrována za sníženého tlaku pro získání bezbarvého vosku. Výtěžek: 96 %. Regioselektivita primární hydroxylové modifikace: 75 %To a solution of (Z)-N-[(2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoctadecan-2-yl]octadec-9-enamide (200 mg, 0.344 mmol) in 2.2 mL of THF and triethylamine (TEA, 20 μL, 0.148 mmol), a solution of succinic anhydride (51.6 mg, 0.516 mmol) in 0.5 mL THF was added dropwise under nitrogen. The resulting mixture was heated to 40 °C for 6 h and then stirred for 16 h at 25 °C. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure, dissolved in CHCl 2 (10 mL) and rinsed with demineralized water (4x 10 mL). The organic fraction was concentrated under reduced pressure to give a colorless wax. Yield: 96%. Regioselectivity of primary hydroxyl modification: 75%

1H NMR (CDCl3, 700 MHz) signály: δ 11,51 ppm (br. s, 1H), 6,48-6,40 ppm (d, 1H), 5,325,23 (m, 2H), 4,88-4,80 (m, 0,25H), 4,57-4,50 (m, 0,25H), 4,47-4,42 (dd, J=11,9 Hz, 0,75H), 4,24-4,20 (dd, J=11,6 Hz, 0,75H), 4,18-4,13 (m, 1H), 3,60-3,50 (m, 2H), 2,65-2,54 (m, 4H) 2,19-2,09 (m, 2H), 2,0-1,88 (m, 4H) 1,60-1,40 (m, 4H), 1,32-1,05 (m, 44H), 0,81 (m, 6H).1H NMR (CDCl3, 700 MHz) signals: δ 11.51 ppm (br. s, 1H), 6.48-6.40 ppm (d, 1H), 5.325.23 (m, 2H), 4.88- 4.80 (m, 0.25H), 4.57-4.50 (m, 0.25H), 4.47-4.42 (dd, J=11.9 Hz, 0.75H), 4, 24-4.20 (dd, J=11.6 Hz, 0.75H), 4.18-4.13 (m, 1H), 3.60-3.50 (m, 2H), 2.65- 2.54 (m, 4H) 2.19-2.09 (m, 2H), 2.0-1.88 (m, 4H) 1.60-1.40 (m, 4H), 1.32- 1.05 (m, 44H), 0.81 (m, 6H).

Příklad 2Example 2

Příprava 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanové kyselinyPreparation of 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanoic acid

K roztoku (Z)-N-[(2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoktadekan-2-yl]oktadec-9-enamidu (20 g, 34,367 mmol) v 690 ml THF a triethylaminu (TEA, 3,832 ml, 27,494 mmol) byl přidán roztok sukcinanhydridu (5,155 g, 51,551 mmol) v 110 ml THF. Výsledná směs byla zahřívána na 40 °C 6 h a následně míchána 16 h při 25 °C. Reakční směs byla zakoncentrována za sníženého tlaku, rozpuštěna v CHCl3 (600 ml) a promyta demineralizovanou vodou (4x 200 ml). Organická frakce byla zakoncentrována za sníženého tlaku. Zbytek byl rozpuštěn v 50 ml propan-2-olu a zakoncentrován za sníženého tlaku pro získání bezbarvého vosku. Výtěžek: 99 %. Regioselektivita primární hydroxylové modifikace: 65 %To a solution of (Z)-N-[(2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoctadecan-2-yl]octadec-9-enamide (20 g, 34.367 mmol) in 690 mL of THF and triethylamine (TEA, 3.832 mL, 27.494 mmol) was added to a solution of succinic anhydride (5.155 g, 51.551 mmol) in 110 mL of THF. The resulting mixture was heated to 40 °C for 6 h and then stirred for 16 h at 25 °C. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure, dissolved in CHCl 3 (600 mL) and washed with demineralized water (4x 200 mL). The organic fraction was concentrated under reduced pressure. The residue was dissolved in 50 mL of propan-2-ol and concentrated under reduced pressure to give a colorless wax. Yield: 99%. Regioselectivity of primary hydroxyl modification: 65%

1H NMR (CDCl3, 700 MHz) signály: δ 11,51 ppm (br. s, 1H), 6,48-6,40 ppm (d, 1H), 5,325,23 (m, 2H), 4,88-4,80 (m, 0,35H), 4,57-4,50 (m, 0,35H), 4,47-4,42 (dd, J=11,9 Hz, 0,65H), 4,24-4,20 (dd, J=11,6 Hz, 0,65H), 4,18-4,13 (m, 1H), 3,60-3,50 (m, 2H), 2,65-2,54 (m, 4H) 2,19-2,09 (m, 2H), 2,0-1,88 (m, 4H) 1,60-1,40 (m, 4H), 1,32-1,05 (m, 44H), 0,81 (m, 6H).1H NMR (CDCl3, 700 MHz) signals: δ 11.51 ppm (br. s, 1H), 6.48-6.40 ppm (d, 1H), 5.325.23 (m, 2H), 4.88- 4.80 (m, 0.35H), 4.57-4.50 (m, 0.35H), 4.47-4.42 (dd, J=11.9 Hz, 0.65H), 4, 24-4.20 (dd, J=11.6 Hz, 0.65H), 4.18-4.13 (m, 1H), 3.60-3.50 (m, 2H), 2.65- 2.54 (m, 4H) 2.19-2.09 (m, 2H), 2.0-1.88 (m, 4H) 1.60-1.40 (m, 4H), 1.32- 1.05 (m, 44H), 0.81 (m, 6H).

- 17 CZ 2023 - 171 A3- 17 CZ 2023 - 171 A3

Příklad 3Example 3

Příprava 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanové kyselinyPreparation of 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanoic acid

K roztoku (Z)-N-[(2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoktadekan-2-yl]oktadec-9-enamidu (20 g, 34,367 mmol) v 690 ml 1,4-dioxanu a triethylamin (TEA, 3,832 ml, 27,494 mmol) byl přidán roztok sukcinanhydridu (5,155 g, 51,551 mmol) ve 110 ml 1,4-dioxanu. Výsledná směs byla zahřívána při 40 °C 6 hodin a potom míchána 16 h při 25 °C. Reakční směs byla zakoncentrována za sníženého tlaku, rozpuštěna v CHCh (600 ml) a promyta demineralizovanou vodou (4x 200 ml). Organická frakce byla zakoncentrována za sníženého tlaku. Zbytek byl rozpuštěn v 50 ml propan-2-olu a zakoncentrován za sníženého tlaku pro získání bezbarvého vosku. Výtěžek: 99 %. Regioselektivita primární hydroxylové modifikace: 63 %To a solution of (Z)-N-[(2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoctadecan-2-yl]octadec-9-enamide (20 g, 34.367 mmol) in 690 mL of 1,4-dioxane and triethylamine (TEA, 3.832 mL, 27.494 mmol) was added a solution of succinic anhydride (5.155 g, 51.551 mmol) in 110 mL of 1,4-dioxane. The resulting mixture was heated at 40 °C for 6 h and then stirred at 25 °C for 16 h. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure, dissolved in CHCl 2 (600 mL) and washed with demineralized water (4x 200 mL). The organic fraction was concentrated under reduced pressure. The residue was dissolved in 50 mL of propan-2-ol and concentrated under reduced pressure to give a colorless wax. Yield: 99%. Regioselectivity of primary hydroxyl modification: 63%

1H NMR (CDCl3, 700 MHz) signály: δ 11,51 ppm (br. s, 1H), 6,48-6,40 ppm (d, 1H), 5,325,23 (m, 2H), 4,88-4,80 (m, 0,37H), 4,57-4,50 (m, 0,37H), 4,47-4,42 (dd, J=11,9 Hz, 0,63H), 4,24-4,20 (dd, J=11,6 Hz, 0,63H), 4,18-4,13 (m, 1H), 3,60-3,50 (m, 2H), 2,65-2,54 (m, 4H) 2,19-2,09 (m, 2H), 2,0-1,88 (m, 4H) 1,60-1,40 (m, 4H), 1,32-1,05 (m, 44H), 0,81 (m, 6H).1H NMR (CDCl3, 700 MHz) signals: δ 11.51 ppm (br. s, 1H), 6.48-6.40 ppm (d, 1H), 5.325.23 (m, 2H), 4.88- 4.80 (m, 0.37H), 4.57-4.50 (m, 0.37H), 4.47-4.42 (dd, J=11.9 Hz, 0.63H), 4, 24-4.20 (dd, J=11.6 Hz, 0.63H), 4.18-4.13 (m, 1H), 3.60-3.50 (m, 2H), 2.65- 2.54 (m, 4H) 2.19-2.09 (m, 2H), 2.0-1.88 (m, 4H) 1.60-1.40 (m, 4H), 1.32- 1.05 (m, 44H), 0.81 (m, 6H).

Příklad 4Example 4

Příprava 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobutanové kyselinyPreparation of 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanoic acid

K roztoku (Z)-N-[(2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoktadekan-2-yl]oktadec-9-enamidu (25 mg, 0,043 mmol) v 1,5 ml dichloromethanu (DCM), pyridinu (6,9 μl, 0,148 mmol) a DMAP (1 mg, 0,009 mmol), byl po kapkách přidáván roztok sukcinanhydridu (8,6 mg, 0,086 mmol) v 1 ml DCM pod dusíkem. Výsledná směs byla zahřívána a refluxována 24 h. Reakční směs byla zakoncentrována za sníženého tlaku, rozpuštěna v CHCl3 (2 ml) a promyta demineralizovanou vodou (4x 2 ml). Organická frakce byla zakoncentrována za sníženého tlaku pro získání bezbarvého vosku. Výtěžek: 100 %. Žádná regioselektivita nebyla pozorována.To a solution of (Z)-N-[(2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoctadecan-2-yl]octadec-9-enamide (25 mg, 0.043 mmol) in 1.5 mL dichloromethane (DCM) , pyridine (6.9 μL, 0.148 mmol) and DMAP (1 mg, 0.009 mmol), a solution of succinic anhydride (8.6 mg, 0.086 mmol) in 1 mL of DCM was added dropwise under nitrogen. The resulting mixture was heated and refluxed for 24 h. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure, dissolved in CHCl 3 (2 mL) and washed with demineralized water (4x 2 mL). The organic fraction was concentrated under reduced pressure to give a colorless wax. Yield: 100%. No regioselectivity was observed.

1H NMR (CDCl3, 700 MHz) signály: δ 11,51 (br. s, 1H), 6,48-6,40 (d, 1H), 5,32-5,23 (m, 2H), 5,16-5,10 (m, 0,13H), 5,05-4,96 (m, 0,73H), 4,96-4,87 (m, 0,59H), 4,66-4,56 (m, 0,50H), 4,34-4,21 (m, 0,48H), 4,13-4,08 (m, 0,65H), 3,80-3,64 (m, 0,49H), 3,64-3,57 (m, 0,52H) 2,65-2,54 (m, 7H) 2,19-2,09 (m, 2H), 2,0-1,88 (m, 4H) 1,60-1,40 (m, 4H), 1,321,05 (m, 44H), 0,81 (m, 6H).1H NMR (CDCl3, 700 MHz) signals: δ 11.51 (br. s, 1H), 6.48-6.40 (d, 1H), 5.32-5.23 (m, 2H), 5, 16-5.10 (m, 0.13H), 5.05-4.96 (m, 0.73H), 4.96-4.87 (m, 0.59H), 4.66-4.56 (m, 0.50H), 4.34-4.21 (m, 0.48H), 4.13-4.08 (m, 0.65H), 3.80-3.64 (m, 0, 49H), 3.64-3.57 (m, 0.52H) 2.65-2.54 (m, 7H) 2.19-2.09 (m, 2H), 2.0-1.88 ( m, 4H) 1.60-1.40 (m, 4H), 1.321.05 (m, 44H), 0.81 (m, 6H).

Příklad 5Example 5

Příprava 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobutanové kyselinyPreparation of 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanoic acid

Roztok (Z)-N-[(2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoktadekan-2-yl]oktadec-9-enamidu (50 mg, 0,086 mmol) byl připraven v THF (2,5 ml), pyridinu (13,8 μl, 0,172 mmol ) a DMAP (2,1 mg, 0,017 mmol), byl po kapkách přidáván roztok sukcinanhydridu (19,9 mg, 0,0129 mmol) v 0,5 ml THF. Výsledná směs byla zahřívána při 40 °C 6 hodin a potom míchánaA solution of (Z)-N-[(2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoctadecan-2-yl]octadec-9-enamide (50 mg, 0.086 mmol) was prepared in THF (2.5 mL) , pyridine (13.8 μl, 0.172 mmol) and DMAP (2.1 mg, 0.017 mmol), a solution of succinic anhydride (19.9 mg, 0.0129 mmol) in 0.5 mL of THF was added dropwise. The resulting mixture was heated at 40 °C for 6 hours and then stirred

- 18 CZ 2023 - 171 A3 h při 25 °C. Reakční směs byla zakoncentrována za sníženého tlaku, rozpuštěna v CHCI3 (2 ml) a promyta demineralizovanou vodou (4x 2 ml). Organická frakce byla zakoncentrována za sníženého tlaku a byl získán bezbarvý vosk. Výtěžek: 98 %. Regioselektivita modifikace primární hydroxylové skupiny byla 61 %.- 18 CZ 2023 - 171 A3 h at 25 °C. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure, dissolved in CHCl 3 (2 mL) and washed with demineralized water (4x 2 mL). The organic fraction was concentrated under reduced pressure to give a colorless wax. Yield: 98%. The regioselectivity of the modification of the primary hydroxyl group was 61%.

1H NMR (CDCI3, 700 MHz) signály: δ 11,51 (br. s, 1H), 6,69-6,64 (d, 0,229H), 6,59-6,47 (d, 0,58H), 6,22-6,15 (m, 0,13H) 5,32-5,23 (m, 2H), 4,93-4,81 (dd, 0,38H), 4,57-4,50 (m 0,35H), 4,47-4,42 (dd, J=11,9 Hz, 0,61H), 4,24-4,20 (dd, J=11,6 Hz, 0,61H), 4,18-4,13 (m, 0,61H), 3,60-3,50 (m, 2H), 2,65-2,54 (m, 4H) 2,19-2,09 (m, 2H), 2,0-1,88 (m, 4H) 1,60-1,40 (m, 4H), 1,32-1,05 (m, 44H), 0,81 (m, 6H). 1 H NMR (CDCl 3 , 700 MHz) signals: δ 11.51 (br. s, 1H), 6.69-6.64 (d, 0.229H), 6.59-6.47 (d, 0.58H ), 6.22-6.15 (m, 0.13H) 5.32-5.23 (m, 2H), 4.93-4.81 (dd, 0.38H), 4.57-4.50 (m 0.35H), 4.47-4.42 (dd, J=11.9 Hz, 0.61H) , 4.24-4.20 (dd, J=11.6 Hz, 0.61H), 4.18-4.13 (m, 0.61H), 3.60-3.50 (m, 2H), 2.65-2.54 (m, 4H) 2.19-2.09 (m, 2H), 2.0-1.88 (m, 4H) 1.60-1.40 (m, 4H), 1.32-1.05 (m, 44H), 0.81 (m, 6H).

Příklad 6Example 6

Příprava (Z)-4-(((28,38,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobut-2-enové kyseliny použitím N-methylmorfolinuPreparation of (Z)-4-(((28,38,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobut-2-enoic acid using N-methylmorpholine

K roztoku (Z)-N-[(28,38,4R)-1,3,4-trihydroxyoktadekan-2-yl]oktadec-9-enamidu (200 mg, 0,344 mmol) v 11,5 ml THF and N-methyl-morfolinu (42 μl, 0,378 mmol) byl po kapkách přidáván roztok maleinanhydridu (50 mg, 0,516 mmol) v 0.5 ml THF pod dusíkem. Reakce byla držena při teplotě místnosti 22 h. Reakční směs byla zakoncentrována a za sníženého tlaku, rozpuštěna v CHCl3 (15 ml) a promyta demineralizovanou vodou (4x 15 ml). Chloroformová frakce byla zakoncentrována za sníženého tlaku pro získání bezbarvého vosku. Výtěžek: 96 %. Regioselektivita modifikace primární hydroxylové skupiny modifikace byla 70 %.To a solution of (Z)-N-[(28,38,4R)-1,3,4-trihydroxyoctadecan-2-yl]octadec-9-enamide (200 mg, 0.344 mmol) in 11.5 mL of THF and N- of methylmorpholine (42 μl, 0.378 mmol), a solution of maleic anhydride (50 mg, 0.516 mmol) in 0.5 ml of THF was added dropwise under nitrogen. The reaction was kept at room temperature for 22 h. The reaction mixture was concentrated and under reduced pressure, dissolved in CHCl 3 (15 mL) and washed with demineralized water (4x 15 mL). The chloroform fraction was concentrated under reduced pressure to give a colorless wax. Yield: 96%. The regioselectivity of the modification of the primary hydroxyl group of the modification was 70%.

1H NMR (DMSO-d6, 700 MHz) signály: δ 12,75 (br. s, 1H), 7,87-7,81 (d, 0,25H), 7,687,61 (d, 0,61H), 6,48-6,08 (m, 2H), 5,41-5,31 (m, 2H), 4,28-4,04 (m, 1H), 3,65-3,60 (m, 1H) 3,42-3,37 (m, 1H), 3,36-3,30 (m, 1H), 2,16-2,06 (m, 2H), 2,05-1,79 (m, 4H) 1,65-1,42 (m, 4H), 1,32-1,05 (m, 44H), 0,90-0,82 (t, 6H) 1 H NMR (DMSO-d6, 700 MHz) signals: δ 12.75 (br. s, 1H), 7.87-7.81 (d, 0.25H), 7.687.61 (d, 0.61H) , 6.48-6.08 (m, 2H), 5.41-5.31 (m, 2H), 4.28-4.04 (m, 1H), 3.65-3.60 (m, 1H) 3.42-3.37 (m, 1H), 3.36-3.30 (m, 1H) , 2.16-2.06 (m, 2H), 2.05-1.79 (m, 4H) 1.65-1.42 (m, 4H), 1.32-1.05 (m, 44H), 0.90-0.82 (t, 6H)

Příklad 7Example 7

Příprava (Z)-4-(((28,38,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobut-2-enové kyseliny použitím TEAPreparation of (Z)-4-(((28,38,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobut-2-enoic acid using TEA

K roztoku (Z) - N-[(28,38,4R )-1,3,4-trihydroxyoktadekan-2-yl]oktadec-9-enamidu (40 mg, 0,069 mmol) v 1,6 ml THF a TEA (4 μl, 0,03 mmol) byl po kapkách přidáván roztok maleinanhydridu (8,8 mg, 0,089 mmol) v 0,2 ml THF pod dusíkem. Reakce byla držena při 0 °C 7 h a následně 17 h při 25 °C. Reakční směs byla zakoncentrována za sníženého tlaku, rozpuštěna v CHCl3 (2 ml) a promyta demineralizovanou vodou (4x 2 ml). Chloroformová frakce byla zakoncentrována za sníženého tlaku pro získání bezbarvého vosku. Výtěžek: 94 %. Regioselektivita modifikace primární hydroxylové skupiny byla 60 %.To a solution of (Z)-N-[(28,38,4R)-1,3,4-trihydroxyoctadecan-2-yl]octadec-9-enamide (40 mg, 0.069 mmol) in 1.6 mL of THF and TEA ( 4 μl, 0.03 mmol) a solution of maleic anhydride (8.8 mg, 0.089 mmol) in 0.2 ml THF was added dropwise under nitrogen. The reaction was held at 0 °C for 7 h and then at 25 °C for 17 h. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure, dissolved in CHCl 3 (2 mL) and washed with demineralized water (4x 2 mL). The chloroform fraction was concentrated under reduced pressure to give a colorless wax. Yield: 94%. The regioselectivity of the modification of the primary hydroxyl group was 60%.

1H NMR (CDCl3, 700 MHz) signály: δ 12,75 (br. s, 1H), 7,48-7,36 (1H), 6,48-6,08 (m, 2H), 5,41-5,31 (m, 2H), 4,44-4,40 (dd, 0,64H), 4,40-0,35 (dd, 0,60H), 4,27-4,16 (m, 0,75H), 4,09-4,05 (m, 0,25H), 3,62-3,53 (2H), 2,16-2,06 (m, 2H), 2,05-1,79 (m, 4H), 1,651,42 (m, 4H), 1,32-1,05 (m, 44H), 0,90-0,82 (t, 6H) 1 H NMR (CDCl 3 , 700 MHz) signals: δ 12.75 (br. s, 1H), 7.48-7.36 (1H), 6.48-6.08 (m, 2H), 5.41 -5.31 (m, 2H), 4.44-4.40 (dd, 0.64H), 4.40-0.35 (dd, 0.60H), 4.27-4.16 (m, 0.75H), 4.09-4.05 (m, 0.25H), 3.62-3.53 (2H), 2.16- 2.06 (m, 2H), 2.05-1.79 (m, 4H), 1.651.42 (m, 4H), 1.32-1.05 (m, 44H), 0.90-0.82 (t, 6H)

- 19 CZ 2023 - 171 A3- 19 CZ 2023 - 171 A3

Příklad 8Example 8

Příprava 4-oxo-4-[(2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoktadekan-2-yl]aminobutanové kyseliny použitím pyridinu (2 S ,3 S ,4 R )-2-aminooktadekane-1,3,4-triol (30 mg, 0,094 mmol) byl rozpuštěn v 3,1 ml THF/CH2Cl2 (3:2; obj./obj.). Následně byl po kapkách přidán pyridin (0,002 ml, 0,019 mmol) a sukcinanhydrid (9,5 mg, 0,094 mmol) v 0,2 ml THF pod argonem. Reakce byla držena při 0 °C 7 h. Potom byla směs nechána zahřát samovolně na teplotu místnosti a následně míchána 17 h. Reakční směs byla zakoncentrována za sníženého tlaku, a zbytek byl krystalizován z ethylacetátu. Bílý precipitát byl centrifugován, dekantován a vysušen za vzniku žluté pevné látky. Výtěžek 79 %.Preparation of 4-oxo-4-[(2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoctadecan-2-yl]aminobutanoic acid using pyridine (2S,3S,4R)-2-aminooctadecane-1,3 ,4-Triol (30 mg, 0.094 mmol) was dissolved in 3.1 mL of THF/CH 2 Cl 2 (3:2; v/v). Subsequently, pyridine (0.002 mL, 0.019 mmol) and succinic anhydride (9.5 mg, 0.094 mmol) were added dropwise in 0.2 mL of THF under argon. The reaction was kept at 0 °C for 7 h. Then the mixture was allowed to warm spontaneously to room temperature and then stirred for 17 h. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure, and the residue was crystallized from ethyl acetate. The white precipitate was centrifuged, decanted and dried to give a yellow solid. Yield 79%.

1H NMR (DMSO-d6, 700 MHz) signály: δ 12,05 (br. s, 1H), 7,57 (d, J=8,9 Hz, 1H), 4,59 (s, 1H), 4,46 (s, 1H), 4,30 (s, 1H), 3,93-3,85 (m,, 1H), 3,57-3,52 (dd, J=10,7 HZ, 1H), 3,493,43 (dd, J=8,4 HZ, 1H), 3,40-3,20 (m, 2H), 2,42-2,38 (m, 2H), 2,36-2,32 (m, 2H), 1,561,47 (m, 1H), 1,46-1,37 (m, 1H), 1,32-1,14 (m, 24H), 0,87-0,82 (m, 3H).1H NMR (DMSO-d6, 700 MHz) signals: δ 12.05 (br. s, 1H), 7.57 (d, J=8.9 Hz, 1H), 4.59 (s, 1H), 4 .46 (s, 1H), 4.30 (s, 1H), 3.93-3.85 (m,, 1H), 3.57-3.52 (dd, J=10.7 HZ, 1H) , 3.493.43 (dd, J=8.4 HZ, 1H), 3.40-3.20 (m, 2H), 2.42-2.38 (m, 2H), 2.36-2.32 (m, 2H), 1.561.47 (m, 1H), 1.46-1.37 (m, 1H), 1.32-1.14 (m, 24H), 0.87-0.82 (m , 3H).

Příklad 9Example 9

Příprava 4-oxo-4-(((2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoktadekan-2-yl)amino)butanové kyseliny použitím triethylaminu (2S,3S,4R)-2-aminooctadekan-1,3,4-triol (40 mg, 0,126 mmol) byl rozpuštěn v 4,3 ml THF/CH2Cl2 (3:2; obj. / obj.). Následně byl po kapkách přidán TEA (0,002 ml, 0,025 mmol) a sukcinanhydrid (0,0139 mg, 0,139 mmol) v 0,2 ml THF pod argonem. Reakce byla držena při 0 °C 7 h. Potom byla směs nechána zahřát samovolně na teplotu místnosti a následně míchána 17 h. Reakční směs byla zakoncentrována za sníženého tlaku a zbytek byl krystalizován z ethylacetátu. Bílý precipitát byl centrifugován, dekantován a vysušen za vzniku bílé pevné látky. Výtěžek 85 %. Produkt obsahoval 36 % esterového vedlejšího produktu.Preparation of 4-oxo-4-(((2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoctadecan-2-yl)amino)butanoic acid using (2S,3S,4R)-2-aminooctadecane-1,3-triethylamine ,4-Triol (40 mg, 0.126 mmol) was dissolved in 4.3 mL of THF/CH 2 Cl 2 (3:2; v/v). Subsequently, TEA (0.002 mL, 0.025 mmol) and succinic anhydride (0.0139 mg, 0.139 mmol) in 0.2 mL of THF were added dropwise under argon. The reaction was kept at 0 °C for 7 h. Then the mixture was allowed to warm spontaneously to room temperature and then stirred for 17 h. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure and the residue was crystallized from ethyl acetate. The white precipitate was centrifuged, decanted and dried to give a white solid. Yield 85%. The product contained 36% ester by-product.

