CZ2004300A3 - Osteogenní růstové oligopeptidy jako stimulátory krvetvorby - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká použití oligopeptidů odpovídajících C-koncové části OGP jako stimulátorů krvetvorby. Konkrétněji tyto oligopeptidy posilují naroubování transplantátů kostní dřeně, rekonstrukci krvetvorby, repopulaci kostní dřeně a zvyšují počet cirkulujících kmenových buněk, zejména po chemoterapii nebo ozařování. Vynález dále poskytuje způsoby použití těchto oligopeptidů a farmaceutické kompozice obsahující tyto oligopeptidy.

Dosavadní stav techniky

Biologické a biochemické interakce mezi kostí a kostní dření nejsou zdaleka zcela pochopeny. Nicméně nedávné studie potvrdily úlohu osteogenních buněk získaných z kostní dřeně při podpoře vývoje krvetvorných buněk [Teichman R. S. a kol., Hematol. 4: str. 421 až 426 (2000) ] .

Studie transplantace kostní dřeně potvrzují dvousměrné interakce mezi dvěma systémy. Ablace kostní dřeně nebo poškození způsobené ozařováním spouští počáteční lokální dočasnou osteogenní reakci [Amsel S. a kol., Anat. Rec. 164: str. 101 až 111 (1969); Patt Η. M. a Maloney M. A., Exp. Hematol. 3: str. 135 až 148 (1975)]. V této osteogenní fázi se v dutině kostní dřeně tvoří trabekuly. Trabekuly jsou dočasné a během rekonstituce krvetvorné dřeně se resorbuji. Kromě toho bylo u lidských dárců kostní dřeně po • · odstraněni podstatné části kyčelní kostní dřeně pozorováno zvýšení markérů tvorby kostí, tj. osteokalcinu a alkalické fosfatasy, v séru [Foldes J. a kol., J. Bone Miner. Res. 4: str. 643 až 646 (1989)]. Hypotéza, podle které lidské osteoblasty podporují lidské krvetvorné progenitorové buňky, je vysoce spekulativní: tyto buňky produkují faktory, které přímo stimulují tvorbu krvetvorných kolonií bez dodávky exogenně dodávaných růstových faktorů. Ve osteoblasty vylučují několik cytokinů faktor stimulující kolonie granulocytů (G-CSF), faktor stimulující kolonie granulocytú-makrofágu (GM-CSF), nádor nekrotizující faktor (TNF) a interleukin 6 (IL-6). Kromě toho kultivované osteoblasty podporují zachování nezralého fenotypu u krvetvorných kmenových buněk [Taichman a kol., Blood 87: str. 518 až 524 (1996)].

skutečnosti zahrnuj ících

Několik z těchto růstových faktorů zvyšuje in vivo repopulaci kostní dřeně a mobilizaci periferních kmenových buněk po vysokých dávkách chemoterapie. Rozsáhlé studie se prováděly u G-CSF, GM-CSF, IL-3 (Interleukin-3) a SCF (faktor kmenových buněk) [Bungart B. a kol., Br. J. Haematol. 76: str. 174 (1990); Lant T. a kol., Blood 85:

str. 275 (1995); Brugger W. a kol., Blood 79 str. 1193 (1991)] a (1992) ; Molinex G. a kol mnoho dalších růstových

Blood 78: str. 961 faktorů, například FLT-3, se nachází ve stádiu studia klinického použití [Ashihara E. a kol., Europ. J. Haematol. 60: str. 86 (1998)]. Pokrok v této oblasti, ke kterému došlo v minulých letech, umožnil pochopit několik fyziologických aspektů funkce kostní dřeně. Navíc schopnost modulovat diferenciaci a proliferaci hematologických prekurzorů představuje základ mnoha inovačních terapií, jakými jsou například transplantace kmenových buněk periferní krve, genová transfekce a ex vivo • · expanze kmenových buněk. Navzdory tomuto působivému vývoji nebylo doposud zcela objasněno několik aspektů fyziologie kmenových buněk a u několika faktorů, rozpustných nebo souvisejících s buněčnou membránou, existuje podezření, že se podílejí na fyziologické nebo patologické proliferaci a/nebo diferenciaci buněk kostní dřeně. Zvýšení počtu činidel, u kterých se prokázalo, že jsou schopna regulovat krvetvorbu, podporuje zásadní otázku týkající se nadbytečnosti nebo spornosti regulátorů krvetvorby [Metcaff D. a kol., Blood 82: str. 3515 (1993)].

Kromě úlohy klasicky definovaných růstových faktorů, by mohlo několik biologických činidel a buněčných typů zlepšovat nebo modifikovat in vivo i ex vivo terapeutické strategie. Endoteliální buňky odvozené z lidské kostní dřeně podporují dlouhodobou proliferaci a diferenciaci progenitorů myeloidů a megakaryocytů [Rafii S. a kol., Blood 86: str. 3353 (1995)]; akcesorni buňky mohou podporovat hematologickou rekonvalescenci po transplantaci kostní dřeně [Bonnet D. a kol., Bone Marrow Transpl. 23: str. 203 (1991)]; a ještě zajímavější pro dané účely je fakt, že osteoblasty mohou zlepšovat naroubování po transplantaci kostní dřeně, která nesouvisí s HLA u myší [El-Badri N. S. a kol., Exp. Hematol. 26: str. 110 (1998)].

Celá řada chemických struktur se podrobila výzkumu, jehož úkolem bylo stanovit jejich případnou úlohu ve fyziologii kostní dřeně. Účinky glykosaminoglykanů se například hodnotily jak na buněčných liniích odvozených od leukémie [Volpi N. a kol., Exp. Cell Res. 215: str. 119 (1994)], tak v testech klonogenní aktivity prováděných na kmenových buňkách získaných z lidské pupečnikové krve [Da Prato I. a kol., Leuk. Res. 23: str. 1015 (1999)]. Za účelem dosaženi hemoregulačních a multiliniových účinků se ^4-0178-04-6^

• · ···· ···· syntetizovaly dokonce i krátké peptidy, které těchto účinků dosahovaly pravděpodobně zlepšením produkce cytokinu buňkami stromatu [King A. G. a kol., Exp. Hematol. 20 (4): str. 531 (1992); Pelus L. M. a kol., Exp. Hematol. 22: str. 239 (1994)].

Idiopatická myelofibróza (IMF) je nejméně běžná a přináší s sebou nejhorší prognózu chronických myeloproliferačních poruch. Základním patologickým procesem je porucha klonálních krvetvorných kmenových buněk, která vede k anémii, atypické hyperplazii megakaryocytů, splenomegalii a různým stupňům mimodřeňové krvetvorby. Naopak charakteristická proliferace stromatu je reakční fenomén, který je výsledkem nepřiměřeného uvolňování růstových faktorů odvozených z megakaryocytů a/nebo krevních destiček, včetně růstového faktoru odvozeného z krevních destiček (PDGF), transformačního růstového faktoru-beta (TGF-beta), bazického fibroblastového růstového faktoru (bFGF), epidermálního růstového faktoru (EGF) a kalmodulinu [Groopman J. , Ann. Intern. Med. 92: str. 857 až 858 (1980); Chvapil M. , Life Sci. 16: str. 1345 až 1361 (1975)]. Průměrná doba přežití u IMF pacientů je přibližně 4 roky. Terapeutické strategie u IMF zůstávají převážně podpůrné a zaměřují se na zmírnění příznaků a zlepšení kvality života. Nejběžnější jsou transfúze krve, podávání androgenů a cytoredukčních činidel, jakým je například hydroxymočovina. Mnohem častěji se uvažuje o transplantaci kostní dřeně ale tato metoda je stále považována za experimentální přístup. Výsledky studií s interferonem-alfa (IFN-alfa) ukázaly slibné výsledky v raných hyperproliferačních stádiích IMF ale žádný nebo pouze velmi omezený účinek v pokročilejších stádiích nemoci.

• · ·· ·· ·· ···

• · · · · · · · · · • · · · · ····· ···· • · · · · · · ·

Již bylo prokázalo, že osteogenní růstový peptid (OGP), 14-aminokyselina, tj . vysoce konzervovaný peptid odvozený z H4 histonu, zvyšuje celulárnost krve a kostní dřeně a posiluje naroubování transplantátů kostní dřeně u

Clin. Orthop. 313: str. 64 (1995);

Blood 88: str. 4719 (1996) a patent z osteogenní fáze myší [Bab I. A. ,

Gurevitch 0. a kol

US 5 461 034]. OGP Se izoloval postablační regenerace kostní dřeně [Bab I. a kol., Endocrinology, 128 (5), str. 2638 (1991)] a je hojně fyziologicky přítomen v krvi, zejména ve formě komplexu s a₂-makroglobulinem (a₂-M) [Gavish H. a kol., Biochemistry, 36: str. 14883 až 14888 (1997)]. Podaný in vivo posiluje tvorbu kosti a posiluje trabekulární kostní hmotu; in vitro stimuluje proliferaci a aktivitu alkalické fosfatasy u osteogenních buněčných linií; a navíc je mitogenní vůči fibroblastům [Greenberg Z. a kol., Biochim. Biophys. Acta. 1178: str. 273 (1993)]. Ukázalo se, že kromě aktivity OGP při regeneraci kostí, při aktivaci osteoblastů a při proliferaci fibroblastů,

OGP rovněž in vivo indukuje vyvážené zvýšení počtu bílých krvinek (WBC) a celkové celulárnosti myeloablační kostní dřeně u myší podstupujících ozařování a syngenní nebo semialogenní transplantaci kostní dřeně [Gurevitch O. a kol., tamtéž (1996)] .

Tento C-koncový pentapeptid OGP, označený jako OGP(10-14), který se, jak se zdá, generuje proteolytickým štěpením celodélkového OGP po disociaci inaktivního komplexu s a₂-M, je ve vysokých koncentracích přítomen v séru savců a osteogenních buněčných kulturách [Bab I. a kol., J. Pept. Res. 54: str. 408 (1999)]. OGP S modifikovaným N-koncem si ponechává OGP-dávkově-dependentní účinek na buněčnou proliferaci, z čehož vyplývá, že ··

C-koncový pentapeptid je zodpovědný za navázání OGP receptoru [Greenberg Z. a kol., tamtéž (1993)]. Dále se ukázalo, že u osteogenních buněk MC3T3 El zvyšují mitogenní dávky OGP(10-14), ale nikoliv OGP, časově-dávkově dependentním způsobem aktivitu MAP kinasy naznačují, že je OGP(10-14) zodpovědný signalizaci [Gabarin a kol., J. Cell Biol. 81: str. 594 až 603 (2001)]. Rovněž se ukázalo, že aktivní formou OGP je jeho C-koncový pentapeptid OGP(10-14). Je zajímavé, že OGP(10-14) netvoří komplex s a₂-M nebo dalšími OGPBP (OGP vážící protein) [Bab I., J. Peptid Res. 54: str. 408 až 414 (1999)}.

Tato zjištěni za následnou

V rámci vynálezu se tedy hodnotila možná krvetvorná aktivita syntetických oligopeptidů, které jsou analogy C-koncové oblasti nativního OGP. Některé takové osteogenně aktivní specifické peptidy jsou popsány v patentu US 5 814 610. Syntetický oligopeptid sOGP(10-14) je popisován jako opiát s analgetickými účinky [Kharchenko a kol., Vepř. Med. Khim., 35(2) str. 106 až 109, (1989)].

Je důležité, že vynález prokázal, že již dříve známé osteogenně účinné oligopeptidy mohou působit jako stimulanty krvetvorného systému. Například syntetický pentapeptid odvozený z OGP, označený jako OGP(10-14), vykazuje několik vlastností, jakými jsou například zvýšení celulárnosti krve a kostní dřeně u myší a podpoření naroubování transplantátů kostní dřeně. Tento pentapeptid vykazoval významnou aktivitu při regeneraci buněk periferní krve po aplazii vyvolané cyklofosfamidem (CFA) a významně ovlivňuje mobilizaci kmenových buněk. Kromě toho se zkoumal ex vivo účinek syntetického OGP(10-14) u tkáňových vzorků kostní dřeně, které se odebraly IMF pacientům, a bylo prokázáno významné celkové zvýšení počtu krvetvorných •· ·· ·· ·· · • · · · · · · · · • · · · · · · · · ···· • · · · · · · ·· · · ·· ·· · · · ^-1-0178-04-ěé] buněk. Navíc hodnota účinku OGP(10-14) je přímo závislá na závažnosti IMF. Tyto výsledky naznačují, že OGP(10-14) může stimulovat tvorbu krvinek a záchrannou krvetvorbu.

Cílem vynálezu je tedy použití oligopeptidů odvozených z OGP jako krvetvorných růstových faktorů. Tyto a další cíle vynálezu budou podrobně objasněny v následující popisné části.

Podstata vynálezu

V prvním aspektu se vynález týká farmaceutické kompozice obsahující jako účinnou složku alespoň jeden oligopeptid mající schopnost stimulovat produkci krvetvorných buněk. Oligopeptid použitý podle vynálezu má molekulovou hmotnost 200 až 1000 a může jím být oligopeptid obsahující kteroukoliv z následujících aminokyselinových sekvencí Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly, Tyr-Gly-Phe-His-Gly, Gly-Phe-Gly-Gly a Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly. Farmaceutické kompozice podle vynálezu případně obsahují farmaceuticky přijatelný nosič, ředidlo nebo excipient.

U jednoho výhodného provedení aspektu podle vynálezu farmaceutická kompozice podle vynálezu obsahuje oligopeptid, kterým je pentapeptid mající vzorec: Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly (označený jako OGP(10-14)), a farmaceuticky přijatelný nosič.

U dalšího provedení obsahuje farmaceutická kompozice podle vynálezu oligopeptid, kterým je pentapeptid mající vzorec: Tyr-Gly-Phe-His-Gly.

