CZ2016836A3 - Využití nanočástic pro detekci nukleotidových sekvencí DNA - Google Patents

Abstract

Řešení se týká použití sensoru pro detekci části nukleotidové sekvence založeného na specifické hybridizaci DNA fragmentu vzorku s jednonukleotidovou DNA sondou vedoucí k zesílení fluorescenčního signálu v důsledku tzv. Försterova rezonančního přenosu energie mezi nanočásticí na bázi kvantové tečky nebo upkonverzní částice a fluorescenční značky. Nanočástice je navázána buď na DNA fragment vzorku s detekovanou sekvencí, nebo na DNA sondu. V prvním případě je pro detekci použita fluorescenčně zančená DNA sonda, ve druhém případě je fluorescenčně značený DNA fragment vzorku. V případě, že DNA fragment vzorku obsahuje úsek s detekovanou sekvencí, dojde po specifické hybridizaci k indukci Försterova nezářivého přenosu energie, což se projeví v měřitelné změně intenzity pásů ve fluorescenčním spektru. Tento sensor je využitelný například pro detekci přítomnosti patogenních organismů na základě charakteristických DNA sekvenčních úseků nebo pro detekci změn (mutací) v sekvenci DNA.

Description

Dosavadní stav techniky

Detekce specifického úseku sekvence DNA je zcela základním nástrojem v celé řadě diagnostických aplikací. Základním použitím, je zjišťování přítomnosti určitého patogenního organismu na základě detekce části sekvence specifické pro daný organismus (např. virus nebo bakterii). Pokročilejším využitím je detekce přítomnosti změny v dané sekvenci například jako průkaz DNA mutace. Mezi metody přímé diagnostiky DNA v současné době patří především sekvenování, elektroforetické a chromatografické separace, nebo metody založené na DNA hybridizaci a fluorescenční detekci. Každá z uvedených technik nabízí určité výhody a nevýhody, jako např. jednoznačná odpověď, ale vyšší cena a náročnost přípravy vzorku u sekvenačních technik, nebo velký dynamický rozsah, ale ne vždy jednoznačná odpověď u separačních technik. Společnou nevýhodou mnoha současných technik je pak časová náročnost analýzy.

Navrhovaný senzor, který založen na Fórsterově rezonančním přenosu energie v principu nabízí vysokou citlivost a rychlou analýzu. Během Fórsterova rezonančního přenosu energie dochází k nezářivému přenosu energie z excitovaného donoru (luminiscenční skupina) na akceptor (jiná luminiscenční skupina). Tento nezářivý proces je možný v úzkém rozmezí vzdáleností obou luminiscenčních skupin, nejčastěji v rozsahu 1 až 10 nm. Akceptor poté vyzáří tuto přijatou energii jako foton o vyšší vlnové délce. Pro primární excitaci je obvykle využíván laser, který dosahuje nejvyšší možné hustoty excitační energie. Tím je umožněno dosažení maximální citlivosti, ale zároveň může docházet k rychlé fotodegradaci donoru. Tento jev je pozorován prakticky u všech organických molekul a následně vede k rychlému snižování užitečného signálu v čase.

Místo organické molekuly lze, jako donor, použít i anorganický luminiscenční nanokrystal. Tyto nanočástice, se staly často používanou součástí luminiscenčních značek, čidel « «

Μ ς » « « · f» ··« t * ♦ i * 4 · 4 &««· · Λ *4··«*· 9»· 4* a sensorů s širokou aplikací v analytické chemii. Ve srovnání s tradičními organickými flourofory, nanočástice vykazují vynikající fotofyzikální vlastnosti, vysokou stabilitu, široké excitační pásy a úzké, symetrické emisní pásy. Tyto vlastnosti dělají luminescenční nanočástice vhodným donorem pro Fórsterův rezonanční přenos energie. Typickými příklady luminiscenčních nanokrystalů jsou například tzv. kvantové tečky CdSe, nebo CdTe¹, nebo upkonverzní nanočástice NaYF₄ dopované prvky vzácných zemin². Pro využití těchto nanočástic ve vodném prostředí je třeba chemická modifikace jejich povrchu, pro zajištění rozpustnosti a stability. Nejčastější modifikace zahrnuje kovalentní připojení nabitých skupin, jako jsou např. karboxy-, nevo amino- skupin, které zajišťují i kladný, nebo záporný náboj povrchu nanokrystalů. Metody povrchových úprav a následné reakce funkčních skupin jsou obecně známé a používané, což ulehčuje jejich aplikace spojené s biologicky významnými látkami. Ukotvení náboje na povrchu luminescenční částice umožňuje monitorovat reakce a změny povrchových vlastností elektroforetickými technikami.

