CZ2003784A3 - Zlepšené podmíněně se replikující vektory, způsoby jejich produkce a jejich použití - Google Patents

Description

Předkládaný vynález poskytuje zlepšené, podmíněně se replikující vektory, způsoby jejich výroby, množení a selektivního obalování, modifikování a použití podmíněně se replikujících vektorů a lentivirových vektorů. Je významné, že tyto vektory mají zmenšenou schopnost se stávat replikačně kompetentními a vyznačují se tedy zvýšenou bezpečností při použití.

Také jsou poskytnuty určité nukleotidové a aminokyselinové sekvence, důležité pro tyto vektory, farmaceutické prostředky a hostitelské buňky, obsahující tyto vektory, použití těchto hostitelských buněk pro skrínink léčiv a způsoby použití těchto vektorů pro zjišťování genové funkce. Tyto způsoby rovněž zahrnují profylaktickou a terapeutickou léčbu chorob, obzvláště virových infekcí a hlavně HIV infekcí. Tento vynález je také směrován na přímé i nepřímé způsoby tvorby nových očkovacích látek pro léčbu infekčních chorob, rakoviny a jiných chorob s genetickou podstatou a pro diagnostické účely. Jiné způsoby a prostředky podle tohoto vynálezu obsahují použití podmíněně se replikujících vektorů a lentivirových vektorů v genové terapii a v jiných aplikacích.

Dosavadní stav techniky

Objev viru lidské imunodeficience (HIV), lentiviru, jako příčiny získaného syndromu imunitní deficience (acquired immune deficiency syndrom (AIDS)) obrátil pozornost výzkumu na mechanizmy, tvořící základ virového infekčního cyklu a patogeneze virů. Studie těchto mechanizmů byly poskytovány výzkumníky se stále rostoucím počtem cílů pro vývoj antivirových činidel, účinných nejenom proti HIV, ale rovněž také proti produktům HIV, jeho genomu a také proti jiným virům. Tato antivirová činidla, hlavně ta, která byla namířena proti HIV, mohou být rozdělena do čtyř kategorií, v závislosti na jejich způsobu účinku. Tyto kategorie zahrnují inhibitory reverzních transkriptáz, kompetitory vstupu virů do buněk, očkovací látky a inhibitory proteáz, rovněž jako modernější kategorie, označované zde jako „genetická antivirová činidla“.

Každý typ antivirového činidla obecně má své vlastní, s ním spojené, příznivé vlastnosti i omezení a musí být posuzován z požadavků v určité léčebné situaci. Antivirová činidla, jako je zidovudin (3'-azido-3'-deoxythymidin, známý také jako AZT), proteázové inhibitory a jim • · · ·

podobné, mohou být dodány do buněk pacientova těla poměrně snadno a byly rozsáhle studovány. Cílení najeden specifický faktor ve virovém infekčním cyklu bylo proti HIV shledáno jako relativně neúčinné. Primární příčinou toho je, že kmeny HIV se rychle mění a stávají se rezistentními proti činidlům, která mají jenom jedno místo účinku (Richman, AIDS Res. and Hum. Retrovir., 8,1065 až 1071 (1992)). V souhlase s tím si problémy genetické variability a rychlé mutace HIV genomu vynutily vzetí do úvahy nových antivirových strategií pro léčbu HIV infekcí. Mezi těmito možnostmi jsou atraktivní antivirová činidla, protože působí na mnoha různých úrovních intracelulámě.

Genetická antivirová činidla se liší od jiných terapeutických činidel v tom, že jsou přenášena jako molekulární elementy do cílových buněk, kde ochraňují tuto buňky před virovou infekcí (Baltimore, Nátuře, 325, 395 až 396 (1988) a Dropulič et al., Hum. Gene Ther., 5, 927 až 939 (1994)). Genetická antivirová činidla mohou mít libovolnou genetickou sekvenci a zahrnovat, ale bez omezení na ně, antisense molekuly, RNA poutače, transdominantní mutanty, interferony, toxiny, imunogeny a ribozymy. Zejména ribozymy jsou genetická antivirová činidla typu antisense, která štěpí cílové RNA, včetně HIV RNA, sekvenčně specifickým způsobem. Specifita ribozymem podmíněného štěpení cílové RNA naznačuje možné použití riobozymů jako terapeutických inhibitorů virové replikace, včetně replikace HIV. V anti-HIV strategiích mohou být použity různé typy ribozymů, jako jsou „hammerhead“ a „hairpin“ (viz, např. US patenty č. 5 144 019; 5 180 818 a 5 272 262 a PCT patentové přihlášky č. WO 94/01 549 a WO 93/23 569). Ribozymy „hammerhead“ i „hairpin“ mohou být upraveny tak, aby štěpily libovolnou cílovou RNA, která obsahuje sekvenci GUC (Haseloff et al., Nátuře, 334, 585 až 291 (1988); Uhlenbeck, Nátuře, 334, 585 (1987); Hampel et al., Nuc. Acids Res., 18,299 až 304 (1990) a Symons, Ann. Rev. Biochem., 61, 341 až 371 (1992)). Obecně řečeno, ribozymy typu „hammerhead“ mají dva typy funkčních domén, konzervovanou katalytickou doménu, obklopenou dvěma hybridizačními doménami. Tyto hybridizační domény se váží na sekvence, které obklopují GUC sekvenci a katalytická doména štěpí cílovou RNA od 3' konce GUC sekvence (Uhlenbeck (1987), výše; Haseloff et al., (1988), výše a Symons (1992) výše).

Četné studie potvrdily, že ribozymy mohou být alespoň částečně účinné při inhibici propagace HIV v buňkách tkáňových kultur (viz, Sarver et al., Science, 247,1222 až 1225 /1990); Sarver et al., NIH Res., 5,63 až 67 (1993a); Dropulič et al., J. Virol., 66,1432 až 1441 (1992); Dropulič et al., Methods: Comp. Meth. Enzymol., 5,43 až 49 (1993); Ojwang et al., PNAS, 889, 10 802 až 10 806 (1992); Yu et al., PNAS, 90, 6340 až 6344 (1993) a Weerasinghe et al., J. Virol., 68, 5531 až 5534 (1991)). Sarver et al., ((1990) výše), zejména dokázal, že ribozymy „hammerhead“ sestrojené pro štěpení v rámci přepsané oblasti HIV gag genu, tj., • · · ·

anti-gag ribozymy, mohou specificky štěpit HIV gag RNA in vitro. Kromě toho, jsou-li buněčné linie, exprimuj ící anti-gag ribozymy, uvedeny do kontaktu s HIV 1, byla pozorována 50 až lOOnásobná inhibice replikace HIV. Obdobně zjistili Weerasingh et al. ((1995) výše), že retrovirové vektory, kódující ribozymy, upravené pro štěpení v rámci sekvence U5 HIV 1 RNA, odpovídají za HIV rezistenci vůči transdukováným buňkám při jejich následném kontaktu s HIV. I když různé klony transdukovaných buněk demonstrují různé hladiny rezistence vůči napadení, jak bylo zjištěno promotorovým systémem, použitým pro regulaci exprese ribozymů, většina buněčných linií, vylučujících ribozymy, podlehla po určitém omezeném čase v kultuře HIV expresi.

Při transdukci buněk tkáňových kultur s provirem do nef genu (který je esenciální pro virovou replikaci v tkáňových kulturách), do kterých byl transduko ván ribozym, a jejichž hybridizační domény byly specifické pro U5 oblast HIV, se ukázalo, že inhibují replikaci virů v transdukovaných buňkách lOOnásobně ve srovnání s buňkami transdukovanými divokým typem proviru (viz, např. Dropulič et al. (1992) a (1993), výše). U ribozymů typu „hairpin“ bylo podobně zjištěno, že inhibuje replikaci HIV v T- buňkách, transdukovaných vektory, které obsahují U5 „hairpin“ ribozymy a napadených HIV (Ojwang et al. (1992, výše). Jiné studie ukázaly, že vektory obsahující ribozymy, exprimované tRNA promotory, také inhibují různé HIV kmeny (Yu et al. (1993) výše).

Přenos ribozymů nebo jiných genetických činidel do buněčných cílů HIV infekce (např. CD4+ T- buněk a monocytických makrofágů) byl hlavní překážkou pro účinnou genetickou terapeutickou léčbu AIDS. Současné přístupy k cílení buněk hematopoetického systému (tj. primárních cílů infekce HIV) volají po zavedení terapeutických genů do prekurzorových multipotentních kmenových buněk, které po diferenciaci dozrávají do T-buněk nebo případně do samotných zralých CD4+ T-buněk. Cílení kmenových buněk je však problematické, protože tyto buňky se obtížně kultivují a transdukují in vitro. Cílení obíhajících T lymfocytů je také problematické, protože tyto buňky jsou tak široce rozesety, zeje obtížné zasáhnout všechny cílové buňky použitím vektorových přenosových systémů. Kromě toho je třeba za buněčné cíle považovat i makrofágy, protože jsou hlavním zásobníkem pro rozšíření viru do jiných orgánů. Protože makrofágy však již mají ukončenou diferenciaci a tudíž již nepodléhají buněčnému dělení, nejsou snadno transduko vány obvykle používanými vektory.

V souhlase s tím v současné době převládající přístup k léčbě HIV používá replikačně deficitní virové vektory a obalové (tj. „helper“) buněčné linie (viz, např. Buchschacher, JAM A, 269 (22), 2880 až 2886 (1993); Anderson, Science, 256, 808 až 813 (1992); Miller, Nátuře, 357, 455 až 460 (1992); Mulligan, Science, 260, 926 až 931 (1993); Friedmann, Science, 244,1275 • ·· · • ·· · až 1281 (1989) a Coumoyer et al., Ann. Rev. Immunol., 11,297 až 329 (1993)) pro zavedení takových cizích genů do buněk náchylných na virovou infekci (jako je HIV infekce), které specificky interferují s replikací virů nebo, které způsobují úhyn infikované buňky (souborný článek Buchschacher (1993), výše). Takové replikačně deficitní virové vektory obsahují kromě zájmového cizího genu i cis účinkující sekvenci, nezbytnou pro virovou replikaci, ale nikoliv sekvence, které kódují esenciální virové proteiny. V důsledku toho je takový vektor neschopný dokončit virový replikační cyklus a helperová buněčná linie, která obsahuje a konstitutivně exprimuje virové geny ve svém genomu, je používána pro jeho propagaci. Po introdukci replikačně defektního virového vektoru do helperové buněčné linie jsou proteiny, nezbytné pro tvorbu virových částic, poskytovány vektoru in trans a jsou produkovány vektorové virové částice, schopné infikovat cílové buňky a exprimovat v nich gen, který interferuje s replikací viru nebo způsobuje úhyn buněk infikovaných virem.

Takové replikačně deficientní retro virové vektory zahrnují adenoviry a adenoasociované viry, rovněž jako ty virové vektory, které se používají v klinických pokusech s léčbou HIV a hlavně myší amfotropní retrovirový vektor, známý jako Moloneyho virus myší leukemie (MuLV). Tyto defektní virové vektory se používají pro transdukci CD4+ buněk s genetickými antivirovými činidly, jako je anti-HIV ríbozym, s různými stupni úspěchu (Sarver et al. (1990), výše); Weerasinghe et al. (1991), výše; Dropulié et al. (1993), výše; Ojwang et al. (1992), výše a Yu et al. (1993) výše). Tyto vektory jsou však pro použití v genové terapii HIV značně omezeny. Například vysoká frekvence transdukce je obzvláště důležitá v léčbě HIV, kde by tento vektor měl transdukovat buď vzácné CD34+ předchůdce hematopoetických kmenových buněk nebo široce rozšířené cílové CD4+ T-buňky, z nichž je většina již infikována HIV v průběhu klinického „latentního“ stadia nemoci. MuLV vektory je však obtížné získat ve vyšším titru, což je tudíž příčinou nepatrné transdukce. Kromě toho nebyla u předchůdců CD34+ kmenových buněk, hlavně po diferenciaci na zralé lymfocyty, získána dlouhodobá exprese transdukované DNA. Kromě toho použití defektních virových vektorů vyžaduje ex vivo strategie přenosu genů (viz např. US patent č. 5 399 346), které mohou být drahé a nad možnosti běžné populace.

Tyto nedostatky, spojené s použitím běžně dostupných vektorů pro genetickou terapeutickou léčbu AIDS, vedly výzkumníky k nalézání nových virových vektorů. Jedním takovým vektorem je sám HIV. HIV vektory byly použity pro infekční studie (Page et al., J. Virol., 64, 5270 až 5276 (1990)) a pro zavedení genů (tak jako sebevražedných genů) do CD4+ buněk, hlavně do CD4+ HlV-infikováných buněk (viz např. Buchschacher et al., Hum. Gener. Ther., 3, 391 až 397 (1992); Richardson et al., J. Virol., 67,3997 až 4005 (1993); Carroll et al., • ·

J. Virol., 68, 6047 až 6051 (1994) a Parolin et al., J. Virol., 68, 3888 až 3895 (1994). Strategií těchto studií je použít HIV vektory pro zavedení genů do CD4+ T-buněk a monocytických buněk.

V současné době jsou tyto vektory extrémně složité. Kromě toho je použití těchto vektorů spojeno s rizikem vzniku divokých typů HIV cestou intracelulární rekombinace. Jako důsledek kotransfekce/koinfekce defektních vektorových sekvencí a helperového viru byla pozorována rekombinace mezi homologními oblastmi virového genomu (Inoue et al., PNAS,

88,2278 až 282 (1991)). Pozorovaná komplementace in vitro naznačuje, že podobný replikačně defektní HIV vektor by se mohl rekombinovat in vivo, čímž by došlo ke zhoršení již existující HIV infekce. Skutečnost, že retro viry obalují dva RNA genomy do jednoho virionu, vedla výzkumníky k názoru, že retro viry nesou dvě virové RNA, aby překonaly jakékoliv genetické defekty, způsobené komplementací a/nebo rekombinací (Inoue et al. (1991), výše).

Kromě rizika intracelulární rekombinace, vyúsťujícího do vzniku divokých typů HIV, nesou HIV vektory i obsažené riziko mutace in vivo, což zvyšuje patogenicitu tohoto virového vektoru. To vedlo Sarvera et al. (AIDS Res. and Hum. Retrovir., 9,483 až 487 (1993b)) ke spekulaci, týkající se vývoje druhé generace rekombinantních HIV vektorů, které jsou replikačně kompetentní, ale již nepatogenní. Takové vektory, ve srovnání s převládajícími používanými nereplikujícími se vektory (tj., replikačně defektními vektory) pokračují v replikaci v pacientovi a podstupují tedy konstantní kompetici s divokým typem HIV. Až posud však takové vektory nejsou k dispozici.

V ideálním případě by nej lepší možnost léčby infikovaného jedince nastala v okamžiku inokulace, ještě dříve než virus infikuje hostitele. To je však obtížně uskutečnitelné, protože mnozí jedinci si neuvědomí, že byli infikováni HIV, do klinicky latentní fáze choroby. Na tomto základě je stadiem, ve kterém je nejpalčivější potřeba antivirového zásahu, průběh klinické latence. Terapie v tomto stadiu vyžaduje, aby bylo čeleno napadení představovanému velkým počtem již infikovaných CD4+ lymfocytů, které obsahují virové genomy. To není jednoduchý úkol, jak je zřejmé ze skutečnosti, že do dnešní doby zůstává HIV neléčitelným a je současně dostupnými terapiemi je pouze částečně léčitelný. Účinná očkovací látka se neblíží a i když bylo prokázáno, že inhibitory reverzních transkriptáz a proteáz zabraňují replikaci HIV v tkáňových kulturách, rozvoj virové rezistence in vivo vedl k neúspěchu této léčby. HIV genová terapie je zatím jenom málo prospěšná pro ohromné množství jedinců, infikovaných HIV, kterých je ku dnešnímu dni přes 30 milionů.

Ve světle shora řečeného je stále více důležité vyvinout dlouhodobé a trvalé imunologické odpovědi vůči určitým patogenům, zvláště virům, zejména například v souvislosti

99

99 9

s AIDS a rakovinou. Jsou brány do úvahy živé oslabené (live-attenuated, LA) očkovací látky, používající replikačně kompetentní, ale nepatogenní viry (Daniel et al., Science, 258, 1938 až 1941 (1992) a Desrosiers, AIDS Res. & Human Retrovir., 10, 331 až 332 (1994)). Avšak takovéto nepatogenní viry, které se liší od odpovídajících divokých typů virů delecí v jednom nebo nebo více genech, buď (i) nemohou vyvolávat ochrannou imunitní odpověď, protože tento antigen není vytrvalý (protože LA virus se účinně nereplikuje) nebo (ii) se LA virus replikuje, ale má jiný patogenní potenciál, jak dosvědčuje schopností tohoto LA viru způsobovat chorobu na modelech živočišných mláďat (Baba et al., Science, 267, 1823 až 1825 (1995)).

Ze shora uvedených důvodů zde stále existuje potřeba alternativních profylaktických a terapeutických léčebných ošetření virové infekce, hlavně v souvislosti s AIDS a rakovinou. Předkládaný vynález nabízí takové alternativní způsoby poskytnutím podmíněně se replikujícího vektoru. Tento vynález také poskytuje navíc způsoby, kterými může být tento vektor využit. Dále jsou tímto vynálezem poskytnuty helperové vektorové konstrukty, které doplňují podmíněně se replikující vektor tím, že zaručují jeho replikaci a obalem jako virových částic a virionů. Jsou popsána různá provedení takových helperových vektorových konstruktů. Tyto a další předměty a výhody předkládaného vynálezu, rovněž jako další znaky vynálezu, budou zřejmé z dále uvedeného popisu vynálezu.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje zlepšené, podmíněně se replikující vektory, stejně jako zlepšené prostředky a způsoby pro výrobu a použití uvedených vektorů. Podmíněně se replikující vektor je charakterizován schopností se replikovat pouze v hostitelské buňce, která připustí replikaci tohoto vektoru. Tyto zlepšené vektory takto poskytují zvýšenou bezpečnost snížením rizika znovuzískání způsobilosti se dělit. Jako takové mohou být tyto vektory také označovány jako „redukovaně rekombinaění“ vektory.

V jednom aspektu vynálezu zahrnuje zlepšený, podmíněně se replikující vektor nejméně jednu sekvenci nukleové kyseliny, jejíž přítomnost a transkripce nebo translace dodávají tomuto vektoru v replikaci umožňující hostitelské buňce selektivní výhodu vzhledem k divokému typu kmene viru, odpovídajícímu viru, z něhož byl tento vektor odvozen. Tento zlepšený, podmíněně se replikující vektor výhodně obsahuje nejméně jednu sekvenci nukleové kyseliny, která dodává tomuto vektoru selektivní výhodu při replikaci vzhledem k jakýmkoliv jiným soutěžícím genomům nebo genomovým prvkům. Zde zmiňovaný genomový prvek je definován jako sekvence nukleové kyseliny v hostitelské buňce, která není odvozena ani od tohoto vektoru, ani • · · · ·· ··· · od libovolného divokého typu viru, a která může soutěžit, interferovat nebo ovlivňovat replikaci vektoru v hostitelské buňce. Tento genomový prvek také není úplným genomem, jako je genom hostitelské buňky nebo jiný virus nebo vektor. Selektivní výhoda při replikaci je dodávána přítomností, transkripcí nebo translací uvedené sekvence nukleové kyseliny.

V jiném výhodném provedení je podmíněně se replikujícím vektorem retro virus, zvláště lentivirus a obsahuje nejméně jednu sekvenci nukleové kyseliny, jejíž přítomnost, transkripce nebo translace dodávají hostitelské buňce, která je infikována tímto vektorem, selektivní výhodu před buňkou, infikovanou divokým typem kmene viru, odpovídajícím tomu viru, ze kterého byl tento vektor odvozen. Alternativně není tento vektor zcela odvozen od divokého typu kmene, ale je chimemí, obsahující komponenty odvozené od více než jednoho divokého typu viru. Tímto více než jedním divokým typem viru mohou být různé (nebo heterologní) viry nebo jiné kmeny nebo izoláty jednoho viru. Je výhodné, když může být uvedená sekvence nukleové kyseliny exprimována, čímž je dosaženo v hostitelské buňce profylaktického účinku. Tyto výsledky jsou pro buňku přetrvávající výhodou, protože tato sekvence nukleové kyseliny zabraňuje jakémukoliv infekčnímu viru v replikaci na úrovni, která působí smrt této buňky.

Jiným výhodným provedením tohoto vynálezu je zlepšený, podmíněně se replikující plazmidový vektor, obsahující nejméně jednu sekvenci nukleové kyseliny, která dodává tomuto vektoru selektivní výhodu v replikaci vůči kterémukoliv jinému soutěžícímu vektoru nebo plazmidové molekule. Například může takový vektor obsahovat sekvenci (například ribozymovou nebo antisense sekvenci), schopnou štěpení nebo odbourávání nebo mající za výsledek rozštěpení nebo destrukci, vedoucí ke štěpení soutěžícího vektoru nebo plazmidu, jsouli umístěny ve vektoru. Pokud je třeba rozložit soutěžící vektor i helper, potom je vektor podle vynálezu sestaven tak, aby obsahoval jiné sekvence, které mu dodávají celkovou selektivní výhodu pro replikaci. Vektor podle vynálezu může například obsahovat atisense sekvenci, která rozrušuje soutěžící vektor i helper, nicméně by tento vektor měl selektivní výhodu pro replikaci, protože kromě toho obsahuje druhou sekvenci prvního nukleotidu (např. promotor, který produkuje více vektorové RNA než RNA soutěžícího vektoru, počet kopií tohoto vektoru v transdukované buňce je vyšší než v soutěžícím genomu, nebo signál k zabalení, který je přítomen ve vektoru, ale ne v helperu), která poskytuje podmíněně se replikující vektor s celkovou selektivní výhodou. Nejméně tato první nukleotidová sekvence tedy dále poskytuje v tomto provedení komplexní selektivní výhodu replikace vektoru podle vynálezu, protože dvě první nukleotidové sekvence (tj. první sekvence s prvním nukleotidem zaciluje soutěžící vektor a/nebo helper a druhá sekvence s prvním nukleotidem poskytuje selektivní výhodu pro replikaci) účinkují ve shodě pro dosažení komplexního účinku selektivní výhody. Synergické ·· ··· · «· 9999

9 9 9 9 9 9

9 9 999 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

99 999 99 99 účinky více sekvencí s prvním nukleotidem mohou tedy vést k prohloubení selekčních podmínek pro podmíněně se replikující vektor, kdy libovolná jednotlivá sekvence s prvním nukleotidem umožňuje rozlišující výběr proti soutěžícímu genomu.

Štěpení nebo rozrušení soutěžícího vektoru nebo plazmidu také zmenšuje u vektoru možnost rekombinace celé délky, takže tento vektor potom má „sníženou rekombinanční“ schopnost. Vektor může být před štěpením chráněn degenerací sekvence, aby nemohla být zacílena ribozymovou nebo natisense sekvencí. Vektor může být dále chráněn před štěpením genetickou úpravou nebo genomovou verzí tohoto vektoru, způsobující, že RNA je jinak uspořádána, takže RNA genomového vektoru není významně štěpena soutěžícím vektorem nebo helperem. Alternativně může helper být podobně a jedinečně geneticky upraven, například vložením prvků sestřihu pro vpravení helperu do komplexu sestřihu, při konstruování vektorové genomové RNA, aby obsahovala první sekvence nukleové kyseliny, které jsou přítomny pouze v nesestřižené a nikoliv v sestřižené vektorové RNA. Tyto neomezující příklady zlepšených vektorů jsou zvlášť výhodné, když jsou použity při produkci virového vektoru nebo plazmidového vektoru a při klonování nebo subklonování sekvencí nukleové kyseliny v těchto vektorech, rovněž jako při jejich použití při mutagenezi, expresi indukovatelných genů a podobně.

Předkládaným vynálezem je rovněž poskytován farmaceutický prostředek, obsahující podmíněně se replikující vektor podle vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič. Kromě toho je poskytnuta hostitelská buňka, obsahující podmíněně se replikující virový vektor. Je zahrnut rovněž vektor, kterýžto vektor, pokud je DNA, obsahuje nukleotidovou sekvenci, vybranou ze skupiny skládající se z SEQ ID NOS: 2, 3,4,5,6,14, ve kterých je nejméně jeden N mutován, 15 a 16, a kde uvedený vektor, pokud je RNA, obsahuje nukleotidovou sekvenci, kódovanou nukleotidovou sekvencí, vybranou ze skupiny, skládající se z SEQ ID NOS: 2, 3,4, 5, 6, 14, ve kterých je nejméně jeden N mutován, a 15 a 16, a dále zde popsané izolované a purifikované molekuly nukleových kyselin. Podobně jsou poskytnuty způsoby genetických úprav vektoru ribozymem, způsob modifikace vektoru a způsob propagace a selektivního obalování podmíněně se replikujícího vektoru bez použití obalovací buněčné linie.

V ještě dalším aspektu tohoto vynálezu je poskytnut způsob terapeutické a profylaktické léčby hostitelské buňky z virové infekce. Ve zvlášť výhodných provedeních je tato léčba ovlivňována v uvedeném hostiteli buňce jemu dodávaným dominantním fenotypem, který inhibuje virovou infekci, nebo dodáním fenotypu, který inhibuje infekci jinými viry. Je výhodné, když tyto jiné inhibované viry zahrnují široké spektrum virových kmenů. Tyto způsoby mohou kromě toho zahrnovat použití pomocného „helperového“ expresního vektoru, φφφφ φφ φφφφ φφ φφφφ • Φ φφφ* φφ φ φ φ φ φ φφφ φφφ φ φφφφ φφφφ φ φφφ φφ φφ φφφ φφ φφ který je podle potřeby také nazýván jako „helperový vektor“ nebo „konstrukt helperového vektoru“, cytotoxického léčiva, proteinů/faktorů nebo inhibitoru proteázy/reverzní transkriptázy. Způsob může být například použit pro inhibici replikace viru, pro léčbu chorob (včetně rakoviny, genetických, infekčních, vaskulámích a jiných chorob), pro provádění účinných přenosů genu ex vivo i in vivo, pro zajištění bezpečné produkce vektoru, pro stanovení funkce genu nebo pro expresi zájmového genu v hostitelské buňce.

V ještě jiném aspektu tohoto vynálezu je poskytnut způsob použití hostitelské buňky, obsahující podmíněně se replikující vektor podle vynálezu, pro detekci interakce mezi léčivem/faktorem a proteinem. Tento způsob umožňuje charakterizaci proteinu a skrínink léčiv, faktorů nebo jiných proteinů na aktivitu nebo fyzikální interakce s ohledem na daný protein, kódovaný tímto vektorem. Tento způsob dále umožňuje identifikaci a charakterizaci proteinů, které jsou funkčně spojeny s daným proteinem, kódovaným tímto vektorem. Pokud je například tímto kódovaným proteinem transkripční faktor, jeho exprese vektorem podle vynálezu umožňuje identifikaci genů, regulovaných tímto transkripčním faktorem.

Tento vynález také poskytuje prostředky a podmínky pro skladování vektorů před jejich použitím za různých podmínek. Příklady takového skladování zahrnují skladování při -80 °C, -20 °C a 4 °C v přítomnosti různých nosičů.

Další provedení vynálezu zahrnují generické lentivirové vektory, modifikace helperových vektorových konstruktů, kterém slouží pro zmenšení, minimalizování nebo eliminování rekombinace pomocného vektoru s podmíněně se replikujícím vektorem, za vzniku replikačně kompetentního vektoru nebo viru (RCV). Proto tento vynález zahrnuje také helperové vektory, které slouží pro přípravu vektorů se „sníženou rekombinací“. Helperový vektor podle vynálezu také výhodně zvyšuje titr produkovaného podmíněně se replikujícího vektoru na hladinu vyšší než 10⁷ transdukčních jednotek na mililitr. Jiná provedení zahrnují koncentrování vektoru, používající vysokootáčkové (ale ne ultra) centrifugy a chromatografické, ultrafiltrační a diafiltrační způsoby koncentrace a purifikace.

Modifikace helperového vektoru podle tohoto vynálezu zahrnuje inzerci ribozymu, jako je anti-U5 ribozym, nebo antisense sekvence, která štěpí nebo jejímž důsledkem je destrukce nebo inaktivace podmíněně se replikujícího vektoru v případě, kdy jsou helper vektor a podmíněně se replikující vektor umístěny spolu nebo spolu zabaleny. V jednom provedení jsou složky helperu zcela integrovány na jednom plazmidovém konstruktu, čímž vzniká dvouplazmidový funkční helper-vektorový systém, který účinně produkuje nekoncentrované titry vektorových supernatantů větší než 10⁷ transdukčních jednotek na ml (viz obr. 3). V jiném provedení je nukleotidová sekvence helperového vektoru degenerována, aby byla

9«

9·99 • 9 9999 • · · · · · • · 9 9 999

9 9 9 « 9

9 9 9 9 9

999 99 9« 999

minimalizována rekombinace s podmíněně se replikujícím vektorem. V ještě jiném provedení obsahuje helperový vektor heterologní trans-účinkující elementy pro použití při zabalení podmíněně se replikujícího vektoru. Příklady takových elementů obsahují, ale bez omezení, obálkový protein viru vesikulámí stomatitidy VSV-G, obálkový protein RDI 14, obálkový protein viru vztekliny, obálkový protein viru giboni leukemie (Gibbon Ape Leukemia Virus, GAL V) a chimérické obálkové proteiny. Další modifikace zahrnují také heterologní, na rev reagující elementy (RRE), posttranskripční regulační elementy (PRE) nebo konstitutivní transportní elementy (CTE).