U ještě dalšího provedení obsahuje farmaceutická kompozice podle vynálezu oligopeptid, kterým je tetrapeptid • « ·

C l·- θ-1-7-8—0 4 ·Όθ1 • · ···· ···· • · · · • · · · · • · · · · · · • · · · mající vzorec: Gly-Phe-Gly-Gly, a farmaceuticky přijatelný nosič.

V dalším provedení farmaceutická kompozice podle vynálezu obsahuje oligopeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly, kde je methioninový zbytek výhodně acylován, konkrétně obsahuje oligopeptid mající vzorec: Ac-Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly, a farmaceuticky přijatelný nosič.

Farmaceutická kompozice podle vynálezu je určena pro zlepšení naroubování transplantátů kostní dřeně, rekonstrukce krvetvorby, repopulace kostní dřeně a zvýšení počtu cirkulujících kmenových buněk.

V dalším provedení je farmaceutická kompozice podle vynálezu určena pro zlepšení naroubování transplantátů kostní dřeně, rekonstrukce krvetvorby, repopulace kostní dřeně a zvýšení počtu cirkulujících kmenových buněk, zejména u pacienta, který podstupuje chemoterapii nebo ozařování.

Oligopeptid použitý ve farmaceutické kompozici podle vynálezu zvyšuje procento cirkulujících multiliniových progenitorových buněk. Tyto multiliniové progenitorové buňky jsou cirkulujícími ranými prekurzorovými CD34 pozitivními buňkami.

Kromě toho oligopeptid použitý jako účinná složka ve farmaceutické kompozici podle vynálezu zlepšuje regeneraci nezralých buněk a monocytů a selektivně zvyšuje kteroukoliv z jednotek tvořících kolonie BFU-E a GEMM (CFU).

Farmaceutická kompozice podle vynálezu je tedy určena pro zvýšení počtu bílých krvinek (WBC), cirkulujících

Li .m 7í?.fi4 čH	9	• · · · · » · · · · « • · · · » · · · · · • · · · · · · · · ♦ ····· • · · · · · · · «··· ···· ·· ·· ·· ·
krvetvorných kmenových	buněk, a	stejně tak celkové
celulárnosti kostní dřeně	a krve.

U zvláště výhodného provedení je kompozice podle vynálezu určena pro podporu transplantace kostní dřeně. Tento účinek je dán schopností oligopeptidů působit na zvýšení počtu krvetvorných kmenových buněk, na urychlení rekonstrukce krvetvorby po transplantaci kostní dřeně a na zvýšení celkové celulárnosti kostní dřeně.

Podle dalšího zvláště výhodného provedení je farmaceutická kompozice podle vynálezu určena pro použití při léčbě subjektů, kterým byla transplantována kostní dřeň a které trpí hematologickými poruchami, solidními tumory, imunologickými poruchami a/nebo aplastíckou anémií. Konkrétněji mohou být hematologickými poruchami lymfomy, leukémie, Hodgkinsonovy choroby a myeloproliferační poruchy. Konkrétně může být myeloproliferační poruchou idiopatická myelofibróza (IMF).

Ve druhém aspektu se vynález týká použití oligonukleotidu obsahujícího libovolnou z následujících aminokyselinových sekvencí Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly,

Tyr-Gly-Phe-His-Gly, Gly-Phe-Gly-Gly a

Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly při přípravě farmaceutické kompozice určené pro zlepšení naroubování transplantátu kostní dřeně, rekonstrukci krvetvorby, repopulaci kostní dřeně a pro stimulaci počtu cirkulujících kmenových buněk.

U konkrétního provedení se oligonukleotidy podle vynálezu použijí při přípravě farmaceutické kompozice určené pro zlepšení naroubování transplantátu kostní dřeně, rekonstrukce krvetvorby, repopulace kostní dřeně a zvýšení ^O178-Q-4-Še( ·· ·· ·· ·· ·· · • · · · · · · · · · · • · ···· ···· • · · · · · · · · · ···· • · · · · · · · ···· ···· ·· ·· ·· · počtu cirkulujících kmenových buněk, zejména u pacienta podstupujícího ozařování nebo chemoterapii.

Podle výhodného provedení se výše specifikované oligopeptidy použijí při přípravě farmaceutické kompozice určené pro zvýšení počtu cirkulujících multiliniových progenitořových buněk. Těmito multiliniovými progenitorovými buňkami jsou cirkulující rané prekurzorové CD34 pozitivní buňky.

Oligopeptidy použité při přípravě farmaceutické kompozice podle vynálezu dále zlepšují regeneraci nezralých buněk a monocytů a selektivně zvyšují počet kterékoliv z jednotek tvořících kolonie BFU-E a GEMM (CFU).

Tyto oligopeptidy lze tedy použít při přípravě farmaceutické kompozice určené pro zvýšení počtu bílých krvinek (WBC), cirkulujících krvetvorných kmenových buněk a/nebo celkové celulárnosti kostní dřeně.

Konkrétněji vynález poskytuje použití těchto oligopeptidů při přípravě farmaceutické kompozice určené pro podporu transplantace kostní dřeně. Tento účinek je dán schopností oligopeptidú působit na zvýšení počtu kmenových buněk, na urychlení rekonstrukce krvetvorby po transplantaci kostní dřeně a na zvýšení celulárnosti kostní dřeně.

Podle dalšího zvláště výhodného provedení se vynález týká použití uvedených oligopeptidú při přípravě farmaceutické kompozice, která je určena pro léčbu subjektů trpících hernatologickými poruchami, solidními tumory, imunologickými poruchami a/nebo aplastickou anémií. Konkrétněji mohou být hematologickými poruchami lymfomy, leukémie, Hodgkinsonovy choroby nebo myeloproliferační poruchy, zejména idiopatická myelofibróza (IMF).

|)1 017-6---04 O

• · · · · · • ♦ · • « · ·· · • · · · ·«· ·

Ve třetím aspektu vynález poskytuje způsob zlepšení naroubování transplantátu kostní dřeně, rekonstrukce krvetvorby, repopulace kostní dřeně a zvýšení počtu cirkulujících kmenových buněk. Tento způsob zahrnuje krok podání účinného množství oligopeptidu majícího schopnost stimulovat produkci krvetvorných buněk, jak bylo popsáno výše, nebo podání kompozice podle vynálezu subjektu, který ji potřebuje. Tento způsob podle vynálezu lze podle výhodného provedení použít pro zlepšení naroubování transplantátu kostní dřeně, rekonstrukce krvetvorby, repopulace kostní dřeně a pro zvýšení počtu cirkulujících kmenových buněk u pacienta, který podstupuje ozařování nebo chemoterapii .

Podle konkrétního provedení tohoto aspektu se vynález týká způsobu léčby subjektu, který trpí hematologickou poruchou, solidním tumorem, imunologickou poruchou nebo aplastickou anémií. Tento způsob podle vynálezu zahrnuje podání terapeuticky účinného množství oligopeptidu majícího schopnost stimulovat produkci krvetvorných buněk, jak bylo popsáno výše, nebo kompozice obsahující tento oligopeptid subj ektu.

U dalšího specifického provedení lze tento způsob použít pro podporu léčby subjektu při transplantaci kostní dřeně.

Konkrétněji mohou bát hematologickými poruchami lymfomy, leukémie, Hodgkinsonova choroba nebo myeloproliferační poruchy, zejména idiopatická myelofibróza (IMF).

Výhodné provedení se týká způsobu zvýšení počtu krvetvorných kmenových/progenitořových buněk. Tento způsob ·· ·· ·· ·· ·· · • ·· · · · · · · ♦ · • 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 99999

9 9 9 9 9 9 9

9999 9999 99 99 99 9 podle vynálezu zahrnuje kroky vystavení těchto buněk působení účinného množství oligopeptidu majícího schopnost stimulovat produkci krvetvorných buněk, jak bylo popsáno výše, nebo působení kompozice obsahující tento oligopeptid.

U zvláště výhodného provedení je způsob podle vynálezu určen pro zlepšení proliferace CD34 pozitivních buněk.

U jednoho zvláště výhodného provedení se buňky nacházejí v buněčné kultuře a způsob lze použít ex vivo nebo in vitro.

Alternativně lze způsob podle vynálezu použít jako in vivo způsob léčby, výhodně u savců a zejména u lidí.

Léčeným subjektem je subjekt, který trpí nebo u kterého se předpokládá zvýšené riziko snížení hladiny krvinek, ke kterým může docházet v důsledku chemoterapie, ozařovací terapie nebo terapie spočívající v transplantaci kostní dřeně.

U ještě dalšího výhodného provedení se vynález týká způsobu in vitro nebo ex vivo udržování a/nebo zvyšování počtu krvetvorných kmenových buněk v krevním vzorku. Tento způsob zahrnuje izolaci buněk periferní krve z krevního vzorku, dodání krevních progenitořových buněk exprimujících CD34 antigen, shlukování dodaných krevních progenitorových buněk za vhodných podmínek a léčbu uvedených buněk oligopeptidem majícím schopnost stimulovat produkci krvetvorných buněk, jak bylo popsáno výše, nebo kompozicí obsahující tento oligopeptid.

In vivo léčba podle vynálezu se týká způsobu repopulace krevních buněk u savce. Tento způsob zahrnuje kroky podání terapeuticky účinného množství oligopeptidu ·· ·· ·» ·« ·· · ·«·· » · · · ··· • · · · 9 · ···· • · * » ··»··· · ··· • · · · · · · · ···· 9999 99 99 99 'i majícího schopnost stimulovat produkci krvetvorných buněk, jak bylo popsáno výše, nebo kompozice obsahující tento oligopeptid uvedenému savci. Těmito krvetvornými buňkami mohou být erytroidní, myeloidní nebo lymfoidní buňky.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 - Dávkově dependentní účinek před ošetřením podávaného syntetického oligopeptidu sOGP(10-14) na celkový počet buněk stehenní dřeně u myší po kombinované ablační radioterapii/BMT

OGP(10-14) Se v naznačené dávce denně subkutánně injektoval po dobu dvanácti dnů samicím C57 BL myší. Osmý den po zahájení léčby OGP(10-14) se myši podrobily 900 Rad rentgenovému ozařování, po kterém následovalo intravenózní podání 10⁵ syngennš neselektovaných buněk kostní dřeně. Čtrnáctý den po zahájení léčby se myši usmrtily a stehenní kostní dřeň se vypláchla do fosfátem pufrovaného solného roztoku. Jednobuněčná suspenze se připravila několikanásobným protažením preparátu skrze odměřené injekční jehly. Sčítání buněk se provádělo v hemocytometru. C-Kontrolním myším byl podán pouze fosfátem pufrovaný solný roztok. Uvedené hodnoty představují průměrnou hodnotu ± standardní odchylku (SE) získanou na základě testování alespoň sedmi myší na jeden testovaný stav. Zkratky: Fem (stehenní), Marr C (buňky dřeně), D (den), mou (myš), premed (premedikace), stimu (stimulace) a cellu (celulárnost) .

·© ·♦ ·· ·· 9 ···· · · · © · · · • · ···· · * · · © · · · · ··· · · · ©··· • · · · · · · · ·€·· ·©·· ·· ·© ·· ©

Obr. 2A-C - OGP(10-14) stimuluje počty krevních buněk dávkově a časově dependentním způsobem u myší, které se podrobují chemoablaci krvetvorných tkání

Samci ICR myší o hmotnosti 2 5 g se podrobili chemoablaci za použití cyklofosfamidu (CFA), 5 mg/myš, injektovaného intraperitoneálně nultý a první den, a to vždy jedna injekce denně. OGP(10-14) Se rozpustil ve „sterilní vodě pro injekci a 0,1 ml naznačených dávek nebo pouze vody (vehikulum) se subkutánně aplikovalo do zátylku myší, a to jednou denně, -7. den až -1. den a +2. den až +8. den. Uvedené hodnoty představují střední hodnoty ± standardní odchylku (SD) získané na základě testování dvaceti zvířat pro daný stav. Označení *: signifikantní proti CFA + vehíkulu, p < 0,05; **: signifikantní proti nmol OGP(10-14) skupině, p < 0,05.

Obr. 2A znázorňuje celkový počet bílých krvinek.

Obr. 2B znázorňuje celkový počet monocytů.

Obr. 2C znázorňuje celkový počet nezralých buněk.

Zkratky: cont (kontrolní, neošetřený), veh (vehikulum), ce (buňka), T (čas-dny)

¢)1 0170 0 4—-ěe φφφφ • ·· φ φφφ φ φ • · «φφφ φ φ φ φφ φφφφφφ φ φ φφφφ φφφφ φφφφ φφ φφ ··

Obr. 3 - OGP(10-14) Stimuluje počet cirkulujících dvojitě pozitivních CD34⁺/Sca-1⁺ u myší, které podstupují chemoablaci krvetvorných tkáni.

Samci ICR myší o hmotnosti 25 g se podrobili chemoablaci za použití cyklofosfamidu (CFA), 5 mg/myš, injektovaného peritoneálně nultý a první den v intervalu jedna injekce denně. OGP(10-14) Se rozpustil ve „sterilní vodě pro injekci při koncentraci 100 nmol/ml a 0,1 ml tohoto roztoku nebo pouze vody (vehikulum) se podávalo subkutánně do zátylku zvířat denně od -7. dne do -1. dne a od +2. dne do +8. dne. Myši s ablací CFA se léčily 10⁶ UI/0,1 ml G-CSF od +2. dne do +8. dne a posloužily jako pozitivní reference. Uvedené hodnoty představují střední hodnotu ± SD (chybové sloupce byly příliš malé na to, aby se zobrazily) získanou při testování 33 zvířat na stav.

Zkratky: veh (vehikulum), T (čas-dny), označení *:

signifikantní proti CFA + vehikulum, p < 0,01.

Obr. 4A-C - Vliv OGP (10-14) léčebného režimu na ex vivo kolonie tvořící jednotky odvozené z kostní dřeně myší, které se podrobily chemoablaci krvetvorných tkání.