1H NMR (DMSO-d6, 700 MHz) signály: δ 12,05 (br. s, 1H), 7,66 (d, J=8,18 Hz, 0,36H), 7,57 (d, J=8,8 Hz, 0,64H), 4,18-4,13 (m, 0,66H) 4,03 (dd, J=6,7 Hz, 0,37H) 3,93-3,85 (m,, 0,64H), 3,57-3,52 (dd, J=10,7 HZ, 0,64H), 3,49-3,43 (dd, J=8,4 HZ, 0,64H), 3,40-3,20 (m, 2H), 2,42-2,38 (m, 2H), 2,36-2,32 (m, 2H), 1,56-1,47 (m, 1H), 1,46-1,37 (m, 1H), 1,321,14 (m, 24H), a 0,87-0,82 (m, 3H).1H NMR (DMSO-d6, 700 MHz) signals: δ 12.05 (br. s, 1H), 7.66 (d, J=8.18 Hz, 0.36H), 7.57 (d, J= 8.8 Hz, 0.64H), 4.18-4.13 (m, 0.66H) 4.03 (dd, J=6.7 Hz, 0.37H) 3.93-3.85 (m ,, 0.64H), 3.57-3.52 (dd, J=10.7 HZ, 0.64H), 3.49-3.43 (dd, J=8.4 HZ, 0.64H) , 3.40-3.20 (m, 2H), 2.42-2.38 (m, 2H), 2.36-2.32 (m, 2H), 1.56-1.47 (m, 1H), 1.46-1.37 (m, 1H), 1.321.14 (m, 24H), and 0.87-0.82 (m, 3H).

Příklad 10Example 10

Příprava (Z)-4-oxo-4-(((2 S ,3 S ,4 R)- 1,3,4-trihydroxyoktadekan-2-yl)amino)but-2-enové kyseliny použitím pyridinu.Preparation of (Z)-4-oxo-4-(((2 S ,3 S ,4 R )-1,3,4-trihydroxyoctadecan-2-yl)amino)but-2-enoic acid using pyridine.

(2S,3S,4R)-2-aminooktadekan-1,3,4-triol (150 mg, 0,472 mmol) byl rozpuštěn v 16,6 ml roztoku THF/CH2Cl2 (3:2; obj./obj.). Následně byl po kapkách přidán pyridin (0,008 ml, 0,094 mmol) a roztok maleinanhydridu (46,3 mg, 0,472 mmol) v 0,2 ml THF pod atmosférou argonu při 0 °C. Výsledná směs byla držena při 0 °C 7 h. Potom byla směs ponechána zahřát se samovolně na teplotu místnosti a následně byla míchána 7 h. Reakční směs byla zakoncentrována za sníženého tlaku a zbytek byl vykrystalizován z ethylacetátu.(2S,3S,4R)-2-Aminooctadecane-1,3,4-triol (150 mg, 0.472 mmol) was dissolved in 16.6 mL of THF/CH2Cl2 (3:2; v/v) solution. Subsequently, pyridine (0.008 mL, 0.094 mmol) and a solution of maleic anhydride (46.3 mg, 0.472 mmol) in 0.2 mL THF were added dropwise under an argon atmosphere at 0 °C. The resulting mixture was kept at 0 °C for 7 h. The mixture was then allowed to warm spontaneously to room temperature and was subsequently stirred for 7 h. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure and the residue was crystallized from ethyl acetate.

- 20 CZ 2023 - 171 A3- 20 CZ 2023 - 171 A3

Bílý precipitát byl centrifugován, dekantován a vysušen a vnikla bílá pevná látka. Výtěžek 85 %.The white precipitate was centrifuged, decanted and dried to give a white solid. Yield 85%.

1H NMR (DMSO-d6, 700 MHz) signály: δ 15.74 (br. s, 1H), 9.35 (br. s, 1H), 6.50 (d, J=12.58 Hz, 1H), 6.23 (d, J=12.8 Hz, 1H), 4.82 (d, J=6.0 Hz, 1H), 4.63 (s, 1H), 4.47 (d, J=6.3 HZ, 1H), 4.12-4.05 (m, 1H), 3.69-3.64 (dd, J=11.2 Hz, 1H), 3.50-3.55 (dd, J=11.2 Hz, 1H), 3.41-3.20 (m, 2H), 1.56-1.36 (m, 2H), 1.32-1.12 (m, 24H), a 0.89-0.82 (m, 3H)1H NMR (DMSO-d6, 700 MHz) signals: δ 15.74 (br. s, 1H), 9.35 (br. s, 1H), 6.50 (d, J=12.58 Hz, 1H), 6.23 (d, J=12.8 Hz, 1H), 4.82 (d, J=6.0 Hz, 1H), 4.63 (s, 1H), 4.47 (d, J=6.3 HZ, 1H), 4.12-4.05 (m, 1H), 3.69-3.64 (dd , J=11.2 Hz, 1H), 3.50-3.55 (dd, J=11.2 Hz, 1H), 3.41-3.20 (m, 2H), 1.56-1.36 (m, 2H), 1.32-1.12 (m, 24H), and 0.89-0.82 (m, 3H)

Příklad 11Example 11

Příprava 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-(2-hydroxyoktadekanamido)oktadecyl)oxy)-4oxobutanové kyselinyPreparation of 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-(2-hydroxyoctadecanamido)octadecyl)oxy)-4oxobutanoic acid

K roztoku 2-hydroxy-N-((2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoktadekan-2-yl)oktadekanamidu (60 mg, 0,100 mmol) v 2,5 ml THF a triethylaminu (TEA, 6 μ! 0,043 mmol) byl po kapkách přidán roztok sukcinanhydridu (15 mg, 0,15 mmol) v 1,5 ml THF pod dusíkem. Výsledná směs byla zahřívána na 40 °C 6 h a následně míchána 16 h při 25 °C. Reakční směs byla zakoncentrována za sníženého tlaku, rozpuštěna v CHCl3 (10 ml) a promyta demineralizovanou vodou (4x 10 ml). Organická frakce byla zakoncentrována za sníženého tlaku a byla získána bezbarvá pevná látka. Výtěžek 69 %.To a solution of 2-hydroxy-N-((2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoctadecan-2-yl)octadecanamide (60 mg, 0.100 mmol) in 2.5 mL of THF and triethylamine (TEA, 6 μ !0.043 mmol) was added dropwise to a solution of succinic anhydride (15 mg, 0.15 mmol) in 1.5 mL of THF under nitrogen. The resulting mixture was heated to 40 °C for 6 h and then stirred for 16 h at 25 °C. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure, dissolved in CHCl 3 (10 mL) and washed with demineralized water (4x 10 mL). The organic fraction was concentrated under reduced pressure to give a colorless solid. Yield 69%.

1H NMR (CDCh, 700 MHz) signály: δ 11,51 ppm (br. s, 1H), 7,4-7,000 ppm (d, 1H), 5,145,02-4,42 (dd, 1H), 4,45-4,31 (dd, 1H), 4,05-,91 (m, 1H), 3,560-3,40 (m, 2H), 2,65-2,54 (m, 4H), 1,80-1,40 (m, 4H), 1,32-1,05 (m, 58H), 0,81 (m, 6H).1H NMR (CDCh, 700 MHz) signals: δ 11.51 ppm (br. s, 1H), 7.4-7.000 ppm (d, 1H), 5.145.02-4.42 (dd, 1H), 4, 45-4.31 (dd, 1H), 4.05-.91 (m, 1H), 3.560-3.40 (m, 2H), 2.65-2.54 (m, 4H), 1.80 -1.40 (m, 4H), 1.32-1.05 (m, 58H), 0.81 (m, 6H).

Příklad 12Example 12

Příprava derivátu 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4oxobutanové kyseliny a hyaluronanu sodného použitím benzoylchloridu.Preparation of a derivative of 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4oxobutanoic acid and sodium hyaluronan using benzoyl chloride.

3,0 g hyaluronanu sodného (7,5 mmol; 6 000 g.mol-1) bylo rozpuštěno v 37,5 ml demineralizované vody. Potom bylo postupně přidáno 18,75 ml THF. Potom TEA (3,136 ml, 3 ekv.) a DMAP (46 mg; 0,05 ekv.) Současně byla rozpuštěna 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobutanová kyselina (5,115 g, 1 ekv.) v 18,75 ml THF a TEA (1,045 ml; 1 ekv.) a potom byl k roztoku přidán benzoylchlorid (0,875 ml; 1 ekv. ). Po 30 min při 60 °C byl přidán roztok k roztoku obsahujícím HA a nechán reagovat 2 h při 25 °C. Potom byla reakční směs naředěna 10 ml demineralizované vody obsahující 3,067 g NaCl. Acylovaný derivát byl izolován následnou precipitací použitím 5-násobku absolutního izopropanolu z reakční směsi. Po dekantaci byl precipitát podroben 4-krát opakované precipitaci a dekantaci. Potom byl precipitát 4-krát promyt absolutním izopropanolem pro odstranění vody z derivátu. Konečně byl precipitát vysušen při 40 °C 48 hodin.3.0 g of sodium hyaluronan (7.5 mmol; 6,000 g.mol -1 ) was dissolved in 37.5 ml of demineralized water. Then 18.75 mL of THF was added gradually. Then TEA (3.136 mL, 3 eq.) and DMAP (46 mg; 0.05 eq.) were simultaneously dissolved in 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy) -4-oxobutanoic acid (5.115 g, 1 equiv) in 18.75 mL THF and TEA (1.045 mL; 1 eq.) and then benzoyl chloride (0.875 mL; 1 eq.) was added to the solution. After 30 min at 60 °C, the solution was added to the solution containing HA and allowed to react for 2 h at 25 °C. Then the reaction mixture was diluted with 10 ml of demineralized water containing 3.067 g of NaCl. The acylated derivative was isolated by subsequent precipitation using 5 times absolute isopropanol from the reaction mixture. After decantation, the precipitate was subjected to repeated precipitation and decantation 4 times. Then the precipitate was washed 4 times with absolute isopropanol to remove water from the derivative. Finally, the precipitate was dried at 40 °C for 48 h.

DS = 14,2 % (stanoveno NMR)DS = 14.2% (determined by NMR)

Mw esterového konjugátu: 8 800 g/molMw of ester conjugate: 8,800 g/mol

1H NMR (D2O, 700 MHz) signály acylu: δ 5,5-5,22 (m, 2H, -CH=CH-), 2,9-2,36 (m, 4H, -OOC-CH2-CH2-COO), 1,8-1,2 (m, 48H, -CH2-), 0,9-0,8 (m, 6H, -CH3)1H NMR (D2O, 700 MHz) acyl signals: δ 5.5-5.22 (m, 2H, -CH=CH-), 2.9-2.36 (m, 4H, -OOC-CH2-CH2- COO), 1.8-1.2 (m, 48H, -CH2-), 0.9-0.8 (m, 6H, -CH3)

- 21 CZ 2023 - 171 A3- 21 CZ 2023 - 171 A3

Příklad 13Example 13

Příprava derivátu 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4oxobutanové kyseliny a hyaluronanu sodného použitím benzoylchloridu.Preparation of a derivative of 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4oxobutanoic acid and sodium hyaluronan using benzoyl chloride.

3,0 g hyaluronanu sodného (7,5 mmol; 6 000 g.mol-1) bylo rozpuštěno v 37,5 ml demineralizované vody. Potom bylo postupně přidáno 18,75 ml izopropylalkoholu. Potom TEA (3,136 ml, 3 ekv.) a DMAP (46 mg; 0,05 ekv.). Současně byla 4-(((2S,3S,4R)-3,4dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobutanová kyselina (5,115 g, 0,6 ekv.) rozpuštěna v 18,75 ml izopropylalkoholu a TEA (1,045 ml; 0,6 ekv.) a potom byl k roztoku přidán benzoylchlorid (0,871 ml; 0,6 ekv.). Po 30 min při 60 °C byl roztok přidán k roztoku obsahujícímu HA a ponechán reagovat 2 h při 25 °C. Potom byla reakční směs naředěna 10 ml demineralizované vody obsahující 3,067 g NaCl. Acylovaný derivát byl izolován následnou precipitací použitím 5-krát absolutního izopropanolu z reakční směsi. Po dekantaci byl precipitát podroben 4-krát opakované precipitaci a dekantaci. Potom byl precipitát 4-krát promyt absolutním izopropanolem pro odstranění vody z derivátu. Konečně byl precipitát vysušen při 40 °C 48 hodin.3.0 g of sodium hyaluronan (7.5 mmol; 6,000 g.mol -1 ) was dissolved in 37.5 ml of demineralized water. Then 18.75 ml of isopropyl alcohol was gradually added. Then TEA (3.136 mL, 3 eq.) and DMAP (46 mg; 0.05 eq.). Simultaneously, 4-(((2S,3S,4R)-3,4dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanoic acid (5.115 g, 0.6 equiv) was dissolved in 18.75 mL isopropyl alcohol and TEA (1.045 ml; 0.6 eq.) and then benzoyl chloride (0.871 ml; 0.6 eq.). After 30 min at 60 °C, the solution was added to the solution containing HA and allowed to react for 2 h at 25 °C. Then the reaction mixture was diluted with 10 ml of demineralized water containing 3.067 g of NaCl. The acylated derivative was isolated by subsequent precipitation using 5 times absolute isopropanol from the reaction mixture. After decantation, the precipitate was subjected to repeated precipitation and decantation 4 times. Then the precipitate was washed 4 times with absolute isopropanol to remove water from the derivative. Finally, the precipitate was dried at 40 °C for 48 h.

DS = 12,0 % (stanoveno NMR)DS = 12.0% (determined by NMR)

Mw esterového konjugátu: 6 600 g/molMw of ester conjugate: 6,600 g/mol

1H NMR (D2O, 700 MHz) signály acylu: δ 5,5-5,22 (m, 2H, -CH=CH-), 2,9-2,36 (m, 4H, -OOC-CH2-CH2-COO), 1,8-1,2 (m, 48H, -CH2-), 0,9-0,8 (m, 6H, -CH3)1H NMR (D2O, 700 MHz) acyl signals: δ 5.5-5.22 (m, 2H, -CH=CH-), 2.9-2.36 (m, 4H, -OOC-CH2-CH2- COO), 1.8-1.2 (m, 48H, -CH2-), 0.9-0.8 (m, 6H, -CH3)

Příklad 14Example 14

Příprava 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobutanové kyseliny derivátu hyaluronanu sodného použitím benzoylchloridu.Preparation of 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanoic acid derivative of sodium hyaluronan using benzoyl chloride.

3,0 g hyaluronanu sodného (7,5 mmol; 6 000 g.mol-1) byly rozpuštěny v 37,5 ml demineralizované vody. Potom bylo postupně přidáváno 18,75 ml izopropylalkoholu. Potom TEA (3,136 ml, 3 ekv.) a DMAP (46 mg; 0,05 ekv.). Současně byla rozpuštěna 4(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobutanová kyselina (5,115 g, 0,4 eq.) v 18,75 ml izopropylalkoholu a TEA (1,045 ml; 1 ekv.) a benzoylchlorid (0,871 ml; 1 ekv.) byl přidán k roztoku. Po 30 min při 60 °C byl roztok přidán k roztoku obsahujícímu HA a ponechán reagovat 2 h při 25 °C. Potom byla reakční směs naředěna 10 ml demineralizované vody obsahující 3,067 g NaCl. Acylovaný derivát byl izolován následnou precipitací použitím 5-krát absolutního izopropanolu z reakční směsi. Po dekantaci byl precipitát podroben 4-krát opakované precipitaci a dekantaci. Potom byl precipitát 4-krát promyt absolutním izopropanolem pro odstranění vody z derivátu. Konečně byl precipitát vysušen při 40 °C 48 hodin.3.0 g of sodium hyaluronan (7.5 mmol; 6,000 g.mol -1 ) were dissolved in 37.5 ml of demineralized water. Then 18.75 ml of isopropyl alcohol was gradually added. Then TEA (3.136 mL, 3 eq.) and DMAP (46 mg; 0.05 eq.). Simultaneously, 4(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanoic acid (5.115 g, 0.4 eq.) was dissolved in 18.75 mL of isopropyl alcohol and TEA ( 1.045 mL; 1 eq.) and benzoyl chloride (0.871 mL; 1 eq.) was added to the solution. After 30 min at 60 °C, the solution was added to the solution containing HA and allowed to react for 2 h at 25 °C. Then the reaction mixture was diluted with 10 ml of demineralized water containing 3.067 g of NaCl. The acylated derivative was isolated by subsequent precipitation using 5 times absolute isopropanol from the reaction mixture. After decantation, the precipitate was subjected to repeated precipitation and decantation 4 times. Then the precipitate was washed 4 times with absolute isopropanol to remove water from the derivative. Finally, the precipitate was dried at 40 °C for 48 h.

DS = 8,8 % (stanoveno NMR)DS = 8.8% (determined by NMR)

Mw esterového konjugátu: 5 600 g/molMw of ester conjugate: 5,600 g/mol

1H NMR (D2O, 700 MHz) signály acylu: δ 5,5-5,22 (m, 2H, -CH=CH-), 2,9-2,36 (m, 4H, -OOC-CH2-CH2-COO), 1,8-1,2 (m, 48H, -CH2-), 0,9-0,8 (m, 6H, -CH3)1H NMR (D2O, 700 MHz) acyl signals: δ 5.5-5.22 (m, 2H, -CH=CH-), 2.9-2.36 (m, 4H, -OOC-CH2-CH2- COO), 1.8-1.2 (m, 48H, -CH2-), 0.9-0.8 (m, 6H, -CH3)

- 22 CZ 2023 - 171 A3- 22 CZ 2023 - 171 A3

Příklad 15Example 15

Příprava derivátu 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4oxobutanové kyseliny a hyaluronanu sodného použitím benzoylchloridu.Preparation of a derivative of 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4oxobutanoic acid and sodium hyaluronan using benzoyl chloride.

mg hyaluronanu sodného (0,125 mmol; 3 000 g.mol-1) bylo rozpuštěno v 0,625 ml demineralizované vody. Potom bylo postupně přidáváno 0,313 ml izopropylalkoholu. Potom TEA (0,052 ml, 3 ekv.) a DMAP (1 mg; 0,05 ekv.) Současně byla rozpuštěna 4(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobutanová kyselina (34 mg, 0,4 ekv.) v 0,313 ml izopropylalkoholu a TEA (0,007 ml; 1 ekv.) a potom byl k reakci přidán benzoylchlorid (0,006 ml; 1 ekv.). Po 30 min při 60 °C byl roztok přidán k roztoku obsahujícímu HA a ponechán reagovat 2 h při 25 °C. Potom byla reakční směs naředěna 0,2 ml demineralizované vody obsahující 51 mg NaCl. Acylovaný derivát byl izolovaný následnou precipitací použitím 5-krát absolutního izopropanolu z reakční směsi. Po dekantaci byl precipitát podroben 4-krát opakované precipitaci a dekantaci. Potom byl precipitát 4-krát promyt absolutním izopropanolem pro odstranění vody z derivátu. Konečně byl precipitát vysušen při 40 °C 48 hodin.mg of sodium hyaluronan (0.125 mmol; 3,000 g.mol -1 ) was dissolved in 0.625 ml of demineralized water. Then 0.313 ml of isopropyl alcohol was gradually added. Then TEA (0.052 mL, 3 eq.) and DMAP (1 mg; 0.05 eq.) were simultaneously dissolved in 4(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4 -oxobutanoic acid (34 mg, 0.4 eq.) in 0.313 mL isopropyl alcohol and TEA (0.007 mL; 1 eq.) and then benzoyl chloride (0.006 mL; 1 eq.) was added to the reaction. After 30 min at 60 °C, the solution was added to the solution containing HA and allowed to react for 2 h at 25 °C. Then the reaction mixture was diluted with 0.2 ml of demineralized water containing 51 mg of NaCl. The acylated derivative was isolated by subsequent precipitation using 5 times absolute isopropanol from the reaction mixture. After decantation, the precipitate was subjected to repeated precipitation and decantation 4 times. Then the precipitate was washed 4 times with absolute isopropanol to remove water from the derivative. Finally, the precipitate was dried at 40 °C for 48 h.

DS = 3 % (stanoveno NMR)DS = 3% (determined by NMR)

1H NMR (D2O, 700 MHz) signály acylu: δ 5,5-5,22 (m, 2H, -CH=CH-), 2,9-2,36 (m, 4H, -OOC-CH2-CH2-COO), 1,8-1,2 (m, 48H, -CH2-), 0,9-0,8 (m, 6H, -CH3)1H NMR (D2O, 700 MHz) acyl signals: δ 5.5-5.22 (m, 2H, -CH=CH-), 2.9-2.36 (m, 4H, -OOC-CH2-CH2- COO), 1.8-1.2 (m, 48H, -CH2-), 0.9-0.8 (m, 6H, -CH3)

Příklad 16Example 16

Příprava derivátu 4-(((2 S,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4oxobutanové kyseliny a hyaluronanu sodného použitím benzoylchloridu.Preparation of a derivative of 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4oxobutanoic acid and sodium hyaluronan using benzoyl chloride.

3,0 g hyaluronanu sodného (7,5 mmol; 9 000 g.mol-1) bylo rozpuštěno v 33,3 ml demineralizované vody. Potom bylo postupně přidáno 16,67 ml THF. Potom TEA (3,136 ml, 3 ekv.) a DMAP (46 mg; 0,05 ekv.). Současně byla rozpuštěna 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobutanová kyselina (5,115 g, 1 ekv.) v 16,67 ml THF a TEA (1,045 ml; 1 ekv.) a potom byl k roztoku přidán benzoylchlorid (0,871 ml; 1 ekv.). Po 30 min při 60 °C byl roztok přidán k roztoku obsahujícímu HA a ponechán reagovat 2 h při 25 °C. Potom byla reakční směs naředěna 10 ml demineralizované vody obsahující přídavek 3,067 g NaCl. Acylovaný derivát byl izolován z reakční směsi následnou precipitací použitím 5-krát absolutního izopropanolu. Po dekantaci byl precipitát podroben 4-krát opakované precipitaci a dekantaci. Konečně byl precipitát 4krát promyt absolutním izopropanolem. Potom byl precipitát vysušen při 40 °C 48 hodin a následně sprejově vysušen pro odstranění zbytkových rozpouštědel.3.0 g of sodium hyaluronan (7.5 mmol; 9,000 g.mol -1 ) was dissolved in 33.3 ml of demineralized water. Then, 16.67 mL of THF was gradually added. Then TEA (3.136 mL, 3 eq.) and DMAP (46 mg; 0.05 eq.). Simultaneously, 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanoic acid (5.115 g, 1 eq.) was dissolved in 16.67 mL of THF and TEA ( 1.045 mL; 1 eq.) and then benzoyl chloride (0.871 mL; 1 eq.) was added to the solution. After 30 min at 60 °C, the solution was added to the solution containing HA and allowed to react for 2 h at 25 °C. Then the reaction mixture was diluted with 10 ml of demineralized water containing the addition of 3.067 g of NaCl. The acylated derivative was isolated from the reaction mixture by subsequent precipitation using 5 times absolute isopropanol. After decantation, the precipitate was subjected to repeated precipitation and decantation 4 times. Finally, the precipitate was washed 4 times with absolute isopropanol. The precipitate was then dried at 40°C for 48 hours and subsequently spray-dried to remove residual solvents.

DS = 8,3 % (stanoveno NMR)DS = 8.3% (determined by NMR)

Mw esterového konjugátu: 10 000 g/molMw of ester conjugate: 10,000 g/mol

1H NMR (D2O, 700 MHz) signály acylu: δ 5,5-5,22 (m, 2H, -CH=CH-), 2,9-2,36 (m, 4H, -OOC-CH2-CH2-COO-), 1,8-1,2 (m, 48H, -CH2-), 0,9-0,8 (m, 6H, -CH3)1H NMR (D2O, 700 MHz) acyl signals: δ 5.5-5.22 (m, 2H, -CH=CH-), 2.9-2.36 (m, 4H, -OOC-CH2-CH2- COO-), 1.8-1.2 (m, 48H, -CH2-), 0.9-0.8 (m, 6H, -CH3)

- 23 CZ 2023 - 171 A3- 23 CZ 2023 - 171 A3

Příklad 17Example 17

Příprava derivátu 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4oxobutanové kyseliny a hyaluronanu sodného použitím benzoylchloridu.Preparation of a derivative of 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4oxobutanoic acid and sodium hyaluronan using benzoyl chloride.