V ještě jiném provedení obsahuje konstrukt helperového vektoru sestřihový donor, akceptorová místa sestřihu nebo místa pro degenerované nebo humanizované nukleotidové sekvence. Například místa sestřihu mohou být umístěna tak, že signál k obalování a/nebo RRE může být odstraněn z transkribované RNA sestřihem. Kromě toho jsou přítomna místa pro inzerci intronu do vektorových nebo helperových konstruktů, takže je minimalizována dimerizace, souběžná lokalizace nebo rekombinace mezi podmíněně se replikujícím vektorem a helperovým vektorem nebo jiným soutěžícím genomem nebo genomovým elementem. Inzerce intronů může být směrována tak, aby měla za výsledek dopravu helperové RNA do komplexů sestřihu a pryč od vektorové RNA. Překvapivě bylo zjištěno, že některé konstrukty helperových vektorů zvyšují titr podmíněně se replikujícího vektoru.

Předkládaný vynález poskytuje zlepšené podmíněně se replikující vektory, lentivirové vektory a jejich použití. Kromě toho, že jsou selektivně replikovány, obsahují tyto vektory specifické modifikace pro snížené pravděpodobnosti rekombinace jako výsledku nastupující replikaění kompetence. Jsou zahrnuty způsoby inhibice replikace divokého typu kmene viru a způsoby pro doručení genu do buněk, zahrnující takovéto zlepšené vektory. Tento způsob zahrnuje kontakt s hostitelem, který je schopen být infikován, je v riziku infekce nebo výhodně skutečně infikován takovým divokým typem kmene viru, se zlepšeným vektorem, který je množen pouze v hostiteli, který umožňuje replikaci tohoto vektoru (tj., nepatogenního nebo nezpůsobujícího chorobu, podmíněně se replikujícího vektoru (vektorů)).

Jak je zde popsáno dále, je konkrétním cílem tohoto způsobu vyvolat v hostiteli pomocí takového nepatogenního, podmíněně se replikujícího viru konkurenční infekci. Obecně zahrnuje podmíněně se replikující vektor podle vynálezu nejméně jednu sekvenci nukleové kyseliny, která přináší selektivní výhodu pro replikaci a rozšíření na podmíněně se replikující vektor ve srovnání s divokým typem viru, a/nebo nejméně jednu sekvenci nukleové kyseliny, která přináší selektivní výhodu pro rozmnožování virových částic do hostitelské buňky obsahující podmíněně se replikující vektor ve srovnání s hostitelskou buňkou obsahující divoký typ viru.

44*4 ««··

9 4 44«

44« 4 444 4 4

4« 4 94««

44 44« 4« «4

Ve výhodném provedení vynálezu obsahuje tento vektor sekvenci HIV a je používán pro léčbu HIV infekce. Tento vektor nebo hostitelská buňka obsahující tento vektor zahrnuje nejméně jednu sekvenci nukleové kyseliny, která (1) poskytuje crHIV genom se selektivní výhodou vůči divokému typu HIV genomu při obalování virionů potomstev (tj., v buňkách, ve kterých jsou oba usazeny) a/nebo (2) poskytuje hostitelskou buňku, která produkuje podmíněně se replikující vektor (virus) se selektivní výhodou při produkci crHIV virionu při srovnání s hostitelskou buňkou, produkující divoký typ viru. Jedním způsobem (na který však tento vynález není omezen) je dodání selektivní výhody při obalování crHIV genomům poskytnutím jednoho nebo více ribozymů, schopných štěpit genomy divokého typu HIV.

V jiném aspektu vynálezu se vektorům dodává snížená pravděpodobnost rekombinace s konstrukty divokého typu a helperovými konstrukty, aby byly získány replikačně kompetentní vektory. Kromě toho jsou také poskytovány helperové vektory, buňky a obalové systémy, které také přispívají ke snížení rekombinace, pro další snížení možnosti produktivní rekombinace, aby bylo zajištěno, že se tyto vektory již dále podmíněně nereplikují.

Divoké typy viru

Podle vynálezu je „virus“ infekčním činidlem, které se skládá z proteinu a nukleové kyseliny, a které používá genetické mechanizmy buňky hostitele pro produkci virových produktů, určených virovou nukleovou kyselinou. „Nukleová kyselina“ označuje polymer DNA nebo RNA, který je jedno nebo dvojvláknový, lineární nebo kruhový a popřípadě obsahuje syntetické, nepřirozené nebo modifikované nukleotidy, které jsou schopny začlenění do DNA nebo RNA polymerů. DNA polynukleotid obsahuje výhodně genomové nebo cDNA sekvence.

„Divoký typ kmene viru“ je kmen, který neobsahuje žádné člověkem provedené mutace, jak je zde popisován, tj., libovolný virus, který může být izolován v přírodě. Alternativně je divokým typem kmene libovolný virus, který byl kultivován v laboratoři, ale stále, v nepřítomnosti jakéhokoliv jiného viru, je schopný produkovat genomy nebo viriony potomstva jako viry, které byly izolovány v přírodě. Například molekulární klon pNL4-3 HIV-1 popsaný v následujících příkladech je divoký typ kmene, který je dostupný v AIDS Research and Reference Reagent Program Catalog od National Institutes of Health (viz také Adachi et al., J. Virol., 59, 284 až 291 (1986)). pPSXB je HIV-2 molekulární klon, který laskavě poskytl Dr Suresh Arya z National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, a který byl popsán v Arya et al. Human immunodeficiency virus type 2 lentivirus vectors for gene transfer: expression and potential for helper virus-fřee packaging. Hum Gene Ther. 1998 Jun 10; 9 (9):1371 až 1380.

• ···· toto ···* tto ··*· ·· ·*·· to· to • « >· ··· to · · « ···· · to · · · to·# to· to ♦ · · · ««· ·* to· *·· ·· *·

Obecně se způsob podle vynálezu výhodně používá pro léčbu virových chorob, které jsou způsobeny virovou infekcí. Je žádoucí, je-li virus (stejně jako vektor, jak je diskutováno níže) RNA virus, ale může to být i DNA virus. RNA viry jsou různorodou skupinou, která infikuje prokaryonty (např. bakteriofágy), stejně jako mnoho eukaryontů, včetně savců a konkrétně člověka. Většina RNA virů má jako svůj genetický materiál jedno vláknovou RNA, i když nejméně jedna skupina má jako svůj genetický materiál dvojvláknovou RNA. RNA viry se dělí do tří hlavních skupin: viry s pozitivním řetězcem (tj. ty, jejichž genom po přenesení virem je translatován na protein a jejichž deproteinovaná nukleová kyselina postačuje k vyvolání infekce), viry s negativním řetězcem (tj. ty, jejichž genom, přenesený virem je komplementární ke smyslu zprávy a musí být transkribován, předtím než může nastat translace, pomocí enzymů, spojených s virionem) a dvoj vláknové RNA viry. Způsob podle vynálezu se výhodně používá pro viry s pozitivním řetězcem, viry s negativním řetězcem i dvoj vláknové RNA viry.

Pod označením RNA virus se zde rozumějí viry podobné Sindbis virům (např. Togaviridae, Bromovirus, Cucumovirus, Tobamovirus, Ilarvirus, Tobravirus a Potexvirus), viry podobné Picomaviru (např. Picomaviridae, Caliciviridae, Comovirus, Nepovirus a Potyvirus), viry s minus-řetězcem (např. Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae a Arenaviridae), dvojvláknové viry (např. Reoviridae a Bimaviridae), viry podobné Flaviviru (např. Flaviviridae a Pestivirus), viry podobné Retroviru (např. Retroviridae), Coronaviridae a jiné skupiny virů, včetně, ale bez omezení na ně, Nodaviridae.

Výhodným RNA virem podle vynálezu je virus čeledi Flaviridae, výhodně virus rodu Filovirus a zejména virus Marburg nebo Ebola. Přednostně je virem čeledi Flaviviridae virus rodu Flavivirus, jako je virus žluté zimnice, denge virus, virus západního Nilu, virus St. Louis encefalitidy, virus japonské encefalitidy, virus encefalitidy Murray Valley, Rocio virus, virus klíšťové encefalitidy a jim podobných.

Výhodnými jsou také viry čeledi Picomaviridae, výhodně virus hepatitidy typu A (HAV), hepatitidy typu B (HBV) nebo virus non-A nebo non-B hepatitidy.

Jiným výhodným RNA virem je virus čeledi Retroviridae (t.j. retrovirus), zejména virus rodu nebo podčeledi Oncovirinae, Spumavirinae, Spumavirus, Lentivirinae a Lentivirus. RNA virus podčeledi Oncovirinae je vhodně lidský T-lymfotropní virus typu 1 nebo 2 (t.j. HTVL-1 nebo HTVL-2) nebo virus hovězí leukemie (BLV), virus ptačího leukosis-sarkomu (např. virus Rousova sarkomu (RSV), virus ptačí myeloblastózy (AMV), virus ptačí erytroblastózy (AEV), virus asociovaný s Rousovým virem (RAV; RAV-0 až RAV-50), savčí virus C-typu (např. virus Moloneyho myší leukemie (MuLV), virus Harveyova myšího sarkomu (HaMSV), virus Abelsonovy myší leukemie (A-MuLV), AKR-MuLV, virus leukemie lišek (FeLV), virus opičího sarkomu, virus retikuloendoteliózy (REV), virus nekrózy sleziny (SNV)), virus B-typu (např. virus nádoru mléčné žlázy u myší (MMTV)) a virus D-typu (např. Mason-Pfizerův opičí virus (MPMV) a SAIDS viry). Vhodným virem podčeledi Lentivirus je virus lidské imunodeficience typu 1 nebo 2 (t.j. HIV-1 nebo HIV-2), kde HIV-1 byl dříve nazýván s lymfoadenopatií spojeným virem 3 (HTLV-III) a se získaným syndromem imunodeficience (AIDS) spojeným virem (ARV)) nebo jiný virus, spojený s HIV-1 nebo HIV-2, který byl identifikován a asociován s AIDS nebo s chorobami podobnými AIDS. Zkratka „HIV“ nebo termín „AIDS virus“ nebo „virus lidské imunodeficience“ jsou zde používány obecně pro označení těchto HIV virů a pro s HIV příbuzné nebo s HIV asociované viry. Dalším RNA virem z podčeledi Lentivirus je přednostně Visna/maedi virus (např. ten, který infikuje ovce), virus liščí imunodeficience (FIV), hovězí lentivirus, virus imunodeficience opic (SIV), virus koňské infekční anémie (EIAV) a virus kozí artritidy-encefalitidy (CAEV).

Virem podle vynálezu je rovněž výhodně DNA virus. Výhodně je DNA virem virus Epstein-Barrové, adenovirus, herpes simplex virus, papillomavirus, virus vakcinie apod

Mnohé z těchto virů jsou klasifikovány jako patogeny „rizikové skupiny 4“ („Biosafety Level 4“, tj., „Risk Group 4“ Světové zdravotnické organizace), pro které platí maximální používání uzavřených zařízení při všech laboratorních pracích. Řádně vyškolení pracovníci jsou však s tímto seznámeni a jsou schopni přijmout bezpečnostní opatření, nezbytná pro práci s těmito viry.

„Hostitelskou buňkou“ může být libovolná buňka, výhodně eukaryontní buňka. Je žádoucí, když touto buňkou je lymfocyt (jako T lymfocyt) nebo makrofág (jako monocytický makrofág) nebo prekurzor některé z těchto buněk, jako je hematopoetická kmenová buňka. Výhodně tyto buňky obsahují na svém povrchu glykoprotein CD4+, tj. jsou CD4+. Je však vhodné, když CD4+ T lymfocyt, který byl infikován AIDS virem, se ještě nestal aktivním (tj. výhodně u něj nenastala exprese nef nebo ještě výhodněji, nebyla exprese genu CD4+ utlumena, jak je diskutováno dále). Kromě toho je hostitelskou buňkou výhodně buňka, která postrádá CD4 markér a přesto je schopna být infikována virem podle vynálezu. Taková buňka zahrnuje, ale bez omezení, astrocyt, fibroblast pokožky, buňku střevního epitelu, endotelovou buňku, epitelovou buňku, dendritovou buňku, Langerhansovy buňky, monocyt, hematopoetickou kmenovou buňku, embryonální kmenovou buňku, buňku, ze které vznikne spermatická nebo vaječná buňka, stromální buňku, mukozální buňku a jim podobné. Je výhodné, když hostitelskou buňkou je buňka eukaryontního, mnohobuněčného druhu (např. jako protiklad jednobuněčné kvasničné buňky) a ještě výhodnější je, když touto buňkou je savčí, např. lidská buňka.

• ·

Buňka může být přítomna jako jednoduchá entita nebo může být částí většího souboru buněk. Takový „větší soubor buněk“ může zahrnovat například buněčnou kulturu (buď směsnou nebo čistou), tkáň (např. endotel, epitel, sliznice nebo jiná tkáň, včetně tkání, které obsahují shora uvedené buňky bez CD4+), orgán (např. srdce, plíce, játra, sval, žlučník, močový měchýř, gonády, oko a jiné orgány), orgánový systém (např. oběhový systém, dýchací systém, gastrointestinální systém, močový systém, nervový systém, kožní systém nebo jiné orgánové systémy) nebo organizmus (např. ptáka, savce apod.). Je výhodné, když orgány/tkáně/buňky, které mají být cílem, jsou součástí oběhového systému (např. včetně, ale bez omezení, srdce, krevního řečiště a krve, včetně bílých krvinek a červených krvinek), dýchacího systému (např. nos, hltan, hrtan, průdušnice, průdušky, průdušinky, plíce a jim podobné), gastrointestinálního traktu (např. ústa, hltan, jícen, žaludek, střeva, slinná žláza, slinivka břišní, játra, žlučník a jiné), močového systému (např. ledviny, močovod, močový měchýř, močová trubice a jim podobné), nervového systému (např. včetně, ale bez omezení, mozku a míchy a specializovaných smyslových orgánů, jako je oko) a kožního systému (např. kůže, pokožka a buňky podkožních nebo kožních tkání). Ještě výhodnější je, když cílové buňky jsou vybrány ze skupiny, která se skládá z buněk srdce, krevního řečiště, plic, jater, žlučníku, močového měchýře a buněk oka. Cílové buňky nemusí být normální buňky a mohou být chorobnými buňkami. Takovéto chorobné buňky mohou být, ale bez omezení na ně, tumorové buňky, infikované buňky, geneticky abnormální buňky nebo buňky v blízkosti nebo v kontaktu s abnormální tkání, jako jsou buňky tumorového vaskulámího endotelu.

Vektor „Vektorem“ je molekula nukleové kyseliny (typicky DNA nebo RNA), která slouží pro přenos sekvencí přenášené nukleové kyseliny (tj., DNA nebo RNA) do hostitelské buňky. Tři obvyklé typy vektorů zahrnují plazmidy, fágy a viry. Výhodně je vektorem virus, který obsahuje zapouzdřené formy vektorových nukleových kyselin, a virové částice, ve kterých jsou vektorové nukleové kyseliny zabaleny.

Je vhodné, když tento vektor není divokým typem kmenu vím a tudíž obsahuje člověkem vytvořené mutace nebo modifikace. Vektor je tedy typicky odvozen genetickou manipulací od divokého typu kmene (např., delecí), aby obsahoval podmíněně se replikující virus, jak je dále popsáno. Optimální je, když tento virový vektor obsahuje kmen viru, který je stejného typu jako divoký typ viru, způsobujícího infekci, která má býti léčena, který je výhodně jedním ze shora uvedených divokých typů virů. V souhlase s tím je výhodné, když je tento vektor odvozen od RNA viru, ještě výhodnější, je-li odvozen od retroviru a optimální je, když je odvozen od viru

lidské imunodeficience. Takový vektor, odvozený od viru lidské imunodeficience je genericky označován jako „crHIV“ vektor.

Vektor je také výhodně „chimérickým vektorem“, tj. spojením virového vektoru s jinými sekvencemi, jako jsou například spojení HIV sekvencí s jedním nebo s více viry (které jsou vhodně odvozeny od divokého typu kmene viru, aby obsahovaly podmíněně se replikující vektor). Je hlavně vhodné, když mohou být HIV sekvence spojeny se sekvencemi modifikovaného (tj. nedivokého typu) kmene adenoviru, s adenovirem spojeného viru, viru z Alphaviridae, viry z Flaviviridae, virem z Hepadnaviridae, virem z Papovaviridae, virem z Parvoviridae, virem z Herpesrviridae, virem z Poxviridae, virem z Paramyxoviridae, virem z Rhabdoviridae, virem z Paramyxoviridae nebo virem z Retroviridae, včetně Onkoretrovirů, Spuma-retrovirů a Lenti-retrovirů. Zahrnuty jsou také viry nebo genomy podobné virovým genomům, které jsou odvozeny nebo asociovány s těmito čeleděmi virů.

Chimérický vektor je výhodný, když vektorové sekvence (tj., sekvence kódující buď proteiny, fragmenty nebo nekódující sekvence), odvozené od jiných než Lentivirus, jsou inzertovány do Lentivirus vektoru. Je výhodné, když jsou inzertovány do vektoru, odvozeného od HIV, jiné než HIV sekvence.

Jak je zde zahrnuto, může vektor obsahovat buď DNA nebo RNA. Pro odvození viru může být například použit buď RNA nebo DNA vektor. Obdobně může být udělána cDNA kopie z virové RNA. Alternativně mohou být cDNA (nebo virové genomové DNA) části přepsány in vitro, čímž vznikne RNA. Tyto způsoby jsou velmi dobře známy odborníkům v této oblasti techniky a jsou také popsány v následujících příkladech.

„Podmíněně se replikující virus“ je replikačně defektní virus, který je defektní pouze za určitých podmínek. Konkrétně tento virus může dokončit svůj replikační cyklus v hostitelské buňce, která to dovolí, a nemůže dokončit svůj replikační cyklus v hostitelské buňce, která to nedovolí. „Hostitelská buňka“ je buňka, která je schopna být infikována, nebo kterájiž je skutečně infikována divokým typem kmene viru nebo pseudotypovým vektorem. Taková infekce divokým typem viru může nastávat buď před nebo po infekci podmíněně se replikujícím virem podle vynálezu. Alternativně může být „hostitelská buňka“ buňkou, která kóduje produkty divokého typu viru nebo helperového genu, které jsou nezbytné pro replikaci viru. Podmíněně se replikující vektor podle vynálezu je tedy virem (který je výhodně stejného typu viru, jako způsobuje infekci, která má být léčena), který se replikuje pouze za komplementace s divokým kmenem viru (nebo helperu) nebo tehdy, když virus divokého typu infikuje buňky, které obsahují genomy podmíněně se replikujícího vektoru.

• · · · · · · • ···· · · · ··· · ··· · ·

Ve výhodném provedení vektor obsahuje RNA virus (např. podmíněně se replikující HIV virus), který je introdukován ve formě DNA. Toto výhodné provedení nabízí způsob použití replikujícího se HIV-1 (crHIV) vektoru, který poskytuje nepatogenní crHIV-1 vektorové genomy se selektivní výhodou proti patogenním divokým typům HIV genomů. Konkrétně v buňkách obsahujících genomy divokého typu HIV i crHIV, mají crHIV RNA selektivní výhodu v obalování do virionů, protože obsahují například ribozymy, které štěpí divoký typ RNA, ale ne crHIV RNA. Takovéto nepatogenní crHIV jsou schopny rozšíření do neinfíkováných buněk, které jsou náchylné na HIV infekci (např. CD4+ buňky) v přítomnosti helperového viru divokého typu. Tímto způsobem interferuje selektivní obalování a rozšiřování crHIV s replikací divokého typu HIV.

Dalším výhodným provedením je nepatogenní crHIV vektor, který je nepatogenní proto, protože neobsahuje žádnou kombinaci sekvencí virových akcesorických proteinů (jako jsou, ale bez omezení na ně, Vif, Vpu, Vpr nebo Nef nebo jejich kombinace nebo fragmenty), které by mohly učinit tento vektor patogenním. Tyto sekvence mohou být alternativně přítomny, ale mohou být transkripčně tiché nebo být netranslatované. Vektor popřípadě neobsahuje žádnou kombinaci regulačních proteinových sekvencí (jako jsou, ale bez omezení na ně, Tat nebo Rev nebo jejich kombinace), které by způsobily patogenitu tohoto vektoru. Tyto sekvence mohou být alternativně přítomny, ale transkripčně tiché nebo netranslatované.

Vektory však výhodně obsahují jakoukoli kombinaci sekvencí strukturních proteinů (jako jsou gag nebo jeho fragment), sekvencí enzymových proteinů (jako jsou pol nebo jeho fragment) a/nebo sekvencí proteinů obálky (jako jsou env nebo jeho fragment) ve formě schopné být translačně aktivní nebo tiché. Podmíněně se replikující vektor může být tudíž schopen se replikovat, ale nikoliv na takových hladinách, které jsou patogenní pro daný hostitelský organizmus. Místo toho tento vektor potřebuje komplementaci s helperovou složkou (jako je helper vektor), obsahující nezbytné sekvence, odvozené od divokého typu viru, aby se mohl replikovat na hladinách dostatečných pro vyvolání potřebného terapeutického, profylakticého nebo biologického účinku. Určování přesné kombinace proteinů nebo nukleotidových sekvencí, přítomných v tomto vektoru a helperu, aby byl získán optimální biologický účinek, zahrnuje pouze přímou aplikaci jednoduchých skríninkových procesů, zahrnujících přidání a odebrání různých kombinací nukleotidových sekvencí do vektoru nebo helperové konstrukce, což jsou pro odborníky v tomto poli techniky rutinní způsoby.

Kromě toho mohou být shora uvedené nukleotidové sekvence modifikovány nebo mutagenizovány, aby byl změněn jejich biologický účinek nebo například zmenšena možnost jejich rekombinace s helperovou konstrukcí. V této oblasti techniky jsou známy početné • ♦ 9 ·

způsoby pro modifikaci nebo mutaci vektorových a helperových konstruktů pro dosažení více optimalizovaných konstruktů (např. Current Protocols in Molecular Biology, Hartcourt Brace and Jovanovich, 2000; Molecular Cloning, Sambrook et al, Cold Spring Harbor Press, 1989 a Soong et al. Nátuře Genetics 25: 436 až 439,2000, které jsou zde obě začleněny ve své celistvosti).

Přístup, umožněný shora uvedenými vektory, se liší od použití živých-zeslabených vakcín (live-attenuated, LA), které používají replikačně kompetentní viry, které postrádají akcesorické proteiny (viz Daniel et al., Science, 258, 1938 až 1941 (1992) a Desrosiers, AIDS Res. & Human Retrovir., 10, 331 až 332 (1994)), protože u LA vakcín se nevyvíjí žádné úsilí pro komplementaci nedostatků, které například zabraňují účinnému vyvolání efektivní imunitní odpovědi a přitom udržují bezpečnost. Například je známo, že mnohonásobně deletované LA SIV vakcíny nemohou vyvolat účinnou imunitní odpověď, zatímco jednoduše deletované (Nef negativní) LA SIV vakcíny jsou patogenní pro juvenilní jedince opice makaka (Baba et al,

1995).

Alternativní přístup k LA HIV vakcínám poskytnutý výše popsaným vynálezem by sočíval v použití nejméně dvou vektorů, z nichž nejméně jeden je mnohonásobně deletovaným HIV vektorem a druhý (helper) vektor exprimuje všechny akcesorické proteiny s výjimkou Nef. Tento mnohonásobně zeslabený HIV vektor by se tudíž mohl replikovat podmíněným způsobem, aniž by způsoboval chorobu, přičemž je kontrolovaným způsobem komplementován s Vif, Vpr a Vpu z helper vektoru. První vektor může být sestrojen tak, aby obsahoval genetické antivirové prostředky, aby interferovaly s replikací a šířením divokého typu HIV. Alternativně by mohl tento první vektor být použit pro vyvolání účinné imunitní odpovědi proti divokému typu viru. Odborníkům v této oblasti techniky bude jasné, že jednoduchý skríninkový proces umožní vyhodnocení, která skutečná(é) kombinace sekvencí, deletovaných z prvního vektoru, ale přítomných v helperovém vektoru by umožnila prvnímu vektoru optimálně poskytovat terapeutickou nebo profylaktickou odpověď a přitom zachovávat bezpečnost svojí nepatogenitou.

Dalším výhodným provedením podmíněně se replikujícího systému vektor - helper může být použití HIV-1 vektoru pro expresi gag, pol, tat a rev, při použití HIV-2 odvozeného helperového vektoru, například, pro expresi Vif, Vpu, Vpr genů a s možností volby Nef genu. Vynález není tímto příkladem nijak omezen, protože je stejně možná libovolná kombinace shora uvedených genů umístěných v libovolné kombinaci kompatibilních vektorů, včetně reverzních HIV-1 a HIV-2 nebo chimérických HIV formátů. Exprese Tat z HIV-1 pozadí by mohla transaktivovat jak HIV-1, tak i HIV-2 LTR pro komplementaci jednoho s druhým za vzniku ····

0004

0

0 0 0 vektorových části, které by obsahovaly buď genomy HIV-1 vektoru nebo genomy HIV-2 vektoru. Tyto dvě genomové RNA se však nemohou účinně dimerizovat, čímž je zabráněno současné lokalizaci vektorových i helperových genomů, které by jinak mohly být společně zabaleny do jedné virionové částice. V případě společného zabalení do jedné virionové částice, by v průběhu reverzní transkripce, poté co tato částice infikuje další cílovou buňku, mohla nastat rekombinace mezi genomy vektoru a helperu, která by produkovala replikačně kompetentní vektor (RCV).

Jako další případ možné produkce společně zabalených konstrukcí mohou tyto vektory dále obsahovat jednu nebo více sekvencí nukleové kyseliny, které snižují riziko jakékoliv rekombinace. První vektor může například obsahovat ribozymovou (nebo antisense/ribozymovou) sekvenci, specifickou pro štěpení helperového vektoru. Společné umístění těchto vektorů na stejném buněčném, podbuněčném nebo mimobuněčném místě by mohlo vyústit do štěpení helperového vektoru pro zvýšení bezpečnosti při rušení dimemího stavu nebo společného umístění těchto vektorů, s výsledkem inaktivace genomu po rekombinaci nebo jiného zabránění vzniku produkce RCV. Tento přístup může být změněn zahrnutím ribozymu na helperovém vektoru nebo dále zlepšen zahrnutím ribozymů na obou vektorech pro dosažení dalšího zvýšení bezpečnosti.

Antisense molekuly mohou být alternativně použity pro náhradu shora uvedených ribozymů, takže dochází k rychlé degradaci útvarů dvojvláknové hybridní RNA buněčnými endonukleázami. Dalším výhodným provedením je, že antisense sekvence mohou být větší délky než 16 poloh baží ribozomální RNA, použité pro cílení.

V modifikovaném přístupu může být helper virus odvozen od heterologního viru (například kteréhokoli z virů a tříd virů, uvedených shora, ale výhodně odvozeného od adenoviru, od viru spojeného s adenovirem, od myšího onkoretroviru nebo od non-HIV lentiviru), přičemž mohou být proteiny exprimovány konstitutivně. Tento heterologní helper vektor může být alternativně sestrojen tak, aby využíval HIV-LTR pro indukovatelnou nebo autoregulovanou expresi Tat, aby byla transaktivována exprese HIV-1 vektoru. Výhodou poskytovanou heterologním virovým helperem je restriktivní asociace mezi genomy prvního a druhého vektoru, tudíž další snížení možnosti rekombinace a vzniku možného RCV.

V jiném provedení vektor obsahuje antisense sekvenci, která je přítomna v helperovém genomu nebo je inzertována do helperového genomu. Neomezující příklad je patrný u vektoru pNlcptASgag, který je analogický vektoru pNlcptASenv, kromě toho, že antisense sekvence je kromě nebo místo env sekvence, přítomné v divokém typu HIV, namířena na gag sekvenci, přítomnou na helper vektoru. Tato anti-gag antisense sekvence je umístěna před akceptorovým ·*·· ·· ···· ·· ···· • · · · 9 9 9

9 9 999 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

99 99 999 99 99 místem sestřihu, které je přítomno za RRE sekvencí, přítomnou ve vektoru. Proto bude gag sekvence zabalena pouze v genomových a nikoliv v subgenomových čili sestřižených vektorových RNA. Helperové genomy helperů, obsahujících intron, jako jsou například helpery systému VIRPAC, budou tak přednostně cíleny na komplex sestřihu buňky, zatímco RNA genomových vektorů, které obsahují anti-gag antisense sekvence, budou tento mechanizmus sestřihu přednostně obcházet.

Rozdílný přenos vektorových a helperových genomů v buňce by měl mít minimální vliv na titr vektoru, dokonce i kdyby byly vektorové a helperové vektory náhodně umístěny společně, neboť hybridizace párováním bází vektorových a helperových genomů by měla vyústit do inaktivace nebo destrukce takovýchto částic, obsahujících vektorový a helperový genom a zabránit rekombinaci vektoru s helperem, vedoucí ke vzniku RCV. V alternativním provedení může být helper sestrojen tak, aby obsahoval antisense sekvence anti-U5 vektoru, směrované na U5 sekvence, které byly nalezeny v podmíněně se replikujícím vektoru. Aniž bychom omezovali podstatu tohoto aspektu vynálezu, mohou antisense sekvence anti-U5 být inzerovány distálně vůči sekvencím kódujícím helper, ale před terminačním místem transkripce. Proto, jestliže budou vektorové a helperové RNA náhodně společně umístěny, zabaleny a případně rekombinovány, budou potom tyto antisense sekvence destruovat nebo inaktivovat takovéto společně zabalené virové částice a zabraňovat rekombinaci.