Samci ICR myší o hmotnosti 25 g se podrobili chemoablaci za použití cyklofosfamidu (CFA), 5 mg/myš, injektovaného intraperitoneálně nultý a první den v intervalu jedna injekce denně. OGP(10-14) se rozpustil ve „sterilní vodě pro injekci při koncentraci 100 nmol/ml a 0,1 ml tohoto roztoku nebo pouze vody (vehikulum) se aplikovalo subkutánně do zátylku zvířat, a to denně po naznačenou periodu (periody). Kostní dřeň se izolovala • · |01 0170 04-Č^

• · · devátý den a provedla se analýza zaměřená na zjištění jednotek tvořících kolonie. Uvedené hodnoty představují průměrnou hodnotu ± SD získanou při testování deseti zvířat na stav.

Obr.	4A	znázorňuj e	CFU-GM.
Obr.	4B	znázorňuj e	CFU-GEMM
Obr.	4C	znázorňuj e	BFU-E.

Zkratky: Colo/di (kolonie/miska), Veh (vehikulum).

Obr. 5A-B - Mikrofotografie biopsie kostní dřeně

Obr. 5A prezentuje mikrofotografie dvou částí vzorku kostní dřeně odebraného od pacienta trpícího idiopatickou myelofibrózou (IMF) a kultivovaného ex vivo 14 dnů za absence OGP(10-14).

Obr. 5B prezentuje mikrofotografie dvou částí vzorku kostní dřeně odebraného pacientovi trpícímu idiopatickou myelofibrózou (IMF) a kultivovaného ex vivo 14 dnů v přítomnosti 10'⁸ M OGP(10-14). U vzorku kultivovaného v přítomnosti OGP(10-14) byla zaznamenána zvýšená buněčná hustota.

Obr. 6A-B - Mikrofotografie biopsie kostní dřeně

Obr. 6A prezentuje mikrofotografie retikulem zabarvených částí dvou oblastí vzorku kostní dřeně získaného od pacienta trpícího idiopatickou myelofibrózou (IMF) a kultivovaného ex vivo 14 dnů za absence OGP(10-14).

• · · · · ·· · · ·· • · · · · · · · · · • · ·· · · · · · · ···· • · · · · · · · ···· ···· ·· ·· ·· ·

Obr. 6B prezentuje mikrofotografie retikulem zabarvených částí dvou oblastí vzorku kostní dřeně získaného od pacienta trpícího idiopatickou myelofibrózou (IMF) a kultivovaného ex vivo 14 dnů v přítomnosti 10’⁸ M OGP(1014). Tkáň ošetřená OGP(10-14) vykazovala normální vzhled.

Obr. 7 - Regresní analýza u IMF

Regresní analýza u pacientů trpících idiopatickou myelofibrózou (IMF) mezi hladinou hemoglobinu a ex vivo poměrem počtu krvetvorných buněk ve vzorku ošetřeném OGP(10-14) ku počtu krvetvorných buněk v neošetřeném vzorku (T/C poměr) navrhuje přímý vztah mezi závažností IMF a účinkem OGP(10-14).

Zkratky: Hem (hemoglobin), Hemato (krvetvorný), rat (poměr), cellu (celulárnost).

Celá řada metod používaná v oblasti buněčné biologie a chemie peptidů zde nebude podrobně popisována vzhledem k tomu, že je považována za odborníkům v daném oboru známou oblast. Tyto metody zahrnují syntézy peptidů a strukturní analýzy, sčítání různých buněk, druhové analýzy buněk, testy na tvorbu kolonií apod. Příručkami popisujícími tyto metody jsou například Current Protocols in Immunology, Coligan a kol. (vydavatel), John Wiley & Sons. Inc. , New York, NY a Stewart J.M. a Young J. D. v: Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL, str. 1 až 175 (1984) . Obsahy těchto publikací jsou zde začleněny pouze formou odkazu. Dále zde není podrobně • · • ·« ···· ·· · · popsána celá řada imunologických technik, které jsou považovány za techniky odborníkům v daném oboru známé.

V textu přihlášky vynálezu jsou použity následující zkratky:

OGP(s) - osteogenní růstový polypeptid (polypeptidy); OGPBP(s) - osteogenní růstový polypeptid vážící protein (proteiny);

SOGP - syntetický OGP;

WBC - bílé krvinky;

PBL - periferní krev;

CFA - cyklofosfamid;

BMT - transplantace kostní dřeně; a

IMF - idiopatická myelofibróza.

Za interakci mezi buňkami kosti a buňkami kostní dřeně by mohlo být zodpovědných několik buněčných nebo rozpustných činidel. Zdá se, že tato interakce je podstatná pro regulaci umístění, proliferace a diferenciace krvetvorných a progenitorových buněk.

OGP Zvyšuje osteogenezi a celulárnost kostní dřeně [Greenberg Z. a kol., tamtéž (1993); Gurevitch O. a kol., tamtéž (1996)] . OGP Je navíc účinným mitogenem pro osteoblasty a fibroblasty a pro buňky kostní dřeně stromatu [Greenberg Z. a kol., J. Cellular Biochem, 65: str. 359 až 367 (1997); Robinson D. a kol., J. Bone Min. Res. , 10:

str. 690 až 696 (1995)].

Nedávno bylo u linie osteoblastů zaznamenáno, že OGP aktivuje mitogenem aktivovanou proteinkinasu prostřednictvím G-proteinu senzitivního na pertusový toxin. Zdá se, že se tyto aktivity omezují na C-koncový pentapeptid • » ·· · ···· ····

OGP(10-14), z čehož tedy vyplývá, že OGP(10-14) je bioaktivni formou OGP [Bab I. a kol., tamtéž (1999)].

OGP(10-14) By mohl být extrémně zajímavý z pohledu možného in vivo využití, pokud se vezme v úvahu absence imunogenicity a toxicity a relativní snadnost výroby a manipulace s peptidem.

Předcházející studie prokázaly, že po dvoutýdenním denním podávání s.c. injekcí 0,1 nmol až 10 nmol OGP tento peptid u normálních myší indukoval vyšší než 50% zvýšení počtu WBC a přibližně 40% zvýšení celkové celulárnosti kostní dřeně [Gurevitch O. a kol., tamtéž, (1996)]. Zastoupení různých buněčných typů se v důsledku léčby neměnilo, z čehož lze usuzovat na multilineární stimulaci krvetvorby. Jak ukazuje zde popsaný experiment, je zajímavé, že po reverzibilní aplazii vyvolané podáním CFA (cyklofosfamid) se myši léčené OGP(10-14) uzdravovaly rychleji než myši, kterým bylo vstřikováno placebo, a to bez jakékoliv zaznamenatelné toxicity při použitých dávkách.

V prvním aspektu se tedy vynález týká farmaceutické kompozice obsahující jako účinnou složku alespoň jeden oligopeptid mající schopnost stimulovat produkci krvetvorných buněk, výhodně mající uvedené aminokyselinové sekvence Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly, Tyr-Gly-Phe-His-Gly,

Gly-Phe-Gly-Gly nebo Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly, rovněž označované jako SEQ ID NOs: 1, 2, 3, respektive 4, a farmaceuticky přijatelný nosič.

Způsob tvorby krevních buněk, který spočívá v náhradě červených a bílých krvinek dělením buněk, které se nacházejí v kostní dřeni, se označuje jako krvetvorba.

• · • · fe-1-0178—©4-ěťf • · · · · ♦ ♦ • · · · · · ····· • · ·· · · · · ···· ···· ·· ·· ·· *

Informace o krvetvorbě lze nalézt v Dexter a Spooncer [Ann. Rev. Cell Biol., 3: str. 423 až 441 (1987)].

Existuje mnoho různých typů krevních buněk, které patři do různých buněčných linií. V každé takové linii navíc existují buňky v různých stádiích zralosti. Zralé krevní buňky jsou specifické svými rozdílnými funkcemi. Například erytrocyty se podílejí na transportu kyslíku a oxidu uhličitého; T a B lymfocyty se podílejí na imunitní odezvě zprostředkovávané buňkami, respektive protilátkami; krevní destičky jsou nutné ke srážení krve; a granulocyty a makrofágy působí jako obecné zachycovače a akcesorní buňky. Granulocyty lze dále rozdělit na basofily, eosinofily, neutrofily a žírné buňky.

U zvláště výhodného provedení tohoto aspektu podle vynálezu obsahuje farmaceutická kompozice podle vynálezu oligopeptid, kterým je pentapeptid mající vzorec: Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly označený jako SEQ ID NO: 1. Tento pentapeptid je v celém textu přihlášky vynálezu označen jako OGP(10-14) .

U dalšího provedení farmaceutická kompozice podle vynálezu obsahuje oligopeptid, kterým je pentapeptid mající vzorec: Tyr-Gly-Phe-His-Gly označený jako SEQ ID NO: 2.

U ještě dalšího provedení farmaceutická kompozice podle vynálezu obsahuje oligopeptid, kterým je tetrapeptid mající vzorec: Gly-Phe-Gly-Gly označený jako SEQ ID NO: 3.

U dalšího provedení farmaceutická kompozice podle vynálezu obsahuje oligopeptid, kterým je hexapeptid mající vzorec Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly označený jako SEQ ID NO: 4, ve kterém může být methioninový zbytek acylován.

• ·

Peptidy použité jako účinná složka ve farmaceutických kompozicích podle vynálezu se synteticky vyrábějí známými metodami organické chemie. Tyto syntézy jsou například popsány v uvedeném patentu US 5 814 610.

Podle výhodného provedení tohoto aspektu vynálezu je farmaceutická kompozice podle vynálezu určena pro zlepšení naroubování transplantátů kostní dřeně, rekonstrukce krvetvorby, repopulace kostní dřeně a pro zvýšení počtu cirkulujících krvetvorných kmenových buněk.

Podle dalšího provedení je farmaceutická kompozice podle vynálezu určena pro zlepšení naroubování transplantátů kostní dřeně, rekonstrukce krvetvorby, repopulace kostní dřeně a pro zvýšení počtu cirkulujících krvetvorných kmenových buněk u pacienta podstupujícího chemoterapii nebo ozařování.

Schopnost krvetvorných kmenových buněk poskytovat celoživotní produkci všech linií krevních buněk je dána rovnováhou mezi plasticitou kmenových buněk, tj . produkcí umístěných progenitořových buněk, které generují specifické linie krevních buněk, a replikací kmenových buněk v neděleném stavu (samoobn ova). Mechanismus regulující plasticitu krvetvorných kmenových buněk a samoobnovu in vivo je obtížné definovat. Nicméně hlavními faktory, které k tomuto mechanismu přispívají, jsou kombinace vlastních buněk a vlivy prostředí [Morrison a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92: str. 10302 až 10306 (1995)]. Důležitost krvetvorného mikroprostředí se určila za použití dlouhodobých systémů kultury kostní dřeně, ve kterých krvetvorné buňky kultivované ve stromatu umožnily zachovat HSCs, i když při nízkých frekvencích [Fraser a kol., Proč.

tft-1 - θ 1-3-β—θ-4—-G

Nati. Acad. Sci. USA 89 (1992) ; Wineman a kol., Blood 81 str. 365 až 372 (1993)] .

plasticitu cytokinovou opakovanou

Demonstrace udržení krvetvorných buněk v kultuře byla výsledkem snah identifikovat kandidáty faktorů „kmenových buněk. Úloha krvetvorných cytokinů při udržování kmenových buněk se studovala přímým přidáním purifikovaných faktorů do in vitro kultur populací kmenových buněk a následnou transplantací kultivovaných buněk [Meunch, a kol., Blood 81: 3463-3473 (1993); Wineman a kol., tamtéž (1993); Rebel, a kol., Blood 83: 128-136 (1994)]. Ukázalo se, že většina známých „běh aktivujících cytokinů, jakými jsou například IL-3, IL-6 a KL, stimulují proliferaci determinovanějších progenitorových buněk a konkurenčně umožňují udržení ale nikoliv expanzi buněk, které jsou schopny dlouhodobé multiliníové repopulace [reviewed in Williams, Blood 81 (12):3169-3172 (1993);MuUer-Sieburg a Deryugina, Stem

Cells, 13: 477-486(1995)]. Tato data sice naznačují, že a repopulační funkci buněk lze udržovat léčbou, nicméně molekuly, které podporují samoobnovu těchto pluripotentních buněk, zůstávají neznámé.

Ukázalo se, že polypeptid použitý ve farmaceutické kompozici podle vynálezu zvyšuje procento cirkulujících multiliniových progenitorových buněk. Těmito multiliniovými progenitořovými buňkami jsou cirkulující rané prekurzorové CD34 pozitivní buňky.

U člověka a u myši lze primitivní zralé krvetvorné progenitorové buňky přiřadit do třídy buněk definované na základě expresse jejich antigenu buněčného povrchu označovaného jako CD34. Tyto buňky lze označit jako CD34 pozitivní buňky. U myší jsou rannou podtřídou těchto CD34 ^1-0178-04···· ··*· ·· · • * · • · · · • · · ···· • · · ·· * pozitivních hematopiotických buněk dvojitě pozitivní CD34⁺/Sca^± buňky. Analogickým Sca-1 antigenem buněčného povrchu u člověka je Flk2. Lidské CD34/Flk2 dvojitě pozitivní buňky jsou tedy považovány za ekvivalent myších dvojitě pozitivních CD34/Sca-1 buněk.

Lidské krvetvorné progenitorové buňky, které exprimují CD34 antigen a/nebo Flk 2 receptor, jsou zde označovány jako „primitivní progenitorové buňky. Naopak krvetvorné buňky, které neexprimuji CD34 antigen nebo Flk2 receptor, jsou označovány jako „zralé progenitorové buňky. Takže výhodné provedení multiliniových progenitorových buněk představují cirkulující rané prekurzorové CD34/Flk2 dvojitě pozitivní buňky.