3,0 g hyaluronanu sodného (7,5 mmol; 15 000 g.mol-1) bylo rozpuštěno v 60 ml demineralizované vody. Potom bylo postupně přidáváno 30 ml izopropanolu. Potom TEA (3,136 ml, 3 ekv.) a DMAP (46 mg; 0,05 ekv.). Současně byla 4-(((2S,3S,4R)-3,4dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobutanová kyselina (5,115 g, 1 ekv.) rozpuštěna v 30 ml THF a TEA (1,045 ml; 1 ekv.) a potom byl k roztoku přidán benzoylchlorid (0,871 ml; 1 ekv.). Po 30 min při 60 °C byl roztok přidán k roztoku obsahujícímu HA a ponechán reagovat 2 h při 25 °C. Potom byla reakční směs naředěna 10 ml demineralizované vody obsahující přídavek 3,067 g NaCl. Acylovaný derivát byl izolován z reakční směsi následnou precipitací použitím 5-krát absolutního izopropanolu. Po dekantaci byl precipitát podroben 4-krát opakované precipitaci a dekantaci. Konečně byl precipitát 4-krát promyt absolutním izopropanolem pro odstranění vody z derivátu. Potom byl precipitát vysušen při 40 °C 48 hodin a následně lyofilizován pro odstranění zbytkových rozpouštědel.3.0 g of sodium hyaluronan (7.5 mmol; 15,000 g.mol -1 ) was dissolved in 60 ml of demineralized water. Then 30 ml of isopropanol was gradually added. Then TEA (3.136 mL, 3 eq.) and DMAP (46 mg; 0.05 eq.). Simultaneously, 4-(((2S,3S,4R)-3,4dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanoic acid (5.115 g, 1 equiv) was dissolved in 30 mL of THF and TEA (1.045 mL; 1 equiv) .) and then benzoyl chloride (0.871 mL; 1 eq.) was added to the solution. After 30 min at 60 °C, the solution was added to the solution containing HA and allowed to react for 2 h at 25 °C. Then the reaction mixture was diluted with 10 ml of demineralized water containing the addition of 3.067 g of NaCl. The acylated derivative was isolated from the reaction mixture by subsequent precipitation using 5 times absolute isopropanol. After decantation, the precipitate was subjected to repeated precipitation and decantation 4 times. Finally, the precipitate was washed 4 times with absolute isopropanol to remove water from the derivative. The precipitate was then dried at 40°C for 48 hours and subsequently lyophilized to remove residual solvents.

DS = 7,7 % (stanoveno NMR)DS = 7.7% (determined by NMR)

Mw esterového konjugátu: 21 000 g/molMw of ester conjugate: 21,000 g/mol

1H NMR (D2O, 700 MHz) signály acylu: δ 5,5-5,22 (m, 2H, -CH=CH-), 2,9-2,36 (m, 4H, -OOC-CH2-CH2-COO-), 1,8-1,2 (m, 48H, -CH2-), 0,9-0,8 (m, 6H, -CH3)1H NMR (D2O, 700 MHz) acyl signals: δ 5.5-5.22 (m, 2H, -CH=CH-), 2.9-2.36 (m, 4H, -OOC-CH2-CH2- COO-), 1.8-1.2 (m, 48H, -CH2-), 0.9-0.8 (m, 6H, -CH3)

Příklad 18Example 18

Příprava derivátu 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4oxobutanové kyseliny a hyaluronanu sodného použitím benzoylchloridu.Preparation of a derivative of 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4oxobutanoic acid and sodium hyaluronan using benzoyl chloride.

3,0 g hyaluronanu sodného (7,5 mmol; 15 000 g.mol-1) bylo rozpuštěno v demineralizované vodě. Potom bylo postupně přidáno 30 ml izopropanolu. Potom TEA (3,136 ml, 3 ekv.) a DMAP (46 mg; 0,05 ekv.). Současně byla rozpuštěna 4-(((2S,3S,4R)3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobutanová kyselina (1,279 g, 0,25 ekv.) ve 30 ml THF a TEA (0,261 ml; 0,25 ekv.) a potom byl k roztoku přidán benzoylchlorid (0,218 ml; 0,25 ekv). Po 30 min při 60 °C byl roztok přidán k roztoku obsahujícímu HA a ponechán reagovat 2 h při 25 °C. Potom byla reakční směs naředěna 10 ml demineralizované vody obsahující přídavek 3,067 g NaCl. Acylovaný derivát byl izolován z reakční směsi následnou precipitací použitím 5-krát absolutního izopropanolu. Po dekantaci byl precipitát podroben 4-krát opakované precipitaci a dekantaci. Konečně byl precipitát 4-krát promyt absolutním izopropanolem pro odstranění vody z derivátu. Potom byl precipitát vysušen při 40 °C 48 hodin a následně lyofilizován pro odstranění zbytkových rozpouštědel.3.0 g of sodium hyaluronan (7.5 mmol; 15,000 g.mol -1 ) was dissolved in demineralized water. Then 30 ml of isopropanol was gradually added. Then TEA (3.136 mL, 3 eq.) and DMAP (46 mg; 0.05 eq.). Simultaneously, 4-(((2S,3S,4R)3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanoic acid (1.279 g, 0.25 equiv) was dissolved in 30 mL of THF and TEA (0.261 mL ; 0.25 eq.) and then benzoyl chloride (0.218 mL; 0.25 eq.) was added to the solution. After 30 min at 60 °C, the solution was added to the solution containing HA and allowed to react for 2 h at 25 °C. Then the reaction mixture was diluted with 10 ml of demineralized water containing the addition of 3.067 g of NaCl. The acylated derivative was isolated from the reaction mixture by subsequent precipitation using 5 times absolute isopropanol. After decantation, the precipitate was subjected to repeated precipitation and decantation 4 times. Finally, the precipitate was washed 4 times with absolute isopropanol to remove water from the derivative. The precipitate was then dried at 40°C for 48 hours and subsequently lyophilized to remove residual solvents.

DS = 3,2 % (stanoveno NMR)DS = 3.2% (determined by NMR)

Mw esterového konjugátu: 12 200 g/molMw of ester conjugate: 12,200 g/mol

- 24 CZ 2023 - 171 A3- 24 CZ 2023 - 171 A3

1H NMR (D2O, 700 MHz) signály acylu: δ 5.5-5.22 (m, 2H, -CH=CH-), 2.9-2.36 (m, 4H, -OOC-CH2-CH2-COO-), 1.8-1.2 (m. 48H. -CH2-), 0.9-0.8 (m, 6H, -CH3)1H NMR (D2O, 700 MHz) acyl signals: δ 5.5-5.22 (m, 2H, -CH=CH-), 2.9-2.36 (m, 4H, -OOC-CH2-CH2-COO-), 1.8-1.2 ( m. 48H. -CH2-), 0.9-0.8 (m, 6H, -CH3)

Příklad 19Example 19

Příprava derivátu 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4oxobutanové kyseliny a hyaluronanu sodného použitím benzoylchloridu.Preparation of a derivative of 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4oxobutanoic acid and sodium hyaluronan using benzoyl chloride.

2,0 g hyaluronanu sodného (5 mmol; 188 000 g.mol-1) bylo rozpuštěno ve 100 ml demineralizované vody. Potom bylo postupně přidáno 50 ml THF. Potom TEA (2,091 ml, 3 ekv.) a DMAP (30,6 mg; 0,05 ekv.). Současně byla rozpuštěna 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobutanová kyselina (3,41 g, 1 ekv.) v 50 ml THF a TEA (0,697 ml; 1 ekv.) a potom byl k roztoku přidán benzoylchlorid (0,581 ml; 0,1 ekv.). Po 30 min při 60 °C byl roztok přidán k roztoku obsahujícímu HA a ponechán reagovat 2 h při 25 °C. Potom byla reakční směs naředěna 6 ml supernasyceného roztoku NaCl. Acylovaný derivát byl izolován z reakční směsi následnou precipitací použitím 5krát objemu izopropanolu. Potom byl precipitát dekantován a opakovaně promyt nejdříve absolutním izopropanolem a následně 4-krát vodným roztokem izopropanolu (85% obj.). Potom byl precipitát 3-krát promyt absolutním izopropanolem pro odstranění vody z derivátu. Konečně byl precipitát vysušen při 40 °C 48 hodin.2.0 g of sodium hyaluronan (5 mmol; 188,000 g.mol -1 ) was dissolved in 100 ml of demineralized water. Then 50 mL of THF was added gradually. Then TEA (2.091 mL, 3 eq.) and DMAP (30.6 mg; 0.05 eq.). Simultaneously, 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanoic acid (3.41 g, 1 eq.) was dissolved in 50 mL of THF and TEA ( 0.697 mL; 1 eq.) and then benzoyl chloride (0.581 mL; 0.1 eq.) was added to the solution. After 30 min at 60 °C, the solution was added to the solution containing HA and allowed to react for 2 h at 25 °C. Then the reaction mixture was diluted with 6 ml of supersaturated NaCl solution. The acylated derivative was isolated from the reaction mixture by subsequent precipitation using 5 times the volume of isopropanol. The precipitate was then decanted and repeatedly washed first with absolute isopropanol and then 4 times with an aqueous solution of isopropanol (85% by volume). Then the precipitate was washed 3 times with absolute isopropanol to remove water from the derivative. Finally, the precipitate was dried at 40 °C for 48 h.

DS = 4,6 % (stanoveno NMR)DS = 4.6% (determined by NMR)

Mw esterového konjugátu: 184 400 g/molMw of ester conjugate: 184,400 g/mol

1H NMR (D2O, 700 MHz) signály acylu: δ 1,8-1,2 (m, 48H, -CH2-), 0,9-0,8 (m, 6H, -CH3)1H NMR (D2O, 700 MHz) acyl signals: δ 1.8-1.2 (m, 48H, -CH2-), 0.9-0.8 (m, 6H, -CH3)

Příklad 20Example 20

Příprava derivátu 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4oxobutanové kyseliny a hyaluronanu sodného použitím benzoylchloridu.Preparation of a derivative of 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4oxobutanoic acid and sodium hyaluronan using benzoyl chloride.

0,2 g hyaluronanu sodného (0,5 mmol; 300 000 g.mol-1) bylo rozpuštěno v 10 ml demineralizované vody. Potom bylo postupně přidáno 5 ml THF. Potom TEA (0,209 ml, 3 ekv.) a DMAP (3 mg; 0,05 ekv.). Současně byla rozpuštěna 4-(((2S,3S,4R)-3,4dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobutanová kyselina (0,256 g, 0,75 ekv.) v 5 ml THF a TEA (0,052 ml; 0,75 ekv.) a potom byl k roztoku přidán benzoylchlorid (0,044 ml; 0,75 ekv.). Po 30 min při 60 °C byl roztok přidán k roztoku obsahujícímu HA a ponechán reagovat 2 h při 25 °C. Potom byla reakční směs naředěna 5 ml demineralizované vody obsahující supernasycený roztok NaCl. Acylovaný derivát byl izolován z reakční směsi následnou precipitací použitím 5-krát objemu izopropanolu. Potom byl precipitát dekantován a opakovaně promyt. Nejdříve absolutním izopropanolem a následně 4-krát vodným roztokem isopropanol/voda (85% obj.). Potom byl precipitát 3-krát promyt absolutním izopropanolem pro odstranění vody z derivátu. Konečně byl precipitát vysušen při 40 °C 48 hodin.0.2 g of sodium hyaluronan (0.5 mmol; 300,000 g.mol -1 ) was dissolved in 10 ml of demineralized water. Then 5 mL of THF was added gradually. Then TEA (0.209 mL, 3 eq.) and DMAP (3 mg; 0.05 eq.). Simultaneously, 4-(((2S,3S,4R)-3,4dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanoic acid (0.256 g, 0.75 equiv) was dissolved in 5 mL of THF and TEA (0.052 mL; 0.75 eq) and then benzoyl chloride (0.044 mL; 0.75 eq) was added to the solution. After 30 min at 60 °C, the solution was added to the solution containing HA and allowed to react for 2 h at 25 °C. Then the reaction mixture was diluted with 5 ml of demineralized water containing a supersaturated NaCl solution. The acylated derivative was isolated from the reaction mixture by subsequent precipitation using 5 times the volume of isopropanol. The precipitate was then decanted and repeatedly washed. First with absolute isopropanol and then 4 times with an aqueous solution of isopropanol/water (85% vol.). Then the precipitate was washed 3 times with absolute isopropanol to remove water from the derivative. Finally, the precipitate was dried at 40 °C for 48 h.

DS = 6,4 % (stanoveno NMR)DS = 6.4% (determined by NMR)

Mw esterového konjugátu: 298 500 g/molMw of ester conjugate: 298,500 g/mol

- 25 CZ 2023 - 171 A3- 25 CZ 2023 - 171 A3

1H NMR (D2O, 700 MHz) signály acylu: δ 1,8-1,2 (m, 48H, -CH2-), δ 0,9-0,8 (m, 6H, CH3)1H NMR (D2O, 700 MHz) acyl signals: δ 1.8-1.2 (m, 48H, -CH2-), δ 0.9-0.8 (m, 6H, CH3)

Příklad 21Example 21

Příprava derivátu 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4oxobutanové kyseliny a hyaluronanu sodného použitím benzoylchloridu.Preparation of a derivative of 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4oxobutanoic acid and sodium hyaluronan using benzoyl chloride.

2,0 g hyaluronanu sodného (5 mmol; 416 000 g.mol-1) bylo rozpuštěno v 100 ml demineralizované vody. Potom bylo postupně přidáno 50 ml THF. Potom TEA (2,091 ml, 3 ekv.) a DMAP (30,6 mg; 0,05 ekv.). Současně byla rozpuštěna 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobutanová kyselina (1,702 g, 0,5 ekv.) v 50 ml THF a TEA (0,348 ml; 0,5 ekv.) a potom byl k roztoku přidán benzoylchlorid (0,290 ml; 0,5 ekv.). Po 30 min při 60 °C byl roztok přidán k roztoku obsahujícímu HA a ponechán reagovat 2 h při 25 °C. Potom byla reakční směs naředěna 6 ml demineralizované vody obsahující 2,92 g NaCl. Acylovaný derivát byl izolován z reakční směsi následnou precipitací použitím 5-krát absolutního izopropanolu. Potom byl precipitát dekantován a opakovaně promyt. Nejdříve absolutním izopropanolem a následně 4-krát vodným roztokem isopropanolu (85% obj.). Konečně byl precipitát vysušen při 40 °C 48 hodin a následně lyofilizován kvůli odstranění zbytkových rozpouštědel.2.0 g of sodium hyaluronan (5 mmol; 416,000 g.mol -1 ) was dissolved in 100 ml of demineralized water. Then 50 mL of THF was added gradually. Then TEA (2.091 mL, 3 eq.) and DMAP (30.6 mg; 0.05 eq.). Simultaneously, 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanoic acid (1.702 g, 0.5 equiv) was dissolved in 50 mL of THF and TEA ( 0.348 mL; 0.5 eq.) and then benzoyl chloride (0.290 mL; 0.5 eq.) was added to the solution. After 30 min at 60 °C, the solution was added to the solution containing HA and allowed to react for 2 h at 25 °C. Then the reaction mixture was diluted with 6 ml of demineralized water containing 2.92 g of NaCl. The acylated derivative was isolated from the reaction mixture by subsequent precipitation using 5 times absolute isopropanol. The precipitate was then decanted and repeatedly washed. First with absolute isopropanol and then 4 times with an aqueous solution of isopropanol (85% by volume). Finally, the precipitate was dried at 40 °C for 48 h and subsequently lyophilized to remove residual solvents.

DS = 1,9 % (stanoveno NMR)DS = 1.9% (determined by NMR)

1H NMR (D2O, 700 MHz) signály acylu: δ 1,8-1,2 (m, 48H, -CH2-), δ 0,9-0,8 (m, 6H, CH3)1H NMR (D2O, 700 MHz) acyl signals: δ 1.8-1.2 (m, 48H, -CH2-), δ 0.9-0.8 (m, 6H, CH3)

Příklad 22Example 22

Příprava derivátu 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4oxobutanové kyseliny a hyaluronanu sodného použitím benzoylchloridu.Preparation of a derivative of 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4oxobutanoic acid and sodium hyaluronan using benzoyl chloride.

0,5 g hyaluronanu sodného (1,3 mmol; 1 000 000 g.mol-1) bylo rozpuštěno ve 100 ml demineralizované vody. Potom bylo postupně přidáváno 50 ml izopropanolu. Potom TEA (0,523 ml, 3 ekv.) a DMAP (7,6 mg; 0,05 ekv.). Následně byla rozpuštěna 4-(((2S,3S,4R)3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobutanová kyselina (426 mg, 0,5 ekv.) v 50 ml THF a TEA (0,087 ml; 0,5 ekv.) a k roztoku byl přidán benzoylchlorid (0,073 ml; 0,5 ekv.). Po 30 min při 60 °C byl roztok přidán k roztoku obsahujícímu HA a ponechán reagovat 2 h při 25 °C. Potom byla reakční směs naředěna 1 ml demineralizované vody obsahující přídavek 0,7 g NaCl. Acylovaný derivát byl izolován z reakční směsi následnou precipitací použitím 5-krát absolutního izopropanolu. Potom byl precipitát dekantován a opakovaně promyt nejdřív absolutním izopropanolem a potom 4-krát vodným roztokem izopropanolu (85% obj.). Potom byl precipitát 3-krát promyt absolutním izopropanolem pro odstranění vody z derivátu. Konečně byl precipitát vysušen při 40 °C 48 hodin.0.5 g of sodium hyaluronan (1.3 mmol; 1,000,000 g.mol -1 ) was dissolved in 100 ml of demineralized water. Then 50 ml of isopropanol was gradually added. Then TEA (0.523 mL, 3 eq.) and DMAP (7.6 mg; 0.05 eq.). Subsequently, 4-(((2S,3S,4R)3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanoic acid (426 mg, 0.5 equiv) was dissolved in 50 mL of THF and TEA (0.087 mL ; 0.5 eq.) and benzoyl chloride (0.073 mL; 0.5 eq.) was added to the solution. After 30 min at 60 °C, the solution was added to the solution containing HA and allowed to react for 2 h at 25 °C. Then the reaction mixture was diluted with 1 ml of demineralized water containing the addition of 0.7 g of NaCl. The acylated derivative was isolated from the reaction mixture by subsequent precipitation using 5 times absolute isopropanol. The precipitate was then decanted and repeatedly washed first with absolute isopropanol and then 4 times with an aqueous isopropanol solution (85% vol). Then the precipitate was washed 3 times with absolute isopropanol to remove water from the derivative. Finally, the precipitate was dried at 40 °C for 48 h.

DS = 2,5 % (stanoveno NMR)DS = 2.5% (determined by NMR)

1H NMR (D2O, 700 MHz) signály acylu: δ 1,8-1,2 (m, 48H, -CH2-), 0,9-0,8 (m, 6H, -CH3)1H NMR (D2O, 700 MHz) acyl signals: δ 1.8-1.2 (m, 48H, -CH2-), 0.9-0.8 (m, 6H, -CH3)

- 26 CZ 2023 - 171 A3- 26 CZ 2023 - 171 A3

Příklad 23Example 23

Příprava derivátu 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4oxobutanové kyseliny a hyaluronanu sodného použitím benzoylchloriduPreparation of a derivative of 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4oxobutanoic acid and sodium hyaluronan using benzoyl chloride

0,5 g hyaluronanu sodného (1,3 mmol; 1 600 000 g.mol-1) bylo rozpuštěno ve 100 ml demineralizované vody. Potom bylo postupně přidáno 50 ml izopropanolu. Potom TEA (0,523 ml, 3 ekv.) a DMAP (7,6 mg; 0,05 ekv.). Současně byla rozpuštěna 4-(((2 S ,3 S ,4 R )3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobutanová kyselina (426 mg, 0,5 ekv.) v 50 ml THF a TEA (0,087 ml; 0,5 ekv.) a k roztoku byl přidán benzoylchlorid (0,073 ml; 0,5 ekv.). Po 30 min při 60 °C byl roztok přidán k roztoku obsahujícímu HA a ponechán reagovat 2 h při 25 °C. Potom byla reakční směs naředěna 1 ml demineralizované vody obsahující přídavek 0,7 g NaCl. Acylovaný derivát byl izolován z reakční směsi následnou precipitací použitím 5-krát absolutního izopropanolu. Potom byl precipitát dekantován a opakovaně promyt nejdřív absolutním izopropanolem a potom 4-krát vodným roztokem izopropanolu (85% obj.). Potom byl precipitát 3-krát promyt absolutním izopropanolem pro odstranění vody z derivátu. Konečně byl precipitát vysušen při 40 °C 48 hodin.0.5 g of sodium hyaluronan (1.3 mmol; 1,600,000 g.mol -1 ) was dissolved in 100 ml of demineralized water. Then 50 ml of isopropanol was gradually added. Then TEA (0.523 mL, 3 eq.) and DMAP (7.6 mg; 0.05 eq.). Simultaneously, 4-(((2 S ,3 S ,4 R )3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanoic acid (426 mg, 0.5 equiv) was dissolved in 50 mL of THF and TEA (0.087 mL; 0.5 eq.) and to the solution was added benzoyl chloride (0.073 mL; 0.5 eq.). After 30 min at 60 °C, the solution was added to the solution containing HA and allowed to react for 2 h at 25 °C. Then the reaction mixture was diluted with 1 ml of demineralized water containing the addition of 0.7 g of NaCl. The acylated derivative was isolated from the reaction mixture by subsequent precipitation using 5 times absolute isopropanol. The precipitate was then decanted and repeatedly washed first with absolute isopropanol and then 4 times with an aqueous isopropanol solution (85% vol). Then the precipitate was washed 3 times with absolute isopropanol to remove water from the derivative. Finally, the precipitate was dried at 40 °C for 48 h.

DS = 0,7 % (stanoveno NMR)DS = 0.7% (determined by NMR)

1H NMR (D2O, 700 MHz) signály acylu: δ 1.8-1.2 (m. 48H. -CH2-), 0.9-0.8 (m, 6H, -CH3)1H NMR (D2O, 700 MHz) acyl signals: δ 1.8-1.2 (m. 48H. -CH2-), 0.9-0.8 (m, 6H, -CH3)

Příklad 24Example 24

Příprava derivátu 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4oxobutanové kyseliny a hyaluronanu sodného použitím benzoylchloridu mg hyaluronanu sodného (0,1 mmol; 6 000 g.mol-1) bylo rozpuštěno v 0,5 ml demineralizované vody. Potom bylo postupně přidáváno 0,25 ml THF. Potom TEA (0,042 ml, 3 ekv.) a DMAP (1 mg; 0,05 ekv.). Současně byla rozpuštěna 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobutanová kyselina (35 mg, 0,5 ekv.) v 0,25 ml THF a TEA (0,007 ml; 0,5 ekv.) a k roztoku byl přidán benzoylchlorid (0,006 ml; 0,5 ekv.). Po 30 min při 40 °C byl roztok přidán k roztoku obsahujícímu HA a ponechán reagovat 2 h při 25 °C. Potom byla reakční směs naředěna 0,2 ml demineralizované vody obsahující 29 mg NaCl. Acylovaný derivát byl izolován z reakční směsi následnou precipitací použitím 5-krát absolutního izopropanolu. Po dekantaci byl precipitát podroben 4-krát opakované precipitaci a dekantaci. Potom byl precipitát 4-krát promyt absolutním izopropanolem pro odstranění vody z derivátu. Konečně byl precipitát vysušen při 40 °C 48 hodin.Preparation of 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4oxobutanoic acid and sodium hyaluronan derivative using benzoyl chloride mg sodium hyaluronan (0.1 mmol; 6,000 g.mol -1 ) was dissolved in 0.5 ml of demineralized water. Then 0.25 mL of THF was gradually added. Then TEA (0.042 mL, 3 eq.) and DMAP (1 mg; 0.05 eq.). Simultaneously, 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanoic acid (35 mg, 0.5 equiv) was dissolved in 0.25 mL of THF and TEA (0.007 mL; 0.5 eq.) and to the solution was added benzoyl chloride (0.006 mL; 0.5 eq.). After 30 min at 40 °C, the solution was added to the solution containing HA and allowed to react for 2 h at 25 °C. Then the reaction mixture was diluted with 0.2 ml of demineralized water containing 29 mg of NaCl. The acylated derivative was isolated from the reaction mixture by subsequent precipitation using 5 times absolute isopropanol. After decantation, the precipitate was subjected to repeated precipitation and decantation 4 times. Then the precipitate was washed 4 times with absolute isopropanol to remove water from the derivative. Finally, the precipitate was dried at 40 °C for 48 h.