V ještě jiném provedení může helper obsahovat cílové sekvence pro první nukleotidovou sekvenci, přítomnou na vektoru. Neomezující příklad nastává při umístění fragmentu env o správné orientaci do helperu dvojplazmidového páru, který obsahuje vektor pNlcptASenv. Tedy, jestliže budou vektorové i helperové RNA společně umístěny, potom by správně orientovaná env sekvence v helperu měla podléhat párování bází s antisense sekvencí env ve vektoru, čímž bude zabráněno rekombinaci. Shora uvedené příklady nejsou míněny jako omezení tohoto vynálezu na právě tento jeden nebo dva typy genetických protivirových sekvencí. Každému odborníkovi na tomto poli techniky bude zřejmé, že do vektorových a/nebo helperových konstruktů mohou být inzertovány početné genetické antivirové sekvence, rovněž jako jejich příbuzné cílové sekvence. Dalším neomezujícím příkladem je, že pNlcptASgagASenv vektor a helper, které obsahují správně orientovanou sekvenci gag a env fragmentu, mohou být použity ve vzájemné kombinaci pro zvýšení bezpečnosti snížením pravděpodobnosti společného zabalení a rekombinace za vzniku RCV.

V jiném výhodném provedení pro expresi vektorových a helperových komponent jsou tyto komponenty exprimovány přechodně. Jedním způsobem, zajišťujícím, aby vektor a helper exprimovaly jejich genom přechodně, je konstrukce tohoto vektoru nebo tohoto helperu • 4 0000

4000

0· 0000

• 0 · · •00 · · · • 0 0 0 0 • 00 ·· ·· použitím, například integráza negativního Pol genu. Takové lentivirové integrázové mutanty jsou známy v této oblasti techniky a bylo uvedeno, že nejsou infekční (Hirsch et al 1989 Nátuře 341: 573 až 574). Vektorové a/nebo helperové genomy, které jsou tudíž produkovány integráza negativními produkčními buňkami, nebudou integrovat, ale mohou být exprimovány přechodným způsobem a tak regulovat rozsah replikace vektoru nebo helperu. Ještě jiným způsobem pro přechodnou expresi buď vektoru nebo helperu je rozbití AAT míst ve vektorových LTR. Tato místa jsou odpovědná za aktivní integraci reverzně transkribované DNA vektorového genomu do chromozómu hostitelské buňky.

Další způsob provedení shora uvedeného využívá fuzního proteinu pro obalení funkční molekuly integrázy do virové částice. V tomto provedení nebude ani podmíněně se replikující vektor, jako je lentivektor, ani helperový vektor kódovat integrázu, ale funkční integrázový fuzní protein bude k dispozici v důsledku exprese z jiného plazmidového konstruktu, jako je helperový vektor nebo z integrované kopie v použité obalové buňce, a poskytne po infekci funkční integrázovou aktivitu. Alternativně je tento integrázový protein získáván in trans expresí z helperového konstruktu, který ho kóduje. V tomto provedení vynálezu nemůže podmíněně se replikující vektor ani lentivektor kódovat integrázu. Uvedeným fuzním proteinem může, ale bez omezení na něho, být vpr-integrázový protein, který obsahuje proteázové štěpné místo na spojnici mezi vpr a aminokyselinovou sekvencí integrázy.

Shora uvedený popis dvojitého, vektor-helper, systému není v žádném případě omezením tohoto vynálezu na konstrukty s dvěma vektory nebo helpery. Může být použita libovolná kombinace dvou, tří nebo více vektorů a/nebo helperů pro získání komponent, nezbytných pro produkci vektoru. Rozdělení nezbytných genomových elementů do více vektorových nebo helperový ch komponent má vliv na vzrůstající bezpečnost, protože pro mnohonásobné vektorové a helperové genomy je obtížnější vznik RCV rekombinací. Bezpečnost může být dále zvýšena sestrojením vektoru(ů) nebo helperu(ů), aby mezi sebou obsahovaly málo nebo žádné oblasti homologie, což je dalším výhodným provedením. Rozdělení nezbytných genomových elementů do mnohočetných komponent může také dále omezit replikaci podmíněně se replikujícího vektoru, protože je málo pravděpodobné pro více než dva genomy, ve srovnání s pouze dvěma, aby byly současně přítomny v hostitelské buňce. Optimální počet potřebných vektoru(ů) a helperu(ů) lze snadno určit jednoduchým skríninkem různých kombinací a může se měnit v závislosti na příslušném virovém vektorovém systému, který je použit.

Jedním jednoduchým, přitom neomezujícím, příkladem omezování nebo odstraňování oblastí homologie mezi vektorem(y) a helperem(y) je prosté degenerování nukleotidové to ««toto ** ♦ *»· ♦» ··>*

9 9 9 9 9 99 · · 9 · ··· 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

999 99 99 9 99 9 9 99 sekvence, přičemž je udržována kódovaná aminokyselinová sekvence. Způsoby degenerace sekvencí jsou v této oblasti techniky dobře známy a jsou rutinní. Jedním výhodným způsobem je humanizace těchto sekvencí, pokud jsou terapeuticky užívány u člověka. Používaný kodon bylo tabelován pro primáty a je popsán v Wada et al. (Nucleic Acid Research vol. 28 Supplement: 2367 až 2411,1990), což je tímto začleněno ve své celistvosti).

Degenerace může být také použita pro ochranu konstruktu helperu před účinky libovolného činidla, určeného pro zacílení vektoru, který má být zabalen s helperem. Toto lze jednoduše provést degenerováním stejné cílové sekvence, pokud nějaká je, jako byla nalezena na helperovém konstruktu. Kromě toho může být degenerace vektorových i helperových konstruktů určena pro redukci rekombinace s jinými virovými sekvencemi, včetně sekvencí jiných divokých typů, které mohou být nalezeny současně s vektorovou nebo helperovou sekvencí v buňce. Například použití páru vektoru a helperu v obalovacím systému, založeném na HIV-1 a HIV-2, může být modifikováno tak, že tento pár vektoru a helperu je degenerován také vzhledem k vnějšímu retro-elementu. Degenerace nukleotidové sekvence bud’ vektoru nebo helperu bude snižovat současnou lokalizaci předpokládaných rekombinací a tudíž redukovat riziko vzniku replikačně kompetentníhp viru mezi vektorovými a helperovými genomy nebo mezi vektorovými nebo helperovými genomy a soutěžícím genomem, jako je endogenní retro-element.

Genomy crHIV se zejména zavádějí do viry infikovaných buněk nebo do neinfikovaných buněk. Infikované buňky zásobují crHIV genom proteiny, potřebnými pro zapouzdření a produkci virových viriónů. Genomy crHIV jsou introdukovány do neinfikovaných buněk výhodně buď přímo transdukci (např. toto může být učiněno například transdukci crDNA provedenou lipozómy nebo použitím chimérického virového vektoru) nebo infekcí crHIV částicemi, které vedou k transfekci buněk infikovaných divokým typem HIV. Neinfikované buňky, obsahující zlepšený crHIV vektor podle tohoto vynálezu neprodukují množství crHIV části, které jsou patogenní pro hostitele. Některá provedení crHIV vektorů buněk, které nejsou superinfikovány s wt-HIV, budou produkovat určité množství crHIV části, ale na hladinách, které nejsou pro hostitele patogenní. Buňky, obsahující nějaký vektor podle tohoto vynálezu, mohou zůstat náchylné vůči superinfekci divokým typem viru, který dodá proteiny, potřebné pro další produkci crHIV částic. V tomto smyslu také, podmíněně se replikující vektor podle tohoto vynálezu, v přítomnosti komplementární superinfekce divokého typu, funguje jako typ „virového dodávkového vektoru“, jenž například může být následován dalšími cykly crHIV infekce (tj. v přítomnosti konkurenční infekce divokým typem HIV). Takový vektor je zdrojem viru pro více než jeden cyklus virové replikace a tedy infekce dalších buněk nebo mnoha cyklů φφ ·«·· • ·ΦΦ* *φ ···«* φφ · φ · ♦ 9 9 9 « * * · · · * * • · · · · * · · -* ** • φ · 9 9 9 φ 5 · φ

III »* «φ ·«· ·· replikace na hladinách, které mohou vyvolat biologickou odpověď, jako je imunitní odpověď. Toto zlepšení je v kontrastu vzhledem k jiným vektorům, jako jsou vektory, použité u standardních obalovacích buněčných linií, a které slouží pouze pro jeden cyklus replikace nebo násobné cykly replikace, které jsou buď nedostatečné pro vyvolání odpovídající biologické reakce nebojsou patogenní vůči hostiteli.

Je-li to žádoucí (např. pro usnadnění použití tohoto vektoru in vitro), mohou být dodávány do infikované buňky společně s podmíněně se replikujícím vektorem produkty genů virů divokých typů. Genové produkty virů divokého typu mohou být dodávány nejenom pomocí koinfekce s divokým typem kmene viru (nebo cDNA nebo pro virem RNA viru), ale také jejich dodávkou do buňky ve formě jejich genů, subklonováných v expresním vektoru („helper“ nebo „helperový vektor“), který je schopný se účastnit transkripce nebo translace sekvencí hostitelské buňky (regulačních nebo strukturních) nebo, alternativně, mohou být produkty genů dodány zvnějšku, tj., přidáním proteinových produktů do buňky.

Například může být sestrojen crHIV vektor, obsahující všechny proteiny divokého typu HIV, s výjimkou například Tat kódující sekvence. Místo použití helperového expresního konstruktu, který exprimuje Tat, může být sám Tat protein použit jako helper. Výhoda použití tohoto proteinu místo helperového konstruktu je v tom, že neexistuje žádná teoretická možnost vzniku divokého typu viru, protože pro rekombinace nejsou k dispozici žádné sekvence nukleových kyselin. crHIV může být tedy rozmnožován použitím Tat proteinu a nikoliv pomocí konstruktů helperové nukleové kyseliny jako takových. Tat 1 nebo Tat 2 (odpovídající prvnímu nebo případně prvnímu a druhému exonu Tat) mohou být použity jako helper. Způsoby produkce a čištění takových proteinů jsou v této oblasti techniky dobře známy.

V jednom výhodném provedení je použit chimérický Tat protein. Tat je třeba zabudovat do fúzního proteinu (např. Tat-VP16) a ukázat zachování jeho transaktivační aktivity promotoru HIV-LTR. Pro dosažení zesílení požadovaného biologického účinku mohou být sestrojeny jiné chimérické Tat proteiny. Pokud je například žádoucím biologickým účinkem zesílení imunitní odpovědi, pak může být sestrojen Tat-GM-CSF fuzní protein. Tento přístup není omezen na jeden typ chimemího proteinu a může být žádoucí přidat alespoň druhý chimérický (nebo nechimerický) Tat protein (např. Tat-IFN-a, Tat-TNF-α, Tat-IL-4, Tat-G-CSF, TNF-α, GMCSF, IL-4, G-CSF, IFN-α, aby bylo uvedeno jen několik možností). Každému odborníkovi v této oblasti techniky bude zřejmé sestrojení atestování jiných chimemích proteinů a jejich skrínink na schopnost zesílení imunitní odpovědi, když současně udržujeme funkci helperu pro vektor. Jiným výhodným provedením je například konstrukt Tat-Rev fúzního proteinu nebo nativního HIV Tat-Rev fúzního proteinu, Trev. Shora uvedený popis chimemích Tat proteinů

není proto omezen na zahrnutí pouze cytokinů nebo buněčných proteinů, ale podle vynálezu lze použít i virových proteinů (produkujících homologické nebo heterologické virové ťuzní proteiny) v závislosti na požadovaném biologickém účinku.

S ohledem na „helperový vektor“, může být jeho exprese buněčně specifická nebo buněčně nespecifická a může být zaveden do hostitelské buňky v souhlasu s podmíněně se replikujícím vektorem, jak je zde definován a tudíž, může umožňovat kontinuální replikaci podmíněně se replikujícího virového vektoru.

„Helperové vektory“ podle tohoto vynálezu mohou dodávat nezbytné produkty genů pro replikaci buď jednoduchým vektorem nebo mnohočetnými vektory. Takové vektory jsou výhodně použity v přechodném transfekčním systému. Alternativně mohou být tyto produkty genů také začleněny do genomu hostitelské buňky nebo buněčné linie. V souhlase s tímto vynálezem je v důsledku zvýšených titrů výhodný jednoduchý vektor nebo plazmid (který může být v hostitelské buňce mono, bi nebo multicistronický) v důsledku zvýšené pravděpodobnosti současné transfekce helperového vektoru a podmíněně se replikujícího vektoru do stejné buňky. Snížená pravděpodobnost současně se transfektujících více než dvou různých vektorů do té samé buňky činí použití jednoduchého helperového vektoru ještě žádanějším. Snížení počtu vektorů nebo plazmidů, zahrnutých v transfekčním systému, je efektivnější i z hlediska nákladů, protože ve srovnání s obvyklým tříplazmidovým transfekčním systémem není nutno produkovat tolik plazmidů pro obalení retrovirových konstruktů.

„Komplementace“ jak je zde používána, označuje negenetickou interakci produktů virového genu z různých zdrojů v buňce. Specificky při smíšené infekci zahrnuje komplementace zvýšení výtěžku viru jednoho nebo obou rodičovských genomů, zatímco genotypy rodičovských genomů zůstanou nezměněny. Komplementace může být nealelická (tj. intergenní, kdy mutanty defektní v různých funkcích si navzájem asistují při virové replikaci dodáváním funkce, pro kterou je jiný virus defektní) nebo alelická (tj. intragenní, kde dva rodiče mají defekty v různých doménách multimemího proteinu).

Je žádoucí, když typy buněk, které mohou být transfektovány (transdukovány) s crHIV DNA (tj., pomocí lipozómů nebo použitím heterologického vektoru pro přípravu chimemího vektoru, jak je popsáno shora) mohou být buňkami buď infikovanými nebo neinfikovánými HIV. Buňky, infikované HIV, mohou být aktivované nebo neaktivované. Pokud jsou aktivovány, mohou bezprostředně přepisovat divoký typ HIV RNA a crRNA, s výsledkem selektivního obalení crHIV RNA do potomstva virionů. Pokud HIV infikované buňky nejsou aktivovány, crHIV DNA bude v nich zůstávat, pokud nebudou aktivovány (např. stimulací pomocí mitogenů, antigenů a jim podobných), přičemž výsledkem bude opět selektivní obalení • ···· ·· ···· ·· ···· ·· · · · · ·· · • · 9 9 999 99 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 ··· ·· · ···· ····· ····· ·· ·· crHIV RNA do potomstva virionů. Aktivované i neaktivované neinfikované buňky, které jsou transfektovány s crHIV DNA, nebudou produkovat viriony, pokud nebudou superinfikovány s divokým typem HIV a aktivovány stimulací, opět za výsledného selektivního obalení crHIV RNA do potomstva virionů.

Jedním provedením hostitelské buňky, transdukované vektorem podle tohoto vynálezu, je, když tato buňka obsahuje maximální počet kopií vektoru, který není průkazně toxický ani k hostitelské buňce, ani k hostitelskému organizmu, obsahujícímu tuto buňku. Jiným provedením hostitelské buňky, transdukované vektorem podle tohoto vynálezu, je, když tato buňka obsahuje nejméně jednu kopii vektoru, ale výhodně obsahuje minimální počet kopií vektoru, potřebný pro vyvolání biologického úěinku.Tento počet kopií v buňce může být zjištěn, například, pomocí TaqMan PCR a přijatelný počet kopií nebo rozsah počtu kopií, vhodný pro oba požadované biologické účinky a postrádající toxicitu, může být snadno určen odborníkem v této oblasti techniky. Přijatelný počet kopií se bude měnit v závislosti na faktorech, zahrnujících typ buňky, který má být transdukován, povaze vektoru (např., původ viru) a požadovaném biologickém účinku, ale lze ho snadno určit rutinním skríninkem odborníkem na tomto poli techniky.

Superinfekce buněk, obsahujících crHIV genomy (např. jako výsledek transfekce nebo infekce), nastává proto, že crHIV genomy nekódují virové proteiny, které blokují superinfekci (jako jsou env a nef). Výsledné crHIV viriony mohou infikovat neinfikované buňky, protože tyto virové částice obsahují reverzní transkriptázové molekuly, které nesou všechny HIV částice, takže mohou vytvářet DNA provirus z jejich genomové RNA. Tento proces je nazýván reverzní transkripcí. Pokud crHIV viriony infikují neinfikované buňky, mohou podléhat reverzní transkripci a produkovat provirus z jejich genomové RNA. Tyto buňky jsou tedy ekvivalentní těm neinfikovaným buňkám, které jsou přímo transdukovány s crHIV DNA. Nemohou produkovat crHIV částice, dokud nejsou superinfikovány divokým typem HIV a nejsou aktivovány, a pak znovu nastává selektivní obalování crHIV RNA do potomstva virionů. Je možné, že crHIV částice mohou také infikovat některé buňky, které již jsou infikovány HIV (viz např. Yunoki et al., Arch. Virol., 116,143 až 158 (1991); Winslow et al., 196, 849 až 854 (1993); Chen et al.„ Nuc. Acids res., 20,4581 až 4589 (1992) a Kim et al., AIDS Res & Hum. Retrovir., 9, 875 až 882 (1193)). Aby k tomuto došlo, nesmí však tyto HIV infikované buňky exprimovat proteiny, které snižují CD4 expresi, protože to by zabránilo crHIV virionům v infikování buněk. Aktivované, HIV inifikované buňky obecně regulují expresi CD4 směrem dolů. V souhlase s tím jsou HIV infikované buňky, které nejsou aktivovány, potenciálně náchylné vůči crHIV superinfekci a mohou být tedy dalším zdrojem produkce crHIV částic.

• · · · · · ···· • · · · · φφφφ φ φ φ • · · · · · • · · · · ·

Výhodný crHIV vektor podle tohoto vynálezu obsahuje sekvence potřebné pro transkripci RNA, vazbu tRNA primeru, dimerizaci a obalení a postrádá buď sekvence kódující proteiny, které blokují superinfekci s divokým typem HIV (např., nef nebo env proteiny) nebo obsahuje tyto sekvence, ale tyto sekvence buď nejsou transksribovány nebo nejsou translatovány do funkčního proteinu, takže jejich exprese je pokládána za „tichou“. Ještě výhodnější je vektor, kterému chybí oblast nebo sekvence, která kóduje oblast divokého typu HIV, počínající gag kódující sekvencí až k a včetně nef genu. Optimální však je, když tento vektor obsahuje element reagující na rev (RRE), který je klonován do vektoru v oblasti delece nebo do některé jiné obvyklé oblasti. Takový výhodný HIV vektor je nazýván „postrádajícím oblast nebo sekvenci, kódující tuto oblast“, pokud může být podáván ve své RNA formě nebo alternativně DNA formě, jak je popsáno výše.

V souhlase s tímto vynálezem, aby bylo dosaženo úspěšné komplementace v systému, který využívá helper vektor ve spojení s podmíněně se replikujícím vektorem, musí být tímto helper vektorem poskytnuta libovolná virová komponenta, nezbytná pro obalení viru, která však není exprimována podmíněně se replikujícím vektorem. Pokud tedy dva nebo více různých vektorů je navzájem zcela komplementárních, co se týče nezbytných virových komponent, je potom složení jednotlivých vektorů předmětem mnoha obměn (permutací). Každá z těchto permutací je v záměru předkládaného vynálezu. Jako příklad, gag a pol geny, nezbytné pro úspěšné obalení a replikaci mohou být oba zabudovány buď do helper vektoru nebo do podmíněně se replikujícího vektoru nebo mohou být tyto oba geny buď v jednom nebo ve druhém z těchto vektorů. Jediný konstrukt helper vektoru kromě toho může obsahovat gag/pol i env sekvence, včetně heterologních env sekvencí, pod kontrolou jediné sady transkripčních regulačních elementů, včetně promotoru nebo pod kontrolou oddělených promotorových elementů. Například pro expresi genových produktů ve vektoru podle tohoto vynálezu může být použita LTR. Použití různých promotorů, včetně indukovatelných promotorů, zaručuje například možnost různé regulace gag/pol a env sekvencí. Sekvence env, zvláště heterologní env sekvence, jako je sekvence VSV-G, může tak být exprimována na větší úrovni.

Konstrukce vektoru je dobře známa odborníkům v této oblasti techniky. Tyto způsoby mohou být použity pro konstrukci podmíněně se replikujícího vektoru i helper vektoru. Tak jak je používán zde, termín „vektor“ označuje oba tyto typy vektoru. Termín vektor kromě toho zahrnuje libovolný lenti virový vektor, aniž by musel být nezbytně podmíněně se replikujícím vektorem. Takové vektory mohou být také označovány jako generické lentivirové vektory. Ve výhodném provedení tohoto vynálezu je však tento vektor podmíněně se replikujícím lentivirovým vektorem. Například, jak je popsáno v příkladu 1, je DNA forma RNA viru, jako je

HIV, štěpena restrikčními enzymy tak, aby byla vystřižena HIV kódující sekvence od gag kódující oblasti až k a včetně U3 oblasti, následující nef gen. Klonační obálka, obsahující polylinker, který obsahuje mnohočetná restrikční místa, je inzertována do oblasti delece, před tím než je ligo vána za vzniku obvyklých restrikčních míst pro klonování v tomto vektoru. DNA fragment, který obsahuje RRE, je subklonován do jednoho z těchto míst. Výsledný vektor produkuje porušený gag transkript a neprodukuje divoký typ Gag proteinu ani jakýkoliv jiný divoký typ HIV proteinů. Kromě toho, není nezbytné, aby tento vektor exprimoval byť zkrácený gag protein, pokud lze iniciační sekvenci gag translace mutovat, aby bylo zabráněno jejímu přepisu.

Použitím stejného přístupu mohou být crHIV sekvence spojeny s jinými sekvencemi, od stejného nebo jiného viru či vektoru, aby byl odvozen chimemí vektor, jak je popsáno výše. crHIV sekvence mohou být například ligovány na sekvence od namátkově jmenovaných Sindbis viru, AAV, adenoviru nebo amfotropních retrovirů. Doplňková virová sekvence, která může být použita, zahrnuje sekvence od Herpes, Pox a jiných, zde popsaných virů, včetně viru, který může být použit pro zajištění přenosu crHIV sekvencí. Takový chimemí vektor může být introdukován do buňky buď použitím spojeného virového mechanizmu pro vstup do buňky (např., endocytózy zprostředkované receptorem pro adenovirus) nebo jinými způsoby, např. lipozomy.

Přednostně podle vynálezu vektor (tj., podmíněně se replikující vektor, který je výhodně crHIV vektorem) obsahuje alespoň jednu sekvenci nukleové kyseliny, jejíž zahrnutí (tj. přítomnost, transkripce nebo translace) představuje selektivní výhodu. Existují dva typy takových sekvencí nukleové kyseliny, které jsou zamýšleny pro zahrnutí do tohoto vektoru: (1) sekvence nukleové kyseliny, jejíž zahrnutí optimálně představuje selektivní výhodu pro virovou replikaci a rozšíření vektoru, obsahujícího takovouto sekvenci, vzhledem k divokému typu kmene viru (tj. výhodně divokého typu kmene, ze kterého byl tento vektor odvozen, a který neobsahuje tuto sekvenci) a (2) sekvence nukleové kyseliny, jejíž zahrnutí optimálně představuje selektivní výhodu pro buňku, která je infikována vektorem, obsahujícím tuto sekvenci, ve srovnání s buňkami, infikovanými nebo neinfikovanými divokým typem kmene vím (tj. výhodně divokým typem kmene, ze kterého byl tento vektor odvozen (a také například helper expresní vektor, který promotuje replikaci vektoru a/nebo funkci v neinfikované hostitelské buňce), a který neobsahuje tuto sekvenci, například promocí buněčného přežívání, promocí produkce a/nebo propagace vektorové částice, promocí produkce virionů vektoru crHIV z buněk, produkujících crHIV vektor, indukováním apoptózy, usnadňováním produkce nebo promoce imunologické funkce nebo cílení, tak, aby bylo dosaženo požadovaného • · profylaktického, terapeutického nebo biologického účinku výsledku. Každá z těchto sekvencí nebo mnohé z těchto sekvencí, tj. sekvence, které samy nebo v kombinaci s jiným faktorem(y), promotuje propagaci vektoru a/nebo promotuje příslušnou funkci hostitelské buňky tak, aby byl umožněn příznivý profylaktický, terapeutický nebo biologický výsledek, může být obsažena ve vektoru, buď za nepřítomnosti nebo v přítomnosti jiných sekvencí, tj. vektor může obsahovat „nejméně jednu sekvenci nukleové kyseliny“ a „nejméně jednu doplňkovou sekvenci nukleové kyseliny“.

Třetím typem sekvence nukleové kyseliny je sekvence, která představuje fenotyp hostitelské buňky, který zmenšuje, minimalizuje nebo zabraňuje virové infekci. Takové sekvence nukleové kyseliny zahrnují sekvence, které kódují produkt genu, který, pokud je exprimován, chrání hostitelskou buňku před virovou infekcí. Například, jedinci, homozygotní na Δ32 alelu CCR5 proteinu, byli chráněni proti HIV-1 infekci v důsledku neexistence hlavního koreceptoru pro vstup HIV-1 do buněk, expresí porušeného CCR5 proteinu na jejich povrchu. Studie s heterozygotními jedinci ukázaly, že Δ32 alela má transdominantní účinek na expresi divokého typu (dt) CCR5 na buněčném povrchu. Toto může být důsledkem schopnosti Δ32 alely se dimenzovat s dt proteinem a zabraňovat správné expresi na buněčném povrchu.

Alela Δ32 obsahuje deleci 32 nukleotidů, což způsobuje mutaci mřížky, vedoucí k porušenému CCR5 proteinu. Protože toto porušení se týká 31 aminokyselin na C-konci alely Δ32, které nejsou přítomny ve dt proteinu a mohou tvořit nežádoucí imunitní odpověď, pokud jsou přítomny na buněčném povrchu, zahrnuje předkládaný vynález expresi porušeného mutantního CCR5A32 proteinu (CCR5Δ32T), který postrádá 31 těchto potenciálně antigenních aminokyselin. Tento protein si zachovává svoji schopnost předávat transdominantní účinek, aby byly získány buňky s ochranou proti HIV infekci. Tato sekvence, kódující CCR5Δ32T je snadno vytvořena zavedením stop kodonu bezprostředně po poslední aminokyselině, společné jak dt CCR5, tak i CCR5A32 (po tyrosinu v poloze 184).

V dalším provedení je dalším třetím typem sekvence nukleové kyseliny ta sekvence, která dále zesiluje přenášený fenotyp zmenšování, minimalizace nebo ochrany proti virové infekci. Taková sekvence nukleové kyseliny může kódovat genetické antivirové činidlo, které je například namířeno na buněčný gen. Například vektor může exprimovat shora uvedený CCR5A32T mutantní protein a kromě toho exprimovat antisense nebo ribozymovou molekulu, z promotoru Ul a obsaženou v Ul snRNA (popsáno v US patentu 5 814 500), která je například cílena na divoký typ CCR5 molekuly. Antisense oblast, která je cílena na divoký typ CCR5, bude degenerována ve vektorem nesené CCR5A32T sekvenci a vytvoří transdominantní • · · · ·· · · • · mutantní RNA, rezistentní vůči účinkům anti-CCR5 antisense nebo ribozymových molekul, ale bude překládána do správné aminokyselinové sekvence za vzniku funkčního CCR5A32T protein.

Shora uvedený způsob současné exprese ribozymu nebo antisense úseku cíleného na genový produkt a degenerování tohoto genu v cílových místech pro zabránění vazby nebo štěpení ribozymu nebo antisense úseku není omezen na CCR5 ani na molekulu, která může minimalizovat virovou replikaci. Dalším neomezujícím příkladem terapeutické aplikace, je cílení onkogenního proteinu, jako je Bcr-Abl fuzní protein, který je etiologickým činidlem pro chronickou myelogenní leukémii. Vektorový konstrukt, obsahující gen Ber nebo Abl nebo oba, může tyto geny exprimovat současně s expresí antisense úseku nebo ribozymu, který je cílen na libovolné místo podél Bcr-Abl transkriptu. Tento abnormální Bcr-Abl fúzní transkript pak bude zničen, zatímco nativní Ber nebo Abl nebo oba budou exprimovány, aby byl tento abnormální defekt odstraněn. Ber nebo Abl geny mají tedy selektivní výhodu v zesílení vzhledem divokému typu nebo k abnormálnímu Bcr-Abl fuznímu genu. Výhodný vektor bude exprimovat Ber a/nebo Abl konstrukt z jejich nativních promotorů, zatímco anti-Bcr-Abl ribozymové nebo antisense sekvence budou exprimovány z Ul promotoru a obsaženy v Ul snRNA sekvencích.