Výraz „progenitorové buňka, jak je zde použit označuje libovolnou somatickou buňku, která má schopnost diferenciací a proliferací generovat plně diferencované funkční progeny. Progenitorové buňky zahrnují progenitory z libovolného tkáňového nebo orgánového systému například včetně krve, nervu, svalu, kůže, střev, kosti, ledvin, jater, slinivky, thymu apod. Progenitorové buňky se liší od „diferenciovaných buněk, které jsou definované jako buňky, které mohou nebo nemusí mít schopnost proliferace, tj. autoreplikace, ale které jsou schopny za normálních fyziologických podmínek podléhat další diferenciaci na jiný buněčný typ. Kromě toho progenitorové buňky se dále liší od abnormálních buněk, jakými jsou například rakovinové buňky, zejména buňky leukémie, které proliferují (autoreplikuji), ale které se zpravidla dále nediferencují, bez ohledu na to, zda vypadají jako nezralé nebo nediferencované.

Progenitory jsou definovány na základě svých progenů, například granulocytovou/makrofágovou kolonu - tvořící éH-0178-O4-£ef • ··· · ·

9 9

99 9 progenitorové buňky (GM-CFU) se diferencují na neutrofily nebo makrofágy; primitivní erytroidní blast - tvořící jednotky (BFU-E) diferencují na erytroidní kolonu - tvořící jednotky (CFU-E), které dávají vzniknout zralým erytrocytům. Podobně jsou Meg-CFU, GEMM-CFU,Eos-CFU a BasCFU progenitory schopné se diferencovat na megakaryocyty, granulocyty, makrofág, eosinofily, resp. basofily.

Do současnosti již bylá charakterizovány celá řada různých dalších krvetvorných progenitorů. Krvetvorné progenitorové buňky například zahrnují ty buňky, které jsou schopny postupných cyklů diferenciace a proliferace, a poskytnout tak až osm různých linií zralých krvetvorných buněk. Na nejprimitivnějším neboli nediferenciovaném konci krvetvorného spektra krvetvorné progenitorové buňky zahrnují krvetvorné „kmenové buňky. Každá z těchto vzácných buněk, které reprezentují 1 z 10 000 až 1 ze 100 000 buněk v kostní dřeni, má schopnost generovat více než 1013 zralých krevních buněk všech linií a je zodpovědná za trvalou produkci krevních buněk po celý život organizmu. Setrvávají v kostní dřeni, zejména v klidovém stavu a mohou tvořit identické dceřiné buňky prostřednictvím procesu označovaného jako samoobnova. Takový nedeterminovaný progenitor může být tedy označen jako „omnipotentní, tj . , jak nutný, tak a postačující pro generování všech typů zralých krevních buněk. Progenitorové buňky, které si zachovávají schopnost generovat všechny linie krevních buněk, ale které nejsou schopny samoobnovy, jsou označovány jako „pluripotentní. Buňky, které mohou produkovat některé ale ne všechny linie krevních buněk a které nejsou schopny samoobnovy, jsou označovány jako „multipotentní. Oligopeptidy použité v rámci vynálezu lze použít pro ochranu libovolných těchto progenitorových buněk, včetně • · · · ► ♦ · · ř · · · » · · · · ι · · ·· ·· ·· · • · · • · · · • · ···· • · · ·· · unipotentních progenitorových buněk, pluripotentních progenitorových buněk a/nebo omnipotentních progenitorových buněk. Oligopeptidy, a zejména OGP(10-14), demonstrují účinnost zejména při ochraně krvetvorných progenitorových buněk.

U dalšího výhodného provedení zvyšuje oligopeptid použitý jako účinná složka ve farmaceutické kompozici podle vynálezu regeneraci nezralých buněčných monocytů a selektivně zvyšuje počet veškerých BFU-E a GEMM kolonu tvořících jednotek (CFU).

Níže uvedený příklad 3 popisuje ex vivo prováděný test tvorby krvetvorné kolony získané od OGP(10-14)-ošetřených myší a kontrolním způsobem ošetřených myší. Výsledky naznačují zvýšení GEMM-CFU a BFU-E v kulturách získaných od OGP(10-14)-ošetřených myší v porovnání z kulturou získanou od skupiny myší ošetřované pouze vehikulem, zatímco pozitivní G-CSF kontrola indukovala významné zvýšení GMCFU. Zvyšování tvorby kolony v kultuře získané od OGP(1014) ošetřených myší bylo zjevné pouze v případě, že se s ošetřováním začalo sedm dnů před chemoablací. Jak in vivo, tak ex vivo výsledky dosažené při použití OGP(10-14) potvrdili již dříve zaznamenanou multiliniovou aktivitu celodélkového OGP v porovnání s jinými cytokiny. Na rozdíl od ostatního růstu a mobilizaěních faktorů [Fleming, W. , a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 3760 (1993)], sOGP(10-14) zvyšuje počet of krvetvorných kmenových buněk v periferní krvi bez redukce oddělení kmenových buněk kostní dřeně.

Farmaceutická kompozice podle vynálezu může být tedy určena pro zvýšení počtu bílých krvinek (WBC), »9 · · · · · • · · · « 9 · · · • · · 9 99999 9 9999 • · · · 9 · 9

9999 99 99 99 9 ···♦ cirkulujících krvetvorných kmenových buněk a celkové celulárnosti kostní dřeně.

U zvláště výhodného provedení je kompozice podle vynálezu určena pro podporu transplantace kostní dřeně. Tento účinek umožňuje schopnost oligopeptidů zvyšovat počet kmenových buněk, urychlovat rekonstrukci krvetvorby po transplantací kostní dřeně a zvyšovat celulárnost kostní dřeně.

Jak je popsáno v příkladu 1, ukázalo se, že oligopeptidy podle vynálezu posilují naroubování transplantátů kostní dřeně a stimulují rekonstrukci krvetvorby. Transplantace Kostní dřeň (BMT) se postupně a rychle stává léčbou volitelnou v případech hematologických malignancí, jakými jsou například lymfomy, Hodgkinovy choroby a akutní leukémie, a stejně tak solidní druhy rakoviny, zejména melanom a rakovina prsu. V nedávné době se začalo rostoucí měrou uvažovat o BMT při léčbě myeloproliferačních poruch, jakými jsou například IMF (idiopatická myelofibróza). Potenciálně by, při zavedení zlepšených metod, bylo možné použít BMT rovněž při léčbě dalších katastrofických chorob, jakými jsou AIDS, aplastická anemie a autoimunitní poruchy. Cílem všech BMT je nahradit hostitelské krvetvorné kmenové buňky, a to jak omnipotentní, tak pluripotentní, které byly poškozeny chemoterapií, ozařováním nebo samotnou nemocí. Tyto kmenové buňky lze opakovaně replikovat a diferencovat za vzniku celého spektra buněk přítomných v krvi, konkrétně erytrocytů, krevních destiček a WBC, které zahrnují lymfocyty, monocyty a neutrofily. Rezidentní makrofágy a osteoklasty jsou rovněž odvozeny od krvetvorných omnipotentních kmenových buněk. Při diferenciaci kmenových buněk dochází k jejich stále častějšímu zařazování do (χΐ-0173~θ4-~£

φ φφφ φ φφφφφ φφφ φφ · konkrétní linie, dokud nejsou schopny vytvořit pouze jediný druh výše zmíněných buněk.

Podle dalšího zvláště výhodného provedení lze tedy farmaceutickou kompozici podle vynálezu použít při léčbě subjektů, kterým byla transplantována kostní dřeň a u kterých se objevila hematologická porucha, solidním tumor, imunologická porucha nebo aplastická anemie. Konkrétněji může být hematologickou poruchou lymfom, Hodgkinova nemoc nebo akutní leukémie a myeloproliferační porucha, zejména idiopatická myelofibróza (IMF).

V případě IMF (idiopatické myelofibrózy) se kostní erytropoéza rozvine v progresivní poškození za současného rozvoje a zesílení ektopické hemopoézy. Patologická kalcifikace fibrózy a strukturální alterace trabekulární kosti mohou být zodpovědné za absolutní nebo relativní deficit osteoblasty sekretujících faktorů a mohou být tedy alespoň částečně zodpovědné za zhoršenou funkci kostní dřeně.

Z výsledků popsaných v příkladu 4 zjevně vyplývá, že OGP(10-14) může v takto krátkém čase zvyšovat hustotu krvetvorných buněk v kostní dřeni u kultivovaných kostních fragmentů odebraných IMF pacientům, a to bez modifikace fibrózy. Buněčné zvýšení se zdá být vyvážené a není zodpovědné za expanzi atypických buněk. Nelze samozřejmě opomenout, že OGP(10-14) jednoduše chrání strukturu a celulárnost kultury kostní dřeně IMF vzorků v porovnání se vzorky kultivovanými bez pentapeptidu. Nicméně ze zachovale nebo dokonce zvýšené celulárnosti v některých OGP(10-14) kultivovaných vzorcích v porovnání s celulárnosti nacházející se v přírodních vzorcích vyplývá proliferační aktivita peptidu. Současně není jasné zda-li OGP působí na • ··· · · *· • · · • · · · • ♦ ···♦ • · · ·· · krevní prekurzory přímo nebo přes buňky stromatu nebo různé buněčné populace, ale alespoň na morfologické úrovni, se jeví být tato aktivita nezávislá na významnějším remodelingu mikroprostředí.

Jedním z výsledků tohoto pozorování je ve skutečnosti zjištění, že je OGP(10-14) schopen zvyšovat, in vitro, expanzí lidských krvetvorných buněk ve třech liniích.

Farmaceutické kompozice podle vynálezu obsahují jako účinnou složku výše popsaný oligopeptid nebo směs těchto oligopeptidú ve farmaceuticky přijatelném nosiči, excipientu nebo stabilizátoru, a případně další terapeutické složky. Přijatelné nosiče, excipienty nebo stabilizátory jsou netoxické pro příjemce v použitých dávkách a koncentracích, a zahrnují pufry, jakými jsou například fosfátem pufrovaný solný roztok a podobné fyziologicky přijatelné pufry, a obecněji všechny vhodné v daném oboru známé nosiče, excipienty a stabilizátory, například pro účely dodání příchutí, barev, lubrikace apod. do farmaceutické kompozice.

Nosiče mohou zahrnovat škrob a jejich deriváty, celulózu a jejich deriváty, například mikrokrystalickou celulózu, xanthanovou gumu apod. Lubrikanty mohou zahrnovat hydrogenovaný ricinový olej apod.

Výhodným pufrovacím činidlem je fosfátem-pufrovaný solný roztok (PBS), pomocí kterého je v roztoku rovněž nastavena jeho osmolarita.

Výhodnou farmaceutickou formulací je formulace postrádající nosič. Takové formulace jsou výhodně určeny pro podání formou injekce, včetně intravenózní injekce.

·· ·· ·♦ ·· ·· « • ♦ · · · · · · · · · • · · · ······ · ··· • · ·· · · · · ···· ···· ·· ·· ·· ·

Příprava farmaceutické kompozice je v daném oboru známá a je popsána v mnoha článcích a učebnicích, viz například Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro A. R. ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1990, zejména strany 1521-1712. Farmaceutické kompozice podle vynálezu lze připravit v jednotkových dávkových formách. Dávkové formy mohou rovněž zahrnovat postupně se uvolňující zařízení. Kompozice lze připravit libovolnou z daných ve farmacii známých metod. Tyto dávkové formy zahrnují fyziologicky přijatelné nosiče, které jsou ve své podstatě netoxické a neterapeutické. Příklady takových nosičů zahrnují iontoměniče, oxid hlinitý, stearát hlinitý, lecitin, sérové proteiny, jakými jsou například lidský sérový albumin, pufrovací látky, jakými jsou například fosfáty, glycin, kyselina sorbová, sorbát draselný, parciální glyceridové směsi nasycených rostlinných mastných kyselin, voda, soli nebo elektrolyty, jakými jsou například protaminsulfát, hydrogenfosforečnan disodný, hydrogenfosforečnan draselný, chlorid sodný, zinečnaté soli, koloidní oxid křemičitý, trikřemičitan horečnatý, polyvinylpyrrolidon, látky na báze celulózy a PEG. Nosiče pro topické formy těchto polypeptidů nebo formy na bázi gelu zahrnují polysacharidy, jakými jsou například nátriumkarboxymethylceluloza nebo methylcelulóza, polyvinylpyrrolidon, polyakryláty, polyoxyethylenové blokové polymery, PEG, a alkoholem je methylalkohol. Pro všechny formy podání jsou vhodné konvenční depotní formy. Tyto formy zahrnují například mikrokapsle, nanokapsle, liposomy, náplasti, inhalační formy, nosní spreje, sublinguální tablety a postupně se uvolňující přípravky.

Vhodné příklady těchto postupně se uvolňujících přípravků zahrnují polopropustné matrice pevných

Úl·-0178· 04^

99 99 * • · · · · · · • · · · · · · · • · · «·©·· · ©·© • · 9 9 9 9

99 99 · hydrofohních polymerů obsahujících oligopeptidy podle vynálezu, přičemž tyto matrice mají formu tvarovaných výrobků, například fólií nebo mikrokapslí. Příklady postupně se uvolňujících matricí zahrnují polyestery, hydrogely, polylaktidy, které například popisuje patent US 3 377 919, kopolymery kyseliny L-glutamové a γ-ethyl-L-glutamátu, nedegradovatelný ethylenvinylacetát, degradovatelné kopolymery kyseliny mléčné a kyseliny glykolové, jakými jsou například Lupron Depots (injektovatelné mikrokuličky tvořené kopolymer kyseliny mléčné a kyseliny glykolové a leuprolid acetát) a kyselina poly-L-(-)3 hydroxybutylova. Zatímco polymery, jakými jsou například ethylenvinylacetát a kyselina mléčná-kyselina glykolová umožňuje uvolňovat molekuly po dobu 100 dní, určité hydrogely uvolňují proteiny po kratší časové periody. Při zakapslení zůstanou peptidy v těle dlouhou dobu, kdy mohou zrát nebo se shlukovat v důsledku vystavení vlhkosti a 3 7 °C, což vede ke ztrátě biologické aktivity a možným změnám imunogenicity. V závislosti na probíhajícím lze pro stabilizaci navrhnout racionální Pokud se například zjistí, že mechanizmem shlukování je tvorba intermolekulární S-S vazby přes thiodisulfidovou záměnu, potom lze stabilizaci dosáhnout modifikací sulfhydrylových zbytků, lyofilizací z kyselinových roztoků, kontrolou obsahu vlhkosti, použitím vhodných aditiv a vývojem specifických polymerních matricových kompozic.

mechanizmu strategie.