DS = 0,6 % (stanoveno NMR)DS = 0.6% (determined by NMR)

1H NMR (D2O, 700 MHz) signály acylu: 2,9-2,36 (m, 4H, -OOC-CH2-CH2-COO-), 1,81,2 (m, 62H, -CH2-), 0,9-0,8 (m, 6H, -CH3)1H NMR (D2O, 700 MHz) acyl signals: 2.9-2.36 (m, 4H, -OOC-CH2-CH2-COO-), 1.81.2 (m, 62H, -CH2-), 0 .9-0.8 (m, 6H, -CH3)

- 27 CZ 2023 - 171 A3- 27 CZ 2023 - 171 A3

Příklad 25Example 25

Příprava derivátu 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4oxobutanové kyseliny a hyaluronanu sodného použitím CDIPreparation of 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4oxobutanoic acid derivative and sodium hyaluronan using CDI

Příprava kyselé formy kyseliny hyaluronové: Stručně, 5,0 g hyaluronanu sodného (12,5 mmol, 15 000 g.mol-1) bylo rozpuštěno v 250 ml demineralizované vody. Následně bylo k roztoku přidáno 30 ml H+ katexu. Reakce byla držena při 5 °C 24 h. Potom byl H+ katex odfiltrován z roztoku kyseliny hyaluronové a promyt několikrát demineralizovanou vodou. Výsledný filtrát byl mrazově vysušen.Preparation of the acid form of hyaluronic acid: Briefly, 5.0 g of sodium hyaluronan (12.5 mmol, 15,000 g.mol -1 ) was dissolved in 250 ml of demineralized water. Subsequently, 30 ml of H+ cation was added to the solution. The reaction was kept at 5 °C for 24 h. Then the H+ cation was filtered from the hyaluronic acid solution and washed several times with demineralized water. The resulting filtrate was freeze-dried.

mg kyselé formy hyaluronanu (0,132 mmol; 15 000 g.mol-1) bylo rozpuštěno v 0,8 ml DMSO. Potom bylo přidáno TEA (0,009 ml, 0,5 ekv.) a DMAP (1 mg; 0,05 ekv.). Současně byla rozpuštěna 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4oxobutanová kyselina (45 mg, 0,066 ekv.) v 0,8 ml DMSO. Potom byl přidán k roztoku TEA (0,009 ml; 0,5 ekv.) a CDI (10,72 mg; 0,5 ekv.). Po 30 min při 60 °C byl roztok přidán k roztoku obsahujícímu HA a ponechán reagovat 24 h při teplotě místnosti. Potom byla reakční směs naředěna 0,3 ml demineralizované vody obsahující přídavek 38,65 mg NaCl. Potom byl precipitát dekantován a opakovaně promyt nejdřív absolutním izopropanolem a následně 4-krát vodným roztokem izopropanolu (90% obj.). Potom byl precipitát 3-krát promyt absolutním izopropanolem pro odstranění vody z derivátu. Konečně byl precipitát vysušen při 40 °C 48 hodin.mg of the acid form of hyaluronan (0.132 mmol; 15,000 g.mol -1 ) was dissolved in 0.8 ml of DMSO. TEA (0.009 mL, 0.5 eq) and DMAP (1 mg; 0.05 eq) were then added. At the same time, 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4oxobutanoic acid (45 mg, 0.066 equiv) was dissolved in 0.8 mL of DMSO. It was then added to a solution of TEA (0.009 mL; 0.5 eq) and CDI (10.72 mg; 0.5 eq). After 30 min at 60 °C, the solution was added to the solution containing HA and allowed to react for 24 h at room temperature. Then the reaction mixture was diluted with 0.3 ml of demineralized water containing the addition of 38.65 mg of NaCl. The precipitate was then decanted and repeatedly washed first with absolute isopropanol and then 4 times with an aqueous isopropanol solution (90% by volume). Then the precipitate was washed 3 times with absolute isopropanol to remove water from the derivative. Finally, the precipitate was dried at 40 °C for 48 h.

DS = 0,8 % (stanoveno NMR)DS = 0.8% (determined by NMR)

1H NMR (D2O, 700 MHz) signály acylu: δ 1,8-1,2 (m, 48H, -CH2-), 0,9-0,8 (m, 6H, -CH3)1H NMR (D2O, 700 MHz) acyl signals: δ 1.8-1.2 (m, 48H, -CH2-), 0.9-0.8 (m, 6H, -CH3)

Příklad 26Example 26

Příprava derivátu (Z)-4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobut2-enové kyseliny a hyaluronanu sodného použitím CDI mg kyselé formy hyaluronanu (0,132 mmol; 15 000 g.mol-1) bylo rozpuštěno v 0,8 ml DMSO. Potom bylo přidáno TEA (0,009 ml, 0,5 ekv.) a DMAP (1 mg; 0,05 ekv.). Současně byla rozpuštěna 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4oxobut-2-enová kyselina (45 mg, 0,066 ekv.) v 0,8 ml DMSO. Potom byl přidán k roztoku TEA (0,009 ml; 0,5 ekv.) a CDI (10,72 mg; 0,5 ekv.). Po 30 min při teplotě 60 °C byl roztok přidán k roztoku obsahujícímu HA a ponechán reagovat 24 h při teplotě místnosti. Potom byla reakční směs naředěna 0,3 ml demineralizované vody obsahující přídavek 38,65 mg NaCl. Acylovaný derivát byl potom izolován z reakční směsi následnou precipitací použitím 5-krát absolutního izopropanolu. Potom byl precipitát dekantován a opakovaně promyt nejdřív absolutním izopropanolem a následně 4-krát vodným roztokem izopropanolu (90% obj.). Potom byl precipitát 3-krát promyt absolutním izopropanolem pro odstranění vody z derivátu a byl vysušen při 40 °C 48 hodin.Preparation of a derivative of (Z)-4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobut2-enoic acid and sodium hyaluronan using CDI mg of the acid form of hyaluronan ( 0.132 mmol; 15,000 g.mol -1 ) was dissolved in 0.8 ml of DMSO. TEA (0.009 mL, 0.5 eq) and DMAP (1 mg; 0.05 eq) were then added. At the same time, 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4oxobut-2-enoic acid (45 mg, 0.066 equiv) was dissolved in 0.8 mL of DMSO. It was then added to a solution of TEA (0.009 mL; 0.5 eq) and CDI (10.72 mg; 0.5 eq). After 30 min at 60 °C, the solution was added to the solution containing HA and allowed to react for 24 h at room temperature. Then the reaction mixture was diluted with 0.3 ml of demineralized water containing the addition of 38.65 mg of NaCl. The acylated derivative was then isolated from the reaction mixture by subsequent precipitation using 5 times absolute isopropanol. The precipitate was then decanted and repeatedly washed first with absolute isopropanol and then 4 times with an aqueous isopropanol solution (90% by volume). Then, the precipitate was washed 3 times with absolute isopropanol to remove water from the derivative and was dried at 40°C for 48 hours.

DS = 1,6 % (stanoveno NMR)DS = 1.6% (determined by NMR)

1H NMR (D2O, 700 MHz) signály acylu: δ 7,75-7,40 (m, 2H, -OOC-CH=CH-COO-) 5,55,22 (m, 2H, -CH=CH-), 1,8-1,2 (m, 48H, -CH2-), 0,9-0,8 (m, 6H, -CH3)1H NMR (D2O, 700 MHz) acyl signals: δ 7.75-7.40 (m, 2H, -OOC-CH=CH-COO-) 5.55.22 (m, 2H, -CH=CH-) , 1.8-1.2 (m, 48H, -CH2-), 0.9-0.8 (m, 6H, -CH3)

- 28 CZ 2023 - 171 A3- 28 CZ 2023 - 171 A3

Příklad 27Example 27

Příprava derivátu (Z)-4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobut2-enové kyseliny a hyaluronanu sodného použitím HSTUPreparation of (Z)-4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobut2-enoic acid derivative and sodium hyaluronan using HSTU

66,50 mg kyselé formy hyaluronanu (0,176 mmol; 15 000 g.mol-1) bylo rozpuštěno v 0,85 ml DMSO. Potom bylo přidáno TEA (0,012 ml, 0,5 ekv.). Současně byla rozpuštěna (Z) 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobut-2-enová kyselina (59.8 mg; 0.5 ekv.) v 0,8 ml DMSO. Potom byl k roztoku přidán TEA (0,012 ml; 0,5 ekv.) a HSTU (14,26 mg; 0,5 ekv.). Po 6 h při teplotě 60 °C byl roztok přidán k roztoku obsahujícímu HA a ponechán reagovat 40 h při 25 °C. Potom byla reakční směs naředěna 0,3 ml demineralizované vody obsahující přídavek 51,41 mg NaCl. Acylovaný derivát byl potom izolován z reakční směsi následnou precipitací použitím 5-krát absolutního izopropanolu. Potom byl precipitát dekantován a opakovaně promyt nejdřív absolutním izopropanolem a následně 4-krát vodným roztokem izopropanolu (90% obj.). Potom byl precipitát 3-krát promyt absolutním izopropanolem pro odstranění vody z derivátu. Nakonec byl zbytek vysušen při 40 °C 48 hodin.66.50 mg of the acid form of hyaluronan (0.176 mmol; 15,000 g.mol -1 ) was dissolved in 0.85 ml of DMSO. TEA (0.012 mL, 0.5 equiv) was then added. At the same time, (Z) 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobut-2-enoic acid (59.8 mg; 0.5 eq.) was dissolved in 0.8 ml DMSO. TEA (0.012 mL; 0.5 eq) and HSTU (14.26 mg; 0.5 eq) were then added to the solution. After 6 h at 60 °C, the solution was added to the solution containing HA and allowed to react for 40 h at 25 °C. Then the reaction mixture was diluted with 0.3 ml of demineralized water containing the addition of 51.41 mg of NaCl. The acylated derivative was then isolated from the reaction mixture by subsequent precipitation using 5 times absolute isopropanol. The precipitate was then decanted and repeatedly washed first with absolute isopropanol and then 4 times with an aqueous isopropanol solution (90% by volume). Then the precipitate was washed 3 times with absolute isopropanol to remove water from the derivative. Finally, the residue was dried at 40°C for 48 hours.

DS = 2,6 % (stanoveno NMR)DS = 2.6% (determined by NMR)

1H NMR (D2O, 700 MHz) signály acylu: δ 5,5-5,22 (m, 2H, -CH=CH-), 1,8-1,2 (m, 48H, -CH2-), 0,9-0,8 (m, 6H, -CH3)1H NMR (D2O, 700 MHz) acyl signals: δ 5.5-5.22 (m, 2H, -CH=CH-), 1.8-1.2 (m, 48H, -CH2-), 0, 9-0.8 (m, 6H, -CH3)

Příklad 28Example 28

Příprava derivátu (Z)-4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobut2-enové kyseliny a hyaluronanu sodného použitím benzoylchloriduPreparation of a derivative of (Z)-4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobut2-enoic acid and sodium hyaluronan using benzoyl chloride

100 mg hyaluronanu sodného (0,30 mmol, 6 000 g.mol-1) bylo rozpuštěno v 1,25 ml demineralizované vody. Potom bylo postupně přidáno 0,625 ml THF. Potom TEA (0,105 ml, 3 ekv.) a DMAP (15,3 mg, 0,05 ekv.). Současně byla rozpuštěna (Z)-4-(((2 S ,3 S ,4 R )3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobut-2-enová kyselina (85 mg, 0,5 ekv.) v 0,625 ml THF a TEA (0,017 ml, ,5 ekv.) a potom byl k roztoku přidán benzoylchlorid (0,015 ml, 0,5 ekv.). Po 1 h při 60 °C byl roztok přidán k roztoku obsahujícímu HA a ponechán reagovat 3 h při 25 °C. Potom byla reakční směs naředěna 1 ml demineralizované vody obsahující přídavek 73 mg NaCl. Acylovaný derivát byl vyizolován z reakční směsi následnou precipitací použitím 5-krát absolutního izopropanolu a následně 4-krát vodným roztokem izopropanolu (90% obj.). Potom byl precipitát 3-krát promyt absolutním izopropanolem pro odstranění vody z derivátu. Nakonec byl precipitát vysušen při 40 °C po dobu 48 hodin.100 mg of sodium hyaluronan (0.30 mmol, 6,000 g.mol -1 ) was dissolved in 1.25 ml of demineralized water. Then 0.625 mL of THF was added gradually. Then TEA (0.105 mL, 3 eq.) and DMAP (15.3 mg, 0.05 eq.). Simultaneously, (Z)-4-(((2 S ,3 S ,4 R )3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobut-2-enoic acid (85 mg, 0.5 equiv) was dissolved .) in 0.625 mL of THF and TEA (0.017 mL, .5 eq.) and then benzoyl chloride (0.015 mL, 0.5 equiv). After 1 h at 60 °C, the solution was added to the solution containing HA and allowed to react for 3 h at 25 °C. Then the reaction mixture was diluted with 1 ml of demineralized water containing the addition of 73 mg of NaCl. The acylated derivative was isolated from the reaction mixture by subsequent precipitation using 5 times absolute isopropanol and then 4 times aqueous isopropanol solution (90% vol). Then the precipitate was washed 3 times with absolute isopropanol to remove water from the derivative. Finally, the precipitate was dried at 40 °C for 48 h.

DS = 1,3 % (stanoveno NMR) 1H NMR (D2O, 700 MHz) signály acylu: δ 6,8-6,4 (m, 2H, -OOC-CH=CH-COO-), 5,55,22 (m, 2H, -CH=CH-), 1,8-1,2 (m, 48H, -CH2-), 0,9-0,8 (m, 6H, -CH3)DS = 1.3% (determined by NMR) 1 H NMR (D2O, 700 MHz) acyl signals: δ 6.8-6.4 (m, 2H, -OOC-CH=CH-COO-), 5.55, 22 (m, 2H, -CH=CH-), 1.8-1.2 (m, 48H, -CH2-), 0.9-0.8 (m, 6H, -CH3)

- 29 CZ 2023 - 171 A3- 29 CZ 2023 - 171 A3

Příklad 29Example 29

Příprava derivátu 4-oxo-4-(((2 λ ,3 S ,4 R )-1,3,4- trihydroxyoktadekan-2-yl)amino)butanové kyseliny a hyaluronanu sodného použitím CDIPreparation of 4-oxo-4-(((2 λ ,3 S ,4 R )-1,3,4-trihydroxyoctadecan-2-yl)amino)butanoic acid derivative and sodium hyaluronan using CDI

279 mg kyselé formy hyaluronanu (0,738 mmol, 15 000 g.mol-1) bylo rozpuštěno v 2,7 ml DMSO. Potom bylo přidáno TEA (0,051 ml, 0,5 ekv.). Současně byla rozpuštěna 4-oxo4- (((2 S ,3 S ,4 R )-1,3,4- trihydroxyoktadekan-2-yl)amino)butanová kyselina (154.11 mg, 0,5 ekv.) v 2,8 ml DMSO. Potom byl k roztoku přidán TEA (0,034 ml, 0,5 ekv.) a 1,1'karbonyldiimidazol (CDI, 59.84 mg, 0.5 ekv.). Po 3 h při teplotě místnosti byl roztok přidán k roztoku obsahujícímu HA a ponechán reagovat 24 h při 25 °C. Potom byla reakční směs naředěna 1 ml demineralizované vody obsahující přídavek 215,67 mg NaCl. Acylovaný derivát byl vyizolován z reakční směsi následnou precipitací použitím 5-krát absolutního izopropanolu. Potom byl precipitát dekantován a opakovaně promyt nejdřív absolutním izopropanolem a následně 4-krát vodným roztokem izopropanolu (90% obj.). Potom byl precipitát 3-krát promyt absolutním izopropanolem pro odstranění vody z derivátu. Nakonec byl precipitát vysušen při 40 °C po dobu 48 hodin.279 mg of the acid form of hyaluronan (0.738 mmol, 15,000 g.mol -1 ) was dissolved in 2.7 ml of DMSO. TEA (0.051 mL, 0.5 equiv) was then added. Simultaneously, 4-oxo4- (((2 S ,3 S ,4 R )-1,3,4-trihydroxyoctadecan-2-yl)amino)butanoic acid (154.11 mg, 0.5 equiv.) was dissolved in 2.8 mL of DMSO. TEA (0.034 mL, 0.5 eq.) and 1,1'carbonyldiimidazole (CDI, 59.84 mg, 0.5 eq.) were then added to the solution. After 3 h at room temperature, the solution was added to the solution containing HA and allowed to react for 24 h at 25 °C. Then the reaction mixture was diluted with 1 ml of demineralized water containing the addition of 215.67 mg of NaCl. The acylated derivative was isolated from the reaction mixture by subsequent precipitation using 5 times absolute isopropanol. The precipitate was then decanted and repeatedly washed first with absolute isopropanol and then 4 times with an aqueous isopropanol solution (90% by volume). Then the precipitate was washed 3 times with absolute isopropanol to remove water from the derivative. Finally, the precipitate was dried at 40 °C for 48 h.

DS = 1,9 % (stanoveno NMR)DS = 1.9% (determined by NMR)

1H NMR (D2O, 700 MHz) signály acylu: δ 2,8-2,3 ppm (4H, OOC-CH2-CH2-COO), 1,81,2 ppm (m, 26H, -CH2-), 0,9-0,8 (m, 3H, -CH3)1H NMR (D2O, 700 MHz) acyl signals: δ 2.8-2.3 ppm (4H, OOC-CH2-CH2-COO), 1.81.2 ppm (m, 26H, -CH2-), 0, 9-0.8 (m, 3H, -CH3)

Příklad 30Example 30

Příprava derivátu 4-oxo-4-(((2S,3S,4R)-1,3,4- trihydroxyoktadekan-2-yl)amino)butanové kyseliny a hyaluronanu sodného použitím HSTUPreparation of 4-oxo-4-(((2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoctadecan-2-yl)amino)butanoic acid derivative and sodium hyaluronan using HSTU

180 mg kyselé formy hyaluronanu (0,476 mmol, 15 000 g.mol-1) bylo rozpuštěno v 1,8 ml DMSO. Potom bylo přidáno TEA (0,066 ml, 1 ekv.) a DMAP (3 mg, 0,05 ekv.). Současně byla rozpuštěna 4-oxo-4-(((2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoktadekan-2-yl)amino)butanová kyselina (39,77 mg, 0,2 ekv.) v 1,5 ml DMSO. Potom byl k roztoku přidán TEA (0,013 ml, 0,2 ekv.) a HSTU (34,24 mg, 0.2 eq.). Po 7 h při teplotě místnosti byl roztok přidán k roztoku obsahujícímu HA a ponechán reagovat 72 h při teplotě místnosti. Potom byla reakční směs naředěna 1 ml demineralizované vody obsahující přídavek 139,14 mg NaCl. Acylovaný derivát byl vyizolován z reakční směsi následnou precipitací použitím 5-krát absolutního izopropanolu. Potom byl precipitát dekantován a opakovaně promyt nejdřív absolutním izopropanolem a následně 4-krát vodným roztokem izopropanolu (90% obj.). Potom byl precipitát 3-krát promyt absolutním izopropanolem pro odstranění vody z derivátu. Nakonec byl precipitát vysušen při 40 °C 48 hodin.180 mg of the acid form of hyaluronan (0.476 mmol, 15,000 g.mol -1 ) was dissolved in 1.8 ml of DMSO. TEA (0.066 mL, 1 equiv) and DMAP (3 mg, 0.05 equiv) were then added. Simultaneously, 4-oxo-4-(((2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoctadecan-2-yl)amino)butanoic acid (39.77 mg, 0.2 equiv) was dissolved in 1, 5 mL of DMSO. TEA (0.013 mL, 0.2 eq.) and HSTU (34.24 mg, 0.2 eq.) were then added to the solution. After 7 h at room temperature, the solution was added to the solution containing HA and allowed to react for 72 h at room temperature. Then the reaction mixture was diluted with 1 ml of demineralized water containing the addition of 139.14 mg of NaCl. The acylated derivative was isolated from the reaction mixture by subsequent precipitation using 5 times absolute isopropanol. The precipitate was then decanted and repeatedly washed first with absolute isopropanol and then 4 times with an aqueous isopropanol solution (90% by volume). Then the precipitate was washed 3 times with absolute isopropanol to remove water from the derivative. Finally, the precipitate was dried at 40°C for 48 hours.

DS = 2,8 % (stanoveno NMR)DS = 2.8% (determined by NMR)

1H NMR (D2O, 700 MHz) signály acylu: δ 2,8-2,3 ppm (4H, OOC-CH2-CH2-COO), 1,81,2 ppm (m, 26H, -CH2-), 0,9-0,8 (m, 3H, -CH3)1H NMR (D2O, 700 MHz) acyl signals: δ 2.8-2.3 ppm (4H, OOC-CH2-CH2-COO), 1.81.2 ppm (m, 26H, -CH2-), 0, 9-0.8 (m, 3H, -CH3)

- 30 CZ 2023 - 171 A3- 30 CZ 2023 - 171 A3

Příklad 31Example 31

Příprava derivátu 4-oxo-4-(((2 λ ,3 S ,4 R )-1,3,4- trihydroxyoktadekan-2-yl)amino)butanové kyseliny a hyaluronanu sodného použitím benzoylchloriduPreparation of 4-oxo-4-(((2 λ ,3 S ,4 R )-1,3,4-trihydroxyoctadecan-2-yl)amino)butanoic acid derivative and sodium hyaluronan using benzoyl chloride

0,176 g hyaluronanu sodného (0,4 mmol, 15 000 g.mol-1) bylo rozpuštěno v 2,93 ml demineralizované vody. Potom bylo postupně přidáváno 1,47 ml THF. Potom bylo přidáno TEA (0,184 ml, 3 ekv.) a DMAP (5,4 mg, 0,1 ekv.). Současně byla rozpuštěna 4-oxo-4(((2 S ,3 S ,4 R )-1,3,4-trihydroxyoktadekan-2-yl)amino)butanová kyselina (92 mg, 0.5 ekv.) v 1,47 ml THF a TEA (0,031 ml; 0,5 ekv.) a potom byl k roztoku přidán benzoylchlorid (0,026 ml; 0,5 ekv.). Po 30 min při 60 °C byl roztok přidán k roztoku obsahujícímu HA a ponechán reagovat 3 h při teplotě místnosti. Potom byla reakční směs naředěna 0,5 ml demineralizované vody obsahující přídavek 129 mg NaCl. Acylovaný derivát byl vyizolován z reakční směsi následnou precipitací použitím 5-krát absolutního izopropanolu. Potom byl precipitát dekantován a opakovaně promyt nejdřív absolutním izopropanolem a následně 4-krát vodným roztokem izopropanolu (90% obj.). Potom byl precipitát 3-krát promyt absolutním izopropanolem pro odstranění vody z derivátu. Nakonec byl precipitát vysušen při 40 °C 48 hodin.0.176 g of sodium hyaluronan (0.4 mmol, 15,000 g.mol -1 ) was dissolved in 2.93 ml of demineralized water. Then, 1.47 mL of THF was gradually added. TEA (0.184 mL, 3 eq) and DMAP (5.4 mg, 0.1 eq) were then added. Simultaneously, 4-oxo-4(((2 S ,3 S ,4 R )-1,3,4-trihydroxyoctadecan-2-yl)amino)butanoic acid (92 mg, 0.5 eq.) was dissolved in 1.47 mL THF and TEA (0.031 mL; 0.5 eq.) and then benzoyl chloride (0.026 mL; 0.5 eq.) was added to the solution. After 30 min at 60 °C, the solution was added to the solution containing HA and allowed to react for 3 h at room temperature. Then the reaction mixture was diluted with 0.5 ml of demineralized water containing the addition of 129 mg of NaCl. The acylated derivative was isolated from the reaction mixture by subsequent precipitation using 5 times absolute isopropanol. The precipitate was then decanted and repeatedly washed first with absolute isopropanol and then 4 times with an aqueous isopropanol solution (90% by volume). Then the precipitate was washed 3 times with absolute isopropanol to remove water from the derivative. Finally, the precipitate was dried at 40°C for 48 hours.

DS = 0,5 % (stanoveno NMR)DS = 0.5% (determined by NMR)

1H NMR (D2O, 700 MHz) signály acylu: δ 2,8-2,3 ppm (4H, CH2), 1,8-1,2ppm (m, 26H, -CH2-), 0,9-0,8 (m, 3H, -CH3)1H NMR (D2O, 700 MHz) acyl signals: δ 2.8-2.3 ppm (4H, CH2), 1.8-1.2ppm (m, 26H, -CH2-), 0.9-0.8 (m, 3H, -CH3)

Příklad 32Example 32

Příprava derivátu (Z)-4-oxo-4-(((2 S ,3 S ,4 R )-1,3,4-trihydroxyoktadekan-2-yl)amino)but-2enové kyseliny a hyaluronanu sodného použitím benzoylchloridu.Preparation of a derivative of (Z)-4-oxo-4-(((2 S ,3 S ,4 R )-1,3,4-trihydroxyoctadecan-2-yl)amino)but-2-enoic acid and sodium hyaluronan using benzoyl chloride.

360 mg hyaluronanu sodného (0,9 mmol, 6 000 g.mol-1) bylo rozpuštěno v 3,6 ml demineralizované vody. Potom bylo postupně přidáváno 1,8 ml THF. Potom bylo přidáno TEA (0,251 ml, 2 ekv.) a DMAP (5,5 mg, 0,05 ekv.). Současně byla rozpuštěna (Z)-4-oxo4-(((2S,3S,4R)-1,3,4- trihydroxyoktadekan-2-yl)amino)but-2-enová kyselina (187 mg, 0.5 ekv.) v 18,75 ml THF a TEA (0,063 ml; 0,5 ekv.) a potom byl k roztoku přidán benzoylchlorid (0,052 ml; 0,5 ekv.). Po 30 min při 60 °C byl roztok přidán k roztoku obsahujícímu HA a ponechán reagovat 2 h při teplotě místnosti. Acylovaný derivát byl vyizolován z reakční směsi následnou precipitací použitím 5-krát absolutního izopropanolu. Potom byl precipitát dekantován a opakovaně promyt nejdřív absolutním izopropanolem a následně 4-krát vodným roztokem izopropanolu (90% obj.). Potom byl precipitát 3-krát promyt absolutním izopropanolem pro odstranění vody z derivátu a precipitát byl vysušen při 40 °C po dobu 48 hodin.360 mg of sodium hyaluronan (0.9 mmol, 6,000 g.mol -1 ) was dissolved in 3.6 ml of demineralized water. Then 1.8 ml of THF was gradually added. TEA (0.251 mL, 2 equiv) and DMAP (5.5 mg, 0.05 equiv) were then added. At the same time, (Z)-4-oxo4-(((2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoctadecan-2-yl)amino)but-2-enoic acid (187 mg, 0.5 eq.) was dissolved in 18.75 mL of THF and TEA (0.063 mL; 0.5 eq.) and then benzoyl chloride (0.052 mL; 0.5 eq.) was added to the solution. 0.5 equiv). After 30 min at 60 °C, the solution was added to the HA-containing solution and allowed to react for 2 h at room temperature. The acylated derivative was isolated from the reaction mixture by subsequent precipitation using 5 times absolute isopropanol. The precipitate was then decanted and repeatedly washed first with absolute isopropanol and then 4 times with an aqueous isopropanol solution (90% by volume). Then, the precipitate was washed 3 times with absolute isopropanol to remove water from the derivative, and the precipitate was dried at 40°C for 48 hours.