Shora uvedený příklad Bcr-Abl neomezuje tento vynález na cílení onkogenů a odborníkovi v této oblasti techniky je být zřejmé, že tento přístup by mohl být použit pro terapeutickou nebo profylaktickou substituci libovolného abnormálního genu, nežádoucího genu nebo dokonce žádoucího zájmového genu(ů). Cílový gen může být homologní nebo heterologní k modifikovanému genu, který je rezistentní vůči účinkům této genetické antivirové molekuly. Další chorobné stavy, které mohou být cílem tohoto způsobu, jsou zřejmé odborníkům v oblasti lékařské a klinické techniky. Molekulární cíle pro léčbu krevních chorob způsobem podle zde popisovaného vynálezu jsou například popsány v „The molecular basis of blood diseases“ (Stamatoyannopoulos, Majerus, Perlmutter & Varmus, 3. vyd., Philadelphia: WB Saundres Co., copyright 1987,1994 a 2001, které je zde tímto začleněno citací).

Tento vynález by neměl být omezen ani jenom na klinické aplikace. Tento přístup může být použit pro určení funkce zájmové genové sekvence. Například zájmová genová sekvence, modifikovaná v oblasti, která nás zajímá, může být současně exprimována s antisense nebo s ribozymovou sekvencí, která inhibuje nebo rozrušuje sekvenci veškerého nemodifikovaného genu, cílením na odpovídající nemodifikovanou oblast. Zájmová sekvence modifikovaného genu tak bude mít selektivní výhodu vzhledem k zesílené expresi vůči sekvenci ···· • · • · · · ·· ··« · • · · · · · · • · · · · * ·· · • · · · ··· · · • · ·· · ···· ··· ····· · · · · nemodifikovaného genu, což umožňuje stanovení funkce sekvence modifikovaného genu nebo jím kódovaného genového produktu analytickými metodami známými v této oblasti techniky.

Termín „nukleová kyselina“ má dříve popsaný význam. „Sekvence nukleové kyseliny“ konkrétně zahrnuje jakoukoli genovou nebo kódující sekvenci (tj., DNA nebo RNA) potenciálně libovolné velikosti (tj. ovšem omezené jakýmikoli obalovacími omezeními, která jsou dána vektorem), jejíž přítomnost přináší selektivní výhodu, jak je zde dále definována. „Gen“ je jakákoli sekvence nukleové kyseliny, kódující protein nebo nascentní molekulu mRNA (bez ohledu na to, zdaje tato sekvence transkribována a/nebo translatována). Zatímco gen zahrnuje kódující sekvence stejně jako nekódující sekvence (např. regulační sekvence), „kódující sekvence“ neobsahuje žádnou nekódující DNA.

1.Sekvence nukleové kyseliny, její přítomnost s sebou nese selektivní výhodu hostitelské buňce pro vektor nesoucí tuto sekvenci, vzhledem k divokému typu kmene viru nebo soutěžící genomové sekvenci, která by interferovala nebo ovlivňovala amplifikaci vektoru.

Sekvence nukleové kyseliny, která uděluje selektivní výhodu vektoru v hostitelské buňce, vůči divokému typu kmene viru, je výhodně libovolnou sekvencí, která umožňuje, aby byly virové částice, které jsou rozmnožovány vektorem, selektivně produkovány nebo obaleny, ve srovnání s virovými částicemi, které jsou rozmnožovány divokým typem viru. Tyto sekvence zahrnují, ale bez omezení na ně, sekvenci, jejímž výsledkem je zvýšení počtu vektorových genomů, produkovaných vnitrobuněčně, ve srovnání s s divokým typem genomu, a antivirovou sekvenci nukleové kyseliny. Tyto sekvence také obsahují, ale bez omezení na ně, sekvenci, jejímž výsledkem je zvýšení počtu, vlastnosti nebo stavu vektorového genomu, který je produkován vnitrobuněčně, ve srovnání s divokými typy genomů, které nejsou odvozeny od příbuzného divokého typu viru.

První kategorií sekvencí nukleových kyselin, které předávají selektivní výhodu v hostitelské buňce na vektor, který obsahuje tuto sekvenci, ve srovnání s divokým typem kmene viru, jsou sekvence, jako je promotor. „Promotor“ je sekvence, která řídí vazbu RNA polymerázy a tím podporuje RNA syntézu, a která může obsahovat jeden nebo více zesilovačů. „Zesilovače“ jsou cis-účinkující elementy, které stimulují nebo inhibují transkripci sousedících genů. Zesilovač, který inhibuje transkripci, je také nazýván jako „silencer“. „Silencerem“ může být také „izolační“ element, jako je tomu u DNAza-hypersenzitivních míst kuřecího erytroidního izolačního elementu. Zesilovače se liší od DNA-vazebných míst pro sekvenčně-specifické DNA vážící proteiny, nalézajících se pouze v promotoru (které jsou také označovány

9 9 9 9 9 •9 9999

··· „promotorové elementy“), v tom, že zesilovače mohou fungovat v obou směrech a ve vzdálenostech až do několika párů kilobází (kb), dokonce z polohy po směru za přepisovanou oblastí.

V souhlase s tím a výhodně je promotor (např. dlouhá terminální opakující se oblast (LTR)) podmíněně se replikujícího HIV vektoru) modifikován tak, aby tento vektor byl citlivější vůči některým cytokinům, než je divoký typ kmene HIV. Například je dostupný modifikovaný HIV promotor, který demonstruje zvýšenou transkripční aktivitu v přítomnosti interleukinu-2. Zabudování tohoto promotoru do vektoru a introdukce tohoto vektoru do divokého typu buněk, infikovaných HIV, výhodně vede ke zvýšené produkci a obalení potomstva virionů vektorového genomu ve srovnání s divokým typem HIV genomu. Jiné cytokiny a/nebo chemokiny (např. včetně, ale bez omezení na ně, interferonu-α, a-faktoru tumorové nekrózy, RANTES apod.) mohou být podobně využity pro promoci selektivního obalování virionů kódovaných vektorem. Umístění elementů, které činí HIV-LTR citlivým na cytokiny, žádným způsobem neomezuje rozsah tohoto vynálezu na tato provedení. Do HIV-LTR může být inzertována libovolná nukleotidová sekvence, aby byla modifikována citlivost tohoto promotoru. Seznam faktorů, které se váží na DNA místa, které mohou být inzertovány do HIV-LTR, lze nalézt v http://transfac.gbf.de/TRANSFAC/lists/browse.html, přístupné od 8. září 2000, který je tímto začleněn citací ve své celistvosti. Seznam faktorů, vážících se na DNA, pro Homo sapiens (http://transfac.gbf.de/TRANSFAC/lists/factor/species/humanHomosapiens.html), přístupný od 8. září 2000, je obdobně tímto začleněn ve své celistvosti citací.

Podobně mohou být silencery nebo izolátory vloženy také do oblastí promotoru nebo zesilovače nativní nebo modifikované retrovirové LTR, jako je HIV-LTR, aby byla exprese tímto promotorem přesně regulována. V určitých případech mohou elementy, vkládané do HIVLTR, přinést tomuto vektoru selektivní nevýhodu s ohledem na infekci divokým typem viru. Účelem aplikace tohoto typu vektoru však může být místo soutěžení s divokým typem viru v obalování do virionů potomstva spíše exprese zájmové sekvence nukleové kyseliny („užitečného genu“), která například inhibuje HIV replikaci bez kompetice. V tomto případě první sekvence nukleové kyseliny neposkytuje vektoru selektivní výhodu, ale musí alespoň například inhibovat rekombinaci mezi vektorem a pomocnou sekvencí - „helperem“ - v průběhu procesu produkce vektoru.

Druhá kategorie sekvence nukleové kyseliny, která předává selektivní výhodu vektoru, který tuto sekvenci obsahuje, ve srovnání s divokým typem kmene viru, zahrnuje jako výhodnou sekvenci nukleové kyseliny antivirovou sekvenci nukleové kyseliny. „Antivirová činidla“ jsou kategorizována podle způsobu jejich účinku, např. jako inhibitory reverzní transkriptázy, * « φφφφ • φ φφφφ φφ φ * φ φ φφ φφ konkurenti vstupu virů do buňky, vakciny, proteázové inhibitory a genetická antivirová činidla. „Genetická antivirová činidla“ jsou molekuly DNA nebo RNA, které jsou přeneseny do buněk a ovlivňují jejich intracelulární cíle buď přímo (tj. tak jak byly intracelulámě zavedeny) nebo po jejich konverzi buď na RNA nebo protein (viz přehledný článek Dropulič et al. (1994), výše). Genetické antivirové sekvence jsou také výhodnými sekvencemi nukleové kyseliny. Genetická antivirová činidla zahrnují, ale bez omezení na ně, antisense molekuly, klamné RNA, transdominantní mutanty, toxiny, modifikátory a modulátory RNA a sestřihu proteinů, EGS (samotné nebo v přímém spojení s elementy Ml, Ul, PRE nebo CTE), imunogeny, RNAi (viz Zámoře et al. Cell 101: 25 až 33,(2000)), nukleotidové sekvence nebo molekuly, které modifikují nebo modulují sestřih, konstitutivní transportní elementy (CTE), jaderné exportní a importní faktory, DNA integrační faktory, RNA stabilizující nebo destabilizuj ící elementy, posttranskripční regulační elementy (PRE), proteiny, které interferují s replikací viru, interferony, toxiny, imunogeny (definované jakýmkoli genem, který je imunologicky příbuzný), protilátky (úplné protilátky, jednořetězcové protilátky nebo molekuly vykazující ligandy), ribozymy nebo jakýkoli element, který ovlivňuje kterýkoliv aspekt replikace vektoru nebo divokého typu viru, a ribozymy. Je žádoucí, je-li genetickým antivirovým činidlem antisense molekula, transdominantní mutant, imunogen a ribozym. Výhodnou sekvencí nukleové kyseliny, která předává vektoru selektivní výhodu vzhledem k divokému typu kmene viru, je tedy sekvence antivirového genetického činidla, vybraného ze skupiny, která se skládá z antisense molekuly, imunogenu a ribozymu.

Genetická antivirová činidla, jak se používají v předkládaném vynálezu, jsou omezena pouze na cílení virové sekvence, zvláště, když nejsou umístěna v podmíněně se replikujících virových vektorech. Jako neomezující příklad může být genetická antivirová sekvence umístěna v lentivirovém vektoru tak, že toto činidlo je směrováno na virové nebo nevirové cíle, například buněčné, bakteriální nebo parazitické cíle. V tomto případě obsahuje lentivirový vektor zájmový gen, operativně připojený k nemodifikované nébo modifikované HIV-LTR (k exprimované sestřižené nebo nesestřižené RNA) a kromě toho genetické antivirové činidlo nebo sekvenci, která je vázána na promotorovou sekvenci, která není operativně spojena s HIV-LTR.

Výhodnou sekvencí je antisense sekvence nebo ribozymy, které jsou chimérické s snRNA, výhodně Ul, U2, U3, U4, U5 nebo U6 snRNA.

Genetické antivirové činidlo není také omezeno na jedinou sekvenci nebo jediný typ sekvence, přítomné buď ve vektoru nebo v helperu. V konstruktu vektoru nebo helperu mohou být současně přítomna dvě nebo více činidel, buď umístěných distálně nebo výhodně spojených v tandemu. Je výhodné, když jsou v tandemu spojena dvě nebo více různých antivirových «999 *

* · 9 ·» »« 99«« 9« «9*9 « » 9 »9 9 »999 9 9 · * 9 »999 9 • 9 · «999 ♦ *· » · 9« genetických činidel. Dalším provedením genetického antivirového činidla pro použití podle vynálezu je kterékoliv, které váže dva různé typy genetických antivirových činidel.

„Antisense molekula“ je molekula, která, na bázi pravidel párování bází a dostupnosti kolísavého párování bází, je „zrcadlovým obrazem“ krátkého segmentu genu, jehož exprese má být blokována. Antisense molekula směrovaná proti HIV hybridizuje s divokým typem HIV RNA, a tak umožňuje její přednostní odbourání buněčnými nukleázami. Antisense molekulami jsou výhodně DNA oligonukleotidy, vhodně od 20 do 200 párů bází do délky, výhodně od 20 do 50 párů bází délky a optimálně méně než 25 párů bází délky. Antisense molekula může být exprimována z RNA crHIV, která se výhodně váže ke genomové RNA divokého typu, čímž poskytuje RNA crHIV se selektivní výhodou pro obalování do virionů potomstva.

Antisense molekuly, exprimované ve vektorech jako RNA, jsou výhodně nejméně 20 bází až libovolně dlouhé, ale výhodně do 2000 párů bází délky, výhodněji 50 až 500 párů bází délky. Tyto antisense molekuly se výhodně váží na genomovou RNA divokého typu a ne na vektorovou RNA, čímž poskytují vektor se selektivní výhodou vzhledem k divokému typu viru. Výhodnou oblastí pro vznik antisense molekuly ve vektoru, odvozeném od HIV viru, je například oblast obálky (env), oblasti proteinů Tat nebo Rev, oblasti akcesorických genů (Vif, Nef, Vpr, Vpu), oblasti Gag, které jsou 3' vzhledem k místu Nsi I restrikčního enzymu na pNL4-3, a oblasti Pol, které neobsahují oblast Pol 545 bází, jak je uvedeno níže.

„Imunogen“ označuje libovolný, imunologicky příbuzný gen a jím kódovaný genový produkt. I když historicky byl termín „imunogen“ použit ve vztahu k adjuvantu, použitému při vakcinaci, jsou termíny „imuno-,, a ,,-gen“ zde používány pro označení imunologicky příbuzného genu a jím kódovaného genového produktu. Imunogen může například kódovat jednořetězcovou protilátku (scAb) směrovanou proti virovému strukturnímu proteinu nebo může kódovat protilátku, která je vylučována buňkou extracelulámě. Imunogen je přenášen jako nukleová kyselina a je exprimován intracelulámě. Podobně může imunogen také kódovat libovolný antigen, povrchový protein (včetně těch, které jsou omezeny třídou) nebo jakoby signální protilátku, která usnadňuje selekci vektoru a/nebo hostitelské buňky. Ve výhodném vektoru obsahuje sekvence nukleové kyseliny scAb kódující sekvenci, která se váže na divoký typ HIV Rev proteinu. To výhodně zabraňuje dozrávání Rev proteinu tím, že vede k jeho zadržení v endoplazmatickém retikulu. Rev proteiny, samotné nebo ve spojení s jinými buněčnými faktory, konkrétně exportují nesestřižené a jednoduše sestřižené HIV RNA z jádra do cytoplazmy vazbou na RRE (vysoce strukturovaná cis-účinkující RNA cílová sekvence pro Rev, nazývaná elementem citlivým na Rev) a poté oligomerizují a obklopují tak HIV RNA. HIV RNA, které jsou v komplexu s Rev, jsou exportovány do cytoplazmy a obcházejí mechanismus

4 ’č 0

0» 00*0 ·· 0004 • 0 000« * 0 0 * 0 0 000 0··

0000 »000 0 000 00 0 0 > 0 >

0 4Λ «0 00« 00 00 buněčného sestřihu. Jestliže se tedy divoký typ Rev neváže na divoký typ RRE, potom nejsou RNA divokého typu HIV exportovány do cytoplazmy a nejsou enkapsidovány do virionů potomstva.

Je optimální, když vektor, obsahující sekvenci scAB nukleové kyseliny, dále obsahuje modifikovanou RRE sekvenci a kóduje mutovaný Rev protein, který rozezná modifikovaný, ale ne divoký typ RRE. V souhlase s tím, v buňkách, které obsahují divoký typ HIV a vektor, který obsahuje scAb sekvenci nukleové kyseliny, je vektor výhodně zabalen do virionů. Podobná strategie se výhodně použije, když jsou cílem pro scAB proteiny divokého typu HIV matrice nebo nukleokapsid (nebo jakýkoli protein, účastnící se interakcí protein/RNA, které ovlivňují enkapsidaci virové RNA).

„Ribozym“ je antisense molekula s katalytickou aktivitou, tj. místo vazby RNA a inhibování translace, váží ribozymy RNA a ovlivňují místně-specifické štěpení vázaných molekul RNA. Obecně jsou čtyři skupiny ribozymů: intervenující sekvence Tetrahymena skupiny I, EGS (externí vedoucí sekvence) a ribozymy typu hammerhead a hairpin. Existují však také další katalytické motivy v jiných molekulách RNA, např. delta viru hepatitidy a ribozomální RNA v mitochondriích hub).

Výhodným ribozymem je ribozym, ve kterém katalytická doména štěpí 3'nukleotidovou sekvenci NUH, kde N může být libovolný nukleotid (tj. G, A, U nebo C) a H může být buď A, C nebo U. Pokud je však sekvencí, která je nejúěinněji štěpena tímto ribozymem, místo GUC, potom NUH sekvence výhodně obsahuje GUC místo.

Je žádoucí, když takový ribozym štěpí v oblasti divokého typu kmene viru nebo jeho transkriptů, ale neštěpí v oblasti vektoru nebo jeho transkriptů. Ribozym štěpí virus nebo jeho transkripty v tom smyslu, že tímto virem nebo vektorem může být buď RNA nebo DNA, jak již bylo dříve uvedeno. Pod štěpením „v oblasti“ je myšleno štěpení v cílové oblasti, tj. výhodně v oblasti viru, která je nezbytná pro propagaci viru. Je žádoucí, když je vektor modifikován tak, že tato konkrétní cílová oblast (pokud je vůbec ve vektoru přítomna), není ribozymem štěpena. Ribozym může popřípadě štěpit vektor, pokud štěpení neprobíhá v oblasti, která je potřebná pro množení virových, např. crHIV částic.

Je optimální, když je tento ribozym kódován sekvencí, vybranou ze skupiny, která se skládá z SEQ ID NO:3 (tj.

CACACAACACTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACGGGCACA) a SEQ ID NO: 4 (tj. ATCTCTAGTCTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACAAGAGTC). Zatímco SEQ ID NO:3 zahrnuje ribozym, který je cílen na +115 místo (tj., v jednotkách počtu baží ve směru od startu • · · ·

transkripce) oblasti U5 divokého typu HIV, SEQ ID NO:4 zahrnuje ribozym, který je cílen na místo +133 oblasti U5 divokého typu HIV.

Takový ribozym je schopen štěpit v rámci genomu divokého typu HIV (nebo jeho transkriptů), ale ne v genomu vektoru (nebo jeho transkriptů), pokus jsou U5 sekvence vektoru modifikovány in vitro místně směrovanou mutagenezí, jak je známa v této oblasti techniky a popsána v příkladu 1. Tyto vektorové sekvence jsou zejména výhodně modifikovány tak, že vektor zahrnuje sekvenci, vybranou ze skupiny, která se skládá z SEQ ID NO:2 (tj. GTGTGCCCACCTGTTGTGTGACTCTGGCAGCTAGAGAAC), SEQ ID NO:5 (tj. GTGTGCCCGCCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATC), SEQ ID NO:6 (tj. GTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGCAACTAGAGATC), SEQ ID NO: 14, kde je nejméně jeden N mutován, SEQ ID NO: 15 a SEQ ID NO: 16. Ve formě RNA tento vektor výhodně zahrnuje sekvenci, kódovanou sekvencí, vybranou ze skupiny, která se skládá z SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:14, kde je nejméně jeden N mutován, SEQ ID NO:15 a SEQ ID NO: 16. Naopak, divoký typ HIV zahrnuje US sekvenci, kódovanou sekvencí SEQ ID NO:1 (tj. GTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATC). Tyto modifikace jako celek a srovnání s divokým typem sekvence U5 (ve formě DNA) jsou uvedeny na obrázku 2.

Kromě toho mohou být použity jiné ribozymy cílené na jiné oblasti virového, zejména HIV genomu, samotné nebo v kombinaci. Například může ribozym štěpit v rámci jiných RNA sekvencí, potřebných pro replikaci viru, např. v rámci reverzní transkriptázy, proteázy nebo transaktivačního proteinu, v rámci Rev nebo v rámci dalších nepostradatelných sekvencí, tak jak byly popsány. Je výhodné, když vektor obsahuje více ribozymů, např. cílených na více míst.

V těchto případech jsou analogické sekvence ve vektoru modifikovány místně směrovanou mutagenezí nebo některým jiným způsobem, známým v oboru, a vzniká vektor, který je rezistentní proti tomuto ribozymovému štěpení.

Pokud je vektorem virus lidské imunodeficience, pak tento vektor s výhodou postrádá tat gen a 5' místo sestřihu pro tat gen a místo něho obsahuje trojitou anti-Tat ribozymovou kazetu, v níž katalytická doména každého ribozymů z trojité kazety štěpí jiné místo molekuly virové nukleové kyseliny divokého typu lidské imunodeficience, zejména jiné místo v rámci tat. Je výhodné, když katalytická doména každého ribozymů štěpí nukleotidovou sekvenci v oblasti molekuly nukleové kyseliny divokého typu lidské imunodeficience, pro kterou neexistuje v samotném vektoru na ribozym citlivý protějšek.

Další provedení ribozymů, jako genetického antivirového činidla, je získáno v ribozymech, které cílí na sekvence nejen podle Watsonova a Crickova principu párování bází, • · ale také podle kolísavého párování bází G-U. Předchozí studie ukázaly, že kolísavé párování GU ve dvoušroubovicové RNA má podobné znaky jako párování bází podle Watsona a Cricka. Uvažuj eme-li vysokou mutační rychlost, i vysoce konzervovaných oblastí, HIV, která dává vzniknout různým kmenům HIV, pak schopnost sestrojit ribozym, který cílí na více kmenů, poskytuje tomuto vynálezu dramatickou výhodu. Například vysoce konzervativní cílová oblast v genu tat, která může být použita jako cílová sekvence pro ribozymy podle vynálezu, obsahuje u 40 dobře definovaných HIV-1 kmenů buď „G“ nebo „A“. Ribozym, cílící na tuto oblast, může tedy být sestrojen tak, aby v příslušné cílené sekvenci obsahoval „U“ místo „C“ , aby bylo umožněno párování buď se zbytkem „G“ nebo „A“. Toto lze porovnat s použitím „C“ v cílené sekvenci, které by snížilo schopnost ribozymu být zacílen na HIV-1 kmeny, které obsahují „A“ v odpovídající poloze. Tento přístup, používající „U“, kdekoliv existuje v cílové poloze pro rozpoznání ribozymem variabilita G, A, významně zvyšuje výhodnost ribozymů podle vynálezu.

Dalším provedením vynálezu v praxi je použití ribozymové kazety (která obsahuje více než jeden ribozym vázaný v tandemu), degenerované tak, že se nejedná o přímo opakovanou sekvenci ve vektoru. Přítomnost degenerovaných sekvencí zabraňuje deleci opakovaných sekvencí, která je pozorována v retro virových vektorech a v jiných nukleových kyselinách. Ribozymová kazeta, složená z tandemově uspořádaných přímo opakovaných sekvencí, totiž může být během vícenásobných cyklů replikace deletována. K překonání tohoto problému lze použít degenerovaných ribozymových sekvencí, protože například sekvence v katalytické doméně ribozymové molekuly typu hammerhead mohou být bez významné ztráty aktivity substituovány jinými nukleotidyna základě kolísavého párování bází. Mutageneze ribozymů typu hammerhead byla již provedena a byla stanovena místa, která mohou být degenerována (Rufíner DE, Stormo GD, Uhlenbeck OC. Sequence requirements of the hammerhead RNA self-cleaving reaction. Biochemistry. 1990 Nov 27; 29(47):10695 až 10702). Jiným způsobem snižování pravděpodobnosti deleci je směrování jednotlivých ribozymů z kazety na různá cílová místa cílové RNA. V kazetě se tedy nebudou vyskytovat přímé opakované sekvence.

„Transdominantní“ nebo „dominantně negativní“ sekvence nukleové kyseliny předává jí kódovaný fenotyp i v přítomnosti sekvence divokého typu (wt). Příkladem je shora uvedená diskuse zkráceného CCR5 proteinu. Jiné příklady zahrnují libovolnou mutantní retro virovou nebo lentivirovou sekvenci, která přenáší transdominantní fenotyp. Příklady zahrnují geny rev a gagPříkladem použití pro na získání selektivní výhody, stejně jako pro inhibici infekčního divokého typu viru, jsou transdominantní gag sekvence, o kterých bylo zjištěno, že inhibují HIV-1 replikaci, pravděpodobně prostřednictvím interference s konstrukcí kapsidy. Tato

sekvence se pak s výhodou používá ve spojení s retrovirovým vektorem, který není založen na HIV-1, což umožňuje jeho replikaci a obalení, aniž by byl touto transdominantní sekvencí inhibován. Například retrovirový vektor, který obsahuje HIV-2 gag a pol sekvence, může zahrnovat transdominantní HIV-1 gag sekvenci. Tento vektor může být replikován a obalen pomocí komplementace s příslušným HIV-2 helperovým vektorovým konstruktem. Po umístění v buňce, která je vystavena infekci HIV-1, je transdominantní gag sekvence po infekci HIV-1 k dispozici pro expresi za účelem blokování mobilizace HIV-1 viru. Geny gag a pol, kódované retrovirovým vektorem HIV-2, jsou však stále k dispozici pro zapouzdření a mobilizaci vektoru.

2. Sekvence nukleové kyseliny, jejíž přítomnost přináší buňkám infikovaným nebo neinfikováným vektorem, který obsahuje tuto sekvenci, selektivní výhodu ve srovnání s buňkami infikovanými divokým typem viru.

Sekvencí nukleové kyseliny, která přináší selektivní výhodu buňce obsahující vektor zahrnující tuto sekvenci, v porovnání s buňkou obsahující nebo neobsahující divoký typ kmene viru (tj. které tato sekvence chybí), je výhodně jakákoli sekvence, která umožňuje buňce, obsahující tento vektor, přežít a rozmnožovat virové částice (tj. virové částice crHIV), ve srovnání s buňkou obsahující divoký typ viru nebo s buňkou, které tato sekvence nukleové kyseliny chybí. Takové sekvence zahrnují, ale bez omezení na ně, libovolnou sekvenci, která umožní buňce nebo vektoru, obsaženému v této buňce, se vyhnout destrukci sekvencí, které podporují přežití buněk, sekvencí, které indukují apoptózu, sekvencí, které usnadňují produkci proteinu nebo sekvencí, které podporují imunitní funkci nebo cílení.

Taková sekvence nukleové kyseliny obsažená ve vektoru například přednostně kóduje geny pro širokospektrální rezistenci vůči léčivům (viz např. Ueda et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 141,956 až 962, (1986); Ueda et al., 262,505 až 508 (1987) a Ueda et al., PNAS, 83, 3004 až 3008 (1987)). V přítomnosti přidaného cytotoxického léčiva (např. jaká se používají pro chemoterapii rakoviny) toto umožňuje přežít buňce, obsahující vektor, zatímco buňka, obsahující divoký typ viru, jako je HIV, nepřežije. Tato cytotoxická léčiva zahrnují, ale bez omezení na ně, aktinomycin D, sulfát vinblastinu, sulfát vinkristinu, BCNU (s kondicionováním BG nebo bez něho), daunomycin, adriamycin, VP-16 a AMS A.

Jiným příkladem této sekvence nukleové kyseliny je libovolná sekvenční varianta O⁶methylguanin-DNA-methyltransferázy (MGMT). MGMT může být použita pro ochranu předchůdců hematopoetických buněk před toxicitou alkylačních činidel. Divoký typ MGMT je inhibován O⁶-benzylguanidinem (BG), který potencuje toxicitu alkylačních činidel. Podle • · · · • · · · · · · • · · · · · ·· · • · · · ··· · · • · · · · ···· ··· ····· ·· · · vynálezu lze dodat kterékoli buňce varianty MGMT, které jsou rezistentní na BG zprostředkovanou aktivaci a jsou schopny chránit proti alky lačním činidlům. Jedním příkladem takové varianty je G156A MGMT.

Například je možno po podání BG a 06-guanin methylačního nebo chlorethylačního činidla selektovat hematopoetické prekurzorové buňky, transdukované touto variantou předkládaného vynálezu. Příklady takových methylačních činidel pro použití podle tohoto vynálezu zahrnují, ale bez omezení na ně, klinicky relevantní temozolomid, nitrosomočoviny, tetraziny, triaziny, dakabazin, temozolomid, streptozotocin, prokarbazin. Příklady chlorethy lační ch činidel zahrnují, ale bez omezení na ně, BCNU (l,3-bis(2-chlorethyl)-lnitrosomočovina), CCNU (3-cyklohexyl-l-chlorethyl-nitrosomočovina), ACNU (l-(4-amino-2methyl-5-pyrimidinyl)methyl-3-(2-chlor)-3-nitrosomethylmočovina) a MeCCNU (1-(2chlorethyl)-3-(4-methylcyklohexyl)-l-nitrosomoěovina. Alkylaěním činidlem je výhodně BCNU.

Bylo zjištěno, že BCNU vytváří jak v klidových, tak v cyklujících buňkách trvalou kovalentní meziřetězcovou lézi DNA. Tato poškození jsou cytotoxická pro buňky v průběhu replikace DNA. MGMT je primárním mechanizmem DNA opravy lézí BCNU. Vzhledem k jeho toxicitě vůči klidovým buňkám, může selekce pomocí variant MGMT, dodávaných lentivirovými vektory podle vynálezu, také umožnit selekci všestranně účinných hematopoetických kmenových buněk (HSC), které jsou převážně ve fázi Go buněčného cyklu, ale které střídavě cyklují, aby mohly produkovat více kmenových buněk a prekurzorů krevních buněk. Kmenové buňky jsou obecně rezistentní vůči retro virové transdukci, ale mohou být transdukovány retro virovými vektory, jenom pokud nejsou ve stavu fáze Go buněčného cyklu. Podobně jako onko-retroviry, mohou být i lentivirové vektory podle vynálezu použity pro transdukci hematopoetických kmenových buněk, včetně stanovitelných hematopoetických ELTC-IC a NOD-SCID nebo SCID-hu pasážovaných buněk. Na rozdíl od onkoretrovirů však podmínky cytokinů nezbytné pro transdukci kmenových buněk bez jejich diferenciace pravděpodobně zvýhodňují lentivirové vektory, protože lentiviry (např. HIV) mohou infikovat buňky, které se aktivně nedělí v době infekce. HSC selekce není možná u jiných strategií, které selektují cyklující prekurzory hematopoetických buněk. Selekce, zprostředkovaná variantami MGMT a lentivirovými vektory podle vynálezu tedy může zvyšovat výskyt transdukovaných všestranně účinných HSC, aniž by pro selekci vyžadovala prodlouženou dobu podávání léčiva.