Postupně se uvolňující oligopeptidy, a zejména tyto sOGPl-14 kompozice rovněž zahrnují liposomálně zachycené polypeptidy. Liposomy obsahující tyto polypeptidy se připraví v daném oboru známými metodami, jakými jsou například metody popsané v Eppstein a kol., Proč. Nati.

^^1..73-04^

·· φ« ·* ·* • * · · φ · « φ · φφ • · · Φ · · · · · · • « φ 9 9 ··· Φ Φ Φ ΦΦΦ· • · ΦΦ · · · Φ ···· ···« ΦΦ ·Φ ΦΦ ·

Acad. Sci. USA 82: 3688-3692 (1985); Hwang, a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77: 4030 (1980); patentech US 4 485 045 a US 4 544 545. Obecně představují liposomy malý (přibližně 20 až 80 nm) unilamelární typ, u kterých je obsah lipidu větší než přibližně 30 % mol. cholesterolu, přičemž konkrétní zastoupení se zvolí tak, aby představovalo optimální terapii využívající polypeptidy. Liposomy s prodlouženým cirkulačním časem jsou popsány v patentu

US 5 013 556.

Terapeutické formulace oligopeptidu se připraví pro skladování smísením těchto polypeptidů majících požadovaný stupeň čistoty s případnými fyziologicky přijatelnými nosiči, excípienty nebo stabilizátory [Remington¹s Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A., Ed., (1980)], ve formě lyofilizovaného koláče nebo vodných roztoků. Přijatelné nosiče, excípienty nebo stabilizátory jsou netoxické pro příjemce v použitých dávkách a koncentracích a zahrnují pufry, jakými jsou například fosfát, citrát a další organické kyseliny; antioxidanty zahrnující kyselinu askorbovou; polypeptidy s nízkou molekulovou hmotností (nižší než přibližně 10 zbytků); proteiny, jakými jsou například sérový albumin, želatina nebo imunoglobuliny; hydrofilní polymery, jakými jsou například polyvinylpyrrolidon; aminokyseliny, jakými jsou například glycin, glutamin, asparagin, arginin nebo lysin; monosacharidy, disacharidy a další karbohydráty zahrnující glukózu, manózu nebo dextriny; chelatační činidla, jakými jsou například EDTA; cukrové alkoholy, jakými jsou například mannitol a sorbitol; soli-tvořící protiionty, například sodné; a/nebo neiontová povrchově aktivní činidla, jakými jsou například Tween, Pluronics nebo polyethylenglykol (PEG).

bl—0-17-8—θ 4—č • · · · ········ ·· · ·

Oligopeptidy mohou být rovněž zachyceny v mikrokapsli připravené například koacervační technikou nebo interfaciální polymerací (například hydroxymethylcelulózové nebo želatinové mikrokapsle, resp. póly(methylmethakrylátové) mikrokapsle), v koloidním systému pro dopravu léčiva (například liposomy, albuminové mikrokuličky, mikroemulze, nanočástice a nanokapsle) nebo v makroemulzích. Tyto techniky jsou popsány v Remington's Pharmaceutical Sciences, tamtéž.

Farmaceutická kompozice je výhodně určena pro podání subjektu jednou denně, a výhodně obsahuje dávku účinné složky odpovídající přibližně 0,001 nmol až přibližně 50 nmol, výhodněji přibližně 0,05 nmol až 25 nmol, nejvýhodněji přibližně 0,1 nmol až přibližně 10 nmol.

Dá se předpokládat, že kromě popsaných oligopeptidů, mohou transplantaci podporující kompozice podle vynález případně dále obsahovat další terapeutické složky. Těmito složkami mohou být jeden nebo více známých cytokinů, například IL-3, IL-4, IL-5, G-CSF, GM-CSF (granulocytovou makrofágovou kolonu stimulující faktor) a M-CSF (makrofágovou kolonu stimulující faktor). V případě zabudování této další složky do kompozice může účinek kompozice při podpoře transplantace kostní dřeně růst synergicky.

V druhém aspektu se vynález týká použití libovolného výše popsaného oligopeptidů, zejména Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly, Tyr-Gly-Phe-His-Gly, Gly-Phe-Gly-Gly a Met-Tyr-Gly-Phe-GlyGly, které jsou označeny jako SEQ ID NOs: 1, 2, 3, resp. 4, při přípravě farmaceutické kompozice pro zlepšení naroubování transplantátu kostní dřeně, při rekonstrukci krvetvorby, při repopulaci kostní dřeně a při zvýšení počtu cirkulujících kmenových buněk.

• · ί&4ΠΜ78 0 4~ČKromě toho lze zde popsané oligopeptidy použít pří přípravě farmaceutické kompozice určené pro urychlení naroubování transplantátů kostní dřeně, zvýšení proliferace transplantovaných kmenových buněk, a tedy zvýšení dostupnosti všech typů krvetvorných buněk zahrnujících erytrocyty, a tedy eliminaci potřeby dodávat tyto buňky hostiteli alespoň po dobu několika týdnů; pro posílení krvetvorného mikroprostředí stromatu zvýšením počtu buněk stromatu a/nebo expresí faktorů získaných z buněk stromatu, které podporují krvetvorbu; zesílením exprese receptorů v krvetvorných kmenových buňkách pro faktory, které podporují krvetvorbu; posílení „homingu intravenózně podaných transplantátů kostní dřeně do kostní dřeně hostitele; zlepšení obnovy celulárnosti krve po BMT; umožnění úspěšné transplantace za použití redukovaného počtu buněk, a tedy snížení počtu (množiny) extrakcí kostní dřeně od dárce, a umožnění použití transplantátů o objemu 10 ml až 15 ml (namísto 1000 ml) ; zvýšení počtu krvetvorných omnipotentních a/nebo pluripotentních kmenových buněk v periferní krvi dárce, a tedy zlepšení proveditelnosti transplantace kmenových buněk z periferní krve; zvýšení počtu krvetvorných kmenových buněk in vitro v dlouhodobě existujících kulturách kostní dřeně určených pro použití jako transplantáty, a rovněž pro poskytnutí způsobu inhibice růstu tumorových buněk v aloimplantátech získaných od pacientů trpících leukémií; pro podporu endogenní obnovy kostní dřeně a krevní celulárnosti po chemo- a/nebo radioterapii; a pro podporu obnovy populace rezidentních makrofágů po BMT nebo po chemo- a/nebo radioterapii.

Konkrétní terapeutická dávka oligopeptidů nebo kompozice podle vynálezu se bude samozřejmě přizpůsobovat jednotlivým pacientům (věk, pohlaví, atd.), povaze léčeného • φ φ φ φ ^-0178-04-5

• φ φ φ φφφ φφφ φ φ φφφφφ φφφφ φ φ φφ · stavu a konkrétní volbě oligopeptidu a způsobu jejich podání. Ve všech případech bude terapeutická dávka stanovena ošetřujícím lékařem.

Pro podání účinné dávky polypeptidu podle vynálezu savci, zejména člověku lze použít libovolný vhodný způsob podání. Jako výhodný se jeví intravenózní, subkutánní a orální způsob podání.

Ve výhodném provedení jsou tyto oligopeptidy použity pro přípravu farmaceutické kompozice pro zvýšení procenta cirkulujících multiliniových progenitořových buněk. Těmito multiliniovými progenitořovými buňkami jsou cirkulující ranné prekurzorové CD34 pozitivní buňky, a výhodně, CD34/Flk2 dvojitě pozitivní buňky.

Výraz „krvetvorná kmenová/progenitorová buňka nebo „primitivní krvetvorná buňka, jak je použit výše, označuje buňku, která je schopna diferencovat se za vzniku determinovanějšího neboli zralejšího typu krevní buňky. „Krvetvornou kmenovou buňkou nebo „kmenovou buňkou je buňka, kterou lze specificky dlouhodobě naroubovat na hostitele ozařovaného letální dávkou.

„CD34⁺ Buněčná populace je bohatá na krvetvorné kmenové buňky. ACD34⁺ buněčnou populaci lze například získat z pupečnikové krve nebo z kostní dřeně. CD34⁺ Buňky lze z krve lidské pupečnikové šňůry získat například za použití imunomagnetických kuliček, které prodává společnost Miltenyi (Calfornia) a sledování pokynů výrobce.

Oligopeptidy použité při přípravě farmaceutické kompozice podle vynálezu navíc zlepšují izolaci nezralých buněk a monocytů a selektivně zvyšuje kteroukoliv z BFU-E a GEMM kolonu formujících jednotek (CFU).

• · je-í-oť/s·· 04 ě^j

Tyto oligopeptidy se tedy používají při přípravě farmaceutické kompozice určené pro zvyšování počtu bílých krvinek (WBC), cirkulujícího krvetvorného kmenu a celkové celulárnosti kostní dřeně.

Konkrétněji vynález poskytuje použití těchto polypeptidů při přípravě farmaceutické kompozice určené pro podporu transplantace kostní dřeně. Tento účinek je určen aktivitou oligopeptidu při zvýšení počtu kmenových buněk, urychlení hematologické rekonstrukce po transplantaci kostní dřeně a zvýšení celulárnost kostní dřeně.

Podle další zvláště výhodné provedení se vynález týká použití uvedených oligopeptidu při přípravě farmaceutické kompozice léčbu subjektu trpícího hematologickými poruchami, solidními tumory, imunologickými poruchami a aplastickou anémií. Konkrétněji mohou být hematologickými poruchami lymfom, leukémie, Hodgkinova nemoc a myeloproliferační poruchy, zejména idiopatická myelofibróza (IMF) .

Ve třetím aspektu vynález poskytuje způsob zlepšení naroubování transplantátu kostní dřeně, rekonstrukce krvetvorby, repopulace kostní dřeně a zvýšení počtu cirkulujících kmenových buněk. Tento způsob zahrnuje podání účinného množství oligopeptidu majícího výše popsanou schopnost stimulovat krvetvorné buňky, nebo kompozice podle vynálezu subjektu, který tuto léčbu potřebuje.

Podle dalšího provedení vynález poskytuje způsob zlepšení naroubování transplantátu kostní dřeně, rekonstrukce krvetvorby, repopulace kostní dřeně a zvýšení počtu cirkulujících kmenových buněk u pacientů podstupujících chemoterapii nebo ozařování.

• · • · • · · ^4--6·ί·78 -&4~Š^ • · · · ····· · · · ·· • · · · · · · •··· ·· ·· ·· ·

U ještě dalšího provedení lze účinné množství oligopeptidů nebo kompozice podle vynálezu použít pro zlepšení naroubování při transplantaci kostní dřeně nebo ke stimulaci mobilizace a/nebo expanze krvetvorných kmenových buněk u savce před sklízením krvetvorných progenitorú z jejich periferní krve.

Podle specifického provedení tohoto aspektu se vynález týká způsob léčby subjektu, který trpí hernatologickými poruchami, solidním tumorem, imunologickou poruchou nebo aplastickou anémii, podáním terapeuticky účinného množství oligopeptidů majícího stimulační účinky na produkci krvetvorných buněk nebo kompozice obsahující účinné množství tohoto oligopeptidů podle vynálezu subjektu.

V dalším specifickém provedení lze tento způsob použít jako podporu léčby subjektu transplantací kostní dřeně.

Při terapeutických aplikacích se oligopeptidy nebo farmaceutická kompozice použitelná podle vynálezu podávají savci, výhodně člověku, ve fyziologicky přijatelné dávkové formě, zahrnující ty formy, které lze člověku podávat intravenózně jako bolus nebo kontinuální infuzí během určité časové periody.

Alternativní způsoby podání zahrnují intramuskulární, intraperitoneální, intracerebrospinální, subkutánní, intraartikulární, intrasynoviální, intratekální, orální nebo topický způsob. Aby se dosáhlo lokálních a stejně tak systemických terapeutických účinků lze oligopeptidy nebo kompozice podle vynálezu rovněž vhodně podávat intratumorálně, peritumorálně, intralezionálně nebo perilezionálně nebo aplikací do lymfy.

Oligopeptidy nebo farmaceutické kompozice určené pro in vivo podání musí být sterilní. Toho lze snadno dosáhnout filtrací přes sterilní filtrační membrány před nebo po lypofilizaci a rekonstituci. Oligopeptidy lze uložit v roztoku. Terapeutické kompozice oligopeptidů se zpravidla umístí do nádoby, která má sterilní vstupní port, například vak pro intravenózní roztok nebo lahvička mající uzávěr prorazítelný hypodermickou injekční jehlou.

Konkrétní „účinné množství kteréhokoliv z oligopeptidů nebo kompozic podle vynálezu, které má být terapeuticky použito, bude záviset například na terapeutických objektech, způsobech podání, stavu pacienta atd. Je tedy třeba, aby terapeut natitroval dávku a modifikoval způsob podání podle potřeby tak, aby se dosáhlo optimálního terapeutického účinku. Zpravidla bude ošetřující lékař podávat oligopeptid až do okamžiku, kdy se při podávané dávce dosáhne požadovaného účinku. Typická denní dávka při systemické léčbě se může, v závislosti na výše zmiňovaných faktorech, pohybovat v rozmezí od přibližně 0,001 nmol/Kg až do 50 nmol/Kg.