DS = 0,4 % (stanoveno NMR) 1H NMR (D2O, 700 MHz) signály acylu: δ 1,8-1,2 ppm (m, 26H, -CH2-), 0,9-0,8 (m, 3H, -CH3)DS = 0.4% (determined by NMR) 1 H NMR (D2O, 700 MHz) acyl signals: δ 1.8-1.2 ppm (m, 26H, -CH2-), 0.9-0.8 (m , 3H, -CH3)

- 31 CZ 2023 - 171 A3- 31 CZ 2023 - 171 A3

Příklad 33Example 33

Příprava derivátu (Z)-4-oxo-4-(((2 S ,3 S ,4 R )-1,3,4- trihydroxyoktadekan-2-yl)amino)but-2enové kyseliny a hyaluronanu sodného použitím HSTU.Preparation of (Z)-4-oxo-4-(((2 S ,3 S ,4 R )-1,3,4-trihydroxyoctadecan-2-yl)amino)but-2enoic acid derivative and sodium hyaluronan using HSTU.

mg kyselé formy hyaluronanu (0,159 mmol, 15 000 g.mol-1) bylo rozpuštěno v 0,6 ml DMSO. Potom bylo přidáno TEA (0,022 ml, 1 ekv.) a DMAP (1 mg, 0,05 ekv.). Současně byla rozpuštěna (Z)-4-oxo-4-(((2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoktadekan-2-yl)amino)but-2enová kyselina (13,19 mg, 0.2 ekv.) v 0,5 ml DMSO. Potom bylo k roztoku přidáno TEA (0,004 ml; 0,2 ekv.) a HSTU (11,4 mg, 0,2 ekv.). Po 7 h při teplotě místnosti byl roztok přidán k roztoku obsahujícímu HA a ponechán reagovat 72 h při teplotě místnosti. Potom byla reakční směs naředěna 1 ml demineralizované vody obsahující přídavek 46,4 mg NaCl. Acylovaný derivát byl vyizolován z reakční směsi následnou precipitací použitím 5-krát absolutního izopropanolu. Potom byl precipitát dekantován a opakovaně promyt nejdřív absolutním izopropanolem a následně 4-krát vodným roztokem izopropanolu (90% obj.). Potom byl precipitát 3-krát promyt absolutním izopropanolem a precipitát byl vysušen při 40 °C po dobu 48 hodin.mg of the acid form of hyaluronan (0.159 mmol, 15,000 g.mol -1 ) was dissolved in 0.6 ml of DMSO. TEA (0.022 mL, 1 equiv) and DMAP (1 mg, 0.05 equiv) were then added. At the same time, (Z)-4-oxo-4-(((2S,3S,4R)-1,3,4-trihydroxyoctadecan-2-yl)amino)but-2enoic acid (13.19 mg, 0.2 equiv) was dissolved. ) in 0.5 ml DMSO. TEA (0.004 mL; 0.2 eq) and HSTU (11.4 mg, 0.2 eq) were then added to the solution. After 7 h at room temperature, the solution was added to the solution containing HA and allowed to react for 72 h at room temperature. Then the reaction mixture was diluted with 1 ml of demineralized water containing the addition of 46.4 mg of NaCl. The acylated derivative was isolated from the reaction mixture by subsequent precipitation using 5 times absolute isopropanol. The precipitate was then decanted and repeatedly washed first with absolute isopropanol and then 4 times with an aqueous isopropanol solution (90% by volume). Then the precipitate was washed 3 times with absolute isopropanol and the precipitate was dried at 40°C for 48 hours.

DS = 1,4 % (stanoveno NMR)DS = 1.4% (determined by NMR)

1H NMR (CDCl3) signály acylu: δ 1.8-1.2 ppm (m, 26H, -CH2-), 0.9-0.8 (m, 3H, -CH3)1H NMR (CDCl 3 ) acyl signals: δ 1.8-1.2 ppm (m, 26H, -CH2-), 0.9-0.8 (m, 3H, -CH 3 )

Příklad 34Example 34

Enkapsulace tokoferolu (vitamín E) do derivátu 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobutanové kyseliny a hyaluronanu sodnéhoEncapsulation of tocopherol (vitamin E) into a derivative of 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanoic acid and sodium hyaluronan

100 mg derivátu 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobutanové kyseliny a hyaluronanu sodného, který byl připraven podle Příkladu 16, bylo rozpuštěno v 10 ml vody za stálého míchání přes noc. Výsledný roztok byl postupně doplněn roztokem tokoferolu (15 mg v 3 ml izopropanolu) za stálého míchání při teplotě v rozsahu mezi 25 a 40 °C. Následně byl isopropanol odstraněn z roztoku za stálého evaporačního procesu při 35 °C. Potom byl suchý zbytek rehydratován demineralizovanou vodou a filtrován přes 1 μm skleněný filtr. Filtrát byl lyofilizován.100 mg of the derivative of 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanoic acid and sodium hyaluronan, which was prepared according to Example 16, was dissolved in 10 ml of water with constant stirring overnight. The resulting solution was gradually supplemented with a tocopherol solution (15 mg in 3 ml of isopropanol) with constant stirring at a temperature between 25 and 40 °C. Subsequently, isopropanol was removed from the solution during a constant evaporation process at 35 °C. Then the dry residue was rehydrated with demineralized water and filtered through a 1 μm glass filter. The filtrate was lyophilized.

Množství navázaného tokoferolu stanovené HPLC bylo 12,3 % (hmotn./hmotn.).The amount of bound tocopherol determined by HPLC was 12.3% (wt/wt).

Příklad 35Example 35

Společné plnění tokoferolu (vitamín E) a kanabidiolu do derivátu 4-(((2S,3S,4R)-3,4dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobutanové kyseliny a hyaluronanu sodného.Co-loading of tocopherol (vitamin E) and cannabidiol into a derivative of 4-(((2S,3S,4R)-3,4dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanoic acid and sodium hyaluronan.

100 mg derivátu 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobutanové kyseliny a hyaluronanu sodného, který byl připraven podle Příkladu 12, bylo rozpuštěno v 10 ml vody za stálého míchání přes noc. Výsledný roztok byl postupně doplněn roztokem tokoferolu (15 mg) a kanabidiolu (5 mg) ve 4 ml izopropanolu) za stálého míchání při teplotě v rozsahu mezi 25 a 40 °C. Následně byl isopropanol odstraněn z roztoku za stálého evaporačního procesu při 35 °C. Potom byl suchý zbytek rehydratován vodou a filtrován přes 1 μm skleněný filtr. Filtrát byl lyofilizován.100 mg of the derivative of 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanoic acid and sodium hyaluronan, which was prepared according to Example 12, was dissolved in 10 ml of water under constant stirring overnight. The resulting solution was gradually supplemented with a solution of tocopherol (15 mg) and cannabidiol (5 mg) in 4 ml of isopropanol) with constant stirring at a temperature between 25 and 40 °C. Subsequently, isopropanol was removed from the solution during a constant evaporation process at 35 °C. Then the dry residue was rehydrated with water and filtered through a 1 μm glass filter. The filtrate was lyophilized.

- 32 CZ 2023 - 171 A3- 32 CZ 2023 - 171 A3

Tokoferol a kanabidiol byly stanoveny HPLC jako 11,4 % a 4,0 % (hmotn./hmotn.), v daném pořadí.Tocopherol and cannabidiol were determined by HPLC as 11.4% and 4.0% (w/w), respectively.

Příklad 36Example 36

Enkapsulace kurkuminu do derivátu 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobutanové kyseliny a hyaluronanu sodnéhoEncapsulation of curcumin into a derivative of 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanoic acid and sodium hyaluronan

100 mg derivátu 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobutanové kyseliny a hyaluronanu sodného, který byl připraven podle Příkladu 12, bylo rozpuštěno v 10 ml vody za stálého míchání přes noc. Výsledný roztok byl postupně doplněn roztokem kurkuminu (5 mg v 5 ml izopropanolu) za stálého míchání při teplotě v rozsahu mezi 25 a 40 °C. Následně byl isopropanol odstraněn z roztoku za stálého evaporačního procesu při 35 °C. Potom byl suchý zbytek rehydratován demineralizovanou vodou a filtrován přes 1 μm skleněný filtr. Filtrát byl lyofilizován.100 mg of the derivative of 4-(((2 S ,3 S ,4 R )-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanoic acid and sodium hyaluronan, which was prepared according to Example 12, was dissolved in 10 ml of water with constant stirring overnight. The resulting solution was gradually supplemented with a curcumin solution (5 mg in 5 ml of isopropanol) with constant stirring at a temperature between 25 and 40 °C. Subsequently, isopropanol was removed from the solution during a constant evaporation process at 35 °C. Then the dry residue was rehydrated with demineralized water and filtered through a 1 μm glass filter. The filtrate was lyophilized.

Množství kurkuminu stanoveno UV-Vis bylo 1,9 % (hmotn./hmotn.)The amount of curcumin determined by UV-Vis was 1.9% (w/w)

Příklad 37Example 37

Enkapsulace ethylferulátu do derivátu 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobutanové kyseliny a hyaluronanu sodného.Encapsulation of ethyl ferulate into a derivative of 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanoic acid and sodium hyaluronan.

100 mg derivátu 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobutanové kyseliny a hyaluronanu sodného, který byl připraven podle Příkladu 16, bylo rozpuštěno v 10 ml vody za stálého míchání přes noc. Výsledný roztok byl postupně doplněn roztokem ehylferulátu (15 mg v 15 ml izopropanolu) za stálého míchání při teplotě v rozsahu mezi 25 a 40 °C. Následně byl isopropanol odstraněn z roztoku za stálého evaporačního procesu při 35 °C. Potom byl suchý zbytek rehydratován demineralizovanou vodou a filtrován přes 1 μm skleněný filtr. Filtrát byl lyofilizován.100 mg of the derivative of 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanoic acid and sodium hyaluronan, which was prepared according to Example 16, was dissolved in 10 ml of water under constant stirring overnight. The resulting solution was gradually supplemented with a solution of heylferulate (15 mg in 15 ml of isopropanol) with constant stirring at a temperature between 25 and 40 °C. Subsequently, isopropanol was removed from the solution during a constant evaporation process at 35 °C. Then the dry residue was rehydrated with demineralized water and filtered through a 1 μm glass filter. The filtrate was lyophilized.

Množství ethylferulátu (stanovené UV-Vis metodou) bylo 6,1 % (hmotn./hmotn.).The amount of ethyl ferulate (determined by the UV-Vis method) was 6.1% (w/w).

Příklad 38Example 38

Enkapsulace keonzymu Q10 do derivátů 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobutanové kyseliny a hyaluronanu sodného.Encapsulation of Keonzyme Q10 into derivatives of 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanoic acid and sodium hyaluronan.

100 mg derivátu 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooktadecyl)oxy)-4-oxobutanové kyseliny a hyaluronanu sodného, který byl připraven podle Příkladu 12, bylo rozpuštěno v 10 ml vody za stálého míchání přes noc. Výsledný roztok byl postupně doplněn roztokem koenzymu Q10 (20 mg v 5 ml CHCl3) za stálého míchání při teplotě v rozsahu mezi 25 a 40 °C. Následně byl CHCh odstraněn z roztoku za stálého evaporačního procesu při 35 °C. Potom byl suchý zbytek rehydratován demineralizovanou vodou a filtrován přes 1 pm skleněný filtr. Filtrát byl lyofilizován.100 mg of the derivative of 4-(((2S,3S,4R)-3,4-dihydroxy-2-oleamidooctadecyl)oxy)-4-oxobutanoic acid and sodium hyaluronan, which was prepared according to Example 12, was dissolved in 10 ml of water under constant stirring overnight. The resulting solution was gradually supplemented with a solution of coenzyme Q10 (20 mg in 5 ml of CHCl3) with constant stirring at a temperature between 25 and 40 °C. Subsequently, CHCl was removed from the solution under a constant evaporation process at 35 °C. Then the dry residue was rehydrated with demineralized water and filtered through a 1 µm glass filter. The filtrate was lyophilized.

Množství navázaného koenzymu Q10 stanovené UV-Vis metodou bylo 11,2 % (hmotn./hmotn.).The amount of bound coenzyme Q10 determined by the UV-Vis method was 11.2% (wt/wt).

- 33 CZ 2023 - 171 A3- 33 CZ 2023 - 171 A3

Příklad 39Example 39

Stanovení kritické agregační koncentrace (cac) esterových konjugátů a Nilské červeně.Determination of critical aggregation concentration (cac) of ester conjugates and Nile red.

Polymerní micely obsahující nekovalentně navázanou Nilskou červeň byly připraveny pro stanovení kritické agregační koncentrace (cac). Stručně, 60 mg esterového konjugátu připraveného, jak je popsáno v příkladech popsaných v Tabulce 1, bylo rozpuštěno za stálého míchání v 10 ml vody přes noc. Výsledný roztok byl postupně doplněn roztokem Nilské červeně (0,72 mg v 1,2 ml CHCI3). Následně byl CHCh odstraněn z roztoku za stálého evaporačního procesu při 35 °C. Potom byl suchý zbytek rehydratován vodou a filtrován přes 1 μm skleněný filtr. Filtrát byl lyofilizován. Lyofilizát byl rozpuštěn a naředěn na koncentraci v rozsahu od 0,00002 do 1,5 mg.ml-1. Po 24 hodinách ekvilibrace byla cac stanovena naměřením emisního fluorescenčního spektra (560-800 nm) na PTI Quanta Master 400 spektrofotometru (PTI) s nastavenou excitační vlnovou délkou 543 nm a excitační a emisní štěrbinou 5 nm. Počátek agregace byl stanoven z koncentrační závislosti maximální pozice NR emisního pásu. Dvě sady dat byly získány pro každý vzorek a analyzovány dohromady. Koordináta inflexního bodu sigmoidního fitu získané semilogaritmické (koncentrační osa) závislosti je uvedena jako cac hodnota (Tabulka 1).Polymeric micelles containing non-covalently bound Nile red were prepared to determine the critical aggregation concentration (cac). Briefly, 60 mg of the ester conjugate prepared as described in the examples described in Table 1 was dissolved with constant stirring in 10 mL of water overnight. The resulting solution was gradually supplemented with a solution of Nile red (0.72 mg in 1.2 ml of CHCl3). Subsequently, CHCl was removed from the solution under a constant evaporation process at 35 °C. Then the dry residue was rehydrated with water and filtered through a 1 μm glass filter. The filtrate was lyophilized. The lyophilizate was dissolved and diluted to a concentration ranging from 0.00002 to 1.5 mg.ml -1 . After 24 h of equilibration, cac was determined by measuring the emission fluorescence spectrum (560-800 nm) on a PTI Quanta Master 400 spectrophotometer (PTI) with an excitation wavelength set at 543 nm and an excitation and emission slit of 5 nm. The beginning of aggregation was determined from the concentration dependence of the maximum position of the NR emission band. Two sets of data were obtained for each sample and analyzed together. The coordinate of the inflection point of the sigmoid fit of the obtained semilogarithmic (concentration axis) dependence is given as the cac value (Table 1).

Tabulka 1. Stanovení kritické agregační koncentrace pro esterové konjugáty této aplikace.Table 1. Determination of critical aggregation concentration for ester conjugates of this application.

Příklady Examples 12 12 13 13 14 14 17 17 18 18 Mw [g.mol-1] Mw [g.mol -1 ] 6 000 6,000 6 000 6,000 6 000 6,000 15 000 15,000 15 000 15,000 DS [%] DS [%] 14,2 ± 0,2 14.2 ± 0.2 12,0 ± 0,3 12.0 ± 0.3 8,0 ± 0,2 8.0 ± 0.2 6,4 ± 0,4 6.4 ± 0.4 3,2 ± 0,2 3.2 ± 0.2 cac [mg.ml-1] cac [mg.ml -1 ] 0,0019 ± 0,0002 0.0019 ± 0.0002 0,0024 ± 0,0006 0.0024 ± 0.0006 0,0065 ± 0,0015 0.0065 ± 0.0015 0,041 ± 0,006 0.041 ± 0.006 0,0125 ± 0,6 0.0125 ± 0.6

Příklad 40Example 40

Stanovení pyrenové vazebné konstanty esterových konjugátů.Determination of the pyrene binding constant of ester conjugates.

Série pyrenových filmů byla připravena ve skleněných vialkách obsahujících pyrenový film. Potom byl do každé vialky přidán amfifilní derivát hyaluronové kyseliny v demineralizované vodě pro získání koncentrace od 0,001 do 10 mg.ml-1. Výsledná koncentrace pyrenu v každé vialce byla 0,8 μg.ml-1. Roztoky byly třepány při teplotě místnosti alespoň 24 h. Potom byla měřena fluorescence použitím PTI Quanta Master 400 spektrofluorofotometru. Excitační vlnová délka byla nastavena na 334 nm a emisní vlnová dálka v rozsahu 345-550 nm. Poměry prvního a třetího fluorescenčního píku pyrenu (I1/I3) byly vyneseny proti koncentraci esterového konjugátu připraveného jako příklady popsané v tabulce 2 pro získání sigmoidní závislosti, jak bylo uvedeno dříve (Kwon a kol., 2003). Reciproční hodnota inflexního bodu na x-ose byla uvedena jako pyrenová vazebná konstanta Kv.A series of pyrene films were prepared in glass vials containing the pyrene film. An amphiphilic derivative of hyaluronic acid in demineralized water was then added to each vial to obtain a concentration from 0.001 to 10 mg.ml -1 . The resulting concentration of pyrene in each vial was 0.8 μg.ml -1 . The solutions were shaken at room temperature for at least 24 h. Fluorescence was then measured using a PTI Quanta Master 400 spectrofluorophotometer. The excitation wavelength was set to 334 nm and the emission wavelength in the range of 345-550 nm. The ratios of the first and third pyrene fluorescence peaks (I1/I3) were plotted against the concentration of the ester conjugate prepared as examples described in Table 2 to obtain a sigmoidal relationship as previously reported (Kwon et al., 2003). The reciprocal of the inflection point on the x-axis was given as the pyrene binding constant Kv.

Tabulka 2. Stanovení pyrenové vazebné konstanty KvTable 2. Determination of pyrene binding constant Kv

Příklady Examples 12 12 13 13 14 14 17 17 18 18 Mw [g.mol-1] Mw [g.mol -1 ] 6 000 6,000 6 000 6,000 6 000 6,000 15 000 15,000 15 000 15,000 DS [%] DS [%] 14,3±0,14 14.3±0.14 12,2±0,21 12.2±0.21 8,3±0,41 8.3±0.41 6,2±0,13 6.2±0.13 3,2±0,15 3.2±0.15 Kv [ml.mg-1] Kv [ml.mg -1 ] 6,31 ± 0,15 6.31 ± 0.15 5,21 ± 0,36 5.21 ± 0.36 2,42 ± 0,17 2.42 ± 0.17 2,18 ± 0,24 2.18 ± 0.24 0,78 ± 0,06 0.78 ± 0.06

- 34 CZ 2023 - 171 A3- 34 CZ 2023 - 171 A3

Výsledky ukázaly, že hydrofobicita vnitřního jádra samouspořádaných polymerních částic roste se zvyšujícím se stupněm substituce a klesající Mw.The results showed that the hydrophobicity of the inner core of self-assembled polymer particles increases with increasing degree of substitution and decreasing Mw.

Příklad 41Example 41

Vyhodnocení cytotoxicity vybraných esterových konjugátůCytotoxicity evaluation of selected ester conjugates

Je důležité, aby se interakce buněk s esterovými konjugáty podle stávajícího vynálezu studovala před aplikací produktu. Po chemické modifikaci hyaluronové kyseliny by deriváty neměly být toxické. V této práci byla cytotoxicita stanovena použitím ředicí metody. Buněčná toxicita připravených HA derivátů byla testovaná na NIH-3T3 buňkách. Buňky byly nasazeny do jamek 96-jamkových testovacích destiček a kultivovány 24 hodin. Buněčná viabilita byla měřena 0, 24, 48 a 72 hodin po ošetření použitím 3-(4, 5dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl-tetrazolium bromidu (MTT). MTT zásobní roztok (20 μl; koncentrace 5 mg.ml-1) byl přidán do buněčného kultivačního média (200 μl) do každé jamky. Destičky byly inkubovány 2,5 h při 37 °C. Potom, po odstranění MTT roztoku bylo přidáno 220 pl lyzačního roztoku a lyze byla provedena 30 min při teplotě místnosti. Optická hustota byla měřena na Mikrodestičkovém readeru VERSAmax při 570 nm. Všechny testované deriváty byly necytotoxické až do koncentrace 1,000 pg.ml-1. Například výsledky pro konjugáty připravené podle příkladů 9, 11, 10, 40 a 14 jsou ukázány na Obr. 11, kde pozitivní účinky na buněčnou viabilitu po 24, 48 nebo 72 h byly pozorovány v celém testovaném koncentračním rozsahu, zatímco nejvíce pozitivní účinky byly opakovaně pozorovány při 100 μg.ml-1, což ukazuje výbornou cytokompatibilitu konjugátu.It is important that cell interaction with the ester conjugates of the present invention be studied prior to application of the product. After the chemical modification of hyaluronic acid, the derivatives should not be toxic. In this work, cytotoxicity was determined using the dilution method. The cellular toxicity of the prepared HA derivatives was tested on NIH-3T3 cells. Cells were seeded into wells of 96-well assay plates and cultured for 24 hours. Cell viability was measured at 0, 24, 48 and 72 hours after treatment using 3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT). MTT stock solution (20 μl; concentration 5 mg.ml -1 ) was added to the cell culture medium (200 μl) in each well. Plates were incubated for 2.5 h at 37°C. Then, after removing the MTT solution, 220 µl of lysis solution was added and lysis was performed for 30 min at room temperature. The optical density was measured on a VERSAmax microplate reader at 570 nm. All tested derivatives were non-cytotoxic up to a concentration of 1,000 pg.ml -1 . For example, the results for conjugates prepared according to Examples 9, 11, 10, 40 and 14 are shown in Fig. 11, where positive effects on cell viability after 24, 48 or 72 h were observed in the entire tested concentration range, while the most positive effects were repeatedly observed at 100 μg.ml -1 , which shows the excellent cytocompatibility of the conjugate.

Příklad 42Example 42

Kožní penetrace konjugátůSkin penetration of conjugates

Podle OECD pokynů v FDA-certifikovaných vertikálních Franzových difuzních celách byly experimenty kožní penetrace provedeny použitím kůže plné tloušťky (1 mm) z prasečích ušních boltců darovaných místními jatky. Receptor byl naplněn PBS (pH 7,4), držený při 32 °C a vyříznutá tkáň byla uchycena mezi donor a receptor s SC mířící vzhůru a vystavenou difuzní plochou 1 cm2. Po 30 min ekvilibrace byl donorový kompartment pomalu naplněn 0,2 ml kontroly (PBS) nebo Nilskou červení naplněnou disperzí samouspořádaných polymerních částic připravených podle příkladů 12 a 14 s koncentrací 1 mg.ml-1 v PBS (pH 7,4) a uzavřených víkem. Po aplikaci trvající 24 h byly buňky uvolněny a kůže byla promyta PBS, zamražena a kryo-nařezána pro další mikroskopickou analýzu. Fluorescence Nilské červeně v kůži byla pozorována po topické aplikaci Nilskou červení naplněných samouspořádaných nanočástic. Obr. 12 ukazuje kožní pronikání konjugátů připravených podle příkladů 11 (DS = 8,2 %) a 9 (DS = 14,2 %).According to OECD guidelines in FDA-certified vertical Franz diffusion cells, skin penetration experiments were performed using full-thickness skin (1 mm) from porcine auricles donated by local slaughterhouses. The receptor was filled with PBS (pH 7.4), kept at 32°C, and the excised tissue was clamped between the donor and the receptor with the SC pointing upwards and a diffusion area of 1 cm 2 exposed. After 30 min of equilibration, the donor compartment was slowly filled with 0.2 ml of control (PBS) or a Nile red-loaded dispersion of self-assembled polymer particles prepared according to examples 12 and 14 at a concentration of 1 mg.ml -1 in PBS (pH 7.4) and closed with a lid . After application lasting 24 h, the cells were detached and the skin was washed with PBS, frozen and cryo-sectioned for further microscopic analysis. Nile red fluorescence in the skin was observed after topical application of Nile red loaded self-assembled nanoparticles. fig. 12 shows the skin penetration of conjugates prepared according to examples 11 (DS = 8.2%) and 9 (DS = 14.2%).