Na shora uvedenou diskusi lze pohlížet v kontextu hemetopoetických buněk in vitro a ex vivo, stejně jako in vivo. Kromě transdukce buněk variantami MGMT in vivo mohou tedy být hematopoetické buňky transdukovány ex vivo s následující medikamentózní léčbou buď ex vivo ·· · · • · • · · ·

4 4 4 4

4 4

4 4

4 4 4 4

nebo in vivo. Tyto ex vivo léčené buňky mohou být potom zavedeny infuzí do subjektu, popřípadě jako součást repopulace kostní dřeně transdukovanými buňkami.

Před aplikací takového postupuje možno rovněž použít alkylační činidlo BCNU obecně pro snížení HIV infikovaných CD4+ buněk v HIV pozitivním subjektu. Jak je uvedeno shora, vytváří BCNU (po zbavení endogenního MGMT) cytotoxické léze v klidových i v proliferujících buňkách. Tyto léze se tvoří i bez nuceného úbytku MGMT, pokud dávka léčiva překročí hladinu funkčního AGT proteinu. Opakovaná systémová léčba pomocí BCNU způsobuje kumulativní myelosupresi a pancytopenii. Mezi lymfatickými buňkami se CD4+ buňky zdají být pozoruhodně citlivé vůči BCNU. V subjektech infikovaných retroviry, jako jsou pacienti s infekcí HIV, bude podávání BCNU, i při malých dávkách, je-li požadováno odstranění myelosuprese, zmenšovat celkovou populaci CD4+ buněk a tím snižovat zatížení virem. Tento přístup může být následován infuzí hematopoetických prekurzorů, jak je diskutováno shora.

Protože BCNU může účinkovat „kradmým“ způsobem a vytvářet cytotoxické léze i v klidových buňkách, má tento přístup další výhodu ve snižování nutnosti opakovaných léčebných zásahů. Tento přístup může být, samozřejmě, spojen s použitím BG pro zesílení účinku BCNU. Alternativně může být tento přístup použit ve spojení s přenosem variant MGMT vektory podle vynálezu, aby bylo dosaženo ochrany transdukovaných CD4+ buněk. Posledně uvedený způsob může být buď nezávislý nebo ve spojitosti s léčbou hematopoetických buněk, jak bylo uvedeno shora. Výhodným provedením vynálezu je tudíž exprese mutantní MGMT (druhá sekvence nukleové kyseliny) ve vektoru, který obsahuje anti-HIV antisense sekvenci nebo ribozym (první sekvence nukleové kyseliny), takže vektor poskytuje jak selektivní výhodu oproti buňkám infikovaným divokým typem HIV, tak selektivní výhodu oproti divokému typu HIV viru. Dalším výhodným provedením je, že vektor exprimuje MGMT gen (čili druhou sekvenci nukleové kyseliny) mimo HIV-LTR promotor, jako sestřiženou mRNA.

Konečně, i když vektory exprimují anti-HIV ribozymy nebo antisense sekvence, není vynález takto omezen, protože odborník může snadno do inzertovat libovolnou inhibiční nukleotidovou sekvenci do vektoru pro konkrétní terapeutický, profylaktický nebo biologický účinek. Výhodným způsobem pro expresi inhibiční sekvence je ji zahrnout do U1 snRNA/promotorové kazety, jak je popsáno u Dietz (US patent 5 814 500).

Může být také žádoucí, jestliže sekvence nukleové kyseliny zahrnuje sekvenci vybranou ze skupiny, skládající se ze sekvence (nebo sekvence, která kóduje) mutované (tj. mutantní) proteázy a sekvence (nebo sekvence, která kóduje) mutované (tj. mutantní) reverzní transkriptázy. Přednostně se sestrojí mutovaná reverzní transkriptáza tak, aby byla rezistentní • φφ · • · · ·

ΦΦΦΦ • φ • ΦΦΦ

vůči nukleosidovým a nenukleosidovým inhibitorům reverzní transkriptázy, a mutovaná proteáza se sestrojí tak, aby byla rezistentní vůči běžně používaným inhibitorům proteáz.

Podání těchto inhibitorů proteázy nebo reverzní transkriptázy hostiteli ve spojitosti s vektorem je používáno pro selekci buněk, které produkují vektor, jako protikladu k buňkám, které produkují divoký typ viru. Podobně je tento přístup modifikován pro použití s libovolným léčivem, které inhibujé virovou replikaci, takže může virus být mutován, aby se vyhnul inhibici. Proto pro léčbu HIV zahrnuje selektivní sekvence nukleové kyseliny, zabudovaná do vektoru, výhodně mutované sekvence HIV. Optimální však je, když tyto sekvence nebrání superinfekci divokým typem HIV.

Výhodně je vektorem jeden z vektorů uvedených shora, zejména zlepšených podmíněně se replikujících vektorů, znázorněných na obrázcích 1A až 1K. Samozřejmě, pokud jsou použity způsobem podle tohoto vynálezu, mohou být GFP kódující sekvence deletovány nebo nahrazeny jinými sekvencemi. GFP kódující sekvence jsou přítomny v těchto příkladných provedeních vektorů jako markér nebo indikátor přítomnosti vektoru nebo genové exprese z vektoru.

Výhodné vektory podle vynálezu mohou obsahovat různé zde popsané elementy. Konkrétně mohou lentivirové vektory postrádat tat gen a obsahovat alespoň jednu antisense sekvenci. Kromě toho mohou vektory obsahovat sekvenci, jako je centrální polypyrimidinový úsek HIV nebo větší fragment nukleové kyseliny, který ho obsahuje.

Optimálně je vektor kompatibilní s buňkou, do které je introdukován, např. je schopen vyvolávat expresi vektorem kódovaných sekvencí nukleové kyseliny na buňce. Je žádoucí, když vektor zahrnuje počátek replikace funkční v buňce. Pokud je sekvence nukleové kyseliny přenesena ve formě své DNA kódující sekvence (např. na rozdíl od formy kompletního genu, obsahujícího vlastní promotor), je optimální, když vektor také obsahuje promotor, který je schopen řídit expresi kódující sekvence a který je operativně vázán ke kódující sekvenci. Kódující sekvence je „operativně vázána“ k promotoru (např. pokud tato kódující sekvence a promotor dohromady tvoří nativní nebo rekombinantní gen), pokud je promotor schopen řídit transkripci této kódující sekvence.

V rekombinantním vektoru podle vynálezu jsou přednostně všechna vlastní místa transkripce (např. iniciační a terminační signály), translace (např. místo vstupu ribozymu nebo vazebné místo apod.), procesní signály (např. donorová nebo akceptorová místa sestřihu, pokud jsou nezbytná, a pólyadenylační signály), místa translokace, sestavení, integrace, vstup ribonukleového komplexu, stabilitní a translokační elementy, v poloze cis nebo trans, uspořádána příslušně způsobem přepsána (a/nebo translatována, pokud je to žádoucí) v buňkách, • 0000 00 0000 ·· 000·

0000 00 0 · 00000 00 0 0 0000 0000 0

000 ·· · 0 0 0 0 • 00 ·0 ·· ··· 0· 00 doje vektor zaveden. Ovlivňování těchto signálů pro zajištění odpovídající exprese v hostitelských buňkách je v rámci znalostí a odborného posouzení běžného odborníka.

Přednostně vektor obsahuje Pol sekvenci, která zvyšuje účinnost stabilní transdukce, definovanou jako integrované kopie vektoru v genomu buňky hostitele. U sekvence, kterou již dříve identifikovali Zennou et al. (Cell 101:173 až 185 (2000)) jako centrální DNA křídlo (fragment 178 párů bází od polohy 4793 do 4971 na pLAI3, odpovídající polohám 4757 až 4935 na pNL4-3), kde bylo uváděno, že zvyšuje transdukční účinnost, bylo nalezeno, že není dostatečná pro významné zvýšení účinnosti stabilní transdukce. Předkládaný vynález zahrnuje objev, že zatímco tento malý fragment není dostatečný pro zvýšení účinnosti stabilní transdukce, větší fragment o 545 párech bází (poloha 4551 až 5096 v pNL4-3) nebo jej obsahující ještě větší fragmenty, jak jsou popsány v US patentu 5 885 806, jsou schopny zvyšovat stabilní transdukci jako součást tohoto vynálezu. Zvýšení účinnosti stabilní transdukce bylo detekováno pomocí GFP exprese a analýzy FACS a Taqmanovy analýzy integrovaných kopií vektorového genomu.

Další možnosti zvyšování účinnosti transdukce jsou popsány ve společně projednávané přihlášce US patentu pořadového čísla (má být teprve přiděleno), podané 31. srpna 2000, pod číslem spisu zástupce č. 397272000400, která je tímto začleněna citací ve své celistvosti.

Virové vektory, použité v předkládaném vynálezu, mohou být také výsledkem tvorby „pseudotypů“, když společná infekce buňky různými viry produkuje viriony potomstvo, obsahující genom jednoho viru zapouzdřený ve vnější vrstvě, obsahující jeden nebo více obálkových proteinů jiného viru. Tento jev se využívá pro obalování zájmových virových vektorů do „pseudotypového“ virionu společnou transfekcí nebo společnou infekcí obalové buňky zájmovým virovým vektorem a genetickým materiálem, kódujícím nejméně jeden obálkový protein druhého viru nebo molekulu buněčného povrchu; viz US patent 5 512 421. Tyto smíšené viry mohou být neutralizovány antisérem proti jednomu nebo více použitým heterologním obálkovým proteinům. Jedním, při tvorbě pseudotypů obvykle používaným virem, je virus vesikulámí stomatitidy (VSV), což je rhabdovirus. Použití pseudotypizace rozšiřuje rozsah hostitelských buněk pro virus začleněním elementů mechanizmu vstupu virů do buňky u použitých heterologních virů. Pseudotypování virových vektorů a VSV pro použití v předkládaném vynálezu má za výsledek virové částice, obsahující nukleovou kyselinu virového vektoru, zapouzdřenou v nukleokapsidě, která je obklopena membránou, obsahující VSV G protein.Tato nukleokapsida výhodně obsahuje proteiny, které jsou normálně spojeny s virovým vektorem. Obklopující membrána, obsahující VSV G protein, tvoří část virové částice po jejím odchodu z buňky, která byla použita pro obalení virového vektoru. Příklady obalujících buněk jsou popsány v US patentu 5 739 018. Ve výhodném provedení vynálezu je virová částice • ··«· ·* ···· ·· ···· ·· · · · · · · 9 • 9 9 9 999 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 · 9 9 9 9 9 9

999 99 99 ·99 99 99 odvozena od HIV a pseudotypována s VSV G proteinem. Pseudotypové virové částice, obsahující VSV G protein, mohou infikovat rozmanité buněčné typy s vyšší účinností než amfotropní virové vektory. Rozsah hostitelských buněk zahrnuje savčí i jiné než savčí druhy, jako je člověk, hlodavci, ryby, obojživelníci a hmyz.

Výhodně vektor také zahrnuje nějaký prostředek, jímž je možno tento vektor nebo jej obsahující subklonovanou sekvenci identifikovat a selektovat. Identifikace a/nebo selekce vektoru se realizuje pomocí mnoha přístupů, které jsou známy odborníkům v této oblasti. Například vektory, které obsahují určité geny nebo kódující sekvence, jsou výhodně identifikovány hybridizaci, přítomností nebo absencí takzvaných „markerových“ genových funkcí, kódovaných markerovými geny, přítomnými v těchto vektorech, a/nebo expresí určitých sekvencí. Při prvním přistupuje přítomnost určité sekvence ve vektoru identifikována hybridizaci (např. DNA-DNA hybridizaci) s použitím sond, obsahujících sekvence, které jsou homologní k relevantní sekvenci. Při druhém přistupuje rekombinantní systém vektor/hostitel identifikován a selektován na základě přítomnosti nebo absence konkrétní funkce markerového genu, jako je rezistence proti antibiotikům, aktivita thymidinkinázy apod., vyvolávané konkrétními geny kódujícími tyto funkce, přítomnými ve vektoru. Při třetím přístupu jsou vektory identifikovány analyzováním na konkrétní genový produkt kódovaný vektorem. Tyto testy jsou založeny na fyzikálních, imunologických nebo funkčních vlastnostech genového produktu.

V souhlase s tím poskytuje předkládaný vynález také vektor, který, pokud je DNA, obsahuje nukleotidovou sekvenci, vybranou ze skupiny, která se skládá z SEQ ID NO:2,4, 5, 6, 15 a 16, a který, pokud je RNA, obsahuje nukleotidovou sekvenci, kódovanou nukleotidovou sekvencí, vybranou ze skupiny, která se skládá z SEQ ID NO:4, 5,6.

Předkládaný vynález dále poskytuje způsob zkombinování vektoru, který je odvozen od divokého typu viru lidské imunodeficience a který je schopen replikace pouze v hostitelské buňce umožňující replikaci tohoto vektoru, s ribozymem.Ribozym, který je obsažen ve vektoru nebo je jím kódován, štěpí nukleovou kyselinu divokého typu viru lidské imunodeficience, ale nikoliv samotný tento vektor a jeho transkripty, pokud existují. Tento postup zahrnuje získání vektoru, který je odvozen od divokého typu viru lidské imunodeficience a který je schopen se replikovat pouze v hostitelské buňce, která dovoluje replikaci tohoto vektoru, a začlenění sekvence nukleové kyseliny do tohoto vektoru, kterážto sekvence zahrnuje nebo kóduje ribozym, jehož katalytická doména štěpí nukleovou kyselinu divokého typu viru lidské imunodeficience, ale nikoliv vektor samotný a jeho transkripty, pokud existují. Pří tomto postupu může být z vektoru deletována nukleotidová sekvence obsahující nebo kódující U5

9999 • 9

9 99

9999 ·♦«· sekvenci divokého typu viru lidské imunodeficience a nahrazena nukleotidovou sekvencí, vybranou ze skupiny, skládající se z SEQ ID NO:2, 5, 6,14, kde je nejméně jedno N mutováno, 15 a 16, pokud je tento vektor DNA, a nukleotidovou sekvencí kódovanou nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny tvořené SEQ ID NO:2, 5,6,14, kde alespoň jedno N je mutováno, 15 a 16, je-li vektor RNA. Přednostně se vektor replikuje v hostitelské buňce, která umožňuje replikaci uvedeného vektoru více než jednou.

Předkládaným vynálezem je také poskytnut způsob modifikování vektoru. Tento způsob zahrnuje získání vektoru a introdukování do tohoto vektoru nukleotidové sekvence, vybrané ze skupiny, která se skládá z DNA sekvencí SEQ ID NO:2,3,4, 5,6,14, ve kterých je alespoň jeden N mutován a 15 a 16, pokud je tento vektor DNA, a nukleotidové sekvence, kódované nukleotidovou sekvencí, která je vybrána ze skupiny, skládající se z SEQ ID NO:2, 4, 5, 6, 15 a 16, pokud je tento vektor RNA.

Dále je předkládaným vynálezem poskytnut způsob propagace a selektivního obalení podmíněně se replikujícího vektoru, bez použití obalovací buněčné linie. Tento způsob zahrnuje kontakt podmíněně se replikujícího vektoru s buňkou, která je schopna být infikována jiným vektorem, který je stejného typu vektoru, jako je podmíněně se replikující vektor, a který se odlišuje od podmíněně se replikujícího vektoru tím, že je divokého typu s ohledem na kompetenci k replikaci; následný kontakt této buňky s uvedeným druhým vektorem a potom kultivaci této buňky za podmínek, vedoucích k propagaci podmíněně se replikujícího vektoru. Helperový vektor, diskutovaný shora a podrobněji níže, je jedním takovým komplementárním vektorem.

Rovněž je poskytnuta izolovaná a purifikovaná molekula nukleové kyseliny, vybraná ze skupiny, která se skládá z molekuly DNA, zahrnující nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající z SEQ ID NO:2, 5,6,14, ve kterých je alespoň jedno N mutováno, 15 a 16, a molekuly RNA, obsahující nukleotidovou sekvenci, kódovanou nukleotidovou sekvencí, vybranou ze skupiny, která se skládá z SEQ ID NO:2,6,15 a 16.

Způsoby použití

Shora popsané vektory se přednostně zavádějí do hostitelské buňky za účelem profylaktické a terapeutické léčby virové infekce, kvůli snadnému udržování vektoru, rovněž jako z jiných důvodů. V souhlase s tím poskytuje předkládaný vynález hostitelskou buňku, obsahující vektor podle vynálezu. Izolace hostitelské buňky a/nebo udržování těchto buněk nebo buněčných linií, z nich odvozených, v kultuře, se stalo rutinní záležitostí, v níž je běžný odborník zběhlý.

·Μ· *·<· 99 9999

9 9 9 9 9 9

9 9 999 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

99 99 999 ·«

Konkrétně se podmíněně se replikující vektor nebo výhodně lenti virový vektor, jak je popsáno shora, výhodně používá v profylaktické a terapeutické léčbě virové infekce, výhodně, když je tato infekce divokého typu viru, výhodně divokého RNA viru, ještě výhodněji divokého typu retroviru a optimálně divokého typu HIV.

Tento způsob zahrnuje kontakt hostitelské buňky, která je schopná být infikována divokým typem viru, s podmíněně se replikujícím vektorem, který je schopen replikace pouze v takové hostitelské buňce, která dovolí replikaci tohoto vektoru, jehož přítomnost, transkripce nebo translace inhibují replikaci divokého typu kmene viru v hostitelské buňce. Je žádoucí, když se tento vektor replikuje více než jednou a obsahuje nejméně jednu sekvenci nukleové kyseliny, jejíž existence (tj. přítomnost, transkripce nebo translace) poskytuje vektoru v hostitelské buňce selektivní výhodu vůči divokému typu kmene viru, což v optimálním případě je ten kmen, ze kterého byl tento vektor odvozen.

V souhlase s tímto způsobem obsahuje sekvence nukleové kyseliny výhodně nukleotidovou sekvenci, která obsahuje nebo kóduje genetické antivirové činidlo, které nepříznivě ovlivňuje replikaci a/nebo expresi viru jiného než uvedený vektor. Je žádoucí, když toto genetické antivirové činidlo je vybráno ze skupiny, která se skládá z antisense molekuly, ribozymu a imunogenu. Optimální je, když je genetickým antivirovým činidlem ribozym, jehož katalytická doména výhodně štěpí 3' nukleotidovou sekvenci NUH (tj. zvláště GUC sekvenci). Popřípadě je tento ribozym kódován, alespoň částečně, sekvencí vybranou ze skupiny, která se skládá z SEQ ID NO:3 a SEQ ID NO:4. Je žádoucí, když tento ribozym štěpí v oblasti divokého typu kmene viru nebo jeho transkriptů, ale neštěpí v oblasti vektoru nebo jeho transkriptů. Je to výhodně proto, že tento divoký typ kmene viru obsahuje sekvenci, kódovanou SEQ ID NO:1, zatímco vektor, jestliže je DNA, zahrnuje nukleotidovou sekvenci, vybranou ze skupiny, která se skládá z SEQ ID NO:2, 5,6,14, ve kterých nejméně jeden N je mutován, 15 a 16, a jestliže je RNA, obsahuje nukleotidovou sekvenci, kódovanou nukleotidovou sekvencí, vybranou ze skupiny, která se skládá z SEQ ID NO:2, 5, 6,14, ve kterých je alespoň jeden N mutován, 15 a 16.

Tento způsob je také výhodně proveden, když vektor obsahuje nejméně jednu sekvenci nukleové kyseliny, jejíž existence (tj. přítomnost, transkripce nebo translace) přináší selektivní výhodu buňce, která je infikována tímto vektorem, oproti buňce, která je infikována divokým typem kmene viru, který je optimálně kmenem viru, ze kterého byl tento vektor odvozen.

V tomto ohledu může vektor obsahovat nejméně jednu sekvenci nukleové kyseliny, která přináší selektivní výhodu buňce, která je infikována tímto virem, a nejméně jednu sekvenci nukleové • 4**4 4« *·4* ·· ·«·« •» * » · · *4 · • · ····· ·· 4 • 4 * 4 4 4 4 4 4 4 • · 4 4 * 4 4 4 4 4 ···>· 4 4 4 4 4 *· ·· kyseliny, která přináší selektivní výhodu vektoru oproti divokému typu kmene viru, odpovídajícímu viru, ze kterého byl tento vektor odvozen.

V souhlase s tím je tento způsob výhodně proveden, když sekvence nukleové kyseliny obsahuje nukleotidovou sekvenci, která kóduje gen širokospektrální rezistence vůči léčivům. Alternativně je tento způsob proveden, když sekvence nukleové kyseliny obsahuje nukleotidovou sekvenci, kódující mutovanou (mutantní) proteázu a nukleotidovou sekvenci, kódující mutovanou (mutantní) reverzní transkriptázu, například když virová infekce, která má být léčena profylakticky nebo terapeuticky, je způsobena retrovirem.

Tento způsob dále výhodně obsahuje podávání činidla, vybraného ze skupiny, která se skládá z cytotoxického léčiva, inhibitoru proteázy a inhibitoru reverzní transkriptázy (tj. kromě podávání vektoru), hostitelské buňce.

V souhlasu s tím může být vektor využíván ve shodě se shora uvedeným způsobem, nejenom pro terapeutickou léčbu virové infekce, ale také pro ochranu potenciální hostitelské buňky před virovou infekcí, tj. způsobem profylaktické léčby virové infekce nebo „vakcinací“ proti zájmovému viru, jako je RNA virus, zejména retrovirus, jako je HIV. Tento způsob v podstatě inhibuje replikaci divokého typu kmene viru předtím, než se hostitelská buňka dostane do kontaktu s tímto divokým typem kmene viru. V tomto ohledu může vektor obsahovat nebo kódovat proteiny, které blokují superinfekci divokým typem viru. Tento způsob zahrnuje kontakt hostitelské buňky s podmíněně se replikujícím vektorem, jak je popsán shora, a „helperovým expresním vektorem“, tj. virovým genomem, který podporuje replikaci tohoto „vektoru“ v neinfikovaném hostiteli. Podmíněně se replikující vektor obsahuje selektivní výhodu při obalování a/nebo propagaci. Kromě toho může tento vektor například obsahovat sekvenci, která zesiluje buněčné přežívání, podporuje produkci viru, indukuje apoptózu, usnadňuje produkci proteinu a/nebo podporuje imunitní funkci a/nebo cílení. Konstrukt „helperového expresního vektoru“ je libovolný expresní vektor, který vyrovnává neschopnost „vektoru“ se replikovat. Tyto helperové expresní vektory jsou obvyklé a jsou snadno sestavitelné odborníkem v této oblasti techniky. Tento helperový expresní vektor může být buď zabalen do virionů jako vektor nebo exprimován bez potřeby zabalení. Protože takovýto „vektor“ má selektivní výhodu v zabalení a/nebo propagaci, poskytuje tento systém bezpečný prostředek k dosažení vysoké replikace viru bez možných patogenních účinků, které by mohl živý zeslabený virus potenciálně způsobovat. Kromě toho může být tento vektor smísen s nespecifickým adjuvantem pro zvýšení imunogenity. Tyto adjuvanty jsou odborníkům v této oblasti techniky známy a obsahují, bez omezení na ně, Freundovo kompletní nebo nekompletní

9949 ·· «··* 9< *·<*· * · 9 · * 9 · • · · ··« · · · » * » 9 · 9 · 9 9

9:9 9 4 4 9 4 9 ·· «9 ·9· 49 99 adjuvans, emulze tvořené komponentami bakteriálních a mykobakteriálních buněčných stěn apod.

Podmíněně se replikující virové vektory nebo výhodně lentivirové vektory podle vynálezu mohou být také využity pro imunoterapii v léčbě virové infekce nebo pro léčbu například onkogenních poruch. Dendritické buňky nebo jejich prekurzory (např. CD34+ hematopoetické buňky nebo krevní monocyty, ale bez omezení na tento typ buněk), rovněž jako jiné antigen prezentující buňky, mohou být transdukovány vektorem, který exprimuje HIV proteiny nebo proteinovou sekvenci, která obsahuje hlavní epitopy, pomocí kterých hostitel realizuje imunitní odpověď na cizí činidlo, jako je virus. Takovéto proteinové epitopy pro HIV jsou popsány v „HIV molecular immunology database“, 1998, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Maryland & Los Alamos National Laboratory, New Mexico, která je tímto začleněna ve své celistvosti. Výhodné provedení HIV epitopového proteinu je integrovaná nebo složená CTL sekvence (nebo její fragment), uvedená níže v příkladu 14. Jiné epitopy, které mohou být exprimovány podobně, jsou odvozeny od jiných virů, bakterií, hub, parazitů, tumorových buněk a geneticky upravených buněk. Do proteinové sekvence může být spojen více než jeden epitop, takže jsou vyloučena neimunogenní místa, aby byl vytvořen vektor se zvýšenou bezpečností, protože protein kódující sekvence jsou přísně diskontinuální. Výhodným provedením diskontinuální sekvence je degenerovaná diskontinuální sekvence (s a nebo bez příslušných linkerovýcch aminokyselinových sekvencí pro stabilizaci proteinové struktury, je-li třeba), kódující imunologicky relevantní epitopy. Toto použití degenerovaných sekvencí snižuje riziko rekombinace. Jiným výhodným provedením je exprese popsané proteinové sekvence (nebo jejího fragmentu) pomocí připojené zprávy, ovládané retrovirovou LTR, jako je HIVLTR.

S použitím retro virů při léčbě lidských infekcí a chorob je však spojeno riziko tvorby replikačně kompetentního viru (RCV). Homologní rekombinace mezi helperovým vektorem a podmíněně se replikujícím vektorem je zřejmě jeden z hlavních směrů vytváření RCV. Předkládaný vynález proto umožňuje modifikaci helperového vektorového konstruktu tak, aby byla minimalizována nebo eliminována možnost homologní rekombinace. Vynález zahrnuje jakoukoli modifikaci, která slouží pro snížení pravděpodobnosti dimerizace, společného zabalení a/nebo rekombinace helperového vektoru a podmíněně se replikujícího vektoru.

Jedno provedení vynálezu spočívá ve vložení jednoho nebo více anti-vektorových ribozymů nebo antisense sekvence (popřípadě ve formě kazety, definované jako alespoň dvě takové sekvence spojené v tandemu s ohledem na ribozymy a definované jako alespoň dvě takové sekvence spojené v tandemu a cílené na diskontinuální oblasti nukleové kyseliny • · · · cílového vektoru s ohledem na antisense sekvence) do 3' konce kódujících sekvencí helper genu, ale 5' vzhledem k terminačnímu místa transkripce. I když se může vyskytovat nespecifické obalení helperových genomů do vektoru, je pravděpodobné, že takové obalení je vektorově závislé. Pro snížení obalení helperového vektoru do vektorových částic může být tudíž použito mnoho strategií, které by jinak byly prvním krokem v možné tvorbě RCV.

Výhodný helperový konstrukt obsahuje anti-vektorový ribozym nebo antisense molekulu na 3' konci sekvence, kódující strukturální protein nebo sekvence, kódující obálku (homologní nebo heterologní). Výhodnější helperový konstrukt obsahuje na 3' konci sekvence, kódující strukturální protein a sekvence, kódující obálku, anti-vektorový ribozym nebo antisense molekulu. Pokud je sekvencí nukleové kyseliny antisense molekula, potom může fungovat i intracelulámě, aby účinkem buněčných nukleáz rozštěpila společně lokalizované dvouvláknové molekuly helperového vektoru. Pokud je helper obalen vektorovou RNA do formy virových částic, potom tyto molekuly nejsou schopny podléhat kompletní reverzní transkripci za vzniku RCV.

V jiném výhodném provedení je na helperovém konstruktu umístěna sekvence, která podporuje odlišné umístění nebo lokalizaci helperové nukleové kyseliny vzdáleně od nukleové kyseliny vektoru. Příkladem, ale bez omezení na něho, je začlenění heterologního intronu a póly A sekvencí do helperových konstruktů, jak je uvedeno například na obrázku 6. Tyto sekvence mohou usnadňovat rozdílné umístění vektoru a helperové nukleové kyseliny v různých celulámích i subcelulámích polohách. Titr produkovaného vektoru touto modifikací helperu přednostně není ovlivňován více než lOOnásobně, výhodněji ne více než lOnásobně a nej výhodněji není ovlivňován.