Dále je možné využít povrchové skupiny pro navázání dalších biomolekul tak, jak je to popsáno v literatuře³. DNA obsahuje dvě funkční skupiny vhodné k tomuto účelu hydroxylovou skupinu a fosfátovou skupinu. Pro usnadnění navázaní se používají ověřené metody, které ovšem vyžadují DNA řetězce s modifikovou funkční skupinou na konci řetězce. Známé metody navázání na povrch nanočástice jsou např. pomocí biotin-streptavidin interakce a „cross-linkerů využívajících vznik peptidické vazby mezi amino skupinou a karboxylovou skupinou. Méně častá metoda je navázaní tzv. výměnou ligandu, které je umožněno silnou dativní vazbou mezi atomy síry a některými kovy.

Podstata vynálezu

Ve zde navrhovaném řešení je DNA mutace detekována tak, že je analyzovaná sekvence nejprve naznačena fluorescenční značkou (akceptor) s excitační vlnovou délkou v oblasti emise luminiscenční kvantové tečky, nebo upkonverzního nanokrystalů (donor) připojené ke detekčnímu řetězci ssDNA. V případě, že dojde k hybridizaci analyzované sekvence DNA s detekčním řetězcem ssDNA a tento hybrid je osvícen vhodným zdrojem záření, dojde také k Fórsterově rezonančnímu přenosu (FRET) z donoru (luminiscenční nanokrystal) na akceptor «

« · * · ♦ « · ♦ 4 » « · • 4 · » » 4 • · 4 · 4 4« i « · * ·

(fluorescenční značka) a lze detekovat odpovídající fluorescenční záření. V případě, že k hybridizaci nedojde, detekční signál není zachycen a hledaná sekvence ve vzorku není detekována. Jednořetězcová DNA (ssDNA) navazaná na nanočástici představuje selektivní část sensoru. Analyzovaný vzorek DNA se označí fluorescenčním barvivém při přípravě vzorku např. během PCR amplifikace. Alternativním způsobem řešení je i obracená konfigurace, kdy luminiscenční kvantovou tečkou je naznačen vyšetřovaný DNA fragment a ten následně hybridizuje s DNA sondou značenou fluorescenčním barvivém.

Jednou z výhod vynálezu je snadná a již poměrně dobře popsaná syntéza nanočástic, které jsou spolu s vhodnou funkční skupinou na svém povrchu dispergované ve vodném prostředí. Velikost nanokrystalů lze regulovat během jejich syntézy. Kromě chemického složení ovlivňuje vlnovou délku emise nanokrystalů také jejich velikost, čímž lze optimalizovat účinnost FRET. S rostoucí velikostí nanokrystalů obvykle roste také vlnová délka emitovaného záření.

Při hledání nejvhodnější metody navázání specifické ssDNA na nanočástici byla jako nejvhodnější metoda experimentálně vyhodnocena výměna ligadů, při které se ponechají reagovat nanočástice se ssDNA, označenou thiolovou skupinou. Mezi atomem síry a povrchem nanočástice se utvoří pevná dativní vazba. Výhoda této reakce spočívá v tom, že se ponechají reagovat pouze dvě výchozí látky a nepřidávají se žádná další činidla.

Mezi hlavní výhody navrhovaného sensoru patří rychlost a jednoduchost finální analýzy pomocí fluorescenční spektrometrie. Měří se fluorescenční emisní spektra samotného sensoru a samotného fluorescenčně značeného analytů, poté jejich směsi. Pozitivní výsledek se projeví v emisním spektru jako pokles intensity donoru a nárůst fluorescenční intensity akceptoru. Výsledek lze jednoduše ověřit pokusem, kde se použije jako analyt fluorescenčně značená DNA, která není komplementární, ve výsledném emisním spektru se poté intensity donoru a akceptoru nemění.