Příklad 43Example 43

Imunomodulační vlastnosti esterových konjugátůImmunomodulating properties of ester conjugates

Imunomodulační vlastnosti sodné soli připravených esterových konjugátů byly stanoveny měřením hladiny prozánětlivého cytokinu interleukinu 6 (IL-6) produkovanému LPSaktivovanými makrofágy po vystavení těmto derivátům. THP-1 buňky (400 000The immunomodulatory properties of the sodium salt of the prepared ester conjugates were determined by measuring the level of the pro-inflammatory cytokine interleukin 6 (IL-6) produced by LPS-activated macrophages after exposure to these derivatives. THP-1 cells (400,000

- 35 CZ 2023 - 171 A3 buněk/jamku, 6-jamková destička) byly diferencovány do makrofágů kultivací ve forbol myristát acetátu (50 ng.ml-1) 24 hodin a potom 24 hodin dlouhou odpočívací fází. Potom byly makrofágy ko-inkubovány s LPS (1 μg.ml-1) a esterovými konjugáty (v koncentracích 250 μg.ml-1 a 100 pg.ml-1). Makrofágy stimulované pouze LPS byly použity jako pozitivní kontrola. Naopak nestimulované makrofágy byly použity jako negativní kontrola. Volný ceramid NP 18:1 a HA (6 kDa) byly použity pro porovnání. Byly testovány ve stejných koncentracích jako esterové konjugáty (250 μg.ml-1 and 100 pg.ml-1). Koncentrace volného ceramidu NP 18:1 byly upraveny podle DS esterových konjugátů a jejich koncentrací. Esterové konjugáty připravené podle příkladů 14 a 17 a HA (6 kDa) byly rozpuštěny v kultivačním médiu; volný ceramid NP 18:1 byl rozpuštěn v DMSO. Rozpouštědlová kontrola (DMSO) byla také zahrnuta do experimentálního nastavení. Po 24-hodin dlouhém vystavení LPS a testovaným látkám byly posbírány supernatanty a hladina IL-6 byla měřena ELISA (Thermo-Fisher).- 35 CZ 2023 - 171 A3 cells/well, 6-well plate) were differentiated into macrophages by culturing in phorbol myristate acetate (50 ng.ml -1 ) for 24 hours and then a 24-hour resting phase. Then, macrophages were co-incubated with LPS (1 μg.ml -1 ) and ester conjugates (at concentrations of 250 μg.ml -1 and 100 pg.ml -1 ). Macrophages stimulated with LPS alone were used as a positive control. Conversely, unstimulated macrophages were used as a negative control. Free ceramide NP 18:1 and HA (6 kDa) were used for comparison. They were tested in the same concentrations as the ester conjugates (250 μg.ml -1 and 100 pg.ml -1 ). Concentrations of free NP 18:1 ceramide were adjusted according to DS ester conjugates and their concentrations. Ester conjugates prepared according to Examples 14 and 17 and HA (6 kDa) were dissolved in the culture medium; free ceramide NP 18:1 was dissolved in DMSO. A solvent control (DMSO) was also included in the experimental setup. After 24-hour exposure to LPS and test substances, supernatants were collected and IL-6 level was measured by ELISA (Thermo-Fisher).

Esterové konjugáty snížily hladinu prozánětlivého cytokinu IL-6, jak je ukázáno na Obr. 15. Bylo zjištěno, že snížení IL-6 hladiny je koncentračně závislé a nejvyšší inhibiční účinek u produkce IL-6 byl pozorován při koncentraci 250 μg.ml-1. Při této koncentraci esterové konjugáty statisticky významně (p < 0.001) inhibovaly produkci IL-6 o 95,3 % (Příklad 17) a 91,1 % (Příklad 14) v porovnání s pozitivní kontrolou. Schopnost esterových konjugátů potlačit zánětlivý marker IL-6 je u těchto derivátů unikátní a byla způsobena synergií mezi HA a ceramidem NP 18:1. Ani nativní HA, ani volný ceramid NP 18:1 neukázaly žádný významný IL-6 inhibiční účinek.The ester conjugates reduced the level of the pro-inflammatory cytokine IL-6, as shown in Fig. 15. It was found that the reduction of IL-6 level is concentration-dependent and the highest inhibitory effect on IL-6 production was observed at a concentration of 250 μg.ml -1 . At this concentration, the ester conjugates statistically significantly (p < 0.001) inhibited IL-6 production by 95.3% (Example 17) and 91.1% (Example 14) compared to the positive control. The ability of the ester conjugates to suppress the inflammatory marker IL-6 is unique among these derivatives and was due to the synergy between HA and ceramide NP 18:1. Neither native HA nor free ceramide NP 18:1 showed any significant IL-6 inhibitory effect.

Příklad 44Example 44

Kompozice emulze připravené použitím esterového konjugátu sfingolipidu s HAEmulsion compositions prepared using a sphingolipid ester conjugate with HA

Krém (emulze olej ve vodě) připravený použitím esterového konjugátu sfingolipidu s HA obsahuje:A cream (oil-in-water emulsion) prepared using an ester conjugate of sphingolipid with HA contains:

(a) od 0,001 do 0,1 % hmotnostních samouspořádané polymerní částice připravené z esterového konjugátu sfingolipidu a HA (b) alespoň jeden tuk vybraný ze skupiny obsahující olej, vosk nebo máslo, (c) alespoň jeden emulgátor, (d) alespoň jednu pomocou aktivní složku, (f) alespoň jeden konzervant (e) q.s.p. 100% hmotnostních gelové báze nebo vody.(a) from 0.001 to 0.1% by weight of self-assembled polymer particles prepared from an ester conjugate of sphingolipid and HA (b) at least one fat selected from the group consisting of oil, wax or butter, (c) at least one emulsifier, (d) at least one using active ingredient, (f) at least one preservative (e) q.s.p. 100% by weight of gel base or water.

Příklady kosmetických formulací jsou shrnuty v Tabulkách 3 - 5.Examples of cosmetic formulations are summarized in Tables 3 - 5.

Tabulka 3Table 3

Přísada Ingredient INCI INCI Emulze s: % (hmotn./hmotn.) Emulsion with: % (w/w) Příklad 17 Example 17 Příklad 14 Example 14 Erkarel TCC V Erkarel TCC V Caprilyc/Capric Triglyceride Caprilyc/Capric Triglyceride 12,00 12.00 12,00 12.00 Sorbitan Stearát Sorbitan Stearate Sorbitan Stearate Sorbitan Stearate 1,50 1.50 1,50 1.50 Polysorbát 60 Polysorbate 60 Polysorbate 60 Polysorbate 60 2,50 2.50 2,50 2.50 Bambucké máslo Shea butter Butyrospermum Parkii Butter Butyrospermum Parkii Butter 4,50 4.50 4,50 4.50 Cetylalkohol Cetyl alcohol Cetyl Alcohol Cetyl Alcohol 4,00 4.00 4,00 4.00

- 36 CZ 2023 - 171 A3- 36 CZ 2023 - 171 A3

Kyselina stearová Stearic acid Stearic Acid Stearic Acid 2,00 2.00 2,00 2.00 Deionizovaná voda Deionized water Aqua Aqua 70,09 70.09 70,09 70.09 Glycerin Glycerine Glycerin Glycerine 2,00 2.00 2,00 2.00 EDTA EDTA Tetrasodium EDTA Tetrasodium EDTA 0,20 0.20 0,20 0.20 Esterový konjugát připravený_____podle Příkladu 17 Ester conjugate prepared_____by Example 17 - - 0,010 0.010 - - Esterový konjugát připravený_____podle Příkladu 14 Ester conjugate prepared_____by Example 14 - - - - 0,010 0.010 Benzylalkohol-DHA Benzyl alcohol-DHA Benzyl Alcohol, Dehydroacetic Acid Benzyl Alcohol, Dehydroacetic Acid 0,80 0.80 0,80 0.80 20 % TEA 20% TEA Triethanolamine Triethanolamine 0,40 0.40 0,40 0.40

Tabulka 4Table 4

Přísada Ingredient INCI INCI Emulze s: % (hmotn./hmotn.) Emulsion with: % (w/w) Příklad 16 Example 16 Příklad 24 Example 24 Glycerin Glycerine Glycerin Glycerine 4,00 4.00 4,00 4.00 Jojobový olej Jojoba oil Simmondsia Chinensis Seed Oil Simmondsia Chinensis Seed Oil 12,00 12.00 12,00 12.00 Kakaové máslo Cocoa butter Theobroma Cacao Seed Butter Theobroma Cacao Seed Butter 6,00 6.00 6,00 6.00 Směs na výrobu krémů Mixture for production creams Glyceryl Stearate, PEG-100 Stearate Glyceryl Stearate, PEG-100 Stearate 3,00 3.00 3,00 3.00 Kyselina stearová Stearic acid Stearic Acid Stearic Acid 2,00 2.00 2,00 2.00 Cetylalkohol Cetyl alcohol Cetyl Alcohol Cetyl Alcohol 3,00 3.00 3,00 3.00 Vitamín E acetát Vitamin E Acetate Tocopheryl Acetate Tocopheryl Acetate 1,00 1.00 1,00 1.00 30% Hydroxid sodný 30% Sodium hydroxide Sodium Hydroxide, Aqua Sodium Hydroxide, Aqua 0,55 0.55 0,55 0.55 Deionizovaná voda Deionized water Aqua Aqua 67,55 67.55 67,55 67.55 Esterový konjugát připravený podle Příkladu 16 Ester conjugate prepared according to Example 16 - - 0,10 0.10 - - Esterový konjugát připravený podle Příkladu 24 Ester conjugate prepared according to Example 24 - - - - 0,10 0.10 Benzylalkohol DHA Benzyl alcohol DHA Benzyl Alcohol, Dehydroacetic Acid Benzyl Alcohol, Dehydroacetic Acid 0,80 0.80 0,80 0.80

Tabulka 5Table 5

Přísada Ingredient INCI INCI Obličejový krém s: % (hmotn./hmotn.) Face cream with: % (w/w) Příklad 18 Example 18 Příklad 13 Example 13 Mandlový olej Almond oil Prunus Amygdalus Dulcis Oil Prunus Amygdalus Dulcis Oil 13,00 13.00 13,00 13.00 Avokádové máslo Avocado butter Hydrogenated avocado oil Hydrogenated avocado oil 5,00 5.00 5,00 5.00 Cetylalkohol Cetyl alcohol Cetyl alkohol Cetyl alcohol 2,00 2.00 2,00 2.00 Glyceryl stearát citrát Glyceryl stearate citrate Glyceryl Stearate Citrate Glyceryl Stearate Citrate 5,00 5.00 5,00 5.00 Vit E acetát Vit E Acetate Tocopheryl Acetate Tocopheryl Acetate 1,00 1.00 1,00 1.00 Deionizovaná voda Deionized water Aqua Aqua 62,95 62.95 62,95 62.95

- 37 CZ 2023 - 171 A3- 37 CZ 2023 - 171 A3

Glycerin Glycerine Glycerin Glycerine 2,00 2.00 2,00 2.00 Panthenol Panthenol Panthenol Panthenol 3,00 3.00 3,00 3.00 Močovina Urea Urea Urea 4,00 4.00 4,00 4.00 HE-celulóza HE-cellulose Hydroxyethylcellulose Hydroxyethyl cellulose 1,00 1.00 1,00 1.00 Esterový______konjugát připravený_______podle Příkladu 18 Ester______conjugate prepared_______by Example 18 - - 0,25 0.25 - - Esterový_____konjugát připravený_______podle Příkladu 13 Ester_____conjugate prepared_______by Example 13 - - - - 0,25 0.25 Benzylalkohol-DHA Benzyl alcohol-DHA Benzyl Alcohol, Dehydroacetic Acid Benzyl Alcohol, Dehydroacetic Acid 0,80 0.80 0,80 0.80

Příklad 45Example 45

Formulace pro sérum připravené použitím esterového konjugátu sfingolipidu s HAA serum formulation prepared using a sphingolipid ester conjugate with HA

Formulace pro sérum připravené použitím esterového konjugátu sfingolipidu s HA obsahující:A serum formulation prepared using a sphingolipid ester conjugate with HA containing:

(a) od 0,001 do 0,1% hmotnostních samouspořádané polymerní částice vytvořené z esterového konjugátu sfingolipidu a HA (b) alespoň jednu pomocnou aktivní přísadu, (c) alespoň jeden konzervant (d) alespoň jedno zahušťovadlo (e) q.s.p. 100% hmotnostních vody.(a) from 0.001 to 0.1% by weight of self-assembled polymer particles formed from an ester conjugate of sphingolipid and HA (b) at least one auxiliary active ingredient, (c) at least one preservative (d) at least one thickener (e) q.s.p. 100% water by weight.

Příklady kosmetických formulací jsou shrnuty v Tabulkách 6 - 7.Examples of cosmetic formulations are summarized in Tables 6 - 7.

Tabulka 6Table 6

Přísada Ingredient INCI INCI Sérum s: (% hmotn./hmotn.) Serum with: (% w/w) Příklad 14 Example 14 Příklad 16 Example 16 Voda Water Aqua Aqua 95,799 95,799 95,799 95,799 Hyaluronát sodný Sodium hyaluronate Sodium Hyaluronate Sodium Hyaluronate 1,50 1.50 1,50 1.50 Vitamín B3 Vitamin B3 Niacinamide Niacinamide 1,50 1.50 1,50 1.50 TanAktin TanActin Glucomannan Glucomannan 0,20 0.20 0,20 0.20 Esterový konjugát připravený podle Příkladu 14 Ester conjugate prepared according to Example 14 - - 0,001 0.001 - - Esterový konjugát připravený podle Příkladu 16 Ester conjugate prepared according to Example 16 - - - - 0,001 0.001 Fenoxyethanol Phenoxyethanol Phenoxyethanol Phenoxyethanol 1,00 1.00 1,00 1.00

- 38 CZ 2023 - 171 A3- 38 CZ 2023 - 171 A3

Tabulka 7Table 7

Přísada Ingredient INCI INCI Sérum s: (% hmotn./hmotn.) Serum with: (% w/w) Příklad 14 Example 14 Příklad 18 Example 18 Voda Water Aqua Aqua 93,0 93.0 93.0 93.0 Ekogel Ecogel Lysolecithin (and) Sclerotium Gum (and) Xanthan Gum (and) Pullulan Lysolecithin (and) Sclerotium Gum (and) Xanthan Gum Pullulan 1,50 1.50 1,50 1.50 Hyaluronát sodný Sodium hyaluronate Sodium Hyaluronate Sodium Hyaluronate 0,10 0.10 0,10 0.10 Vitamín B3 Vitamin B3 Niacinamide Niacinamide 1,50 1.50 1,50 1.50 Panthenol Panthenol Panthenol Panthenol 1,00 1.00 1,00 1.00 Vitamín C Vitamin C Sodium Ascorbyl Phosphate Sodium Ascorbyl Phosphates 1,80 1.80 1,80 1.80 TanAktin TanActin Glucomannan Glucomannan 0,20 0.20 0,20 0.20 Esterový konjugát připravený podle Příkladu 14 Ester conjugate prepared according to Example 14 - - 0,1 0.1 - - Esterový konjugát připravený podle Příkladu 18 Ester conjugate prepared according to Example 18 - - - - 0,1 0.1 Benzylalkohol- DHA benzyl alcohol- DHA Benzyl Alcohol, Dehydroacetic Acid Benzyl Alcohol, Dehydroacetic Acid 0,80 0.80 0,80 0.80

Příklad 46Example 46

Vývoj nanoemulze vyrobené z esterového konjugátu sfingolipidu s HADevelopment of a nanoemulsion made from a sphingolipid ester conjugate with HA

Nanoemulze byly připraveny použitím homogenizační metody za vysokého třepání na Ultra-Turrax® zařízení (IKA, Německo). Formulace sestávala z olejové fáze obsahující olejový emulgátor (0,1 - 10%) a vodné fáze obsahující samouspořádané částice konjugátu sfingolipidu s HA připravené podle Příkladů 12 až 24 (2 % hmotn./obj.) a ultračistou vodu. Fáze byly homogenizované odděleně pomocí magnetického míchadla. Potom byla olejová fáze nastříknuta do vodné váze za třepání 10 000 rpm, které bylo zvýšeno na 17 000 rpm a drženo 30 min s řízenou teplotou.Nanoemulsions were prepared using the homogenization method under high shaking on an Ultra-Turrax® device (IKA, Germany). The formulation consisted of an oil phase containing an oil emulsifier (0.1-10%) and an aqueous phase containing self-assembled sphingolipid conjugate particles with HA prepared according to Examples 12 to 24 (2% w/v) and ultrapure water. The phases were homogenized separately using a magnetic stirrer. Then the oil phase was injected into the aqueous phase with shaking at 10,000 rpm, which was increased to 17,000 rpm and held for 30 min with controlled temperature.

Příklad 47Example 47

Formulace hydrogelu obsahující esterový konjugát sfingolipidu s HAA hydrogel formulation containing a sphingolipid ester conjugate with HA

Roztok oxidované HA (HA-OX) připravený podle patentu WO2011069475A2 a samouspořádané částice konjugátu sfinolipidu s HA připravené podle Příkladů 12 až 24 (1:1) byly připraveny v demineralizované vodě, ve které byly finální koncentrace polymerů od 1,5 do 7,5 %, v daném pořadí. K tomuto roztoku bylo přidáno (0,1 % hmotn./obj.) O,O'-1,3-propandiylbishydroxylamine dihydrochlorid 98% linker byl rozpuštěný a homogenizovaný. Potom byl roztok přenesen do Teflonových forem (válce, průměr 10 mm, výška 5 mm), aby se vytvořil gel.A solution of oxidized HA (HA-OX) prepared according to WO2011069475A2 and self-assembled sphingolipid conjugate particles with HA prepared according to Examples 12 to 24 (1:1) were prepared in demineralized water in which the final polymer concentrations were from 1.5 to 7.5 %, respectively. To this solution was added (0.1% w/v) O,O'-1,3-propanediylbishydroxylamine dihydrochloride 98% linker was dissolved and homogenized. Then, the solution was transferred into Teflon molds (cylinders, diameter 10 mm, height 5 mm) to form a gel.

- 39 CZ 2023 - 171 A3- 39 CZ 2023 - 171 A3

Příklad 48Example 48

Příprava bukální náplastiPreparation of buccal patch

300 mg esterového konjugátu připraveného podle Příkladů 21 a 22 bylo rozpuštěno v 60 ml demineralizované vody během 12 h. Potom byl roztok mrazově vysušen, aby se vytvořila bukální náplast pro vnitřní aplikaci na bukální sliznici.300 mg of the ester conjugate prepared according to Examples 21 and 22 was dissolved in 60 ml of demineralized water over 12 h. The solution was then freeze-dried to form a buccal patch for internal application to the buccal mucosa.

Příklad 49Example 49

Stanovení hmotnostní průměrné molekulární hmotnosti vylučovací chromatografií (SEC)mnohoúhlovým laserovým rozptylem (MALLS)Determination of mass average molecular weight by size exclusion chromatography (SEC) multi-angle laser scattering (MALLS)

Hmotnostně průměrná molekulární hmotnost a distribuce molekulové hmotnosti byly stanoveny SEC-MALLS použitím Agilent degasser Model G 13 79A, chromatografického systému složeného z Agilent HPLC pumpy Model G1310A, manuálního injektoru Rheodyne Model 7125i, dvou 7,8 mm ultrahydrogel Lineárních kolon (Waters), chromatografických detektorů zahrnujících DAWN EOS MALLS, ViscoStar diferenční viskometr a Optilab T-rEX diferenční refraktivni index v sériích (Wyatt Technology, Santa Barbara, California). Injekční objem byl 100 μΐ 0,015-1% (hmotn./obj.) konjugátů sfingolipidu a HA. Koncentrace byla dříve optimalizována podle Mw, která má být analyzována. Dosud je koncentrace požadovaná pro nízkou molekulární hmotnost (6-15 kDa) 1% (hmotn./obj.), zatímco vyšší molekulová hmotnost HA (188 - 442 kDa) potřebovala 0,05% (hmotn./obj.). Mobilní fáze byla vodný 50 mM fosfátem pufrovaný fyziologický roztok a 0,02% roztok azidu sodného za průtoku 0,5 ml.min'1. Inkrement refraktivního indexu (dn/dC) 0,155 ml.g'1 byl použit pro výpočet molekulární hmotnosti a polydisperzity (Mw/Mn) esterového konjugátu.Weight average molecular weight and molecular weight distribution were determined by SEC-MALLS using an Agilent degasser Model G 13 79A, a chromatographic system consisting of an Agilent HPLC pump Model G1310A, a Rheodyne Model 7125i manual injector, two 7.8 mm ultrahydrogel Linear columns (Waters), chromatographic detectors including DAWN EOS MALLS, ViscoStar differential viscometer and Optilab T-rEX differential refractive index in series (Wyatt Technology, Santa Barbara, California). The injection volume was 100 μΐ of 0.015-1% (w/v) sphingolipid-HA conjugates. The concentration was previously optimized according to the Mw to be analyzed. So far, the concentration required for low molecular weight (6-15 kDa) is 1% (w/v), while higher molecular weight HA (188 - 442 kDa) needed 0.05% (w/v). The mobile phase was an aqueous 50 mM phosphate-buffered saline solution and a 0.02% sodium azide solution at a flow rate of 0.5 ml.min' 1 . A refractive index increment (dn/dC) of 0.155 ml.g' 1 was used to calculate the molecular weight and polydispersity (Mw/Mn) of the ester conjugate.

OdkazyLinks

Battogtokh, G., & Ko, Y. T. (2014). Self-assembled chitosan-ceramide nanoparticle for enhanced oral delivery of paclitaxel. Pharm Res, 37(11), 3019-3030. doi: 10.1007/sl 1095-014-1395-2Battogtokh, G., & Ko, Y.T. (2014). Self-assembled chitosan-ceramide nanoparticle for enhanced oral delivery of paclitaxel. Pharm Res, 37(11), 3019-3030. doi: 10.1007/sl 1095-014-1395-2

Cadete, Ana, Olivera, Ana, Besev, Magnus, Dhal, Pradeep K., Goncalves, Lidia, Almeida, Antonio J.,. . . Torres, Dolores. (2019). Self-assembled hyaluronan nanocapsules for the intracellular delivery of anticancer drugs. Scientific Reports, 9(1), 11565.Cadete, Ana, Olivera, Ana, Besev, Magnus, Dhal, Pradeep K., Goncalves, Lidia, Almeida, Antonio J.,. . . Torres, Dolores. (2019). Self-assembled hyaluronan nanocapsules for the intracellular delivery of anticancer drugs. Scientific Reports, 9(1), 11565.