Obrázek 7 ukazuje, že přítomnost jednoho ribozymů (pVirPacl.2Rz) nebo ribozymů a intronu, sestaveného pro ovlivňování buněčného přenosu helperové RNA (pVirPacl.2RzIn) neměla významný vliv na titr vektoru. Obrázek 12 ukazuje, že PCR analýza titrovaných vzorků na společně obalené helperové konstrukty ukázala snížení společného obalení v nepřítomnosti ribozymů oproti vysokému společnému obalování v absenci ribozymů. Přítomnost dvou ribozymů kompletně zabránila společnému obalení helperového vektoru do vektorových virových částic. Tento vynález tedy zahrnuje účinný prostředek použití dvouplazmidového obalovacího systému jak pro produkci vysokých titrů vektoru, tak zlepšení bezpečnosti těchto vektorů snížením nebo eliminací společného obalování helperového vektoru.

Tyto údaje nasvědčují, že obalování helperu do virionů není náhodné, aleje závislé na vektoru. Alternativním výhodným provedením pro zabránění společného obalení helperových nukleových kyselin s nukleovými kyselinami vektoru je degenerace helperového konstruktu v oblastech, které jsou důležité pro spojování helperové a vektorové sekvence. Tento přístup může být dále modifikován kompletní degenerací helperové sekvence, aby bylo zabráněno společnému zabalení helperové a vektorové sekvence.

Například může být nukleotidová sekvence helperového vektoru degenerována buď částečně nebo úplně. Zatímco taková degenerace významně snižuje nebo eliminuje pravděpodobnost homologního párování a rekombinace helperového vektoru a podmíněně se replikujícího vektoru, neovlivňuje schopnost helperového vektoru kódovat proteinové produkty, nezbytné pro replikaci viru a obalení. Tato degenerace může být směrována vůči každému možnému genu a otevřenému čtecímu rámečku (ORF), který je homologní mezi helperem a podmíněně se replikujícím vektorem, nebo přesněji cílena na konkrétní geny nebo v rámci konkrétních genů nebo ORF v helperovém vektoru. Je třeba poznamenat, že pro snížení pravděpodobnosti homologní rekombinace není nezbytná úplná degenerace, protože neexistence sekvenční homologie, větší než 18 nukleotidů délky, by měla být dostatečná. Degenerace do takové úrovně, kde není více než 18, 17, 16,15,14, 13,12, 11, 10, 9, 8, 7 nebo 6 nukleotidů identických mezi sekvencemi, bude potlačovat nebo zabraňovat rekombinaci.Tyto sekvence mohou být v případě potřeby degenerovány použitím kodonů, které mají preferenční expresi v lidských nebo určitých buněčných typech.

Jako příklad může být sekvence kódující gag, rev a/nebo tat degenerována buď úplně nebo částečně. Jiné příklady zahrnují degeneraci prvních 42 nukleotidů gag sekvence, prvních 208 nukleotidů rev sekvence, posledních 183 nukleotidů tat sekvence a posledních 545 nukleotidů Pol sekvence. Příklady helperových vektorů s takovou degenerací jsou pVirPacl.2, pVirPacl.2Rz, pVirPacl.2Rz2 a pVirPacl.2RzIn nebo jejich deriváty. Nukleotidová sekvence, kódující jakýkoliv jiný genový produkt, může být samozřejmě také degenerována podle tohoto vynálezu, čímž je zmenšována, minimalizována nebo eliminována pravděpodobnost homologní rekombinace.

Alternativní provedení vynálezu spočívá v tom, že se do helperového vektoru zabuduje element, který zasahuje a degraduje podmíněně se replikující vektor, pokud nastane případ společného umístění, společného zabalení nebo jiného společného párování těchto dvou vektorů. Příkladem takového elementu je ribozym. Libovolný ribozym, který selektivně zasahuje podmíněně se replikující vektor, je v rozsahu záměru tohoto vynálezu. Lze použít i více ribozymů, jako jsou zde popsané dvojité nebo trojité ribozymové kazety. Například může ribozym zasahovat U5 oblast (např. U5 oblast HIV-1, HIV-2 nebo jiného retroviru, použitého v podmíněně se replikujícím vektoru). Štěpení podmíněně se replikujícího vektoru zabraňuje, aby při rekombinaci s podmíněně se replikujícím vektorem vznikal RCV, což může nastat, pokud • · · ·

jsou tyto dva vektory společně zabaleny. Příklady helperových vektorů, obsahujících ribozym, j sou pVIRPAC-1.1 Rz a pVIRPAC-1.2Rz2, j ak j sou uvedeny na obrázku 6.

Ještě dalším provedením předkládaného vynálezu je substituce heterologní RRE, včetně libovolné retro virové RRE, ale výhodně jiné lenti virové RRE, do helperového vektoru, jako je substituce HUIV-2 RRE za HIV-1 RRE, CTE nebo PRE. Tento přístup přispívá ke zmenšení, minimalizaci nebo eliminaci možnosti homologní rekombinace, založené na různých RRE, které mají různé sekvence. Další výhodou takové substituce podle vynálezu je překvapivé a neočekávané zvýšení produkce podmíněně se replikujícího vektoru, až přibližně 5násobné. Aniž bychom se vázali na teorii, přítomnost různých RRE mezi helperovým vektorem a podmíněně se replikujícím vektorem může být vázána najeden nebo dva různé buněčné faktory, které mohou být omezeny co do množství. Použití různých RRE může tudíž snížit konkurenci mezi těmito dvěma vektory o omezené buněčné faktory. Příklady helperových vektorů, obsahujících HIV-2 RRE element pro obalení retrovirového vektoru, založeného na HIV-1, jsou pVIRP AC-1.2 a pVIRPAC-1.2Rz2, jak jsou uvedeny na obrázku 6.

Ještě další provedení spočívá v tom, že se do heplerového vektoru začlení nukleotidová sekvence kódující heterologní env protein, jako je VSV-G z viru vesikulámí stomatitidy, G protein vztekliny, GaLV, glykoprotein alfaviru El/2 nebo RDI 14, env protein z liščího endogenního viru. To umožňuje zahalovat podmíněně se replikující vektor do částic s heterologními env proteiny. Kromě toho může být do obálkového proteinu popřípadě vložen ligand, aby podporoval stimulaci cílové buňky v průběhu transdukce, je-li to žádoucí. Protože modifikace obálkového proteinu může porušit jeho schopnost vazby, je výhodným provedením exprimovat v průběhu produkce jak modifikovaný ligand, obsahující chimérický obálkový protein, tak i nemodifikovaný, pseudotypovaný obálkový protein. Na povrchu buňky tak mohou být oba typy obálkových proteinů, jeden pro stimulaci cílové buňky, druhý pro zprostředkování vazby a vstupu. Výhodným pseudotypo váným lenti virovým vektorem, který také exprimuje chimérický receptor pro buněčnou stimulaci, je VSV-G obálkový protein a chimérický VSV-G obálkový protein. Výhodnějším chimérickým obálkovým proteinem je VSV-G/RD114 chimérický obálkový protein (viz obrázky 14A a 14B). Další výhodné proteiny (nebo jejich fragmenty) pro tvorbu chimér s VSV-G zahrnují notch, delta, FLT-3 ligand, TPO, Kit ligand, ligand vážící CD3, ligand vážící CD28 a ligand vážící GM-CSF.

Sekvence, kódující heterologní env protein, může být popřípadě operativně spojena s druhým indukovatelným promotorem, aby byla zajištěna větší dodávka env proteinu pro obalení viru. Tento přístup může dále zvýšit produkci viru, zvláště za podmínek, kdy je produkce env proteinu faktorem, limitujícím rychlost. Tato sekvence kódující heterologní env protein může být buď obsažena ve stejném helperovém vektoru jako sekvence kódující druhý komplementární virový protein nebo na jiném vektoru. Popřípadě může být také začleněna do produkčních hostitelské buňky nebo buněčné linie.

Dalším provedením předkládaného vynálezu je selektivní umístění donorového a akceptorového místa sestřihu na helperovém vektoru takovým způsobem, že selektivní sestřih určitých virových komponent slouží pro minimalizaci nebo eliminaci možnosti homologní rekombinace s podmíněnou replikací. Tato místa sestřihu mohou být například umístěna tak, aby umožňovala deleci RRE a/nebo obalení dimerizačních signálů jako výsledek sestřihu. Souvislost, zda jsou nukleové kyseliny exprimovány, může být tedy kontrolována umístěním míst sestřihu do vektoru. Místa sestřihu mohou být například umístěna distálně k ribozymové nebo antisense sekvenci, takže ribozymy nebo antisense sekvence jsou zabudovány například v nesestřižené, ale nikoli sestřižené RNA. Alternativně mohou být tyto ribozymy nebo antisense sekvence umístěny za místo sestřihu, pokud je cílem exprimovat ribozymy nebo antisense molekuly ze všech molekul mRNA a nejenom určitého subtypu.

Pokud je vektor používán v souhlasu se shora uvedeným způsobem jako profylaktická léčba virové infekce, může tento vektor kódovat antigen proteinu, který není kódován divokým typem viru, jako je mutantní virový protein nebo nevirový protein. V souhlase s tím může být antigen, kódovaný tímto vektorem, například bakteriálního původu nebo z rakovinné buňky. Kromě toho může podmíněně se replikující virový vektor nebo výhodně lentivirový vektor také kódovat MHC gen pro správnou prezentaci antigenu hostitelskému imunitnímu systému. Tyto vektory mohou být tedy použity pro usnadnění trvalé imunologické odpovědi proti rozličným potenciálním patogenům a/nebo endogenním proteinům (např. tumorově specifický antigen), které jsou selektivně exprimovány v abnormálních buňkách.

Shora uvedený příklad neomezuje použití vynálezu pro dodování antigenu do dendritických buněk pro imunoterapii. Naopak vynález poskytuje prostředky a metody pro dodávání libovolného zájmového genu a jeho expresi v buňce libovolného požadovaného typu. Kromě toho tento vynález také zaručuje dodávku a expresi více genů jedním vektorem. Exprese více genů může být prováděna jakoukoli vhodnou strategií genové exprese. Neomezujícím příkladem je použití vnitřních ribozomálních vstupních míst (IRES, Intemal Ribosome Entry Sítě), která mohou být umístěna distálně od prvního genu, který je třeba exprimovat. Výhodným příkladem je exprese zájmového genu do IRES sekvence, která je distálně umístěna od variantního MGMT genu. Výhodnější provedení vektoru exprimuje zájmový gen a IRES připojený zájmový gen z nemodifikovaného nebo modifikovaného HIV-LTR promotoru mimo sestřiženou poslíčkovou sekvenci. Další výhodný vektor exprimuje dva zájmové geny

z nemodifikovaného nebo modifikovaného HIV-LTR promotoru, který, pokud je modifikován, je modifikován v sekvencích, které váží transkripční faktory. Kromě HIV-LTR mohou být samozřejmě použity libovolné nemodifikované nebo modifikované lentivirové LTR.

Jiným neomezujícím příkladem je exprese zájmového genu z HIV-LTR s použitím míst sestřihu, která jsou odvozena od HIV. Jeden zájmový gen může být například exprimován z Nef akceptorového místa sestřihu, zatímco druhý zájmový gen může být exprimován z Tat akceptorového místa sestřihu. Tímto způsobem nohou být exprimovány dva geny, aniž by byl třeba IRES element. Může být použito jakékoliv místo sestřihu, včetně míst genů Tat, Rev, Vif, Vpr, Vpu, Nef a Env. Env protein je exprimován z jednoduše sestřižené poslíčkové sekvence, takže exprese zájmového genu přes toto místo sestřihu může vyžadovat Rev, pokud je požadována významná exprese zájmového genu. Kromě toho, je-li to žádoucí, může být exprese z HIV-LTR provedena tak, aby byla závislá na Tat a Rev.

Kromě toho, může být pomocný virový expresní vektor (zde také nazývaný jako „helper“) sestrojen tak, aby exprimoval pouze v určitých buněčných typech (např. kmenových buňkách, specializovaných buňkách pro prezentaci antigenů a tumorových buňkách) přidáním nebo vypuštěním určitého genetického elementu/faktoru (buď ve vektoru nebo v expresním konstruktu helperového viru), což umožňuje buněčně specifickou replikaci a šíření vektoru. Vektor se tak stále šíří komplementací s konstruktem helperového viru, ale toto šíření je buněčně specifické, závislé na tom, jestli je ve vektoru nebo v expresním konstruktu helperového viru přidán nebo vynechán určitý genetický element/faktor. Toto může být použito samostatně nebo ve spojení s jinou ze shora uvedených strategií.

Například podmíněně se replikující HIV vektor může být konstruován pro specifickou replikaci v makrofázích místo v T-buňkách. Vektor, který by tvořil Tat-defektní HIV (vektor kóduje jiné HIV proteiny, ty ale nejsou exprimovány v důsledku nepřítomnosti Tat transkripěního aktivátoru), může kódovat ribozym, který štěpí divoký typ HIV, ale ne podmíněně se replikující HIV RNA. Helperový expresní vektor pro tento vektor může kódovat tat gen, exprimovaný z makrofágově specifického promotoru. Tak se bude crHIV podmíněně replikovat pouze v makrofágových buňkách, zatímco se nebude schopný se replikovat v Tbuňkách nebo v jiných typech buněk.

Alternativně může být tat gen operativně vázán na tumorově specifický promotor; crHIV se tudíž bude potom replikovat pouze v tumorových buňkách CD4 a ne v normálních CD4 buňkách. Genetický element/faktor může být také modifikací promotorové sekvence vektoru, který je exprimován pouze v určitých typech buněk a ne v jiných typech buněk, v souhlasu s expresním konstruktem „helper-viru“.

V jiném provedení mohou být obálkové proteiny helperového expresního konstruktu nebo vektorového konstruktu (pokud jsou tyto konstrukty sestrojeny, aby obsahovaly obálkové proteiny) modifikovány tak, že vektor-virion bude specificky infikovat určité typy buněk (např. tumorové buňky), přičemž nebude schopen infikovat jiné typy buněk (např. normální buňky).

V ještě jiném provedení může být adenovirus, který postrádá jeden nebo více klíčových faktorů pro replikaci, komplementován použitím helperového konstruktu, který poskytuje tyto faktory, vázané na tumorově specifický promotor. Tyto faktory, které komplementují replikaci adenoviru, mohou být tedy exprimovány pouze v tumorových buňkách, čímž umožňují replikaci viru v tumorových buňkách (s expresí proteinů, potřebných pro usmrcení buňky), ale ne v normálních buňkách.

V dalším výhodném provedení může vektor exprimovat negativní selekční gen pro usmrcování buněk použitím O⁶-guanin alkylačních činidel, jako je, ale bez omezení na něj, BCNU (nebo funkční analog BCNU) jako negativního selekčního léčiva. Do normálních buněk může být dodáván lentivirový vektor, exprimující antisense sekvenci nebo ribozym, cílený na MGMT gen. V pozdějším požadovaném čase mohou být tyto buňky ošetřeny BCNU nebo jeho analogem, buď ex vivo nebo in vivo, aby byly usmrceny buňky, které byly tímto vektorem transdukovány. Ve výhodném provedení jsou normální buňky proťylakticky transdukovány MGMT antisense expresním vektorem a jsou později usmrceny, když se stanou abnormálními. Příkladem tohoto posledně jmenovaného přistupuje, když se tyto transdukované buňky stanou rakovinnými buňkami, které mohou být poté usmrceny léčbou těchto buněk BCNU nebo jeho funkčním analogem. Jiným výhodným provedením je exprimovat antiMGMT antisense sekvenci nebo molekulu ribozymu z U1 promotoru a obsaženou v U1 snRNA. Ještě výhodnějším provedením je transdukovat anti-MGMT lentivirový vektor do populace hematopoetických buněk, jako jsou lymfocyty, kmenové buňky a dendritické buňky.

V jiném výhodném provedení jsou normálními buňkami hematopoetické buňky, výhodně T buňky, které jsou transdukovány vektorem před transplantací do allogenního hostitele. Tyto buňky mohou být usmrceny léčbou BCNU nebo jeho funkčním analogem, pokud se stanou pro hostitele škodlivými (např. pokud dochází k obranné reakci hostitele vůči štěpu).

V ještě dalším provedení může být stejný lentivirový vektor experimující anti-MGMF antisense sekvenci nebo ribozym použit pro odstranění nežádoucích buněk ze směsných buněčných populací. Nelimitující příklad je v případě kostní dřeně kontaminované rakovinnými buňkami, která je připravena pro transplantaci. Bylo pozorováno, že tumorové buňky se velmi účinně transdukují při relativně nízkých MOI v jednom cyklu transdukce (viz obrázek 13 A). Naproti tomu normální buňky, zvláště, ale bez omezení na CD34+ hematopoetické buňky, jsou mnohem · 99 · · 9· · 9· · • 9 · · ·

9 9 9 9 · · • · · 9 9 · • · · 9 9 · ··· ·* ·· obtížněji efektivně transdukovatelné a vyžadují mnohonásobné cykly transdukce, aby bylo dosaženo vysoké účinnosti (viz obrázek 13B). Atraktivní purifikační strategií je tedy transdukce kontaminované kostní dřeně s vektorem, obsahujícím anti-MGMT antisense sekvenci, s použitím MOI, která bude účinně transdukovat kontaminující tumorové buňky, ale ne normální buňky. Tento příklad neomezuje rozsah záměru tohoto vynálezu buď na jeho použití ex vivo nebo pouze na použití spojená s rakovinou. Další aplikace zahrnují in vivo selektivní dodávku genu, zvláště, ale bez omezení na ně, při léčbě rakovin mozku a libovolné jiné choroby, kde se vyskytuje rozdílná účinnost transdukce mezi nemocnými a normálními buňkami, která může být využita pro cílení podle vynálezu.

Předkládaný vynález proto poskytuje způsob léčby rakoviny, a zejména léčby T-buněčné leukemie. „Léčba rakoviny“ podle tohoto vynálezu zahrnuje podávání hostiteli dále modifikovaného vektoru, jak je zde popisován, za účelem vyvolání terapeutické odpovědi. Taková odpověď může být zjištěna, sledováním zmenšování růstu tumoru a/nebo regrese tumoru. „Růst tumoru“ zahrnuje zvýšení velikosti tumoru a/nebo počtu tumorů. „Regrese tumoru“ zahrnuje zmenšování hmoty tumoru.

„Rakovina“ podle tohoto vynálezu zahrnuje nádorová onemocnění, která jsou charakterizována abnormálním rozmnožováním buněk a absencí kontaktní inhibice, čehož důkazem je vznik tumoru. Tento termín zahrnuje rakovinu lokalizovanou v tumorech, rovněž jako rakovinu nelokalizovanou v tumorech, jako jsou například rakovině buňky, které se šíří z tumoru lokálně invazí nebo systémově metastázou. Teoreticky může být předmětem léčby podle vynálezu libovolný typ rakoviny. Výhodné však je, když je tato rakovina virového původu.

Konečně mohou být shora uvedené vektory přímo použity pro in vivo genovou terapii. Současné strategie genové terapie strádají, protože nemohou zprostředkovat dodávání genů do velkého procenta buněk; infikováno je pouze určité procento buněk. Toto je obzvláště důležité při antitumorových strategiích, kde je transdukce genu do celé tumorové populace rozhodující. Po přidání „vektoru“ ve spolupráci s „helperem“ budou okamžitě transdukované buňky produkovat virové částice, které mohou infikovat sousední buňky a tudíž umožňovat vysokou a možná úplnou účinnost transdukce. V jednom provedení tohoto vynálezu může být lidský retrovirus (kterým může být HIV nebo retrotranspozonový element) doručen do tkáně (nebo do buněk in vitro) „helperovým“ konstruktem. Buňky okamžitě obsahující tento vektor a helper budou produkovat virus a obalovat tento vektor podmíněně do virionů. Tyto viriony budou schopny zprostředkovat vysokou účinnost transdukce sousedních buněk (protože kontakt buňkabuňka je nejúčinnějším způsobem transdukce buněk). Bezprostředně transdukované buňky • ·· •9 9999

• · 999· • 9 9 9 9 β • · ··· · · · • · · · · · · • · · · · · · ·· ··· ·· ·· mohou, ale nemusí uhynout, v závislosti na tom, jestli výsledkem kombinace vektor/helper je cytolytická infekce. V případě retrotranspozonu nemusí helper obsahovat strukturní proteiny, protože normální nebo tumorové buňky mohou obsahovat protein/faktor, nezbytný pro zapouzdření do virionů. V tomto případě může helper být pouze, ale bez omezení na to, transaktivačním proteinem, který aktivuje transkripci faktorů, nutných pro zapouzdření retrotranspozonu. V případě HIV mohou být pro zapouzdření HIV genomu do potomstva virionů pro infekci/transdukci buněk potřeba, ale ne nezbytně, jiné faktory.

Shora popsané vektory mohou být také použity při strategiích boje proti biologickým nebo chemickým zbraním. Podmíněně se replikující vektor může být například dodán do jedince, v nedávné době napadeného vysoce patogenním virem nebo baktérií nebo chemickým činidlem (např. toxinem). Tento vektor bude interferovat s replikací patogenního viru, jak bylo výše popsáno. Podmíněně se replikující vektor však může být také použit pro antibakteriální nebo protichemické strategie ve shodě s helperovým expresním vektorem („helperem“).

Například může podmíněně se replikující vektor vylučovat antibakteriální nebo antitoxinové protilátky poté co „helper“ umožní jeho expresi a propagaci. Tento „helper“ může být, ale nikoliv nezbytně, řízen indukovatelným promotorem, který zaručuje jeho expresi po aktivaci baktérií, cytokinem (jako odpověď na bakteriální infekci), antibiotikem (jako v případě tetracyklinem indukovatelných promotorových systémů (Paulus et al., J. Virol., 70, 62 až 67(1996)) nebo chemikálií (např. toxinem samotným). Tento podmíněně se replikující vektor se tudíž nebude s pomocí „helperu“ pouze selektivně množit jako odpověď na hrozící patogen nebo toxin (jako výsledek aktivace helperu), ale bude také vylučovat anti-patogennní nebo antitoxinové protilátky, aby byly inhibovány patologické účinky tumorového antigenů, patogenu nebo chemikálie (např. toxinu). Tudíž může být do podmíněně se replikujícího vektoru vložen libovolný protein, faktor nebo genetický element, který může být buď přepsán do mRNA a/nebo proteinu, aby byla inhibována patogenní odpověď - v souhlasu s „helperem“, který podporuje jeho selektivní propagaci a expresi (selektivní, protože produkty helperu jsou exprimovány podmíněně (například, ale bez omezení, (a) indukovatelný promotoravý systém - faktor v tumorové buňce aktivuje produkci helperového faktoru, sekvenci citlivou na toxin, která exprimuj e helperový faktor, nebo promotor, citlivý na cytokin, vyvolává podukci helperového faktoru, (b) helper RNA/protein/faktor je selektivně stabilizován v určitých buňkách a nikoliv v jiných) a (c) nepřímá indukce genu třetí strany, který ovlivňuje produkci helperového virového proteinu, provázení, cílení, strukturu nebo jiné biologické funkce). Tyto strategie mohou být použity u transgenních rostlin a zvířat pro jejich ochranu před patogeny. Podobně mohou být • ··· ·· ···· ·· ···· • · · · · · · • · · ··· · · · • 999 9 9 9 9 · • · ·· · · · · · • ·* 99 999 99 99 tyto strategie použity v transgenních systémech pro produkci cenných heterologních proteinů/faktorů.

V jiném provedení způsobu podle předkládaného vynálezu může být vyvinuta buněčná linie pro skrínink léčiva/faktoru, například pro stanovení, která část proteinu/faktoru je důležitá pro určitou funkci. Může být sestrojen vektor pro expresi mutovaného zájmového proteinu v dané buněčné linii. RNA, kódující tento mutovaný protein, je však sestavena tak, aby byla rezistentní k ribozymů, například vložením tichých bodových mutací. Exprese proteinu divokého typuje však v buněčné linii inhibována. Vektory, které exprimuj í ribozym vůči tomuto zájmovému proteinu, mohou být také sestrojeny tak, aby exprimovaly mutantní testovací protein. Pokud je tento vektor transdukován do buněk, bude většina z nativní RNA, kódující normální protein, rozštěpena, zatímco mutantní testovací protein bude exprimován. Tento způsob může být použit se současně vyvíjenými způsoby dodání a selekce, jako rychlý a mocný způsob pro určení jak daný protein funguje a jak daný faktor/léčivo interaguje s tímto proteinem.

V ještě dalším použití vektoru pro léčbu chorob přenášených krví pacient podstupuje leukafarézi, aby bylo z krve extrahováno dostatečné množství bílých krvinek. Po leukafarézi jsou tyto požadované buňky izolovány, transdukovány s vektorem a potom v kultuře namnoženy na požadovaný počet buněk. V průběhu ex vivo množení tohoto požadovaného typu buněk dostává pacient infuzi protilátek proti proteinům buněčného povrchu požadovaného typu buněk, se záměrem rozbít tyto buňky v průběhu času, který odpovídá rozšíření dostatečného množství požadovaného typu buněk. Transdukované buňky jsou posléze pacientovi zpětně vráceny infúzí, aby byla kompenzována in vivo ztráta buněk, způsobená protilátkou.

Výhodným způsobem provedení shora uvedeného je izolace CD4+ T buněk z leukafarezovaného materiálu a posléze transdukce těchto buněk s HIV vektorem, který obsahuje anti-HIV antisense nebo ribozymovou sekvenci, pro rozšíření ex vivo. V průběhu ex vivo rozšiřování buněk jsou pacientovy endogenní CD4+ T buňky ničeny podáváním například anti-thymocytového globulinu (ATG) Pasteur Merieux Serums et Vaccins, Lyon, Francie, dodávaného SangStat Medical Corporation, Menlo Park, CA, USA) nebo Atgam (Upjohn Company, Kalamazoo, MI, USA), ale po předchozím skríninku může být použita jakákoli cytoreduktivní protilátka, jak je odborníkovi zřejmé. Po rozšíření jsou tyto transdukované CD4+ T buňky vráceny infúzí zpět pacientovi. Ve výhodném provedení jsou CD4 negativní buňky, získané v průběhu izolace CD4 pozitivních buněk, zachyceny, zmrazený a roztaveny pro infuzi v okamžiku, kdy jsou transdukované CD4 pozitivní buňky vraceny pacientovi infúzí zpět.

Shora uvedený příklad neomezuje rozsah vynálezu ani na ATG , ani na CD4+ T buňky. Libovolný buněčný typ může být cílem použití protilátky, která váže protein buněčného povrchu ·· *···

4 • 440 ···· ····

0 0 0 • · · ··· ·« uvedené buňky a která je cytocidní. Tato protilátka může být introdukována exogenně do pacienta a nebo může být do organizmu zaveden druhý vektor, vylučující tuto protilátku. Tento vektor může produkovat protilátku buď konstitutivně (po celý život této buňky) nebo přechodně (například, ale bez omezení na integrázový minus vektor) nebo indukovatelně (například, ale bez omezení na tetracyklinem indukovatelný promotorový systém).

Existuje také mnoho použití metod a vektorů podle vynálezu in vitro. Například mohou být tyto vektory používány pro zjištění určitých nuancí virové replikace a funkce ribozymů. Podobně, mohou být ribozym obsahující vektory použity jako diagnostické nástroje, například pro zjištění mutací přítomných v nemocných buňkách, nebo pro vyšetřování genetického driftu. Tyto vektory mohou také být použity pro určení nebo potvrzení funkce genu, ať už je tato funkce předem známa, neznáma nebo pouze naznačena nebo uvažuje-li se o ní. Tato shora uvedená diskuze není v žádném případě vyčerpávající, co se týče použití vynálezu.

Přínosy vynálezu

Výhody použití crHIV strategie pro genetickou terapeutickou léčbu AIDS a jiných chorob jsou značné. Například se řeší problém cílení vektoru na buňky, infikované HIV. Po in vivo transfekci crHIV do infikovaných CD4+ buněk, jsou crHIV pomocí endogenních infekčních HIV obálkových proteinů zabaleny do virionů potomstva. crHIV RNA se přitom navazuje podél vnitřních virionů potomstva a infikuje buněčné typy, které jsou normálně infikovatelné tímto konkrétním kmenem HIV, a tak produkuje nepatogenní viriony. Toto zahrnuje i obtížně zacílitelné buňky, jako jsou mozkové mikrogliové buňky, které jsou hlavní zásobárnou HIV infekce pro centrální nervový systém. Je pravděpodobné, že s crHIV vektory, které infikují neinfikované CD4+ buňky, je spojeno málo toxicity, protože crHIV vektory nekódují žádné virové proteiny. Kromě toho, výsledkem kompetice crHIV vektoru s divokým typem HIV je produkce nepatogenních částic, což má za následek sníženou virovou zátěž. Snižování patogenních HIV-1 zátěží nezvyšuje pouze dobu přežívání infikovaných jedinců, ale také snižuje rychlost přenosu na neinfikované jedince, protože crHIV částice se také mohou rozšiřovat systémově (tj. tak jako infekční HIV). Snížené patogenní HIV-1 zátěže v krvi mohou být důležité zvláště u těhotných HIV infikovaných jedinců, protože produkce crHIV může také snižovat přenos HIV-1 u infikovaných matek na plod v děloze.