• · · * · ·

Příklady uskutečnění vynálezu

Předmětem vynálezu je příprava a použití sensoru založeného na detekčních řetězcích ssDNA kovalentně připojených na luminiscenčních nanočásticích na bázi kvantových teček nebo upkonverzních nanočásticích. Sensor je určený pro detekci mutací ve vzorku DNA. Obecné schéma detekce DNA mutace s pomocí navrhovaného FRET senzoru (detekční ssDNA řetězec kovalentně navázaný na luminiscenční nanokrystal) je na Obrázku 1.

Vzhledem ktomu, že velikost nanokrystalů je relativně velká, v rozmezí 1-200 nm, je na každém z nich připojeno více než jedna kopie (až desítky) detekčních ssDNA řetězců umožňující hybridizaci s větším množstvím DNA vzorku. Tím je zvýšen celkový signál detekované FRET emise. Obrázek 2 zobrazuje typická excitační a emisní spektra donoru (CdTe kvantová tečka) a akceptoru (rhodamin) použitelných v senzoru dle Obrázku 1.

Z Obrázku 2 je zřejmé, že v případě použití kvantových teček je FRET kaskáda uspořádána tak, že vlnová délka excitačního záření je vždy delší, než emise donoru a následně jsou delší i vlnové délky excitace a emise akceptoru. K exitaci tak lze použít záření v ultrafialové, nebo viditelné oblasti. To je dále demonstrováno na obrázku 3, kde je znázorněna funkce senzoru při použití vzorku s komplementární a nekomplementární DNA.

V dalším alternativním uspořádání lze namísto kvantových teček využít upkonverzních nanočástic, které po exitaci v infračervené oblasti emitují záření s kratší vlnovou délkou ve viditelné až ultrafialové oblasti. Při použití upkonverzních nanočástic je tak možné použít excitační záření v infračervené oblasti a pro FRET využít jedno, nebo více emisních maxim ve viditelné, nebo UV oblasti. V tomto uspořádání je sice nutné použít vyšší výkon excitačního záření, ale zcela odpadají rušivé efekty pžípadných fluorescenčních nečistot vzorku.

¹ Rosenthal S. J., McBride J., Pennycook S. J., Feldman L. C.: Surf. Sci. Rep. 62,111 (2007).

² Boyer JC, Větroně F, Cuccia LA, Capobianco JA. J Am Chem Soc. 2006 Jun 14;128(23):7444-5.

³ He X, Gao L, Ma N. Sci Rep. 2013 Oct 2;3:2825. doi: 10.1038/srep02825.

	i-	> *♦* *·* · ··· i β t « * · · · · f * » « i ♦· · · ♦ • « « ‘ « * · · * »«· · r «»»·»«· » · ♦ ··
fa+wl***

Claims (7)

1. Detekce nukleotidové sekvence části fluorescenčně značeného DNA fragmentu pomocí hybridizace s komplementární jednořetězcovou DNA sondou vyznačená tím, že na této jednořetězcové DNA sondě je kovalentně navázán luminiscenční nanokrystal a při hybridizaci s fluorescenčně značeným DNA fragmentem dochází k Fórsterově rezonančnímu přenosu.

2. Detekce nukleotidové sekvence části DNA fragmentu pomocí hybridizace s komplementární fluorescenčně značenou jednořetězcovou DNA sondou vyznačená tím, že na DNA fragment je kovalentně navázán luminiscenční nanokrystal a při hybridizaci s fluorescenčně značenou jednořetězcovou DNA sondou dochází k Fórsterově rezonančnímu přenosu.

3. Nárok podle bodu 1 a 2, vyznačený tím, že luminiscenční nanokrystal má velikost v rozmezí od 4 nm do 200 nm.

4. Nárok podle bodu 1 a 2, vyznačený tím, že luminiscenční nanokrystal je kvantová tečka se složením CdSe, nebo CdTe

5. Nárok podle bodu 1 a 2, vyznačený tím, že luminiscenční nanokrystal je upkonverzní nanokrystal NaYF₄ dopovaný v rozsahu od 1% do 30% jedním, nebo více prvky vzácných zemin.

6. Nárok podle bodu 4, vyznačený tím, že excitační záření použité při detekci je v rozsahu od 300 nm do 600 nm.

7. Nárok podle bodu 5, vyznačený tím, že excitační záření použité při detekci je v rozsahu od 800 nm do 1100 nm.