Další specifické provedení se týká léčby subjektu nesoucího transplantát, kde lze adoptovat metodu ex vivo. U této metody se buňky určené pro transplantaci před samotnou transplantací vystaví působení účinného množství oligopeptidů nebo kompozic podle vynálezu.

V současnosti je nejběžnějším způsobem získání dostatečného množství krvetvorných kmenových buněk pro transplantaci extrakce 1 litru nebo více tkáně kostní dřeně z více míst kostí dárce pomocí jehly a injekční stříkačky, přičemž použitý způsob zpravidla vyžaduje celkovou anestézii. Dárci alogenní BMT (tkáně kostní dřeně) jsou • · fe^~ůii8-=O4-ě • * • · · • ··· typy jsou o nepříbuzné zpravidla sourozenci, jejichž tkáňové kompatibilní a v některých případech se jedná dárce kteří vykazují shodný typ HLA s příjemcem. Autologní transplantáty,které eliminují potřebu porovnávání a shodnosti HLA lze použít u pacientů, kteří podstupují ablační chemoradioterapii za účelem eradikace (vyhubení) solidních tumorů. Autologní kmenové buňky lze rovněž získat z pupeční kove krve při narození a lze je skladovat pro budoucí podání.

Po transplantaci a před usídlením fungující kostní dřeně získané od dárce může u pacientů, kteří jsou hostiteli BMT, přechodně docházet k výrazné pancytopeníi, která tyto pacienty vystavuje infekcím. Výskyt bakteriální a plísňové infekce koreluje jak se závažností, tak s dobou trvání pancytopenie [Slavín, S. a Nagler, A., Transplantation (1992)]. Z podobného důvodu CSF selhává při podpoře erytropoézy a tvorbě krevních destiček.

Bylo prokázáno, že oligopeptidy, které podporují krvetvorbu, mohou být užitečné a prospěšné i jinak. Někteří výzkumní pracovníci zjistili, že přidání kmenových buněk z periferní krve do buněk získaných z kostní dřeně významně zvyšuje rychlost naroubování, nicméně extrakce dostatečných počtů kmenových buněk z periferní krev je komplikovaný proces. Podáním oligopeptidů podle vynálezu dárcům za účelem zvýšení počtu kmenových buněk v krvi se zlepší realizovatelnost transplantace kmenových buněk z periferní krve [Golde, D. W., Sci. Am. 36 December (1991)].

Nezbytným předpokladem pro krvetvorbu a tedy pro úspěšnou MBT je přítomnost funkčních buněk stromatu a tkáně, která oslabuje krvetvorné mikroprostředí, determinuje usídlení injektovaných kmenových buněk z

Η'-0170 04 Čcf

cirkulace do kostní dřeni a podporuje krvetvorbu [Watson, J. D. a McKenna, H. J. Int. J. Cell Cloning 10: 144(1992)]. Kostní dřeň odvozená ze tkáně stromatu rovněž poskytuje podmínky pro udržování kmenových buněk v in vitro dlouhodobé kultuře kostní dřeně. V současné době je tato technologie postačující pro udržení kmenových buněk na živu.

Přidání vhodných krvetvorných oligopeptidů k těmto kulturám může napomoci expanzi kmenové buněčné populace in vitro, což poskytne zvýšený počet těchto buňky pro transplantaci.

Kombinovaný in vitro/in vivo přístup může poskytnout základ pro perspektivní strategii (i) pro získání malých preparátů kmenových buněk získaných z krve nebo kostní dřeně dárce a (ii) v případě zdravých jedinců pro vytvoření zásoby jejich kmenových buněk na dobu, kdy by mohl tyto buňky potřebovat pro léčbu závažného onemocnění a může tak obejít složitost související s použitím alogenní BMT.

Použití malých peptidů, jakými jsou například oligopeptidy popsané v této přihlášce vynálezu, které stimulují post-BMT rekonstrukci krvetvorby zlepšením in vivo, ex vivo a/nebo in vitro krvetvorného mikroprostředí, jehož vláknitá tkáň, kost a kostní buňky jsou důležitými složkami, by mělo tedy značný terapeutický význam. Tyto peptidy mohou rovněž podporovat krvetvorbu u spontánně se vyskytuj ícího nebo indukovaného myelosupresivního stavu, ke kterému nemusí nezbytně docházet v souvislosti s BMT.

Zdá se, že oligopeptidy popsané v přihlášce vynálezu a výhodně pentapeptid OGP(10-14), přímo působí na úrovni raného krvetvorného prekurzoru (tj. krvetvorných kmenových/ • · ·

progenitorových buněk). Takto expandovaná kmenová buněčná populace může sloužit jako zdroj buněk pro myelopoezu, erytropoezu (například slezinnou erytropoezu) a lymfopoezu. Z výše uvedených důvodů lze tyto oligopeptidy použít pro stimulaci proliferace a/nebo zachováni krvetvorných kmenových/progenitořových buněk buď in vitro nebo in vivo (například při léčbě onemocnění nebo poruch krvetvorby).

Výhodné provedení se tedy týká způsobu posílení proliferace krvetvorných kmenových/progenitorových buněk. Podle vynálezu tento způsob zahrnuje vystavení těchto buněk působení účinného množství oligopeptidú majícího schopnost stimulovat krvetvorné buňky nebo působení účinného množství kompozice obsahující tyto oligopeptidy výše popsaným způsobem. Podle vynálezu je tato expozice účinná ve smyslu zvyšující se proliferace uvedených buňky.

Výraz „zvyšující se proliferace buňky zahrnuje zvýšení rozsahu růstu /nebo reprodukce buňky v porovnání s neošetřenou buňkou a to buď in vitro nebo in vivo. Zvýšení buněčné proliferace v buněčné kultuře lze detekovat stanovením počtu buněk před a po expozici na sledovanou molekulu. Rozsah proliferace lze kvantifikovat pomocí mikroskopického stanovení stupně souvislosti vrstvy. Buněčnou proliferaci lze rovněž kvantifikovat za použití testu, při kterém se zabudovává thymidin nebo BrdU.

U zvláště výhodného provedení je způsob podle vynálezu určen pro zvýšení proliferace CD34 pozitivních buněk, výhodně Flk2 pozitivních buněk.

Oligopeptidy nebo kompozice podle vynálezu jsou použitelné při in vivo nebo ex vivo zvyšování počtu a/nebo proliferace a/nebo diferenciace a/nebo zachování • · φ φ · · φφφ • · · · φφφ · · · φφφφ φ φ φ φφφφ φφφφ φφ «φ φφ φ krvetvorných kmenových/progenitořových buněk, při expanzi populace těchto buněk a zvýšení repopulace těchto buněk a krevních buněk více linií u savce.

U jednoho zvláště výhodného provedení jsou tyto buňky v buněčné kultuře a bude se tedy jednat o ex vivo/in vitro metodu.

Alternativně lze způsob podle vynálezu použít jako in vivo způsob léčení v případě, kdy jsou ošetřené buňky přítomny v těle savce.

Výraz „léčba zde označuje jak terapeutickou léčbu, tak profylaktická nebo preventivní opatření, takže označením „v případě potřeby léčby se myslí, jak v případě již vypuknuvší nemoci nebo poruchy, tak v případě, kdy se má nemoci nebo poruše předcházet.

Výraz „savec označuje pro potřeby léčby libovolného živočicha klasifikovaného jako savce včetně člověka, domácích a hospodářských zvířat, a zvířat chovaných v zoo, sportovních zvířat nebo domácích mazlíčků, jakými jsou například psi, koně, kočky, krávy, atd. Výhodně je savce člověk.

U specifického provedení, savec léčený způsobem podle vynálezu trpí sníženou hladinou krevních buněk nebo je k tomu náchylný, přičemž tento stav může způsobit chemoterapie, ozařování, transplantace kostní dřeně nebo kterákoliv jiná iatrogenní nebo přirozená příčina.

Chemo- a radioterapie způsobují dramatické snížení populace krevních buněk u pacientů trpících rakovinou. V USA a v Evropě každým rokem podstupuje chemoterapii a radioterapii alespoň 500 000 pacientů trpících rakovinou a ]η-0'13·&~Θ4· ···· ···· další 200 000 v Japonsku. Transplantace kostní dřeně se stává v případě aplastické anémie, primární imunodeficience, akutní leukémie a solidních tumorů (po celkovém ozařování těla) lékařskou komunitou stále častěji používanější terapií. Alespoň 15 000 Američanů získává každým rokem transplantát kostní dřeně. Dalšími nemocemi, které mohou způsobovat redukci všech nebo zvolených linií krevních buněk, jsou například anémie (včetně makrocystické a aplastické anémie); thrombocytopenie; hypoplazie; imunní (autoimunní) thrombocytopenické purpury (ITP); a HIV i ndukované ITP.

Existuje potřeba vyvinout farmaceutické produkty, které by byly schopny posilovat rekonstituci populací krevních buněk u těchto pacientů.

Předmětem vynálezu je tedy poskytnout způsob posílení proliferace a/nebo diferenciace a/nebo zachování primitivních krvetvorných buněk. Tento způsob lze použít v případě zesilování repopulace krvetvorných kmenových buněk a tedy linií zralých krevních buněk. Toto je žádoucí v případě, kdy savec trpí redukcí krvetvorných nebo zralých krevních buněk v důsledku nemoci, ozařování nebo chemoterapie. Tento způsob lze rovněž používat při generování expandovaných populací takových linií kmenových buněk a zralých krevních buněk z těchto krvetvorných buněk ex vivo.

U ještě dalšího výhodného provedení se vynález týká způsobu in vitro/ex vivo zachování a/nebo expanze kmenových buněk. Tento způsob zahrnuje izolaci periferních krevních buněk z krevního vzorku, obohacení krevních progenitořových buněk exprimujících CD34 antigen, srážení obohacených krevních progenitořových buněk za vhodných podmínek a ošetření uvedených buněk oligopeptidem podle vynálezu fei 0170 ·· ·« ·· ·· • ♦ · · · · · « • · · · · · • · · · · · · · • · · · · ···· ···· ·· ·· majícím schopnost stimulovat krvetvorbu buněk nebo kompozicí podle vynálezu obsahující jako účinnou složku oligopeptid mající schopnost stimulovat krvetvorbu buněk.

U specifického provedení múze způsob podle vynálezu zahrnovat další krok, kterým je vystavení ošetřených buněk působení cytokinu. Tento cytokin lze například zvolit z množiny sestávající z TPO (trombopoietin), EPO (erytropoietin), M-CSF (makrofágové kolonie stimulující faktor), GM-CSF (granulocyt-makrofág-CSF), G-CSF (granulocyt CSF) , IL-1 (interleukin-1) , IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, LIF (inhibiční faktor leukémie) a KL (Kit ligand).

Pokud jde o in vivo léčbu vynález se týká způsobu repopulace krevních buněk u savce. Tento způsob zahrnuje podání terapeuticky účinného množství oligopeptidu majícího schopnost stimulovat krvetvorbu buňky nebo účinného množství kompozice podle vynálezu uvedenému savci. Těmito krvetvornými buňky mohou být libovolné erytroidní, myeloidní a lymfoidní buňky.

„Lymfoidními liniemi krevních buněk jsou ty krvetvorné prekurzorové buňky, které jsou schopny diferenciace za vzniku lymfocytů (B-buňky nebo T-buňky). Stejně tak „lymfopoeza je tvorba lymfocytů.

„Erytroidní krevní buněčná linie označuje ty krvetvorné prekurzorové buňky, jsou schopny diferenciace za vzniku erytrocytů (červené krvinky) a „erytropoeza je tvorba erytrocytů.

Výraz „myeloidní krevní buněčné linie, jak je zde uveden, zahrnuje všechny krvetvorné prekurzorové buňky, jiné než lymfoidní a erytroidní krevní buněčné linie, jak

-1 .....04 G·· ♦· ·« ·♦ ·· · • · · · · · · · · · · • · · · · · · · · · • · ·· * · · · · · ····· • · · · · · · ♦ ···· ···· ·· ·· ·· · jsou definovány výše, a „myelopoeza zahrnuje tvorbu krevních buněk (jiných než lymfocyty a erytrocyty).

Je třeba uvést že použité příklady provedení vynálezu mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen přiloženými patentovými nároky.

Rovněž je třeba zdůraznit, že použití singuláru v popisné části a přiložených patentových nárocích zahrnují ve všech případech, pokud není stanoveno výslovně jinak, i plurál.

Stejně tak výraz „obsahují, a jeho varianty, jakými jsou například „obsahuje a „obsahující, je třeba chápat tak, že kromě konkrétně jmenované množiny prvků nebo kroků mohou do této množiny spadat další prvky nebo kroky.

Příklady provedení vynálezu

Reakční činidla

1. C-koncový pentapeptid osteogenního růstového

Peptidu (10-14) [sOGP(10-14)]: Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly;

molekulová hmotnost 499,7 (SEQ ID NO:1) dodali Polypeptids Laboratories lne. (Torrance, California 90503, USA Batch No. 9712-006) .

2. CFA-cyklofosfamid (CFA, SIGMA, 5 mg/myš) se použil pro indukci ablace kostní dřeně.

3. Dexter-imitující médium: McCoyovo médium (GibcoLife technologies, USA) s 12,5 % fetálního bovinního séra (FBS, Hyclone, Holland) , 12,5 % koního séra (HS, Sigma, St ·· ·· ·* ·« ·« · • · · · · · · · « · · • · ···· ···· • · · · · ··· · · · ···· • · · · · · · · ««·· ···· ·· ·♦ ·· *

Louis, MO) , 0,8 % esenciálních a 0,4 % esenciálních aminokyselin (Gibco-Life technologies, USA) , 1 % glutamin (Sigma, St Louis, MO) , 0,4 % vitaminů zahrnujících cholin, kyselinu listovou, inositol, nicotinamid, pyridoxal HCl, riboflavin, thiamin HCl, D-Ca pantothenát (Gibco-Life technologies, USA), 1 % amfotericinu B (Fungizone, BristolMyers Squibb), 1 % gentamicinu, a 10’^s M hydrokortisonu v přítomnosti rekombinantního lidského faktoru kmenových buněk (50 ng/mL rhSCF, Calbiochem, USA) , rekombinantního lidské granulocyt-monocytové kolony stimulujícího faktoru (rhGM-CSF 10 ng/mL, Sandoz, Switzerland), rekombinantního lidského interleukinu-3 (rhIL-3 10 ng/mL, Calbiochem, USA) a rekombinantního lidského erytropoietinu (rhEpo 2 jednotky/mL, Sigma, St Louis, MO) s nebo bez sOGP(10-14) 10’⁸M (Abiogen Pharma SpA Research Laboratories).