Cho, Hyun-Jong, Yoon, Hong Yeol, Koo, Heebeom, Ko, Seung-Hak, Shim, Jae-Seong, Lee, Ju-Hee, . . . Kim, Dae-Duk. (2011). Self-assembled nanoparticles based on hyaluronic acid-ceramide (HA-CE) and Pluronic® for tumor-targeted delivery of docetaxel. Biomaterials, 32(29), 7181-7190. doi:Cho, Hyun-Jong, Yoon, Hong Yeol, Koo, Heebeom, Ko, Seung-Hak, Shim, Jae-Seong, Lee, Ju-Hee, . . . Kim, Dae-Duk. (2011). Self-assembled nanoparticles based on hyaluronic acid-ceramide (HA-CE) and Pluronic® for tumor-targeted delivery of docetaxel. Biomaterials, 32(29), 7181-7190. doi:

https://doi.Org/10.1016/j.biomaterials.2011,06,028https://doi.Org/10.1016/j.biomaterials.2011,06,028

Choi, S. M., & Lee, B. M. (2015). Safety and risk assessment of ceramide 3 in cosmetic products. Food Chem Toxicol, 84, 8-17. doi: 10.1016/j.fct.2015.07.012Choi, S.M., & Lee, B.M. (2015). Safety and risk assessment of ceramide 3 in cosmetic products. Food Chem Toxicol, 84, 8-17. doi: 10.1016/j.fct.2015.07.012

Dřímalová, Evženia, Velebný, Vladimír, Sasinková, Vlasta, Hromádková, Zdenka, & Ebringerová, Anna. (2005). Degradation of hyaluronan by ultrasonication in Battogtokh, G., & Ko, Y. T. (2014). Self-assembled chitosan-ceramide nanoparticleDrímalová, Evženia, Velebný, Vladimír, Sasinková, Vlasta, Hromádková, Zdenka, & Ebringerová, Anna. (2005). Degradation of hyaluronan by ultrasonication in Battogtokh, G., & Ko, Y. T. (2014). Self-assembled chitosan-ceramide nanoparticles

-40CZ 2023 - 171 A3 for enhanced oral delivery of paclitaxel. Pharm Res, 57(11), 3019-3030. doi: 10.1007/sl 1095-014-1395-2-40CZ 2023 - 171 A3 for enhanced oral delivery of paclitaxel. Pharm Res, 57(11), 3019-3030. doi: 10.1007/sl 1095-014-1395-2

Jin, Yu-Jin, Termsarasab, Ubonvan, Ko, Seung-Hak, Shim, Jae-Seong, Chong, Saeho, Chung, Suk-Jae,. . . Kim, Dae-Duk. (2012). Hyaluronic Acid Derivative-Based SelfAssembled Nanoparticles for the Treatment of Melanoma. Pharmaceutical Research, 1-12. doi: 10.1007/sl 1095-012-0839-9Jin, Yu-Jin, Termsarasab, Ubonvan, Ko, Seung-Hak, Shim, Jae-Seong, Chong, Saeho, Chung, Suk-Jae,. . . Kim, Dae-Duk. (2012). Hyaluronic Acid Derivative-Based Self-Assembled Nanoparticles for the Treatment of Melanoma. Pharmaceutical Research, 1-12. doi: 10.1007/sl 1095-012-0839-9

Kwon, Seunglee, Park, Jae Hyung, Chung, Hesson, Kwon, lek Chan, Jeong, Seo Young, & Kim, In-San. (2003). Physicochemical Characteristics of Self-Assembled Nanoparticles Based on Glycol Chitosan Bearing 5p-Cholanic Acid. Langmuir, 79(24), 10188-10193. doi: 10.102l/la0350608Kwon, Seunglee, Park, Jae Hyung, Chung, Hesson, Kwon, lek Chan, Jeong, Seo Young, & Kim, In-San. (2003). Physicochemical Characteristics of Self-Assembled Nanoparticles Based on Glycol Chitosan Bearing 5p-Cholanic Acid. Langmuir, 79(24), 10188-10193. doi: 10.102l/la0350608

Li, Tingyu, & Vanderah, David. (2021). Solubility ofN, N'-Disuccinimidyl Carbonate and its relevance to polysaccharide functionalization. Analytical Biochemistry, 626, 114250. doi: https://doi.Org/10.1016/i.ab.2021.114250Li, Tingyu, & Vanderah, David. (2021). Solubility of N, N'-Disuccinimidyl Carbonate and its relevance to polysaccharide functionalization. Analytical Biochemistry, 626, 114250. doi: https://doi.Org/10.1016/i.ab.2021.114250

Li, Zengmin, Bai, Xiaopeng, Ruparel, Hameer, Kim, Sobin, Turro, Nicholas J., & Ju, Jingyue. (2003). A photocleavable fluorescent nucleotide for DNA sequencing and analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences, 100(2), 414-419. doi: 10.1073/pnas.242729199Li, Zengmin, Bai, Xiaopeng, Ruparel, Hameer, Kim, Sobin, Turro, Nicholas J., & Ju, Jingyue. (2003). A photocleavable fluorescent nucleotide for DNA sequencing and analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences, 100(2), 414-419. doi: 10.1073/pnas.242729199

Licciardi, M., Scialabba, C., Sardo, C., Cavallaro, G., & Giammona, G. (2014). Amphiphilic inulin graft co-polymers as self-assembling micelles for doxorubicin delivery. Journal of Materials Chemistry B, 2(27), 4262-4271. doi: 10.1039/C4TB00235KLicciardi, M., Scialabba, C., Sardo, C., Cavallaro, G., & Giammona, G. (2014). Amphiphilic inulin graft co-polymers as self-assembling micelles for doxorubicin delivery. Journal of Materials Chemistry B, 2(27), 4262-4271. doi: 10.1039/C4TB00235K

Meschaninova, Mariya I., Novopashina, Darya S., Semikolenova, Olga A., Silnikov, Vladimir N., & Venyaminova, Alya G. (2019). Novel Convenient Approach to the Solid-Phase Synthesis of Oligonucleotide Conjugates. Molecules, 24(23), 4266.Meschaninova, Mariya I., Novopashina, Darya S., Semikolenova, Olga A., Silnikov, Vladimir N., & Venyaminova, Alya G. (2019). Novel Convenient Approach to the Solid-Phase Synthesis of Oligonucleotide Conjugates. Molecules, 24(23), 4266.

Sahle, F. F., Wohlrab, J., & Neubert, R. H. (2014). Controlled penetration of ceramides into and across the stratum comeum using various types of microemulsions and formulation associated toxicity studies. Eur JPharm Biopharm, 86(2), 244-250. doi: 10.1016/j.ejpb.2013.07.011Sahle, F.F., Wohlrab, J., & Neubert, R.H. (2014). Controlled penetration of ceramides into and across the stratum comeum using various types of microemulsions and formulation associated toxicity studies. Eur JPharm Biopharm, 86(2), 244-250. doi: 10.1016/j.ejpb.2013.07.011

Sahoo, Sujata, Chung, Cindy, Khetan, Sudhir, & Burdick, Jason A. (2008). Hydrolytically Degradable Hyaluronic Acid Hydrogels with Controlled Temporal Structures. Biomacromolecules, 9(4), 1088-1092. doi: 10.1021/bm800051mSahoo, Sujata, Chung, Cindy, Khetan, Sudhir, & Burdick, Jason A. (2008). Hydrolytically Degradable Hyaluronic Acid Hydrogels with Controlled Temporal Structures. Biomacromolecules, 9(4), 1088-1092. doi: 10.1021/bm800051m

Su, R., Yang, L., Wang, Y., Yu, S., Guo, Y., Deng, J., . . . Jin, X. (2017). Formulation, development, and optimization of a novel octyldodecanol-based nanoemulsion for transdermal delivery of ceramide IIIB. Int J Nanomedicine, 12, 5203-5221. doi: 10.2147/ijn.sl39975Su, R., Yang, L., Wang, Y., Yu, S., Guo, Y., Deng, J., . . . Jin, X. (2017). Formulation, development, and optimization of a novel octyldodecanol-based nanoemulsion for transdermal delivery of ceramide IIIB. Int J Nanomedicine, 12, 5203-5221. doi: 10.2147/ijn.sl39975

Tessema, Efrem N., Gebre-Mariam, Tsige, Paulos, Getahun, Wohlrab, Johannes, & Neubert, Reinhard Η. H. (2018). Delivery of oat-derived phytoceramides into the stratum corneum of the skin using nanocarriers: Formulation, characterization and in vitro and ex-vivo penetration studies. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 127, 260-269. doi: https://doi.Org/10.1016/j.ejpb.2018.02.037Tessema, Efrem N., Gebre-Mariam, Tsige, Paulos, Getahun, Wohlrab, Johannes, & Neubert, Reinhard Η. H. (2018). Delivery of oat-derived phytoceramides into the stratum corneum of the skin using nanocarriers: Formulation, characterization and in vitro and ex-vivo penetration studies. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 127, 260-269. doi: https://doi.Org/10.1016/j.ejpb.2018.02.037

-41 CZ 2023 - 171 A3-41 CZ 2023 - 171 A3

Uchida, Y., & Park, K. (2021). Ceramides in Skin Health and Disease: An Update. Am J Clin Dermatol, 22(6), 853-866. doi: 10.1007/s40257-021-00619-2Uchida, Y., & Park, K. (2021). Ceramides in Skin Health and Disease: An Update. Am J Clin Dermatol, 22(6), 853-866. doi: 10.1007/s40257-021-00619-2

Wang, Xiaojun, Messman, Jamie, Mays, Jimmy W., & Baskaran, Durairaj. (2010). 5 Polypeptide Grafted Hyaluronan: Synthesis and Characterization.Wang, Xiaojun, Messman, Jamie, Mays, Jimmy W., & Baskaran, Durairaj. (2010). 5 Polypeptide Grafted Hyaluronan: Synthesis and Characterization.

Biomacromolecules, 11 (9), 2313-2320. doi: 10.1021/bm1004146Biomacromolecules, 11 (9), 2313-2320. doi: 10.1021/bm1004146

Zerobin, Elise, Markovic, Marica, Tomášiková, Zuzana, Qin, Xiao-Hua, Ret, Davide, Steinbauer, Patrick, . . . Baudis, Stefan. (2020). Hyaluronic acid vinyl esters: A toolbox 10 toward controlling mechanical properties of hydrogels for 3D microfabrication.Zerobin, Elise, Markovic, Marica, Tomášiková, Zuzana, Qin, Xiao-Hua, Ret, Davide, Steinbauer, Patrick, . . . Baudis, Stefan. (2020). Hyaluronic acid vinyl esters: A toolbox 10 towards controlling mechanical properties of hydrogels for 3D microfabrication.

Journal of Polymer Science, 58(9), 1288-1298. doi:Journal of Polymer Science, 58(9), 1288-1298. doi:

https://doi.org/10.1002/pol.20200073https://doi.org/10.1002/pol.20200073

Claims (34)