Směs plazmid/lipid, která může být využita pro zavedení crHIV vektoru do hostitelských buněk, by měla být stabilní a výrobně laciná, obcházející nákladné strategie ex vivo. Samozřejmě, způsob podle tohoto vynálezu je ve své podstatě přizpůsobitelný i pro použití při dodání genů ex vivo, pokud je to žádoucí. Bez ohledu na to otevírá dostupnost lipozomy »· ·* 0000 00 0000 • · · · · · 0 » · 0 000 0 0 0 ••• 0 000 0 0 • 00 využívajícího přístupu možnost léčby široké populace, něco, co není proveditelné se současnými genovými terapeutickými strategiemi. crHIV vektory mohou být také sestrojeny tak, aby obsahovaly několik ribozymů, které mohou být konstruovány vůči různým cílům v genomu HIV. Tím je snížena možnost, že infekční HIV bude mutovat a tím unikne účinku anti-HIV ribozymů. Kromě toho, může být vektor, schopný se podmíněně replikovat, aplikován na léčbu jiných virových infekcí, zvláště těch, u který je vysoký obrat viru.

Zvlášť využitelnou vlastností crHIV vektorů je, že mohou být použity pro posttranskripění expresi genetických antivirových činidel, například ribozymů. Infekce neinfikovaných buněk crHIV vektory totiž vede k nižší toxicitě, protože v nepřítomnosti Tat proteinu bude probíhat malá exprese z HIV dlouhého koncového opakujícího se (LTR) promotoru. Vysoké hladiny crHIV exprese a následná antivirová aktivita, nastává pouze tehdy, když je poskytnut Tat protein komplementací s divokým typem HIV. crHIV vektory tudíž nejsou kontruovány k ochraně buněk před HIV infekcí, ale aby snižovaly celkovou zátěž divokým typem HIV pomocí selektivní akumulace nepatogenních crHIV částic.

I když se nechceme vázat na jakoukoliv určitou teorii, vztahující se k pochodům a k funkcím tohoto vynálezu, máme za to, že ribozymy mohou být využívány, jak je potvrzeno v následujících příkladech, pro získání crHIV genomů se selektivní výhodou, na základě dvou použitelných vlastností: (1) mají vysoký stupeň specifity a (2) mají relativní účinnost, v závislosti na jejich schopnosti být společně umístěn (společně lokalizován) s cílovými RNA (Cech, Science, 236,1532 až 1539 (1987). Specifita ribozymů je jim propůjčena specifickou hybridizací na komplementární cílové sekvence, obsahující XUY místo. Ribozymy jsou relativně účinné, protože štěpí cílovou RNA s vysokou účinností pouze tehdy, když jsou účinně společně umístěny s cílovými RNA. Při smíšené infekci HIV/crHIV musí nastat společné umístění ribozymů, obsahujících crHIV RNA s divokým typem HIV RNA, protože genomy HIV RNA před zabalením do virionů potomstva dimerizují. Štěpení ne genomových RNA divokého typu HIV, které je potřebné pro tvorbu virových proteinů, je pravděpodobně méně účinné než štěpení genomických RNA divokého typu HIV, protože negenomové HIV RNA nedimerizují. Ve zde popsaných experimentech bylo objeveno, že selektivní výhoda, kterou získává crHIV, je důsledkem selektivního zabalení crHIV do virových částic. Tyto výsledky naznačují, že nej účinnější štěpení nastává intracelulámě v průběhu dimerizace, s výsledkem selektivní destrukce divokého typu HIV RNA nukleázami hostitele. V důsledku toho je umožněno výhodné zabalení crHIV do virových částic.

Aplikace crHIV vektorů pro HIV terapii může zahrnovat nejenom genomovou selekci crHIV, ale také buněčnou selekci buněk, produkujících crHIV částice. Jinak budou buňky, ·»·· ·· ΦΦΦΦ

ΦΦ ΦΦ··

ΦΦΦΦ φ φ φ • φ φ ΦΦΦ ΦΦΦ • · · φ ΦΦΦ φ φ ♦ ♦ 9 9 φ ΦΦΦΦ • ·♦ ΦΦ ··· ΦΦ ΦΦ produkující divoký typ HIV, produkovat divoký typ HIV částic se selektivní výhodou oproti buňkám, produkujícím crHIV částice, a budou rychle převládat. Selektivní výhoda může být buňkám, exprimujícím crHIV, dodána inzercí genu do genomů crHIV (např. genu multispecifické rezistence proti léčivům), který dodává buňkám, exprimujícím crHIV (v přítomnosti léčiva) výhodu přežití oproti buňkám, exprimujícím divoký typ HIV. Za těchto podmínek buňky exprimující HIV divokého typu progresivně hynou, ale stále produkují určité množství HIV divokého typu, zatímco crHIV exprimující buňky, selektivně produkující crHIV, přežívají. Infekce crHIV obsahujících buněk zbylými HIV buňkami divokého typu bude mít za následek další produkci virových částic, obsahujících crHIV. Virový genomový posun tak může mít za výsledek kumulativní infekci CD4+ buněk genomem crHIV, čímž je změněna virová rovnováha v hostitelské buňce od patogenního divokého typu HIV k nepatogenním crHIV genomům. Tato strategie bude mít za následek vymizení divokého typu HIV, jakmile dojde k selektivnímu posunu rovnováhy genomů HIV od divokého typu HIV ke crHIV. Virová replikace bude nakonec přerušena, protože crHIV se může replikovat pouze v přítomnosti helperových genomů divokého typu HIV. Za takových vzájemně restriktivních podmínek může být tudíž možné sestrojit crHIV vektory, které nejenom snižují virovou zátěž divokým typem HIV, ale také odstraňují tento virus z hostitele, infikovaného HIV.

Prostředky produkce

Vektor může být produkován způsobem komplementace, buď použitím přechodné transfekce vektorového a helperového genomu do buněčné linie, výhodně, ale bez omezení na ni, do známé buněčné linie 293T, nebo použitím obalovací buněčné linie. Buňka je přechodně transfektována s vysokou transfekční účinností pomocí transfekčního činidla, výhodně fosforečnanu vápenatého, elektroporace nebo lipidového transfekčního činidla. Když transfekce proběhne, je vektor izolován ze supernatantu výhodně ne dříve než 12 hodin po transfekci a ne déle než 7 dní po transfekci. Vektor se, pokud je to žádoucí, zkoncentruje vysokorychlostní centrifugací bez precipitace nebo ultracentrifugací. Výhodné centrifugační podmínky jsou asi 5000 až 12 000 x g, výhodně asi 10 000 x g. Výhodnějšími podmínkami je centrifugace přes noc při 4 °C.

44··

4 4

4 44 4

4444 ► 4 4

I 4 4

Způsoby purifikace vektoru

Způsob 1

1. Vyčiření virového supematantu

2. Koncentrování ultrafiltrací

3. Diafiltrace s nebo bez ošetření benzonázou

4. Ionexová chromatografie

5. Velikostně vylučovací chromatografie nebo diaultrafiltrace

6. Případné koncentrování ultrafiltrací

Způsob 2

1. Vyčiření virového supematantu

2. Ionexová chromatografie

3. Diafiltrace nebo velikostně vylučovací chromatografie

4. Případné ošetření benzonázou

5. Velikostně vylučovací chromatografie nebo diafiltrace

6. případné koncentrování ultrafiltrací

Pro shora uvedené postupy je možno použít různé pryskyřice, včetně Poros 50HQ od Perseptive Biosystems. Pro ultrafiltrací nebo diafiltraci mohou být použity patrony s dutým vláknem, včetně patron (UFP-750 serie) od A/G Technologies.

Způsoby podání

Podle vynálezu se v případě potřeby genové terapie virové infekce vektor zavede do hostitelské buňky, jak bylo uvedeno dříve. Způsob zavedení zahrnuje kontakt hostitelské buňky, schopné být infikována virem s vektorem podle vynálezu. Je výhodné, když tento kontakt zahrnuje libovolný způsob, kterým je tento vektor zaveden do buňky; metoda není závislá na konkrétním prostředku zavedení a nelze ji tak vykládat. Metody zavádění jsou odborníkům známy a jsou zde také uvedeny na příkladech.

V souhlase s tím může být introdukce provedena, například buď in vitro (např. při způsobu genové terapie typu ex vivo) nebo in vivo, což zahrnuje použití elektroporace, transformace, transdukce, konjugace nebo třírodičovského párování, transfekce, infekce, • 444

4444 »1 »444 • * · 4 9 4 44 9 • 4 4444« 4« 4 * 4444 4444 4 ·♦* · · 4 4444 ··· 4· 44 «94 «4 44 membránové fuze s kationtovými lipidy, vysokorychlostní bombardování projektily, potaženými DNA, inkubací s DNA, precipitovanou fosforečnanem vápenatým, přímé mikroinjekce do jednotlivých buněk apod. Jsou dostupné a odborníkům známé i jiné metody.

Výhodně se však vektory nebo ribozymy zavádějí pomocí kationtových lipidů, např. lipozomů. Takové lipozomy jsou komerčně dostupné (např. Lipofectin™., Lipofectamine™ apod., dodávané firmou Life Technologies, Gibco BRL, Gaithersburg, Md.). Kromě toho mohou být v předkládaném vynálezu využity lipozomy, mající zvýšenou kapacitu přenosu a/nebo sníženou toxicitu in vivo (např. jak je popsáno v PCT patentové přihlášce č. WO 95/21259). Pro podání lipozomů je možno použít doporučení, popsané v PCT patentové přihlášce č. WO 93/23569. Obecně je při takovém podání formulace přijata většinou lymfocytů během 8 hodin při 37 °C, s více než 50 % injekční dávky, detekovanými ve slezině jednu hodinu po intravenózním podání. Podobně jiné farmaceutické nosiče zahrnují hydrogely a polymery s kontrolovaným uvolňováním.

Forma vektoru, introdukováného do hostitelské buňky, se může měnit, v částečné závislosti na tom, zde se vektor zavádí in vivo nebo in vitro. Nukleová kyselina může být například uzavřená kruhová, přerušená nebo izovaná, v závislosti na tom, zda má být vektor udržován extragenomově (tj. jako autonomně se replikující vektor), integrovaný jako provirus nebo profág, přechodně transfektovaný, přechodně infikovaný při použití replikačně deficientního nebo podmíněně se replikujícího viru, nebo stabilně introdukován do hostitelského genomu prostřednictvím dvojitého nebo jednoduchého rekombinačního křížení.

Před introdukcí do hostitele může být vektor podle vynálezu formulován v různých prostředcích pro použití v terapeutických i v profylaktických léčebných metodách. Zejména může být vektor vložen do farmaceutických prostředků spojením s vhodnými, farmaceuticky přijatelnými nosiči nebo plnidly a může být formulován tak, aby byl vhodný pro humánní nebo veterinární aplikaci.

Prostředek pro použití ve způsobu podle vynálezu může tudíž obsahovat jeden nebo více shora uvedených vektorů, výhodně ve spojení s farmaceuticky přijatelným nosičem. Farmaceuticky přijatelné nosiče jsou odborníkům známy, stejně jako vhodné způsoby podání. Volba nosiče může být určena částečně konkrétním vektorem, stejně jako konkrétním způsobem, použitým pro podání tohoto prostředku. Odborníkovi je známo, že existují různé cesty podání prostředku a i když pro podání je možno použít více než jednu cestu podání, může určitá cesta podání poskytnout okamžitější a účinnější reakci než jiná cesta. V souhlase s tím existuje mnoho vhodných lékových forem pro prostředky podle předkládaného vynálezu.

• w ·· + « ·· ·»»·

9 9 9 9

9999 « 9 ·

9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 ·· 999 9« 9«

Prostředek, obsahující vektor podle předkládaného vynálezu, samotný nebo ve spojení s jinými antivirovými sloučeninami, může být připraven v lékové formě, vhodné pro parenterální podání, výhodně pro intraperitoneální podání. Tato léková forma může zahrnovat vodnou i nevodnou formu, izotonické sterilní injekční roztoky, které mohou obsahovat antioxidanty, pufty, bakteriostatika a rozpuštěné látky, které způsobují, že léková forma je izotonická s krví zamýšleného příjemce, a vodné i nevodné sterilní suspenze, které mohou obsahovat suspendující činidla, rozpouštědla, zahušťující činidla, stabilizizátory a konzervační látky. Tyto lékové formy mohou být uvedeny v jednotkových dávkách nebo ve vícedávkových zatavených obalech, jako jsou ampule a lahvičky, a mohou být skladovány v lyofilizovaném (mrazově sublimováném) stavu, vyžadujícím pouze přidání sterilního kapalného nosiče, například vody pro injekci, bezprostředně před použitím. Injekční roztoky a suspenze pro okamžité použití mohou být připraveny ze sterilních prášků, granulí a tablet, jak je zde popsáno.

Vektor může být skladován v libovolném vhodném roztoku, pufru nebo v lyofilizované formě, je-li třeba. Výhodným skladovacím pufřem je Dulbecco's Phosphate Buffered Salině; Dulbecco's Phosphate Bufered Salině smísený s 1 až 50% roztokem trehalózy ve vodě (1:1), výhodně 10% roztokem trehalózy ve vodě (1:1), takže je výsledná koncentrace 5% trehalózy; Dulbecco's Phosphate Buffered Salině smísený s 1 až 50% roztokem glukózy ve vodě (1:1), výhodně 10% roztokem glukózy ve vodě (1:1), takže je výsledná koncentrace glukózy 5%; 20mM HEPES pufrovaný fyziologický roztok smísený s 1 až 50% roztokem trehalózy ve vodě (1:1), výhodně 10% roztokem trehalózy ve vodě (1:1), takže je výsledná koncentrace trehalózy 5% nebo Dulbecco's Phosphate Buffered Salině smísený s 1 až 50% roztokem mannitolu ve vodě (1:1), výhodně 5% roztokem mannitolu ve vodě (1:1), takže výsledná koncentrace mannitolu je 2,5%.

Léková forma, vhodná pro orální podání, může sestávat z kapalných roztoků, jako je účinné množství sloučeniny, rozpuštěné v rozpouštědle, jako je voda, fyziologický roztok nebo ovocná šťáva; kapsle, sáček nebo tablety, obsahující předepsané množství aktivní složky, v pevné formě nebo granulích; roztoky nebo suspenze ve vodné kapalině a emulze olej ve vodě nebo voda v oleji. Tabletové formy mohou obsahovat jednu nebo více z laktóza, mannitol, kukuřičný škrob, bramborový škrob, mikrokrystalická celulóza, arabská guma, želatina, koloidní oxid křemičitý, talek, stearát hořečnatý, kyselina stearová a jiná plnidla, barevné látky, ředidla, pufrační látky, zvlhčující činidla, konzervace, chuťové látky a farmaceuticky přijatelné nosiče.

Pro podání inhalací mohou být také připraveny aerosolové lékové formy. Aerosolová léková forma může být umístěna v tlakovém přijatelném hnacím plynu, jako je dichlordifluormethan, propan, dusík a jim podobné.

to ••toto toto toto·· »* totototo • · » to ©to to « ····· toto · • toto · * · » · » ·· ·« · to··· ·· ·· ··· ·· ··

Lékové formy pro orální podání mohou obdobně zahrnovat formy pokroutek, které mohou obsahovat aktivní složku v chuťové složce, obvykle sacharóze a arabské gumě a tragantu; pastilek, které obsahují aktivní složku v inertním základu, jako je želatina a glycerin nebo sacharóza a arabská guma a ústních vod, které obsahují aktivní složku ve vhodném kapalném nosiči, rovněž jako krémů, emulzí, gelů a jim podobných, obsahujících, kromě aktivní složky ještě nosiče, známé v této oblasti techniky.

Lékové formy pro místní použití mohou být ve formě krémů, pleťových mastí nebo pleťových vod.

Lékové formy pro rektální podání mohou být ve formě čípků se vhodným základem, obsahujícím, například kakaové máslo nebo salicylát. Lékové formy, vhodné pro vaginální podání, mohou být pesary, tampóny, krém, gel, pasta, pěna nebo sprej ové lékové formy, obsahující kromě aktivní složky nosiče, které jsou známy v této oblasti techniky jako vhodné. Aktivní složka může být obdobně kombinována s lubrikantem, jako je povlak na kondomu.

Dávka, podávaná živočichovi, hlavně člověku, by měla být podle předkládaného vynálezu dostatečná pro vyvolání terapeutické odpovědi v infikovaném jedinci po přiměřený časový úsek. Dávka je určena podle síly příslušného vektoru, využívaného pro léčbu, rozsahu stavu nemoci, rovněž jako tělesné hmotnosti a věku infikovaného jedince. Velikost dávky bude také určena na základě existence jakýchkoliv nepříznivých postranních účinků, které mohou doprovázet použití konkrétního vektoru. Vždy je žádoucí, aby, pokud je to možné, byly nepříznivé vedlejší účinky udržovány na minimu.

Dávka může být v jednotkové dávkové formě, jako jsou tablety nebo kapsle. Termín Jednotková dávková forma“ je zde používán pro označení fyzikálně oddělených dávek, vhodných jako jednotkové nedělené dávky pro lidské i zvířecí subjekty, kde každá jednotka obsahuje předepsané množství vektoru, samotného nebo ve spojení s jinými antivirovými činidly, v množství, vypočteném jako dostatečné pro vyvolání požadovaného účinku ve spojení s farmaceuticky přijatelným plnidlem, nosičem nebo prostředkem. Specifikace jednotkových dávkových forem podle předkládaného vynálezu závisí na konkrétní sloučenině nebo sloučeninách, které jsou využívány a na účinku, kterého má být dosaženo, rovněž jako na farmakodynamice, spojené s každou sloučeninou u daného hostitele. Podávaná dávka by měla být v „antivirově účinném množství“ nebo v množství, nezbytném pro dosažení „účinné hladiny“ u jednotlivého pacienta.

I když „účinná hladina“ je používána jako výhodný konečný bod pro dávkování, skutečná dávka a dávkový režim se mohou měnit, v závislosti na rozdílech ve farmakokinetice mezi individuálními pacienty, distribuci léčiva a metabolizmu. „Účinná hladina“ může být φφφφ φφ «φφφ • φ φφφ φφφ φφ

ΦΦ ΦΦΦ» • · · • Φ ΦΦΦ

Φ Φ · • · · ·· Φ·· * · Φ

ΦΦΦ Φ Φ Φ

Φ Φ Φ Φ

ΦΦ ΦΦ například definována jako hladina v krvi nebo v tkáni, požadovaná u pacienta, která odpovídá koncentraci jednoho nebo více vektorů podle tohoto vynálezu, které inhibují virus, jako je HIV, v testu, prediktivní klinické antivirové aktivity těchto chemických sloučenin. „Účinná hladina“ pro sloučeniny podle předkládaného vynálezu se může také změnit, pokud jsou sloučeniny podle předkládaného vynálezu použity ve spojení se zidovudinem nebo jinými známými antivirovými sloučeninami nebo jejich kombinací.

Odborník v této oblasti techniky je schopen snadno určit dávku, dávkový režim a způsob podání pro určitou lékovou formu používané sloučeniny, aby bylo dosaženo požadované „účinné hladiny“ u individuálního pacienta. Odborník v této oblasti techniky také snadno určí a použije vhodnou indikaci „účinné hladiny“ sloučenin podle předkládaného vynálezu buď přímou (např. chemickou analýzou) nebo nepřímou (např. náhradní íindikací virové infekce, jako je p24 nebo reverzní transkriptáza pro léčbu AIDS nebo chorob podobných AIDS) analýzou vhodných vzorků, odebraných pacientovi (např. krev a/nebo tkáň).

Dále, s ohledem na určení účinné hladiny u pacienta pro léčbu AIDS nebo chorob podobných AIDS, jsou konkrétně k dispozici zvířecí modely, které byly rozsáhle začleněny do vyhodnocování in vivo účinnosti proti HIV v různých postupech genové terapie (Sarver et al. (1993b), výše). Tyto modely zahrnují myš, osla a kočku. I když tyto zvířecí modely nejsou přirozeně náchylné vůči HIV nemocem, chimérické modely myši (např. SCID, bg/nu/xid, NOD/SCID, SCID-hu, imunokompetentní SCID-hu, BALB/c s odebranou kostní dření), rekonstituované lidskými periferními krevními mononukleámími buňkami (PBMC), lymfatickými uzlinami, fetálními játry/brzlíkemnebo jinými tkáněmi mohou být infikovány vektorem nebo HIV a využívány jako modely pro HIV patogenezi a genovou terapii. Podobně může být využíván virus opičí imudodeficience (SIV) nebo oslí model, rovněž jako model viru imunodeficience lišek (FIV) nebo koček.

Tyto modely mohou být také využívány pro určení bezpečnosti vektoru pro postupy vyhodnocení vektorového systému v klinických postupech. Důležitou aplikací je použití těchto živočišných modelů pro biodistribuční studie. Transdukované buňky, výhodně, ale bez omezení na lidské buňky, obsahující vektor, jsou injikovány do jiného než lidského živočišného modelu a bezpečnost tohoto vektoru je určena na základě nepřítomnosti vektorového genetického materiálu v živočišné tkáni. Tato nepřítomnost vektorového genetického mateirálu v živočišné tkáni znamená, že se tento vektor autonomně nereplikuje bez přítomnosti helperu nebo divokého typu viru a tudíž může být pokládán zabezpečný pro klinické použití u člověka. Přítomnost vektoru v nepřítomnosti helperového vektoru nebo helperového viru může být pokládána za bezpečnostní riziko, pokud se neočekává, že se vektor replikuje autonomně. V případě, že se • · · · • · ··· · • · očekává, že vektory jsou schopné autonomní replikace, je však nutné určit jiná kriteria bezpečnosti, například neschopnost replikace v určitých tkáních nebo hladinu replikace v živočichovi. Přítomnost nebo nepřítomnost tohoto vektoru lze určit pomocí PCR nebo analýzou FACS, pokud testovaný vektor exprimuje markerový gen, který může být vizualizován pomocí FACS, ale není omezena na tyto způsoby detekce.

Obecně je množství vektoru, vhodné pro dosažení koncentrace podávaného ribozymu (nebo vektoru) v tkáni, výhodně od asi 5 pg/kg do asi 300 mg/kg tělesné hmotnosti na den, zvláště od asi 10 pg/kg do asi 200 mg/kg tělesné hmotnosti na den. V určitých aplikacích, např. místníh, oční nebo vaginální, jsou výhodné vícenásobné denní dávky. Kromě toho bude počet dávek záviset na způsobu dodání a konkrétním podávaném vektoru.

V léčbě některých jedinců infikovaných viry může být žádoucí použít „mega-dávkový“ režim, kdy je podána velká dávka vektoru, této sloučenině je ponechán čas pro působení a poté je jedinci podáno vhodné činidlo pro inaktivaci této aktivní sloučeniny (sloučenin). Při způsobu podle vynálezu (tj. replikaci vektoru v kompetici s virem, který je léčen) je tato léčba nezbytně omezena. Jinými slovy, jak se hladina, například HIV, snižuje, bude se snižovat také hladina vektoru závislého na HIV pro produkci virionů.

Farmaceutický prostředek může obsahovat ve spojení s vektorem podle vynálezu jiné farmaceutické sloučeniny, pokud je použit pro terapeutickou léčbu AIDS. Tyto jiné farmaceutické sloučeniny mohou být použity jejich tradičním způsobem (tj. jako činidla pro léčbu HIV infekce), stejně jako konkrétně při selekci na crHIV viry in vivo. Tato zde popsaná selekce bude podporovat šíření podmíněně se replikujícího HIV a umožní podmíněně se replikujícímu HIV, aby účinněji soutěžil s divokým typem HIV, což bude nutně omezovat patogenicitu divokého typu HIV. Zejména se uvažuje, že může být využito antiretrovirové činidlo, jako je výhodně zidovudin. Další reprezentativní příklady těchto doplňkových farmaceutických sloučenin, které mohou být použity kromě shora popsaných, zahrnují antivirové sloučeniny, imunomodulátory, imunostimulanty, antibiotika a jiná činidla a léčebné režimy (včetně těch, které jsou označovány jako alternativní medicína), které mohou být využity pro léčbu AIDS. Antivirové sloučeniny zahrnují, ale bez omezení na, ddl, ddC, gancyklovir, fluorované dideoxynukleotidy, sloučeniny nenukleosidových analogů, jako je nevirapin (Shih et al., PNAS, 88,9878 až 9882 (1991)), TIBO deriváty, jako je R82 913 /White et al., Antiviral Research, 16,257 až 266 (1991)) a BI-RJ-70 (Shih et al., Am. J. Med., 90 (Suppl. 4A), 8S až 17S (1991)). Imunomodulátory a imunostimulancia zahrnují, ale bez omezení na ně, různé interleukiny, CD4, cytokiny, preparáty protilátek, krevní transfuze a buněčné transfuze.

·· ···· • · • · · ·

Antibiotika zahrnují, ale bez omezení na ně, antiíungální činidla, antibakteriální činidla a činidla proti Pneumocystis carinii.

Podání sloučeniny, inhibující virus, s jinými antiretrovirovými činidly a zejména se známými RT inhibitory, jako jsou ddC, zidovudin, ddl, ddA nebo jiné inhibitory, které účinkují proti jiným HIV proteinům, jako jsou anti-TAT činidla, bude obecně inhibovat většinu nebo všechna replikační stadia životního cyklu viru. Byla publikována dávkování ddC a zidovudinu, použitá u pacientů s AIDS nebo ARC. Virostatický rozsah ddC je obecně mezi 0,05 μΜ až 1,0 μΜ. Rozsah od 0,005 do 0,25 mg/kg hmotnosti těla je virostatický u většiny pacientů. Dávkové rozsahy pro orální podání jsou poněkud širší, například 0,001 až 0,25 mg/kg podané v jedné nebo více dávkách v intervalech 2,4, 6, 8 a 12 atd. hodin. Je výhodné, když je podáváno 0,01 mg/kg tělesné hmotnosti pacienta ddC každých 8 hodin. Pokud se jedná o kombinovanou terapii, může být tato další antivirová sloučenina například podávána současně s vektorem podle vynálezu nebo může být dávkování upraveno jak je třeba. Vektor může být také kombinován v prostředku. Pokud je použita kombinace, může být dávka každé složky nižší než když je užita samostatně.

Přehled orázků na výkresech

Obrázky IA až 1K jsou schematickými znázorněními konkrétních zlepšených podmíněně se replikujících vektorů, zahrnutých ve vynálezu: pNl (cPT), pNl (cPTc) ASenvGFP (464), pNl (cPT) ASenvGFP (452), pNl (cPT2) ASenvGFP, pNl (cPT) cGFP, pNl GFP (cPT) T, pNl (cPT) GFPTAR, pNl GFP (cPT) VT, pN2GFP, pN2ASenvGFP (418) apN2 (spe) ASenvGFP. Markerový gen pro zeleně fluoreskující protein (GFP) může být samozřejmě odstraněn před použitím vektoru ve zde popsaných aplikacích. Označení: Nl, minimální HIV odvozený vektor bez gag/pol sekvencí, ale s obalovací sekvencí z gag naznačuje, že gag' nebo gag a terminační kodon jsou umístěny asi 40 párů baží od AGT sekvence gag; N2, HIV-1 odvozený vektor, schopný exprese gag/pol sekvencí; AS, antisense; Asenv, env sekvence přítomná v antisense orientaci; gag, pol a env, sekvence kódující proteiny, které tvoří obal viru, reverzní transkriptázy, respektive obálky; tat, rev, rre a nef, další virové geny; cPTc, minimální střední polypyrimidinový úsek sekvence; cPT, středový polypyrimidinový úsek, obsahující velký inzert o 548 párech baží; cPT2, střední polypyrimidinový úsek, obsahující sekvenci 438 párů baží (neobsahuje gag sekvence jako jsou cPT); spe, gag/pol sekvence nejsou translatovány; GFP, kódující zeleně fluoreskující protein..

• · • · · ·

Obrázek 2 popisuje DNA sekvence divokého typu HIV U5 RNA SEQ ID NO: 1 (A) a modifikovanou crHIV U5 RNA SEQ ID NO: 2 (B). Čísla označují počet baží od startu transkripce.

Obrázek 3A až 3E znázorňuje účinky helperového vektoru na podmíněně se replikující vektor (cr) v poměru k titru produkovaného cr vektoru. Obrázek 3 A ukazuje molámí poměr 1 : 0,5 při výsledku s nej vyšším titrem pro pNl (cPTc) GFP; 3B a 3C ukazují molámí poměr 1 : 0,75, poskytující nejvyšší titr pro pNl (cPT) GFP a pNl (cPT2), resp. ASenvGFP a 3D a 3E ukazují molámí poměr 1 : 1,5 poskytující nyjvyšší titr pNlcGFP, resp. pN2cGFP. Tyto vektory jsou ukázány na obrázku 1, s výjimkou pNl (cPT)GFP, kde chybí antisense env sekvence a pNlcGFP a pN2cGFP, které mají inzertován cytomegalovirový (CMV) promotor pro expresi GFP. Tyto obrázky naznačují, že s dvojplazmidovým systémem bylo dosaženo podmínek pro produkci titrů nejméně 1,5 x 10 transdukěních jednotek na mililitr.

Obrázky 4A a 4B ukazují mapy dvou na HIV-2 založených podmíněně se replikujících vektorů: pSIcGFP a pS2cGFP. Označení pSI a pS2 označují přítomnost nebo nepřítomnost gag/pol sekvencí, jak jsou popsány shora pro pNl a pN2. Označení c znamená přítomnost CMV promotoru pro řízení exprese GFP.

Obrázek 5A a 5B znázorňuje účinky různých konstruktů helperového vektoru na zabalení pSIcGFP a pS2cGFP. Účinek různých molárních poměrů mezi helperovým vektorem a podmíněně se replikujícím vektorem byl testován společně s účinkem různých RRE na helperový vektor. Jak je uvedeno, použití poměru 1 : 1 helperového vektoru k podmíněně se replikujícímu vektoru bylo účinnější při produkci funkčních vektorových částic, než jiné použité poměry.