4. E.D.T.A Milan, Italy).

kyselinový pufr (Mielodec,

Bio

Optica,

Zvířata * Samci myší ICR byli zakoupeni u společnosti Charles River's (Italy) a chováni ve specifických patogenů prostých podmínkách.

* Samičky myši černé CV57 se získaly z chovné stanice Hebrew University Medical School (Jerusalem, Izrael). Hmotnost myši obou druhů byla při příchodu do laboratoře vynálezců 25 g.

Statistická analýza »··· ····

99 99

9 9 9 9 9

9 9 · 99

9 99999 9

9 9 9 9 9

99 99 9 • · ···

Srovnání mezi skupinami se provedla za použití metody Fisher's PLSD, faktoriálové nebo pro opakovaná měření, analýzy rozptylu (ANOVA). Pro testování kolonií se použil Mann-Whitneyho test.

Příklad 1

Vliv OGP(10-14) na naroubování transplantátu kostní dřeně

Materiály a metody

Samičky myši černé CV57 se použily pro vyšetření možného vlivu OGP(10-14) na naroubování transplantátů kostní dřeně. OGP(10-14) ve fosfátem pufrovaném solném roztoku se podával denně subkutánně formou lOgl injekcí po dobu 12 dní. Denní dávka se pohybovala od 0,001 nmol do 10 nmol na myš. Kontrolní myši přijímaly pouze fosfátem pufrovaný solný roztok. 8. Den po zahájení léčby OGP(10-14) myši podstoupily rentgenové ozařování celého těla sestávající z jediné 900rad dávky, která se aplikovala pomocí ⁶⁰Co zdroje (Picker C-9, 102,5 rad/min). Po tomto ozařování bezprostředně následovala intravenózní injekce 10⁵ neselektovaných syngenních buněk kostní dřeně. Zvířata se usmrtila 14 dní po zahájení OGP(10-14) léčby, obě stehenní kosti se odřízly a jejich epifyzální konce se odstranily. Kostní dřeň se kompletně vypláchla do fosfátem pufrovaného solného roztoku (PBS). Jednobuněčná suspenze se připravila tak, že se přípravek několikrát protáhl skrze kalibrované injekční jehly počet buněk se určil v hemocytometru.

()1- 6-178-04 č

·· • · ·· ·· ·· ·· ·· • · · · · · • · 9 · · 9

9 9 99 9 9 9

9 9 9 9 9

9 9 99 9 • · ····

Výsledky

Obr. 1 znázorňuje stimulační účinek OGP(10-14) na celkový počet buněk femorální kostní dřeně po ozařování /po transplantaci. Tento účinek je dávkově dependentní, a při třech nejvyšších dávkách byl statisticky významný, tj. počet buněk byl 2krát vyšší než u PBS kontrol.

Příklad 2

Hodnocení toxicity OGP(10-14)

Jak bylo uvedeno výše, bylo zjištěno, že OGP(10-14) zlepšuje naroubování transplantátů kostní dřeně. Před detailní analýzou farmakologické aktivity uvedeného peptidu se studie nejprve zaměřily na možnou toxicitu uvedeného peptidu.

U 55 myší se 15 dní po subkutánním podání v dávce 10 nmol/myš hodnotila možná toxicita související s OGP(1014) a výsledky se porovnaly s výsledky získanými od 30 placebem ošetřených kontrolních zvířat. Pokud jde o přežití, chování, nárůst tělesné hmotnosti a růst, nebyly pozorovány žádné rozdíly. Pokud jde o hematologické parametry, podání uvedených dávek peptidu nevyvolalo žádné významnější modifikace počtu bílých krvinek (WBC), červených krvinek (RBC), krevních destiček (PLT) nebo hladiny hemoglobinu (Hb).

Příklad 3

ΦΦ φφ • · · φ • φ

Φ· φφ φφ · φ φ φ φ φ φ φ « φ φ · φ φφφ φ φ φφφφφ φφφφφ φ φ φφφφ φ φ φ φ φφ φ

OGP(10-Y4) Stimulace regenerace krvetvorby po chemoablaci kostní dřeně

Materiály a metody

V této skupině experimentů se ablace kostní dřeně indukovala intraperitoneální injekcí cyklofofamidu (CFA, SIGMA, 5 mg/myš ve 150 1 (sterilního PBS) po dobu dvou po sobě jdoucích dnů (označených den 0 a den 1. Bylo prokázáno, že tento protokol indukuje závažnou, reverzibilní leukopoeza s L.D. <30 [Spangrude, G.J. et al, Science, 241:58 (1988)) . Šest dnů po první injekci injekce se zaznamenaly nej nižší počty kostní dřeně.

Za účelem hodnocení vlivu OGP(10-14) na WBC diferenciální počty buněk a stanovení volby dávky OGP(1014) , která má být použita při dalších experimentech, se myši ošetřovaly denně subkutánními injekcemi 0,1 ml OGP(1014)-prostého vehikula nebo vehikula obsahujícího různé dávky OGP(10-14) naznačené na obr. 2. Jedna skupina tvořící referenční základní kontrolní skupinu se nechala neošetřená a nepřijímala ani CFA ani sterilní vodné vehikulum s nebo bez OGP(10-14) (obr. 2). Krev se shromažďovala retroorbitálním odběrem ve dnech -12, -4, +3, +7, +14, +17, +21 a +24 (obr. 2C) . Určování diferenciálních počtů buněk se provádělo za použití čítače Coulter (Sysmex Microcell Counter F-800) .

Pro hodnocení účinku OGP(10-14) na dvojitě pozitivní CD34+/Sca-1+ buňky v krvi ve srovnání s vlivem G-CSF, se myši s CFA ablací ošetřovaly denně 10 nmol OGP(IO-14), a to ode dne -7 až do dne +7, au krevních vzorků získaných ve dnech +5, +7 a +15 se provedla průtoková cytometrie. Podání G-CSF se realizovalo ve dnech +2 až +8.

·* ·· ·«

• ·

• to to ·· • · · · · toto·· · • to ··· to to ·· ·· • · to · · ·<··· • to ··

V případě průtokové cytometrie se shromáždily skupiny tří krevních vzorků myší a jednojaderné buňky, které se získaly gradienční centrifugací, se resuspendovaly v PBS při koncentraci 1 x 106/ml. Buňky se následně inkubovaly v přítomnosti specifických monoklonálních protilátek (finální ředění 1:10) po 30 min při 4°C. Při detekci CD34+ buněk se jako první vrstva použila purifikovaná krysí anti-myší monoklonální protilátka (Pharmingen, RAM34). Po třech průplaších se buňky resuspendovaly v PBS a inkubovaly s FITC polyklonální kozí anti-krysí (Pharmingen). Při detekci Sca-1+/CD34+ buněk se vzorky dále třikrát propláchly v PBS a inkubovaly s krysí anti-myší Sca-1 (Ly.6A.2) PE od Caltag. Substituce primární protilátky irelevantním immunoglobulinem představovala specifickou kontrolu. K získání a analýze dat se použil průtokový cytometr FACScan(tm) (Becton Dickinson) a Lysis II software (obr. 3).

Při hodnocení různých dávkových režimů OGP(10-14), se myši s chemoablací podrobily denní léčbě OGP(10-14), jak naznačuje obr. 4. Myši se usmrtily v den +15, femorální kostní dřeň se vypláchla a jednobuněčné suspenze (připravené výše popsaným způsobem) se podrobily ex vivo testům progenitorových buněk (tvorba kolonií). Účinek OGP(10-14) na tvorbu CFU-GM, CFU-GEMM a BFU-E se porovnával s účinkem G-CSF (obr. 4).

Testy progenitorových buněk

V den +10 se po injekci CFA ve všech skupinách izolovaly buňky kostní dřeně. Buňky se naředily na 2 x 106/ml v Iscoveově modifikovaném Dulbeccoho médiu (IMFM) s 2% FBS a přidaly do prostředí methylcelulózy podle instrukcí výrobce |Hr—Od 7 8 ~0 4«· ·· ·« ·· ·· * • « · · · · · · > · · • · ···· ···· • » · · · ··· · · · ···· « · ·· · · · · ···· ···· ·· ·· ·· 9 (MethoCult, StemCell Technologies lne., Vancouver, Canada).

V každém testu se na plotnu umístilo 2 x 104 buněk. Použily se jak M3434 (pro myší GM-CFU, a GEMM-CFU) , tak M3334 (pro myší BFU-E test). M3434 se doplnil rekombinantním myším interleukinem-3 (rmIL-3, 10 ng/ml), rekombinantním lidským interleukinem-6 (rhIL-6, 10 ng/ml), rekombinantním faktorem myších kmenových buněk (rmSCF, 50 ng/ml) a rekombinantním lidským erythropoietinem (rhEpo, 3 U/ml). U M3434 byl obsaženým faktorem pouze Epo. Podle postupů uvedených v protokolu se pro každou myš naslepo provedly 14 dní po inkubaci duplikační testy.

Výsledky

Určení celkového a diferenciálního počtu WBC provedené v den +3 ukázalo významný pokles u všech CFA-ošetřených skupin (obr. 2). V den 7 došlo k regeneraci přibližně dvojnásobku celkového počtu WBC u vehikulem ošetřených vzorků s chemoablací, což je stále podstatně nižší hodnota než jaké byly zaznamenány u neošetřených referenčních myši. Na druhé straně OGP(10-14) zvířata vykazovala vyšší hodnoty při všech testovaných dávkách, přičemž maximální počty byly naměřeny u myši přijímajících 10 nmol OGP(10-14)/den. Počty v této skupině se velmi těsně blížily hodnotám zaznamenaným u neošetřené referenční skupiny (obr. 2A). Diferenciální sčítání buněk, které se provádělo v den 7, rovněž potvrdily OGP(10-14) indukované, dávkově dependentní zvýšení počtu monocytů a nezralých buněk (obr. 2B, 2C) . Počty monocytů při maximální dávce (10 nmol) byly 6krát vyšší než u normálních referenčních vzorků (obr. 2B); počty nezralých buněk byly rovněž výrazně vyšší než v případě referenčních vzorků (obr. 2C). Celkový počet WBC se dostal na normální pár51 úroveň u všech skupin v den 10 a v následujících dnech (obr. 2A). Nicméně počet monocytů vykazuje stejný vývoj již v den 7, přičemž normální hladiny je dosaženo v den 14 (obr. 2B) . Navzdory snížení počtu nezralých buněk u všech skupin, kromě 0,01 nmol skupiny, bylo nejvyšších hodnot dosaženo u 10 nmol skupiny. Počet nezralých buněk se dostal na normální úroveň u všech skupin v den 14 a v následujících dnech (Obr. 2C).

Množství dvojitě pozitivních CD34+/Sca-1+ buněk v den +5 byl u zvířat s chemoablací ošetřovaných denně 10 nmol OGP(10-14) 5krát vyšší než u myši ošetřovaných samotným vehikulem (obr. 3). Účinky OGP(10-14) byly podobné účinkům G-CSF. Měření průtokové cytometrie, která se prováděla v den +7 a +15, demonstrovala srovnatelné počty CD34+/Sca-1+ buněk. Nicméně v den +15 OGP(10-14) ošetřené myši vykazovaly výrazně vyšší počet než vehikulem a G-CSF ošetřené myši (Obr. 3).

Testy progenitorových buněk ukázaly, že OGP(10-14) významně stimuluje CFU-GEMM a BFU-E, ale nikoliv CFU-GM. Vliv OGP byl zjevný pouze v případě, kdy se léčba zahájila 7 dní před chemoablací (obr. 4). Absence OGP(10-14) účinku na CFU-GM je konzistentní s nevýznamným účinkem na počet granulocytů. G-CSF měl vliv pouze na CFU-GM (obr. 4).

Příklad 4

OGP 10-14 Záchrana celulárnosti krvetvorné kostní dřeně v ex-vivo vzorcích získaných od pacientů trpících idiopatickou myelofibrózou

í)l-0178--04-čěl • · • · • ·

Materiály a metody

Ve snaze stanovit účinnost OGP(10-14) u lidí se provedly ex vivo studie zaměřené na schopnost OGP(10-14) podporovat krvetvorbu u vzorků kostní dřeně získaných od pacientů trpících idiopatickou myelofibrózou (IMF).

Do studie se dobrovolně přihlásilo potom, co bylo informováno o obsahu studie, pět IMF pacientů, t j . jeden pacient trpící sklerodermií a dva pacienti s dalšími syndromy myelodisplazie (MDS). Ke stanovení diagnózy IMF se použily standardní klinické a hematologické metody [Barosi, G. , et al., Br. .J, Haematol. 704; 730-737; (1999)]. Biopsie kostní dřeně ukazující fibrózu byla podstatným znakem. Diagnóza IMF byla nakonec stanovena po vyloučení dalších možných příčin fibrózy a rovněž po vyloučení přítomnosti diferentních myeloproliferačních onemocnění. Zejména diagnóza chronické myelogenní leukémie byla vyloučena na základě vyloučení přítomnosti Ph chromozomu a bcr/abl přeuspořádání. Tři z pěti IMF pacientů byly před tím léčeni nízkými dávkami busulfanu, které se podávaly vždy 10 dnů v měsíci a 1 (g 1,25(OH)2D3/den. Údaje týkající se pacientů jsou shrnuty v tabulce 1.