PATENTOVÉ NÁROKYPATENT CLAIMS 1. Esterový konjugát sfingolipidu a hyaluronanu obecného vzorce I:1. Ester conjugate of sphingolipid and hyaluronan of general formula I: (I), kde n je přirozené číslo v rozsahu od 7 do 4000 dimerů,(I), where n is a natural number in the range from 7 to 4000 dimers, R5 je H+ nebo farmaceuticky přijatelná sůl,R 5 is H + or a pharmaceutically acceptable salt; R4 je -H nebo sfingolipidový substituent s linkerem obecného vzorce IIR 4 is -H or a sphingolipid substituent with a linker of general formula II (Π), kde(Π), where A je CH2-CH2, CH=CH nebo C(H)OH-CH2, pokud kterýkoli H vázaný na C atom CH2-CH2 nebo CH=CH nebo C(H)OH-CH2 je substituovaný hydroxylovou skupinou, může být esterifikována R3, který váže kyselinu hyaluronovou nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl kovalentní vazbou,A is CH2-CH2, CH=CH or C(H)OH- CH2 , if any H bonded to the C atom of CH2-CH2 or CH=CH or C(H)OH-CH2 is substituted with a hydroxyl group, R can be esterified 3 , which binds hyaluronic acid or its pharmaceutically acceptable salt by a covalent bond, R1 je přímý řetězec nebo rozvětvená alkylová skupina s 10 až 22 uhlíkovými atomy, která může případně obsahovat jednu nebo více dvojných vazeb, kterýkoli z H vázaných na atom C uvedené alkylové skupiny je případně substituován jednou nebo více hydroxylovými skupinami, s výhodou je to alkylová skupina s přímým řetězcem s 12 až 18 uhlíkovými atomy, výhodněji je to alkylová skupina s přímým řetězcem s 13 uhlíkovými atomy,R 1 is a straight chain or branched alkyl group with 10 to 22 carbon atoms, which may optionally contain one or more double bonds, any of the H bonded to the C atom of said alkyl group is optionally substituted by one or more hydroxyl groups, preferably alkyl a straight chain group with 12 to 18 carbon atoms, more preferably a straight chain alkyl group with 13 carbon atoms, R6 je -H nebo COR2, kdeR 6 is -H or COR 2 , where R2 je přímý řetězec nebo rozvětvená alkylová skupina s 13 až 55 uhlíkovými atomy, s výhodou 15 až 50 uhlíkovými atomy, výhodněji 17 až 23 uhlíkovými atomy, která může případně obsahovat R 2 is a straight chain or branched alkyl group with 13 to 55 carbon atoms, preferably 15 to 50 carbon atoms, more preferably 17 to 23 carbon atoms, which may optionally contain -43 CZ 2023 - 171 A3 jednu nebo více dvojných vazeb; alkylový řetězec může obsahovat vnitřní esterovou skupinu; nebo H alkylové skupiny může být případně substituovaný jednou nebo více hydroxylovými skupinami,-43 CZ 2023 - 171 A3 one or more double bonds; the alkyl chain may contain an internal ester group; or H of the alkyl group may optionally be substituted by one or more hydroxyl groups, R3 je -H nebo -OC-CH2-CH2-CO- nebo -OC-CH2=CH2-CO-, a s výhradou, že alespoň jeden R3 je OC-CH2-CH2-CO- nebo -OC-CH2=CH2-CO-, kde volná -OC- část je kovalentně navázána k -Ona R4 pozici konjugátu sfingolipidu a hyaluronanu obecného vzorce I, s výhradou, že alespoň jeden R4 konjugátu je sfingolipidový substituent s linkerem obecného vzorce II a kde stupeň substituce sfingolipidového substituentu s linkerem obecného vzorce II v konjugátu hyaluronanu je v rozsahu od 0,1 do 15 %.R 3 is -H or -OC-CH2-CH2-CO- or -OC-CH2=CH2-CO-, with the proviso that at least one R 3 is OC-CH2-CH2-CO- or -OC-CH2=CH2 -CO-, where the free -OC- part is covalently bound to the -Ona R 4 position of the conjugate of sphingolipid and hyaluronan of general formula I, with the proviso that at least one R 4 of the conjugate is sphingolipid a substituent with a linker of the general formula II and where the degree of substitution of the sphingolipid substituent with a linker of the general formula II in the hyaluronan conjugate is in the range from 0.1 to 15%. 2. Konjugát podle nároku 1, kde hmotnostně střední molekulární hmotnost konjugátu vzorce I je v rozsahu od 3 000 g/mol do 1 600 000 g/mol, s výhodou v rozsahu od 3 000 do 20 000 g/mol, výhodněji 5 000 až 7 000 g/mol.2. Conjugate according to claim 1, where the weight average molecular weight of the conjugate of formula I is in the range from 3,000 g/mol to 1,600,000 g/mol, preferably in the range from 3,000 to 20,000 g/mol, more preferably from 5,000 to 7000 g/mol. 3. Konjugát podle kteréhokoli z nároků 1 až 2, kde stupeň substituce v konjugátu hyaluronanu je v rozsahu od 0,4 do 15 %, s výhodou je stupeň substituce v rozsahu od 5,5 do 10,5 %, výhodněji je stupeň substituce v rozsahu od 6,5 do 8,5 %.3. The conjugate according to any one of claims 1 to 2, wherein the degree of substitution in the hyaluronan conjugate is in the range of 0.4 to 15%, preferably the degree of substitution is in the range of 5.5 to 10.5%, more preferably the degree of substitution in ranging from 6.5 to 8.5%. 4. Konjugát podle kteréhokoli z nároků 1 až 3, kde farmaceuticky přijatelná sůl je vybraná ze skupiny obsahující jakékoli ionty alkalických kovů nebo ionty kovů alkalických zemin, s výhodou Na+, K+ nebo Mg2+.4. The conjugate according to any one of claims 1 to 3, wherein the pharmaceutically acceptable salt is selected from the group containing any alkali metal ions or alkaline earth metal ions, preferably Na + , K + or Mg 2+ . 5. Způsob syntézy esterového konjugátu sfingolipidu a hyaluronanu podle kteréhokoli z nároků 1 až 4 vyznačující se tím, že sfingolipid obecného vzorce III5. Method for the synthesis of the ester conjugate of sphingolipid and hyaluronan according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the sphingolipid of general formula III (III), kde(III) where A je CH2-CH2, CH=CH nebo C(H)OH-CH2,A is CH2-CH2, CH=CH or C(H)OH- CH2 , R1 je přímý řetězec nebo rozvětvená alkylová skupina s 10 až 22 uhlíkovými atomy, které mohou případně obsahovat jednu nebo více dvojných vazeb, kterýkoli H vázaný na C atom řuvedené alkylové skupiny je případně substituovaný jednou nebo více hydroxylovými skupinami, s výhodou je to alkylová skupina s přímým řetězcem s 12 až 18 uhlíkovými atomy, výhodněji je to alkylová skupina s přímým řetězcem s 13 uhlíkovými atomy,R 1 is a straight chain or branched alkyl group with 10 to 22 carbon atoms, which may optionally contain one or more double bonds, any H bonded to the C atom of said alkyl group is optionally substituted by one or more hydroxyl groups, preferably an alkyl group a straight chain of 12 to 18 carbon atoms, more preferably a straight chain alkyl group of 13 carbon atoms, R6 je H nebo COR2, kdeR 6 is H or COR 2 , where R2 je přímý řetězec nebo rozvětvená alkylová skupina s 13 až 55 uhlíkovými atomy, s výhodou 15 až 50 uhlíkovými atomy, výhodněji 17 až 23 uhlíkovými atomy; alkylový řetězec může obsahovat vnitřní esterovou skupinu; může případně obsahovat jednu nebo více dvojných vazeb a může případně být substituovaný jednou nebo více hydroxylovými skupinami;R 2 is a straight chain or branched alkyl group of 13 to 55 carbon atoms, preferably 15 to 50 carbon atoms, more preferably 17 to 23 carbon atoms; the alkyl chain may contain an internal ester group; may optionally contain one or more double bonds and may optionally be substituted with one or more hydroxyl groups; -44CZ 2023 - 171 A3 je spojen s linkerem, kterým je zbytek kyseliny jantarové nebo zbytek kyseliny maleinové přidáním sukcinanhydridu nebo maleinanhydridu v polárním rozpouštědle v přítomnosti organické báze nebo jejich směsí za vzniku sfingolipidu s linkerem obecného vzorce IV-44CZ 2023 - 171 A3 is connected to a linker which is a succinic acid residue or a maleic acid residue by adding succinic anhydride or maleic anhydride in a polar solvent in the presence of an organic base or their mixture to form a sphingolipid with a linker of general formula IV (IV), kde(IV) where A je CH2-CH2, CH=CH nebo C(H)OH-CH2,A is CH2-CH2, CH=CH or C(H)OH- CH2 , R1 je přímý řetězec nebo rozvětvená alkylová skupina s 10 až 22 uhlíkovými atomy, která může případně obsahovat jednu nebo více dvojných vazeb, kterýkoli z H vázaných na C atom uvedené alkylové skupiny je případně substituovaný jednou nebo více hydroxylovými skupinami, s výhodou je to alkylová skupina s přímým řetězcem s 12 až 18 uhlíkovými atomy, výhodněji je to alkylová skupina s přímým řetězcem s 13 uhlíkovými atomy,R 1 is a straight chain or branched alkyl group with 10 to 22 carbon atoms, which may optionally contain one or more double bonds, any of the H bonded to the C atom of said alkyl group is optionally substituted by one or more hydroxyl groups, preferably alkyl a straight chain group with 12 to 18 carbon atoms, more preferably a straight chain alkyl group with 13 carbon atoms, R6 je H nebo COR2, kdeR 6 is H or COR 2 , where R2 je přímý řetězec nebo rozvětvená alkylová skupina s 13 až 55 uhlíkovými atomy, s výhodou 15 až 50 uhlíkovými atomy, výhodněji 17 až 23 uhlíkovými atomy; alkylový řetězec může obsahovat vnitřní esterovou skupinu; může případně obsahovat jednu nebo více dvojných vazeb a může případně být substituovaný jednou nebo více hydroxylovými skupinami;R 2 is a straight chain or branched alkyl group of 13 to 55 carbon atoms, preferably 15 to 50 carbon atoms, more preferably 17 to 23 carbon atoms; the alkyl chain may contain an internal ester group; may optionally contain one or more double bonds and may optionally be substituted with one or more hydroxyl groups; R7 je -H nebo -OC-CH2-CH2-COOH nebo -OC-CH=CH-COOH, a za předpokladu, že alespoň jeden R7 je -OC-CH2-CH2-COOH nebo -OC-CH=CH-COOH, který je aktivovaný aktivačním činidlem vybraným ze skupiny zahrnující l,l'-karbonyldiimidazol nebo tetramethyl-O-(M-sukcinimidyl)uronium hexafluorofosfát nebo benzoylchlorid, v přítomnosti organického rozpouštědla za vzniku aktivovaného sfingolipidu s linkerem obecného vzorce VR 7 is -H or -OC-CH2-CH2-COOH or -OC-CH=CH-COOH, and provided that at least one R 7 is -OC-CH2-CH2-COOH or -OC-CH=CH- COOH, which is activated with an activating agent selected from the group consisting of 1,1'-carbonyldiimidazole or tetramethyl-O-(M-succinimidyl)uronium hexafluorophosphate or benzoyl chloride, in the presence of an organic solvent to form an activated sphingolipid with a linker of general formula V -45CZ 2023 - 171 A3-45CZ 2023 - 171 A3 (V), kde(V) where A je CH2-CH2, CH=CH nebo C(H)OH-CH2,A is CH2-CH2, CH=CH or C(H)OH- CH2 , R1 je přímý řetězec nebo rozvětvená alkylová skupina s 10 až 22 uhlíkovými atomy, které mohou případně obsahovat jednu nebo více dvojných vazeb, kterýkoli z H vázaných na C atom uvedené alkylové skupiny je případně substituovaný jednou nebo více hydroxylovými skupinami, s výhodou je to alkylová skupina s přímým řetězcem s 12 až 18 uhlíkovými atomy, výhodněji je to alkylová skupina s přímým řetězcem s 13 uhlíkovými atomy,R 1 is a straight chain or branched alkyl group with 10 to 22 carbon atoms, which may optionally contain one or more double bonds, any of the H bonded to the C atom of said alkyl group is optionally substituted by one or more hydroxyl groups, preferably it is alkyl a straight chain group with 12 to 18 carbon atoms, more preferably a straight chain alkyl group with 13 carbon atoms, R6 je H nebo COR2, kdeR 6 is H or COR 2 , where R2 je přímý řetězec nebo rozvětvená alkylová skupina s 13 až 55 uhlíkovými atomy, s výhodou 15 až 50 uhlíkovými atomy, výhodněji 17 až 23 uhlíkovými atomy; alkylový řetězec může obsahovat vnitřní esterovou skupinu; může případně obsahovat jednu nebo více dvojných vazeb a může případně být substituovaný jednou nebo více hydroxylovými skupinami;R 2 is a straight chain or branched alkyl group of 13 to 55 carbon atoms, preferably 15 to 50 carbon atoms, more preferably 17 to 23 carbon atoms; the alkyl chain may contain an internal ester group; may optionally contain one or more double bonds and may optionally be substituted with one or more hydroxyl groups; R7 je -H nebo -OC-CH2-CH2-COOH nebo -OC-CH=CH-COOH, a s výhradou, že alespoň jeden R7 je -OC-CH2-CH2-COOH nebo -OC-CH=CH-COOH,R 7 is -H or -OC-CH2-CH2-COOH or -OC-CH=CH-COOH, with the proviso that at least one R 7 is -OC-CH2-CH2-COOH or -OC-CH=CH-COOH , R9 je substituent vybraný ze skupiny substituentů zahrnujících substituent obecného vzorce VI nebo substituent vzorce VII nebo substituent vzorce VIII, kde R8 je jeden nebo více substituentů vybraných ze skupiny zahrnující Η, -NO2, -COOH, halogenidy, Ci-Ce alkyloxy, s výhodou halogenidy, methoxy nebo ethoxy, výhodněji Cl,R 9 is a substituent selected from the group of substituents comprising a substituent of general formula VI or a substituent of formula VII or a substituent of formula VIII, where R 8 is one or more substituents selected from the group comprising Η, -NO2, -COOH, halides, Ci-Ce alkyloxy, with preferably halides, methoxy or ethoxy, more preferably Cl, -46CZ 2023 - 171 A3-46CZ 2023 - 171 A3 (VII),(VII), (VIII), který reaguje s kyselinou hyaluronovou nebo její farmaceuticky přijatelnou solí v přítomnosti směsi vody a s vodou mísitelného organického rozpouštědla nebo v přítomnosti organického rozpouštědla, s výhodou dimethylsulfoxidu.(VIII) which reacts with hyaluronic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof in the presence of a mixture of water and a water-miscible organic solvent or in the presence of an organic solvent, preferably dimethyl sulfoxide. 6. Způsob podle nároku 5 vyznačující se tím, že koncentrace sfíngolipidu obecného vzorce III je v rozsahu od 0,88 % do 2,5 % (hmotn./obj.) a molární ekvivalent sukcinanhydridu nebo maleinanhydridu je v rozsahu od 1,0 do 2,0, s výhodou 1,5 ekvivalentů vzhledem ke sfíngolipidu obecného vzorce III.6. The method according to claim 5, characterized in that the concentration of the sphingolipid of general formula III is in the range from 0.88% to 2.5% (w/v) and the molar equivalent of succinic anhydride or maleic anhydride is in the range from 1.0 to 2.0, preferably 1.5 equivalents relative to the sphingolipid of general formula III. 7. Způsob podle nároku 5 nebo nároku 6 vyznačující se tím, že připojení linkeru je provedeno v rozsahu teplot od 0 °C do 50 °C po dobu 4 až 20 hodin, s výhodou 6 až 8 hodin v rozsahu teplot od 0 °C do 40 °C, následováno mícháním při teplotě v rozsahu od 0 °C do 29 °C, s výhodou při teplotě místnosti 5 až 24 hodin, výhodněji 16 až 20 hodin.7. The method according to claim 5 or claim 6, characterized in that the connection of the linker is carried out in the temperature range from 0 °C to 50 °C for a period of 4 to 20 hours, preferably 6 to 8 hours in the temperature range from 0 °C to 40°C, followed by stirring at a temperature ranging from 0°C to 29°C, preferably at room temperature for 5 to 24 hours, more preferably 16 to 20 hours. 8. Způsob podle kteréhokoli z nároků 5 až 7 vyznačující se tím, že organická báze je vybraná ze skupiny zahrnující sekundární nebo terciární amin s lineární nebo rozvětvenou nebo cyklickou nebo aromatickou, nasycenou nebo nenasycenou C3-C30 alkylovou skupinou a polární rozpouštědlo je vybráno ze skupiny zahrnující tetrahydrofůran, dioxan, dimethylsulfoxid, dichlormethan a chloroform nebo jejich směsi.8. The method according to any one of claims 5 to 7, characterized in that the organic base is selected from the group comprising a secondary or tertiary amine with a linear or branched or cyclic or aromatic, saturated or unsaturated C3-C30 alkyl group and the polar solvent is selected from the group including tetrahydrofuran, dioxane, dimethylsulfoxide, dichloromethane and chloroform or mixtures thereof. 9. Způsob podle nároku 8 vyznačující se tím, že organická báze je vybraná ze skupiny zahrnující pyridin, trimethylamin, A-methylmorfolin, dimethylaminopyridin nebo jejich směsi a polární rozpouštědlo je s výhodou dichlormethan nebo tetrahydrofůran nebo jejich směs.9. The method according to claim 8, characterized in that the organic base is selected from the group including pyridine, trimethylamine, A-methylmorpholine, dimethylaminopyridine or their mixtures and the polar solvent is preferably dichloromethane or tetrahydrofuran or their mixture. 10. Způsob podle kteréhokoli z nároků 5 až 9, vyznačující se tím, že aktivační činidlo je benzoylchlorid, který je substituovaný nebo nesubstituovaný benzoylchlorid nebo jeho deriváty obecného vzorce IX10. The method according to any one of claims 5 to 9, characterized in that the activating agent is benzoyl chloride, which is substituted or unsubstituted benzoyl chloride or its derivatives of general formula IX (ix), (ix), -47CZ 2023 - 171 A3 kde R8 je jeden nebo více substituentů vybraných ze skupiny zahrnující H, -NO2, -COOH, halogenidy, C1-C6 alkyloxy, s výhodou halogenidy, methoxy nebo ethoxy, výhodněji Cl.-47CZ 2023 - 171 A3 where R 8 is one or more substituents selected from the group including H, -NO2, -COOH, halides, C1-C6 alkyloxy, preferably halides, methoxy or ethoxy, more preferably Cl. 11. Způsob podle kteréhokoli z nároků 5 až 10 vyznačující se tím, že vznik aktivovaného sfingolipidu s linkerem obecného vzorce V je provedena za teploty v rozsahu od 5 °C do 60 °C, s výhodou 40 °C, po dobu 0,5 až 24 hodin.11. The method according to any one of claims 5 to 10, characterized in that the formation of an activated sphingolipid with a linker of the general formula V is carried out at a temperature in the range from 5 °C to 60 °C, preferably 40 °C, for a period of 0.5 to 24 hours. 12. Způsob podle kteréhokoli z nároků 5 až 11 vyznačující se tím, že molární množství aktivačního činidla je v rozsahu od 0,03 do 2 molárních ekvivalentů, s výhodou 1 molární ekvivalent na sfingolipid s linkerem obecného vzorce IV.12. The method according to any one of claims 5 to 11, characterized in that the molar amount of the activating agent is in the range from 0.03 to 2 molar equivalents, preferably 1 molar equivalent per sphingolipid with a linker of general formula IV. 13. Způsob podle kteréhokoli z nároků 5 až 12 vyznačující se tím, že organické rozpouštědlo je vybráno ze skupiny zahrnující isopropanol, terc-butanol, dioxan, dimethylsulfoxid, acetonitril a tetrahydrofuran.13. The method according to any one of claims 5 to 12, characterized in that the organic solvent is selected from the group comprising isopropanol, tert-butanol, dioxane, dimethylsulfoxide, acetonitrile and tetrahydrofuran. 14. Způsob podle kteréhokoli z nároků 5 až 13 vyznačující se tím, že koncentrace aktivovaného sfingolipidu s linkerem obecného vzorce V, který reaguje s kyselinou hyaluronovou nebo její farmaceuticky přijatelnou solí, je v rozsahu od 0,25 % do 7,0 % (hmotn./obj.) v roztoku.14. The method according to any one of claims 5 to 13, characterized in that the concentration of the activated sphingolipid with a linker of the general formula V, which reacts with hyaluronic acid or its pharmaceutically acceptable salt, is in the range from 0.25% to 7.0% (w/w ./vol.) in solution. 15. Způsob podle kteréhokoli z nároků 5 až 14 vyznačující se tím, že reakce aktivovaného sfingolipidu s linkerem vzorce V a kyseliny hyaluronové nebo její farmaceuticky přijatelné soli je provedena v rozsahu teplot 5 °C až 37 °C, s výhodou při 25 °C po dobu 2 hodin.15. The method according to any one of claims 5 to 14, characterized in that the reaction of the activated sphingolipid with the linker of the formula V and hyaluronic acid or its pharmaceutically acceptable salt is carried out in the temperature range of 5 °C to 37 °C, preferably at 25 °C after for 2 hours. 16. Způsob podle kteréhokoli z nároků 5 až 15 vyznačující se tím, že s vodou mísitelné organické rozpouštědlo je vybráno ze skupiny zahrnující isopropanol, terc-butanol, dioxan, dimethylsulfoxid a tetrahydrofuran.16. The method according to any one of claims 5 to 15, characterized in that the water-miscible organic solvent is selected from the group comprising isopropanol, tert-butanol, dioxane, dimethylsulfoxide and tetrahydrofuran. 17. Způsob podle kteréhokoli z Nároků 5 až 16 vyznačující se tím, že molární množství aktivovaného sfingolipidu s linkerem vzorce V je 0,01 až 2,0 ekvivalenty, s výhodou 0,03 až 0,5 ekvivalentů vzhledem k dimeru kyseliny hyaluronové.17. The method according to any one of Claims 5 to 16, characterized in that the molar amount of the activated sphingolipid with a linker of the formula V is 0.01 to 2.0 equivalents, preferably 0.03 to 0.5 equivalents relative to the hyaluronic acid dimer. 18. Kompozice vyznačující se tím, že zahrnuje esterový konjugát kteréhokoli z nároků 1 až 4, s výhodou je esterový konjugát ve formě samouspořádané polymerní částice.18. A composition characterized in that it comprises an ester conjugate of any one of claims 1 to 4, preferably the ester conjugate is in the form of a self-assembled polymer particle. 19. Kompozice podle nároku 18 vyznačující se tím, že koncentrace esterového konjugátu obecného vzorce I je v rozsahu od 0,001 do 7,5 % (hmotn./hmotn.), s výhodou od 0,001 do 5 % (hmotn./hmotn.), výhodněji od 0,001 do 1 % (hmotn./hmotn.).19. Composition according to claim 18, characterized in that the concentration of the ester conjugate of general formula I is in the range from 0.001 to 7.5% (wt/wt), preferably from 0.001 to 5% (wt/wt), more preferably from 0.001 to 1% (w/w). 20. Kompozice podle kteréhokoli z nároků 18 až 19 vyznačující se tím, že je ve formě vybrané ze skupiny zahrnující emulzi, sérum, hydrogel nebo bukální náplast.20. The composition according to any one of claims 18 to 19, characterized in that it is in the form selected from the group comprising emulsion, serum, hydrogel or buccal patch. 21. Kompozice podle nároku 20 vyznačující se tím, že je ve formě emulze, zatímco koncentrace esterového konjugátu podle obecného vzorce I je v rozsahu od 0,001 do 5 % (hmotn./hmotn.), s výhodou od 0,001 do 1 % (hmotn./hmotn.).21. The composition according to claim 20, characterized in that it is in the form of an emulsion, while the concentration of the ester conjugate according to the general formula I is in the range from 0.001 to 5% (wt/wt), preferably from 0.001 to 1% (wt /weight). 22. Kompozice podle nároku 21 vyznačující se tím, že obsahuje vodu a alespoň jeden kosmetický nebo farmaceutický excipient vybraný ze skupiny obsahující olej, vosk, máslo, emulgátor, pomocnou aktivní složku a konzervant.22. Composition according to claim 21, characterized in that it contains water and at least one cosmetic or pharmaceutical excipient selected from the group containing oil, wax, butter, emulsifier, auxiliary active ingredient and preservative. 23. Kompozice podle nároku 22 vyznačující se tím, že olej je vybraný ze skupiny zahrnující kokosový, olivový, avokádový, sezamový, mandlový, ricinový, slunečnicový, konopný, jojobový, arganový, meruňkový, brutnákový, marulový, bavlníkového semínka, pupalky dvouleté, hroznového semínka, lískového ořechu, lněného semínka, zrcadlovky bílé, moringa, švestky, máku, rýže, šípku, světlice barvířské, oleje z pšeničných klíčků, makadamové oleje a skvalenu; máslo je vybrané ze skupiny zahrnující kakaové máslo, illipe máslo, kokum máslo, murumuru máslo, mangové máslo, cupuacu máslo, avokádové máslo a bambucké máslo; vosky jsou vybrány ze skupiny lanolin, včelí vosk, karnaubský vosk, kandelilový vosk a vazelína.23. Composition according to claim 22, characterized in that the oil is selected from the group including coconut, olive, avocado, sesame, almond, castor, sunflower, hemp, jojoba, argan, apricot, borage, marula, cotton seed, evening primrose, grape seeds, hazelnut, linseed, SLR, moringa, plum, poppy, rice, rose hip, safflower, wheat germ oil, macadamia oil and squalene; the butter is selected from the group consisting of cocoa butter, illipe butter, kokum butter, murumuru butter, mango butter, cupuacu butter, avocado butter and shea butter; waxes are selected from the group of lanolin, beeswax, carnauba wax, candelilla wax and petroleum jelly. - 48 CZ 2023 - 171 A3- 48 CZ 2023 - 171 A3 24. Kompozice podle kteréhokoli z nároku 22 vyznačující se tím, že emulgátor je vybraný ze skupiny zahrnující glyceryl kaprylát, behenyl alkohol, glyceryl behenát, cetearyl glukosid, methylglukózový sekvistearát, glycerylstearát citrát, polyglyceryl-3-stearát, cetearyl olivát, lecitin, stearylalkohol, sorbitanoleát, polysorbáty, kyselina stearová, cetylalkohol a cetearylalkohol, akrylát sodný, kopolymer akryloyldimethyltaurát sodný nebo jejich směsi.24. Composition according to any one of claim 22, characterized in that the emulsifier is selected from the group comprising glyceryl caprylate, behenyl alcohol, glyceryl behenate, cetearyl glucoside, methyl glucose sestearate, glyceryl stearate citrate, polyglyceryl-3-stearate, cetearyl olivate, lecithin, stearyl alcohol, sorbitan oleate, polysorbates, stearic acid, cetyl alcohol and cetearyl alcohol, sodium acrylate, sodium acryloyldimethyltaurate copolymer or mixtures thereof. 25. Kompozice podle kteréhokoli z nároku 22 vyznačující se tím, že pomocná aktivní složka je vybraná ze skupiny zahrnující vitamíny A, D, E, K, C a skupina vitamínů B; kurkumin, koenzym Q10, alantoin, bisabolol, kyselina mléčná, aminokyseliny, α-hydroxy a β-hydroxykyseliny, ceramidy, peptidy, s výhodou acetylhexapeptid-8, palmitoyltripeptid-1, palmitoyltetrapeptid-7, měďný tripeptid-1, palmitoylpentapeptid-4, Saccharomyces peptidy, hexapeptid-1 a protein, s výhodou rýžový protein, sójový protein, quinoa protein nebo pšeničný protein; polysacharidy, kyselina hyaluronová nebo její farmaceuticky a kosmeticky přijatelná sůl, karboxymethyl glukan, schizofylan, glukomannan; panthenol; močovina; glycerol; pentylenglykol; rostlinné extrakty, s výhodou extrakt z aloe vera, extrakt z heřmánku, extrakt z acai, extrakt ze zeleného čaje, extrakt z řas, extrakt z ovsa, extrakt z konopí a extrakt z brusinek, bakuchiol, resveratrol; extrakty, fermenty, lyzáty nebo filtráty z bakterií s výhodou z Lactobacillus, Thalassospira, Bifidobacterium, Halobacterium; nebo z hub s výhodou z Saccharomyces, Agaricus subrufescens, Choiromyces maeandriformis, Cordyceps sinensis, Ganoderma lucidum, Grifola frondosa, Hypsizygus ulmarium, Inonotus obliquus, Lentinula edodes, Polyporus, Trametes versicolor, Tremella fuciformis, Tuber, Schizophyllum commune.25. The composition according to any one of claim 22, characterized in that the auxiliary active ingredient is selected from the group including vitamins A, D, E, K, C and the group of vitamins B; curcumin, coenzyme Q10, allantoin, bisabolol, lactic acid, amino acids, α-hydroxy and β-hydroxy acids, ceramides, peptides, preferably acetylhexapeptide-8, palmitoyltripeptide-1, palmitoyltetrapeptide-7, copper tripeptide-1, palmitoylpentapeptide-4, Saccharomyces peptides, hexapeptide-1 and protein, preferably rice protein, soy protein, quinoa protein or wheat protein; polysaccharides, hyaluronic acid or its pharmaceutically and cosmetically acceptable salt, carboxymethyl glucan, schizophyllan, glucomannan; panthenol; urea; glycerol; pentylene glycol; plant extracts, preferably aloe vera extract, chamomile extract, acai extract, green tea extract, algae extract, oat extract, hemp extract and cranberry extract, bakuchiol, resveratrol; extracts, ferments, lysates or filtrates from bacteria, preferably from Lactobacillus, Thalassospira, Bifidobacterium, Halobacterium; or from mushrooms preferably from Saccharomyces, Agaricus subrufescens, Choiromyces maeandriformis, Cordyceps sinensis, Ganoderma lucidum, Grifola frondosa, Hypsizygus ulmarium, Inonotus obliquus, Lentinula edodes, Polyporus, Trametes versicolor, Tremella fuciformis, Tuber, Schizophyllum commune. 26. Kompozice podle kteréhokoli nároku 22 vyznačující se tím, že konzervant je vybraný ze skupiny zahrnující aromatické kyseliny a jejich deriváty, s výhodou kyselinu benzoovou, kyselinu salicylovou, kyselinu dehydrooctovou, sorbát draselný, parabeny; alkoholy s výhodou ethanol, isopropanol, benzylalkohol, fenoxyethanol, fenethylalkohol; deriváty imidazolu s výhodou hydantoin, imidazolidinyl močovina; kationické povrchově aktivní látky, s výhodou benzalkonium chlorid.26. Composition according to any one of claim 22, characterized in that the preservative is selected from the group including aromatic acids and their derivatives, preferably benzoic acid, salicylic acid, dehydroacetic acid, potassium sorbate, parabens; alcohols preferably ethanol, isopropanol, benzyl alcohol, phenoxyethanol, phenethyl alcohol; imidazole derivatives preferably hydantoin, imidazolidinyl urea; cationic surfactants, preferably benzalkonium chloride. 27. Kompozici podle nároku 20 vyznačující se tím, že je ve formě séra, přičemž koncentrace esterového konjugátu podle obecného vzorce I je v rozsahu od 0,001 do 5 % (hmotn./hmotn.), s výhodou od 0,001 do 1 % (hmotn./hmotn.); a zároveň obsahující vodu a alespoň jednu ve vodě rozpustnou pomocnou aktivní složku; alespoň jedno zahušťovadlo a alespoň jeden konzervant podle nároku 26.27. The composition according to claim 20, characterized in that it is in the form of a serum, while the concentration of the ester conjugate according to the general formula I is in the range from 0.001 to 5% (wt/wt), preferably from 0.001 to 1% (wt. /weight); and at the same time containing water and at least one water-soluble auxiliary active ingredient; at least one thickener and at least one preservative according to claim 26. 28. Kompozice podle nároku 27 vyznačující se tím, že koncentrace esterového konjugátu podle obecného vzorce I je s výhodou v rozsahu od 0,001 do 1 % (hmotn./hmotn.).28. Composition according to claim 27, characterized in that the concentration of the ester conjugate according to general formula I is preferably in the range from 0.001 to 1% (wt/wt). 29. Kompozice podle Nároku 27 vyznačující se tím, že ve vodě rozpustná pomocná aktivní složka je vybraná ze skupiny zahrnující vitamín C; vitamíny skupiny B; aminokyseliny, α-hydroxy a βhydroxy kyseliny, peptidy; s výhodou acetylhexapeptid-8, palmitoyltripeptid, tripeptid-1 mědi, peptidy Saccharomyces, hexapeptid-1; a proteiny s výhodou rýžový protein, sójový protein, quinoa protein nebo pšeničný protein; a ve vodě rozpustné polysacharidy, s výhodou kyselina hyaluronová nebo její farmaceuticky a kosmeticky přijatelná sůl, karboxymethyl glukan, schizofylan, glukomannan, močovina; glycerol; pentylenglykol; rostlinné extrakty s výhodou extrakt z aloe vera, extrakt z heřmánku, extrakt z acai, extrakt ze zeleného čaje, extrakt z řas, extrakt z ovsa, extrakt z konopí, extrakt z brusinek; extrakty, fermenty, lyzáty a filtráty z bakterií s výhodou z Lactobacillus, Thalassospira, Bifidobacterium, Halobacterium nebo z hub s výhodou z Saccharomyces, Agaricus subrufescens, Choiromyces maeandriformis, Cordyceps sinensis, Ganoderma lucidum, Grifola frondosa, Hypsizygus ulmarium, Inonotus obliquus, Lentinula edodes, Polyporus poddr., Trametes versicolor, Tremella fuciformis, Tuber, Schizophyllum commune.29. Composition according to Claim 27, characterized in that the water-soluble auxiliary active ingredient is selected from the group comprising vitamin C; B vitamins; amino acids, α-hydroxy and β-hydroxy acids, peptides; preferably acetyl hexapeptide-8, palmitoyl tripeptide, copper tripeptide-1, Saccharomyces peptides, hexapeptide-1; and proteins preferably rice protein, soy protein, quinoa protein or wheat protein; and water-soluble polysaccharides, preferably hyaluronic acid or its pharmaceutically and cosmetically acceptable salt, carboxymethyl glucan, schizophyllan, glucomannan, urea; glycerol; pentylene glycol; plant extracts preferably aloe vera extract, chamomile extract, acai extract, green tea extract, algae extract, oat extract, hemp extract, cranberry extract; extracts, ferments, lysates and filtrates from bacteria preferably from Lactobacillus, Thalassospira, Bifidobacterium, Halobacterium or from fungi preferably from Saccharomyces, Agaricus subrufescens, Choiromyces maeandriformis, Cordyceps sinensis, Ganoderma lucidum, Grifola frondosa, Hypsizygus ulmarium, Inonotus obliquus, Lentinula edodes , Polyporus subdr., Trametes versicolor, Tremella fuciformis, Tuber, Schizophyllum commune. 30. Kompozice podle kteréhokoli z nároků 18 až 29 vyznačující se tím, že dále obsahuje alespoň jednu hydrofobní sloučeninu vybranou ze skupiny zahrnující kanabidiol, tokoferol, kurkumin, koenzym Q10, ethylferulát, resveratrol, bakuchiol, retinylpalmitát, který je enkapsulován v samouspořádaných polymerních částicích esterového konjugátu podle nároků 1 až 4.30. The composition according to any one of claims 18 to 29, characterized in that it further contains at least one hydrophobic compound selected from the group comprising cannabidiol, tocopherol, curcumin, coenzyme Q10, ethyl ferulate, resveratrol, bakuchiol, retinyl palmitate, which is encapsulated in self-assembled polymer particles of ester conjugate according to claims 1 to 4. - 49 CZ 2023 - 171 A3- 49 CZ 2023 - 171 A3 31. Kompozice podle nároku 27 vyznačující se tím, že zahušťovadlo je vybráno ze skupiny zahrnující xantanová guma, sklerotiová guma, guarová guma, celulózová guma, karbomer, hydroxyethylcelulóza, extrakt z kořene Amorphophallus konjac, karagenan, pullulan, lecitin, lysolecitin, akrylát sodný, kopolymer akryloyldimethyltaurátu sodného nebo jejich směsi.31. Composition according to claim 27, characterized in that the thickener is selected from the group including xanthan gum, sclerotia gum, guar gum, cellulose gum, carbomer, hydroxyethyl cellulose, Amorphophallus konjac root extract, carrageenan, pullulan, lecithin, lysolecithin, sodium acrylate, sodium acryloyldimethyltaurate copolymer or a mixture thereof. 55 32. Esterový konjugát sfingolipidu a hyaluronanu podle kteréhokoli z nároků 1 až 4; nebo kompozice podle kteréhokoli z nároků 18 až 31 pro použití pro ošetření kůže nebo bukální sliznice.32. The ester conjugate of sphingolipid and hyaluronan according to any one of claims 1 to 4; or a composition according to any one of claims 18 to 31 for use in the treatment of the skin or buccal mucosa. 33. Esterový konjugát sfingolipidu a hyaluronanu a kompozice podle mároku 32 pro použití v lékařském ošetření kožní nemoci vybrané ze skupiny zahrnující atopickou dermatitidu, lupénku, ichtyózu a růžovku nebo pro použití v medicínské léčbě nemocí bukální sliznice vybraných ze33. A sphingolipid hyaluronan ester conjugate and a composition according to claim 32 for use in the medical treatment of a skin disease selected from the group consisting of atopic dermatitis, psoriasis, ichthyosis and rosacea or for use in the medical treatment of a buccal mucosal disease selected from 10 skupiny zahrnující aftovou stomatitidu a Behcetovu nemoc.10 groups including aphthous stomatitis and Behcet's disease. 34. Použití esterového konjugátu sfingolipidu a hyaluronanu podle kteréhokoli z nároků 1 až 4 a kompozice podle kteréhokoli z nároků 18 až 31 pro kosmetické ošetření kůže.34. Use of a sphingolipid-hyaluronan ester conjugate according to any one of claims 1 to 4 and a composition according to any one of claims 18 to 31 for cosmetic skin treatment.
CZ2023-171A 2023-04-28 2023-04-28 An ester conjugate of sphingolipid and hyaluronan, a method of its synthesis, compositions that contain it, the use of such conjugate or composition CZ2023171A3 (en)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2023-171A CZ2023171A3 (en) 2023-04-28 2023-04-28 An ester conjugate of sphingolipid and hyaluronan, a method of its synthesis, compositions that contain it, the use of such conjugate or composition
PCT/CZ2024/050031 WO2024222981A1 (en) 2023-04-28 2024-04-26 Ester conjugate of sphingolipid and hyaluronan, method of synthesis thereof, composition containing thereof, use of conjugate or composition

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2023-171A CZ2023171A3 (en) 2023-04-28 2023-04-28 An ester conjugate of sphingolipid and hyaluronan, a method of its synthesis, compositions that contain it, the use of such conjugate or composition

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ2023171A3 true CZ2023171A3 (en) 2024-11-06

Family

ID=91617010

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2023-171A CZ2023171A3 (en) 2023-04-28 2023-04-28 An ester conjugate of sphingolipid and hyaluronan, a method of its synthesis, compositions that contain it, the use of such conjugate or composition

Country Status (2)

Country Link
CZ (1) CZ2023171A3 (en)
WO (1) WO2024222981A1 (en)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101175193B1 (en) * 2009-11-20 2012-08-20 (주)바이오제닉스 Composition for skin disease comprising ceramide-hyaluronic composite

Also Published As

Publication number Publication date
WO2024222981A1 (en) 2024-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2006253886B2 (en) Compositions comprising a lipid and copolymer of styrene and maleic acid
US10172946B2 (en) Monodisperse glycogen and phytoglycogen nanoparticles and use thereof as additives in cosmetics, pharmaceuticals, and food products
US8741347B2 (en) Method for forming cyclodextrin polymer and lipophilic compound emulsions, resulting emulsions, and compositions including said emulsions
FR2808691A1 (en) CYCLODEXTRINS SUBSTITUTED PREFERENTIALLY ON THEIR PRIMARY SURFACE BY ACID OR AMINE FUNCTIONS
WO2008135563A1 (en) Polyglutamic acids functionalized by cationic groups and hydrophobic groups and applications thereof, in particular therapeutic applications thereof
WO2013150193A1 (en) Microparticles and nanoparticles made up of hydrophobized polysaccharides and an alpha-cyclodextrine
do Amaral Rodrigues et al. Acetylated cashew gum-based nanoparticles for the incorporation of alkaloid epiisopiloturine
FR2997406A1 (en) HYALURONATE AND GLUCOMANNAN POLYMER
WO2012097245A1 (en) Water soluble fullerene formulations and methods of use thereof
Manzi et al. “Click” hyaluronan based nanohydrogels as multifunctionalizable carriers for hydrophobic drugs
US20230017661A1 (en) Compositions and modular nano- and microparticles for the delivery of various agents and use thereof
Nikhat et al. Enhanced transdermal delivery of lutein via nanoethosomal gel: Formulation optimization, in-vitro evaluation, and in-vivo assessment
US20190038542A1 (en) Moisturizing personal care compositions comprising monodisperse phytoglycogen nanoparticles and a further polysaccharide
EP3658237B1 (en) Cross polymers composed of polysaccharides and polyamino acids, and uses thereof
CA3118491A1 (en) Crosslinked materials
CZ2023171A3 (en) An ester conjugate of sphingolipid and hyaluronan, a method of its synthesis, compositions that contain it, the use of such conjugate or composition
JP2006273790A (en) Cationic polymer micell medicinal carrier, dispersant containing the medicinal carrier, and skin care preparation and cosmetic blended with the medicinal carrier
WO2020165514A1 (en) Cosmetic and/or dermatological composition for combating stretch marks
CN112574426B (en) Amphiphilic graft copolymer and application thereof
US20180036220A1 (en) Hyaluronic acid particles for cosmetic or dermatological uses
FR2999425A1 (en) Composition used in cosmetic product including cosmetic care product, makeup product or personal hygiene product e.g. lotion, comprises cosmetic active ingredients encapsulated in liposome, which comprises phospholipid and glycolipid
KR20210040512A (en) Skin permation enhancing composition of hppln1 using epidermal pentetrating peptide-phospolipid liposome complex
CN115154422B (en) CD44 targeting and ROS response nano micelle pharmaceutical composition, and preparation method and application thereof
KR102539795B1 (en) Cosmetic composition with water resistance comprising zwitterionic chitosan derivative
RU2745124C1 (en) Bioactive composition based on a crosslinked hyaluronic acid salt containing resveratrol and a method of its preparation