• · • ·

• · • · ·

Tabulka 1: Klinická data IMF (A-E) a MDS (F-G) pacientů

Pacient	Věk (roky)	Datum diagnózy	ECO G	HB (g/di)	PLT (X10_8/l)	WBC (X108/l)	LDH LD (U/l)*	Slezina (cm) A it	Léčba
A	72	5/199 8	0	10,4	131	15,0	740	17	Ne- ošet- řené
B	82	9/199 8	2	8,5	434	11,2	830	20	Ne- ošet- řené
C	78	3/200 0,	2	8,2	68	1,3	664	20	Ne- ošet- řené
D	70	3/199 0	3	6, , 8	60	7,3	763	30	Ošetře- né
E	79	6/199 5	1	10,0	180	4,5	666	18	Ne- ošet- řené
F	65	4/199 7	0	14,0	24	12,0	408	30	Ošetře- né
G	65	2/200 0	2				632	11	Ne- ošet- řené
H	40	3/200 0	0	15	280	10	300	10	Ne- ošet- řené

*, normální hodnoty: 240 - 480 U/l,

Ekografické měření

Třímilimetrové vzorky kostní dřeně se získaly z jádra zadní horní kosti kyčelní pomocí jednorázové bioptické jehly číslo 8 opatřené úchytem pro zajištění minimální distorze vzorku (TraoSystem MDThech, USA). Vzorky se rozdělily na tři 1 cm dlouhé části. Jedna nahodile zvolená část se použila pro předběžné morfologické určení. Zbývající dva fragmenty se kultivovaly v 35mm miskách určených pro kultivace tkáňové kultury a zcela překryly by 1 ml Dexter napodobující médium v přítomnosti rhSCF (50 ng/ml), rhGM-CSF (10 ng/ml), rhIL-3 (10 ng/ml), a rhEpo ··· · · ····· (2 jednotky/ml) s nebo bez 10'⁸ M OGP (10-14) při 37 °C, 5% C0₂-vzduch. Polovina média se po 7 dnech najednou vyměnila bez změny složení všech složek s výjimkou obnovy počáteční koncentrace cytokinů a OGP(10-14). Po dalších 7 dnech v kultuře se vzorky kostní dřeně histologicky zpracovaly. Stručně řečeno, vzorky se fixovaly v modifikovaném B5, demineralizovaném v E.D.T.A kyselinovém pufru a řezy se barvily pomocí Giemsa, hematoxylin-eosinu nebo stříbrné impregnace retikula. Změny v kostní dřeni se testovaly semikvantitativně na stupnici I až IV. Hodnocení IV se použilo pro vzorky kostní dřeně, které mají významně vyšší počet buněk než normální vzorky; hodnocení III reprezentovalo sníženou celulárnost se sníženou jadernou hustotou; vzorky s hodnocení II lakuny; krvetvorné buňky u vzorků přítomny v extrémně malém množství a/nebo plocha kostní dřeně byla výraznou měrou nahrazena lakunárními zónami. Alespoň 3 stejně veliké histologické řezy na jeden vzorek se testovaly za použití celořezové plochy. Kromě toho se buněčná hustota automaticky hodnotila za použití počítače spolupracujícího s mikroskopem Leica a vybaveného softwarem Leica.QWin, jako poměr mezi počty buněk a plochou kostní dřeně. Výsledky pro každého pacienta se vyjádřily jako poměr střední buněčné hustoty u OGP(10-14) ošetřeného vzorku ku poměru střední buněčné hustoty u neošetřeného vzorku (T/C poměr).

vykazovaly rozšířené s hodnocením I byl

Výsledky

Po 14 dnech v kultuře se vzorky kostní dřeně ošetřené OGP(10-14) zdály být bohatší na krvetvorné buňky než OGP(10-14)-prosté vzorky odebrané od stejných pacientů (obr. 5, 6). Toto semikvantitativní hodnocení se výrazně zvýšilo u všech IMF pacientů (p < 0,05). Žádné rozdíly nebyly detekovány mezi OGP(10-14) ošetřenými a neošetřenými vzorky žádného z IMF pacientů. Ve všech IMF případech (p < 0,01) vykazovala celulárnost hodnocená za použití počítače T/C poměr 1, z čehož lze usuzovat na zvýšený počet buněk number v OGP(10-14)-ošetřených vzorcích. Kromě toho byl T/C poměr statisticky signifikantní v každém páru vzorků získaných od jednotlivých pacientů (tabulka 2). T/C Poměr vykazoval velmi vysokou a signifikantní inverzní korelaci s hladinou hemoglobinu u pacientů (obr. 7). Snížené hladiny hemoglobinu jsou nejdůležitějším serologickým indikátorem pro závažnost IMF. Z této korelace tedy jasně vyplývá, že účinek OGP(10-14) je nej vyšší u vážněji postižených pacientů.

*Tabulka 2: Počítačem zpracované hodnocení buněčné hustoty

Pacient	T/C Poměr	Hodnota
A	2,0	p<0,05
B	3,3	p<0,01
C	5,7	p<0,003
D	8,1	p<0,0002
E	1,8	p<0,025
F	1,2	p=NS
G	0,9	p=NS
H	1,1	p=NS

Poměr mezi erytroidními a myeloidními buňkami zůstal po kultivaci s OGP(10-14) zjevně nezměněn. Nicméně ze semikvantitativního hodnocení vyplynulo l,5násobné až lOnásobné snížení počtu megakaryocytů ve vzorcích získaných

017Ό -04 “β © « ·· ·· ·· ·© ·© ···· · ♦ · © © • · ···· ···· • · ·· · · · · · · ···· • · ·· ···· ···· ···· ·· ·· ·· · od IMF pacientů. Stejně jako v případě celkové krvetvorné celulárnosti, se tyto rozdíly neprojevily u vzorků získaných od pacientů netrpících idiopatickou myelofibrózou (IMF).

ΦΦ ΦΦ ΦΦ ΦΦ 1

Η—· : · : : :: : :

I φ φ φ Φ ΦΦΦ· Φ φ ' t~X- · · φφφφ

J 'Γ ·*♦· ···· ·* ·· ’

Τ6

Sekvenční protokol <110> YISSUM RESEARCH DEVELOPMENT COMPANY OF THE HEBREW <120> OGP-karboxy-terminální syntetické peptidy mající hematologickou aktivitu <130> 13361wo <140>

<141>

<160> 4 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Syntetická sekvence <220> .

<223> Popis syntetické sekvence: syntetická peptidová sekvence • * φφφφ <400> 1

Tyr Gly Phe Gly Gly 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Syntetická sekvence /θ8τ-θ±-7Ό-04 -O

Ψ=!

»· ·· ·· *· ···· · · · · • · · · · · • ο · € · ··· • · · · · ···· ···· ·» ·· ·· · • * · • · · · • ····» • · · ·· · <220> .

<223> Popis syntetické sekvence sekvence <400> 2

Tyr Gly Phe His Gly 1 5 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: sekvence syntetická peptidová syntetická peptidová <400> 3

Gly Phe Gly Gly 1 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: syntetická peptidová sekvence <400> 4

Met Tyr Gly Phe Gly Gly 1 5 jU-O-3/18-- (14.--.0 ~Erf » · ·

9 99 9 99999 · · « • · 9 · · · · ········ · 9 9 9 9 9 •Co, ^vt1-&

Claims (26)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití oligonukleotidu majícího molekulovou hmotnost 200 až 1000 a obsahujícího aminokyselinovou sekvenci kteréhokoliv z peptidů zvolených z množiny sestávající z Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly, Tyr-Gly-Phe-His-Gly, Gly-Phe-Gly-Gly a Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly uvedených jako SEQ ID NO: 1, 2, 3 a 4, při přípravě farmaceutické kompozice pro zlepšení mobilizace multiliniových krvetvorných kmenových buněk do periferní krve.
2. 2. Použití oligonukleotidu majícího molekulovou hmotnost 200 až 1000 a obsahujícího aminokyselinovou sekvenci kteréhokoliv z peptidů zvolených z množiny sestávajíc! z Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly, Tyr-Gly-Phe-His-Gly, Gly-Phe-Gly-Gly a Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly uvedených jako SEQ ID NO: 1, 2, 3 a 4, při přípravě farmaceutické kompozice pro zlepšení mobilizace multiliniových ranných CD34 pozitivních krvetvorných kmenových buněk do periferní krve.
3. 3. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 a 2, kde vede zlepšení mobilizace do periferní krve k zvýšení počtu cirkulujících multiliniových raných CD34 pozitivních krvetvorných kmenových buněk.

   5-8
4. 4. Použití oligonukleotidu majícího molekulovou hmotnost 200 až 1000 a obsahujícího aminokyselinovou sekvenci kteréhokoliv z peptidů zvolených z množiny sestávající z Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly, Tyr-Gly-Phe-His-Gly, Gly-Phe-Gly-Gly a Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly, označených jako SEQ ID NO: 1, 2, 3 a 4, při přípravě transplantátu periferních krevních kmenových buněk pro léčbu subjektu, který tuto léčbu potřebuje.
5. 5. Použití podle nároku 4, kde oligopeptid zlepšuje mobilizaci multiliniových krvetvorných kmenových buněk do periferní krve.
6. 6. Použití podle nároku 5, kde jsou krvetvornými kmenovými buňkami CD34 pozitivní buňky.
7. 7. Použití podle kteréhokoliv z nároků 2, 3 a 4, kde jsou cirkulujícími multiliniovými kmenovými buňkami dvojitě pozitivní CD34/Flk2 buňky.
8. 8. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, kde je oligopeptidem pentapeptid mající vzorec: Tyr-Gly-Phe-GlyGly, označený jako aminokyselinová sekvence SEQ ID NO: 1.
9. 9. Použití podle nároků 1 až 4, kde je oligopeptidem pentapeptid mající vzorec: Tyr-Gly-Phe-His-Gly, označený jako aminokyselinová sekvence SEQ ID NO:2.

   &í-oi78-e4-š • ·
10. 10. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, kde je oligopeptidem hexapeptid mající vzorec: Ac-Met-Tyr-Gly-PheGly-Gly, označený jako aminokyselinová sekvence SEQ ID NO: 4 .
11. 11. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, kde je oligopeptidem tetrapeptid mající vzorec: Gly-Phe-Gly-Gly, označený jako aminokyselinová sekvence SEQ ID NO: 3 .
12. 12. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro přípravu farmaceutické kompozice pro zlepšení regenerace nezralých buněk a monocytů.
13. 13. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 pro přípravu farmaceutické kompozice pro selektivní zvýšení kterékoliv z BFU-E a GEMM kolonie tvořících jednotek (CFU).
14. 14. Použití oligopeptidu majícího aminokyselinovou sekvenci Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly, Tyr-Gly-Phe-His-Gly, Gly-PheGly-Gly nebo Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly, označenou jako SEQ ID NO: 1, 2, 3 a 4, pro přípravu farmaceutické kompozice pro zlepšení selektivní proliferace CD34 pozitivních krvetvorných kmenových buněk u subjektu, který to potřebuje.
15. 15. Použití podle nároku 14, kde jsou CD34 pozitivními buňkami dvojitě pozitivní CD34/Flk2 buňky.

    bd—O47A8—θ-4-
16. 16. Použití oligopeptidu majícího aminokyselinovou sekvenci Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly, Tyr-Gly-Phe-His-Gly, Gly-PheGly-Gly nebo Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly, označenou jako SEQ ID NO: 1, 2, 3 a 4, pro přípravu farmaceutické kompozice pro léčbu subjektů trpících myeloproliferační poruchou.
17. 17. Použití podle nároku 16, kde je myeloproliferační poruchou idiopatická myelofibróza (IMF).
18. 18. Použití podle kteréhokoliv z nároků 16 a 17, kde farmaceutická kompozice zvyšuje celkovou celulárnosti kostní dřeně u subjektu trpícího IMF.
19. 19. Použití oligopeptidu majícího aminokyselinovou sekvenci Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly, Tyr-Gly-Phe-His-Gly, Gly-PheGly-Gly nebo Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly, označenou jako SEQ ID NO: 1, 2, 3 a 4, pro in vitro a/nebo ex vivo selektivní zachování a/nebo rozšíření populace CD34 pozitivních kmenových buněk v krevním vzorku.
20. 20. Použití podle nároku 19, kde je krevním vzorkem krevní vzorek savce.
21. 21. Použití podle nároku 20, kde je krevním vzorkem krevní vzorek člověka.

    »··· ···«

    999 • · * 9 ····
22. 22. Použití podle nároku 20, kde krevní vzorek pochází od savce trpícího sníženým počtem krvinek, savce se zvýšeným rizikem snižování počtu krvinek.
23. 23. Použití podle nároku 22, kde je snížený počet krvinek způsoben chemoterapii, ozařováním nebo transplantací kostní dřeně.
24. 24. Použití podle nároku 23, kde kompozice dále obsahuje alespoň jeden cytokin.
25. 25. Použití podle nároku 24, kde je cytokin zvolen z množiny sestávající z TPO (trombopoietin), EPO (erytropoietin), M-CSF (makrofágové kolonie stimulující faktor), GM-CSF (granulocyt-makrofág-CSF), G-CSF (granulocyt CSF) , IL-1 (interleukinu-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, LIF (inhibiční faktor leukémie) a KL (Kit ligand).
26. 26. Způsob zvýšení mobilizace multiliniových krvetvorných kmenových buněk do periferní krve, vyznačující se tím, že zahrnuje podání účinného množství oligopeptidu majícího aminokyselinovou sekvenci Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly, Tyr-Gly-Phe-His-Gly, Gly-Phe-Gly-Gly nebo Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly, označené jako SEQ ID NO: 1, 2, 3 a 4, nebo farmaceutické kompozice obsahující toto účinné množství uvedeného oligopeptidu subjektu, který to potřebuje.

    ^.-OITB-Oě-G