Obrázky 6A až 6G popisují struktury různých konstruktů helperových vektorů: pVIRPAC-1, pVIRPAC-2, pVIRPAC-l.lRz, pVIRPAC-1.2, VirPacl.2Rz, pVIRPAC-1.2Rz2, and pVIRPAC-1.2RzIn, jak jsou zahrnuty v předkládaném vynálezu. Rz označuje přítomnost anti-U5 ribozymů, zatímco 1,1 a 1,2 označují helperový vektor, který má RRE odvozeno od HIV-1, případně od HIV-2.

Obrázek 7 znázorňuje vliv jednoho nebo více ribozymů na titry virového vektoru. PNl (cPT) GFP byl obalen v HeLa-tat buňkách v přítomnosti pVirPacl.2 (neobsahující žádné ribozymy), pVirPacl.2RzIn (obsahující jeden ribozym a intron), pVP1.2Rz (obsahující jeden ribozym) nebo pVP1.2Rz2 (obsahující dva ribozymy). Jak je uvedeno na grafu, přítomnost jednoho ribozymů (pVirPacl.2Rz) nebo ribozymů a intronu, určeného pro ovlivnění buněčného transportu helperové RNA (pVirPacl.2RzIn), neměla žádný průkazný účinek na titr vektoru. PCR analýzy titru vzorků spolu zabalených konstruktu helperového vektoru naznačily nízké • · • · · • · · · • · ···· • · · · · * · · · ®· ·Φ ··· ·· · · spolu-sbalování v přítomnosti ribozymu proti vysokému spoiu-sbalování v nepřítomnosti ribozymu. Indikátor “VirPac” může být také označován jako “VIRPAC” nebo jako “VP”.

Obrázek 8 znázorňuje inhibiční účinek vektorů z pNl a pN2 serie na divoký typ replikace v T buňkách. T buňky byly nejprve transdukovány vektorem a potom infikovány divokým typem viru při mnohočetnosti infekce 0,1 se 100 % transdukovaných buněk. Replikace viru byla testována pomocí p24 ELIS A analýzy zachytávání antigenu. pN2ASenvGFP vykázal hlubokou inhibicí replikace divokého typu viru.

Obrázky 9A a 9B ukazují mohutnou inhibicí replikace divokého typu HIV vektory, založenými na pNl a pN2. Obrázek 9A ukazuje mohutnou inhibici divokého typu HIV v lidských T buňkách vektory pNlGFP(cPT) VT a pN2ASEnvGFP ve srovnání s kontrolními tumorovými buňkami po infekci divokým typen HIV. Obrázek 9A ukazuje podobné výsledky v T buňkách s pNl(cPT)ASenvGFP a pN2ASenvGFP.

Obrázek 10A a 10B ukazuje vektory a jejich použití pro selekci transdukovaných buněk. Obrázek 10A ukazuje organizaci použitých vektorů, kde pNICMIG a pNIMCG obsahují interní CMV promotor, zatímco pNIMIG a pNIMIG-W exprimují MGMT geny prostřednictvím HIV LTR promotoru. Obrázek 10B ukazuje graf expanze SupTl buněk, transdukovaných se shora uvedenými vektory a selektované na základě BG a BCNU, jak je popsáno v příkladu 5 níže.

Obrázek 11, panely A až F, ukazují selekci transdukovaných primárních CD4+ buněk pomocí BG a BCNU. CD4+ buňky, transdukované s pN2MIG, byly kultivovány v 0; 0,5; 2,5; 10 a 10 pM BG (uvedeno na panelech A až F), s uvedenou koncentrací BCNU. Panel F dále ukazuje výsledky ředění transdukovaných buněk 1 : 5 s následným ošetřením 10 μΜ BG s uvedenými koncentracemi BCNU. Výchozí hladina 3 % GFP+ buněk na panelu F byla zvýšena nejméně 32násobně na 97% hladinu, která dosud nebyla in vitro pozorována.

Obrázek 12 ukazuje účinky ribozymů při ochraně před spolu-zabalením helperové RNA do vektorových preparátů. Supematanty, obsahující virus, byly extrahovány “boom” extrakcí a podrobeny digesci DNázou I, následovanou kvalitativní reverzní transkriptázovou-PCR (RT PCR) detekcí HIV-1 gag-pol oblasti, nacházejícíc se v helperovém konstruktu. Jak je patrné, přítomnost jednoho nebo dvou ribozymů v použitém konstruktu helperu (pVP 1.2Rz nebo pVPl .2Rz2) významně snížila množství současně sbaleného helperového vektoru vzhledem k ribozymu bez helperu (pV 1.2).

Obrázky 13A a 13B ukazují schopnost odstraňovat tumorové buňky z CD34+ kmenových buněk. Obrázek 13A ukazuje, že při MOI rovno 10, pNl (cPT) ASenvGFP transdukoval 98,52 % SupTl tumorových buněk po jednoduchém cyklu transdukce. Obrázek 13B ukazuje, že při transdukci CD34+ buněk nebyla zjevná významná transdukce po • · · · · • · · • · · φφ · · · jednoduchém cyklu transdukce. Významná transdukce byla pozorována terpve po třech cyklech transdukce. Označení: například 1/2/A. označuje 1 cyklus transdukce, MOI rovno 2 a přítomnost virových doplňkových proteinů na transdukovaném vektoru, zatímco například 3/50 znamená 3 cykly transdukce a MOI rovno 50.

Obrázek 14A ukazuje struktury VSV-G divokého typu, RDI 14 divokého typu a chimérických obálkových proteinů s vyznačenými extracelulámími, transmembránovými a cytoplazmatickými doménami. Obrázek 14B ukazuje titry HIV-1 vektorů pseudotypo váných v HT1080 s různými obálkovými proteiny (VSV-G divoké typy, G virus vztekliny, divoký typ RD 114a RD114E, chimérické konstrukce VSV-G a RD114).

Obrázky 15A až 15E jsou schematická znázornění specifických konstruktů obalovací linie, zahrnuté ve vynálezu: p (CGCRSRRE), p(TREtTApuro), p(BI-RevTat), p(EH-GP) a p(CMV-GP). Obrázek 15F ukazuje organizaci konstruktů VSV-G, závislých na rev.

Obrázek 16 ukazuje výtěžek pNl (cPT) GFP vektorů na zastoupené buňky před a po koncentraci v HeLa-tat buňkách. Jak je patrné, výtěžek se udržuje na přibližně 1O¹⁰ za každého souboru podmínek.

Obrázek 17 ukazuje výsledky při použití systému Rev/RRE/CRS pro kontrolu exprese VSV-G.

Obrázek 18 ukazuje vliv zásobního pufru na výtěžek vektoru při skladování po 3 až 5 týdnů při různých teplotách. Jak je patrné, přítomnost 10 % trehalózy nebo 10 % glukózy buď v D-PBS nebo HBS poskytla dobré výtěžky vektoru při skladování buď při -20 °C nebo při -80 °C.

Příklady provedení vynálezu

Předkládané vynalezené sloučeniny a způsoby jsou dále popsány v souvislosti s následujícími příklady. Tyto příklady slouží pro další ilustraci předkládaného vynálezu a nejsou zamýšleny jako omezení rozsahu vynálezu.

Příklad 1

Tento příklad popisuje sestrojení podmíněně replikačně kompetentních vektorů podle vynálezu. Tento příklad konkrétně popisuje sestrojení podmíněně se replikujících vektorů, založených na HIV, tj. crHIV vektorů.

Jedním z nej nápadnějších aspektů HIV-1 patogeneze je produkce genetických variant viru. Rychlá produkce HIV variant in vivo nasvědčuje, že na tento virus můžeme nahlížet « « · · • · ··· · • 9 • 999 • · · ·

9 999 v rámci Darwinovského genetického modelování (viz např. Coffin, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 176,143 až 164 (1992) a Coffin, Science, 267,483 až 489 (1995)). Tyto varianty jsou výsledkem nepřesností molekuly reverzní transkriptázy HIV-1, která tvoří mutace v provirech, nově transkribovaných z virové genomové RNA. Proto za podmínek in vivo, charakterizovaných neexistencí významného krirického období a mnoha replikačními cykly, dochází k podstatnému stupni genetické variability s produkcí mnoha virových variant. Přesto však převládá divoký typ HIV, protože za takovýchto neomezených podmínek má nejvyšší selektivní výhodu. V přítomnosti inhibitoru, například zidovudinu, bude však selektována virová varianta, která je vybavena vyšší selektivní výhodou než divoký typ kmene, a následkem toho bude převládat (Coffin (1992) a (1995), výše). Na tomto základě předkládaný vynález poskytuje strategii podmíněně se replikujícího vektoru, která nabízí nepatogenní HIV-1 genomy se selektivní výhodou proti patogennímu HIV-1 divokého typu.

Tyto nepatogenní, podmíněně se replikující HIV (crHIV) vektory jsou defektní HIV, které podléhají replikaci a obalování pouze v buňkách, které jsou infikovány divokým typem HIV. Tyto crHIV genomy soutěží s divokým typem HIV a snižují jeho virovou zátěž. Uvedený účinek snižování virové zátěže divokým typem HIV v infikovaném hostiteli by měl vést ke zvýšení očekávané doby života. Měl by také snižovat schopnost infikovaného hostitele přenášet divoký typ HIV na neinfikováné jedince. Pro úspěšné soutěžení crHIV s divokým typem HIV-1 se zdají být důležité dva faktory: (1) selektivní výhoda crHIV genomů oproti genomům divokého typu HIV a (2) selektivní výhoda crHIV exprimuj ících buněk oproti buňkám, exprimuj ícím divoký typ HIV (tj. selektivní výhoda pro produkci crHIV virionů crHIV exprimuj ícími buňkami oproti buňkám, exprimuj ícím divoký typ HIV).

Tyto crHIV vektory se podmíněně replikují v důsledku skutečnosti, že obsahují sekvence, potřebné pro expresi RNA, dimerizaci a obalení, ale neexprimují funkční (tj. divokého typu) HIV-1 proteiny. Selektivní výhoda byla začleněna do těchto crHIV vektorů inzercí ribozymové kazety, která štěpí U5 oblast divokého typu HIV genomu, ale ne U5 oblast v RNA crHIV.

Ribozymy, přítomné ve vektorech, neštěpí crHIV RNA, protože U5 oblast crHIV RNA byla modifikována substitucí konzervovaných bází (substituce bází, přítomných v jiných HIV kmenech), aby bylo ribozymům zabráněno v účinné vazbě a štěpení těchto míst. Tyto crHIV jsou navíc nepatogenní, protože nekódují proteiny, o kterých se soudí, že jsou odpovědné za smrt CD4+ buněk. Pokud jsou HIV infikované buňky (které byly transfektovány s crHIV vektorem) aktivovány, stávají se schopnými komplementace crHIV genomových deficitů, čehož výsledkem je produkce vironů potomstva crHIV.

• ··· ·· · · • · · · · · to · · ···

Genomy crHIV byly obecně konstruovány z celé délky infekčního HIV klonu pNL4-3 (Adachi et al. (1986), výše). Všechny klonační reakce a DNA, RNA a proteinové manipulace byly provedeny použitím metod známých odborníkům, které byly v oboru popsány, například Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání (Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1982)). Enzymy a činidla, použité v těchto reakcích, byly získány od komerčních dodavatelů (např. New England Biolabs, lne., Beverly, Mass.; Clontech, Palo Alto, Calif., a Boehringer Mannhiein, lne., Indianopolis, Ind.) a byly použity podle doporučení výrobců. Udržování a propagace vektorů byly kromě toho prováděny způsoby, které jsou obecně známy, a které byly dříve popsány (např. Dropulič et al. (1992), viz výše, a Dropulič et al. (1993), výše).

pNL4-3 byl štěpen enzymy Pst I (který štěpí v gag, v poloze asi +1000 od startu transkripce) a Xho I (který štěpí v nef, v poloze asi +8400 od startu transkripce) a byl vložen polylinker, obsahující vhodná restrikční místa. Fragment Bgl II až Bam HI 0,86 kb, obsahující element, citlivý na rev (RRE), byl klonován do Bam HI místa, přítomného v polylinkeru. Tyto manipulace měly za výsledek deleci genomu divokého typu HIV od míst v gag kódující oblasti do míst v U3 kódující oblasti (tj. tedy také deleci nef genu). Zatímco je tento vektor schopen produkovat zkrácený gag transkript, není celá délka funkčního Gag proteinu tímto vektorem produkována. Jelikož nejsou však funkce divokého typu Gag podle vynálezu nezbytné, mohou být gag sekvence mutovány, aby bylo zabráněno translaci Gag proteinu.

Ribozymová kazeta, jak je zde popisována obsahující buď jeden nebo více ribozymů, byla inzertována do Sal I místa po směru od Bam HI místa. Aby bylo možno toto provést, byly syntetizovány sekvence ribozymů, kódujících komplementární deoxyoligonukleotidy, spojeny a potom klonovány do Sal I místa. Ribozymy, použité pro sestrojení crHIV vektorů, byly ribozymy typu „hammerhead“. Tyto ribozymy obsahovaly katalytickou doménu, složenou z 22 párů bází, a dvě hybridizační domény, obsahující každá 9 párů bází. Ribozymy byly zacíleny buď na místo +115 nebo +133 (tj. odpovídající počtu párů bází po směru od startu transkripce) sekvence U5 RNA. Hybridizační domény a katalytická doména (podtržené) ribozymů, namířených proti +115 místu a +133 místu jsou následující:

CACACACAACACTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACGGGCACA („+115 ribozym“) SEQ ID NO:3

ATCTCTAGTCTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACCAGAGTC („+133 ribozym“) SEQ ID NO:4 • · · · · ·

Ribozymová kazeta obsahovala buď jednoduchý, dvojitý nebo trojitý ribozym(y), tandemově uspořádané. Vektory obsahující buď jednoduché nebo trojité ribozymy mohou být snadno sestrojeny a cíleny na to samé místo U5 HIV RNA, v poloze +115. Vektory obsahující dvojité ribozymy mohou být snadno sestrojeny a cíleny buď na stejné místo v poloze +115 nebo na různá místa v polohách +115 a +133 U5 HIV RNA.

Aby byla dokončena konstrukce těchto vektorů, byla crHIV vektorům udělena rezistence vůči štěpení ribozymy (tj. pokud jsou ve formě RNA) mutováním místa, rozpoznávaného „hammerhead“ ribozymy, vyskytujícími se v U5 oblasti crHIV genomu. Aby bylo tohoto dosaženo, byl pro zavedení modifikovaných míst do vektoru použit dvojvláknový oligonukleotid (tj.

AAGCTTGCCTTGCGTGCTCAAAGTAGTGTGTGCCCACCTGTTGTGTGACTCTGGCAG CTAGAGATCCCACAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCC (SEQ ID NO: 13), obsahující substituce bází, znázorněné na obrázku 2 SEQ ID NO:2. Konkrétně byly substituce provedeny v místech hybridizace a štepění ribozymu v párech bází 115 a 133. Mutace byly provedeny zejména, jak je znázorněno na obrázku 2, v párech bází 113,114,132, 134 a 142. Tato místa mohou být modifikována, aby obsahovala libovolnou mutaci (tj. GTGTGCCCNNCTGTTGTGACTCTGGNANCTAGAGANC, kde N může být libovolným mutantním nukleotidem, SEQ ID NO: 14). Je výhodné, když je však tato sekvence mutována tak, že je například G substituováno A v poloze +113 (tj. tak, že tato sekvence obsahuje GTGTGCCCATCTGTTGTGACTCTGGTAACTAGAGATC, SEQ ID NO: 15), substituci U (tj. T v případě sekvence DNA) za C v místě +114 SEQ ID NO:5, substituci U (tj. T v případě sekvence DNA) za C v místě +132 SEQ ID NO:6, substituci A na G v místě +134 (tj. tak, že sekvence obsahuje GTGTGCCCGTCTGTTGTGACTCTGGTAGCTAGAGATC, SEQ ID NO: 16) a substituci U (tj. T v případě DNA) za A v místě +142, přičemž tyto mutace mohou být provedeny buď samotné nebo v kombinaci. Zejména v nepřítomnosti jiných mutací U5 substituce U (tj. T v případě sekvence DNA), v místě +114 na C v místě +114 SEQ ID NO:5 a/nebo v místě +132 SEQ ID NO:6 v crHIV US RNA zabraňuje jeho štěpení ribozymy (Uhlenbeck (1987), výše). Inzertované substituce bází jsou přítomny v různých jiných kmenech HIV (Myers et al., HIV Sequence Database, Los Alamos Nat. Lab. (1994)), což naznačuje, že tyto substituce nesnižují replikační kapacitu HIV genomu.

Zde uvedený způsob může být využíván pro konstrukci jiných podmíněně se replikujících vektorů, například obsahujících různé virové genomy (např. různé RNA viry) nebo různá genetická antivirová činidla. Kromě toho může být podmíněně se replikující vektor dále »· 4441

4

444 • · • 4 · 4 *«·« modifikován tak, aby hostitelské buňce, do které je tento vektor zabudován, poskytoval selektivní výhodu oproti hostitelské buňce, která obsahuje divoký typ viru. Tento vektor může být, například modifikován tak, aby také kódoval multispektrální rezistenci proti léčivům nebo proti mutované proteáze nebo reverzní transkriptáze.

Tyto způsoby mohou být samozřejmě také využity pro konstrukci různých zde popsaných kontraktů helperového vektoru.

Příklad 2

Tento příklad popisuje rezistenci vůči štěpení ribozymem podmíněně se replikujících vektorů, zejména crHIV vektorů.

Pro potvrzení rezistence crHIV vektorů proti ribozymovému štěpení byla provedena in vitro transkripce. Aby mohla být provedena, byly klonovány ribozymové sekvence v Xho I místě u pBluescript KSII (Stratagene, La Jolla, Calif.). Bgl II fragment o délce 0,21 kilobází párů (kb), obsahující mutovanou crHIV U5 oblast byl podobně vystřižen z crHIV vektoru a inzertován do Bam HI místa u pBluescript KSII. Výsledné modifikované pBluescript KS II vektory byly před in vitro transkripcí linearizovány s Bss HII. Podobný plazmid, exprimující divoký typ HIV U5 RNA (popsaný v Myers et al. (1994), výše), byl použit jako kontrola. Před in vitro transkripcí byl linearizován s Eco Rl.

Radioizotopicky značená U5 HIV RNA a ribozymová RNA byly získány in vitro transkripcí těchto vektorů, jak je popisováno (Dropulié et al. (192), výše). Izotopově značené transkripty byly společně inkubovány (při molámím poměru cíle k ribozymu 1:2) v IX transkripčním pufru, obsahujícím 40 mM Tris.HCl, pH 7,5,6 mM MgCl₂,2 mM spermidinu a 10 mM MaCl. Vzorky byly ohřátý na 65 °C a poté ochlazeny na 37 °C na 5 minut před přidáním roztoku stop pufru, obsahujícího 95 % formamidu, 20 mM EDTA, 0,05 % Bromphenol Blue a 0,05 Xylen Cyanol FF. Produkty reakce byly poté rozděleny elektroforézou v polyakrylamidovém gelu (PAGE) v denaturujícím prostředí a detekovány autoradiografií.

Když byl divoký typ U5-HIV RNA inkubován s transkriptem, obsahujícím jednotlivý ribozym na místě +115, bylo pozorováno snadné štěpení. Výsledkem tohoto štěpení byly produkty PI a P2. Štěpení lze také pozorovat, pokud byl divoký typ HIV RNA inkubován s RNA, obsahující dvojité ribozymy buď na stejném místě nebo na různých místech. Pokud byl ribozym obsahující transkript směrovaný na dvě různá místa inkubován s divokým typem HIV RNA, byly produkovány produkty Pl, P2 a P3. P3 je výsledkem štěpení na místě +133.

Pro srovnání, když byla modifikovaná U5 obsahující crHIV RNA inkubována buď s jednotlivým ribozymem, směrovaným na místo +115 nebo dvojitým ribozymem, směrovaným • · · ·

buď na místo +115 nebo na místo +133, nebyly detekovány žádné štěpné produkty. Tyto výsledky tudíž potvrzují, že crHIV U5 RNA jsou rezistentní vůči ribozymovému štěpení, zatímco divoký typ HIV-U5 RNA je štěpen anti-U5 ribozymy. Tyto výsledky kromě toho potvrzují, že přístup podle předkládaného vynálezu může být využíván pro předávání selektivní výhody pro replikaci podmíněně se replikujícím vektorům (včetně vektorů jiných než vektory crHIV), když jsou introdukovány do hostitelské buňky, ve srovnání s divokým typem kmene viru.

Příklad 3

Tento příklad stručně popisuje klíčové kroky v produkci konstruktů helperového vektoru podle vynálezu. Pokud není uvedeno jinak, sekvence nukleových kyseliny, kódující různé retrovirové elementy, byly získány z veřejně dostupných zdrojů. Všechny popsané kroky vyžadovaly sekvenování celých kódujících oblastí pro všechny proteiny, aby byly odhaleny chyby a v případě potřeby provedeny opravy.

Pro degeneraci tat sekvence a umožnění jejího zacílení pomocí anti-tat ribozymů byla použitím QuickChange kitu od Stratagenu mutována plazmidová pTAT, aby v anti-tat ribozymové kazetě byla zahrnuta cílová místa. Mutovaná tat sekvence byla následně klonována v expresním vektoru, založeném na pMG plazmidu od InvitroGen. Sekvence tat byla fúzována k IRES v prvnmí ATG pomocí Ncol místa. Vektor byl dále modifikován, aby obsahoval gen rezistence proti ampicilinu a SV40 počátek replikace.

Sekvence, obsahující elementy HIV-1 rev a RRE, byly získány vystřižením třetího exonu z rev společně s RRE z pNL4-3, a poté byly klonovány v pLITMUS38 plazmidu. Rev sekvence po nukleotid 208, která obsahuje druhý exon a část třetího exnu až do BamHI místa, byla sestrojena ze 3 syntetických nukleotidů pomocí ETR a PCR. PCR produt byl klonován v pUC18 a potom subklonován v pLIT/RRErev3. Tyto dvě části rev byly fúzovány pomocí QuickChange kitu. RRE z HIV-2 byla substituována za HIV-1 RRE a oba konstrukty byly klonovány v gag/pol/Rz vektoru. Degenerované rev sekvence byly také přímo použity pro subklonován! v obalovacím konstruktu pro vektory, jako je pVIRPac-2.

Aby bylo degenerováno prvních 42 nukleotidů u gag, které jsou potřeba pro obalení a musí být částí vektorového plazmidu, byl BssHII/Spel fragment z pNL4-6 subklonován v pLITMUS38. Sekvence gag byla degenerována pomocí QuickChange kitu tak, že byly eliminovány všechny komponenty obalovacího signálu a před prvním ATG kodonem gag byl reinzertován HIV hlavní donor sestřihu. Degenerovaný gag byl subklonován v plazmidu pNgp, daru Dr. Conde, v poloze 5 'LTR, aby vznikla souvislá gag sekvence. Tento výsledný konstrukt * · ·9 »· · · ·· « ·· · stále obsahuje sekvence sestřihového akceptoru (SA) a sestřihového donoru (SD), použité pro expresi vif proteinu. Výsledkem tohoto sestřihu může být přítomnost ribozymové kazety v sestřižené mRNA, které je nežádoucí díky možnému rozštěpení sestřižené retrovirové (podmíněně se replikující) vektorové RNA a výslednému snížení titru obaleného transdukujícího vektoru. Překrývající se PCR byla použita pro mutování sekvencí SA a SD. PCR produkt byl inzertován a klonován v gag/pol konstruktu, s následnou inzercí anti-U5 ribozymové kazety a rev a RRE elementů.

Obálkový protein env proteinu vesikulámí stomatitidy G (VSV-G) byl klonován do prvního NCS z pMG-tat vektoru, aby vznikla expresní obálková kazeta. Pro zjednodušení dalších klonačních kroků byl VSV-G klonován jako fragment s tupým koncem do BglII místa, vyplněného Klenowovou polymerázou. Tak vznikl konstrukt s SV40 začátkem replikace (ori). Pro dokončení obalovacích plazmidů jako helperových vektorů, byla subklonována rev sekvence v druhém MCS. Výsledný plazmid byl nazván pVIRPAC-2 (viz obrázek 6).

Aby z některých obalovacích plazmidů vznikly helperové vektory, byla gag/pol/Rz/RRE/rev kazeta subklonována v pMG-tat-G plazmidů (bez SV40 ori). Byly připraveny konstrukty s RRE buď z HIV-1 nebo z HIV-2 (pVIRPac-1,1 a l,2Rz na obrázku 6). Jako kontrola pro testování funkce ribozymů, byla ribozymová kazeta v konečném produktu, obsahujícím HIV-2 RRE, deletována, čímž vznikl pVIRPac-1,2. Nakonec pro otestování hypotézy, že umístění gag/pol RNA do sestřihového mechanizmu může zabránit štěpení retrovirové (podmíněně se replikující) vektorové genomové RNA, byl intron z β-globinu inzertován před SV40 póly A signál (pVIRPac-l,2RzIn). V jiných provedeních tohoto vynálezu je samozřejmě inzertovaný intron odvozen od HIV, výhodně od kompletního HIV intronu, u kterého bylo potvrzeno, že směruje RNA do buněčného sestřihového mechanizmu (např. spliceozom).

Příklad 4

Tento příklad popisuje účinnost různých konstruktů helperového vektoru. V těchto experimentech byly použity standardizované postupy produkce retrovirového vektoru přechodnou transfekcí. Megapreparáty plazmidové DNA byly připraveny použitím známých způsobů. Pro produkci viru byly 293T buňky transfektovány společně s plazmidy retrovirového vektoru a helperového vektoru metodou s použitím fosforečnanu vápenatého. Buněčné supernatanty byly spojeny přibližně 40 h po transfekci, filtrovány přes 0,45 pm filtry v injekčních stříkačkách a titrovány na HT1080 buňkách. Titr vektoru byl vypočten na základě jeho transdukční účinnosti, měřené průtokovou cytometrií 72 h po infekci. Pro výpočet titru byl • * · 4 » · ·

I • * ·9 použit uzanční vzorec N*400000*, kde N je podíl transdukovaných buněk, 400000 je přibližný počet buněk v době infekce a F je zřeďovací faktor,

Pro zvýšení bezpečnosti helperového vektoru snižováním možnosti tvorby RCV při rekombinaci s retrovirovým vektorem, odvozeným od HIV-1, byla do určitých konstrktů helperového vektoru inzertována anti-U5 ribozymová kazeta. Tento ribozym může stříhat a ničit retrovirovou vektorou RNA, pokud je zabalen společně do virionů. Je však také možné, že tento ribozym může také štěpit vektorovou RNA uvnitř produkčních buněk, čímž interferuje s produkcí viru. Pro další zvýšení bezpečnosti obsahovaly helperové konstrukty RRE-2 element pro další snížení pravděpodobnosti společného zabalení helperu a vektoru do virových částic. Tyto helpery byly použity pro zabalení pNl(cPT)GFP vektoru.

Jak je znázorněno na obrázku 7, měla přítomnost ribozymu na helperovém konstruktu malý vliv na titr vektoru. Je důležité, že konstrukt helperu (pVirPacl,2RzIn), obsahující intron pro ovlivnění buněčného transportu helperové RNA mimo vektorovou RNA, neměla také významný vliv na titr vektoru. Titr vektoru, vytvořeného s tímto dvojplazmidovým systémem, je srovnatelný s titrem, získaným použitím helperového konstruktu pVirPacl.l, obsahujícího RRE1, vykázal asi 5násobně nižší obalovací účinnost. Inkorporace RRE-2 do helperového konstruktu tudíž nejenom zvýšila jeho bezpečnost snížením možnosti homologní rekombinace, ale také neočekávaně zvýšila účinnost obalení.

Příklad 5

Tento příklad testuje, zdaje exprese genu MGMT z mRNA, sestřižené s HIV-LTR, dostatečná pro účinnou selekci buněk, transdukovaných s MGMT, pomocí BG a BCNU. Obrázek 10A ukazuje použité vektory. Obrázek 10B ukazuje efektivní přežívání buněk a rozšíření v přítomnosti cytocidních koncentrací BG/BCNU. Označení jsou následující: M, MGMT; I, IRES; G, GFP; W, Woodchuckův postranskripční element, a C, CMV promotor. Všechny z těchto shora uvedených elementů byly klonovány v pNl vektoru, po směru od RRE elementu, takže ze sestřižené mRNA bude exprimován libovolný gen ve směru 3' k RR elementu, protože sestřihové akceptorové místo bylo umístěno v těsném sousedství místa inzerce tohoto genu. Obrázek demonstruje, že zatímco kontrolní buňky, netransdukované s lentivirovým vektorem („CGFP“), se ani nerozšiřují, ani nepřežívají, všechny vektory, exprimující MGMT, přežívají a rozšiřují se.

Buňky, transdukované s pNICMIG, byly mrtvé po 14 týdnech, zatímco buňky, transdukované s pNIMCG, byly mrtvé po 21 týdnech. Je důležité, že buňky, transdukované « <·0 • * ··· · • * • ··· ·· ···· • · 0 0 • · 0 • 0 000 s pNIMIG a pNIMIG-W, zůstávaly živé po 29 týdnů, což naznačuje dlouhodobé přežívání buněk, transdukovaných s vektorem bez inzertovaného vnitřního promotoru.

Je překvapivé, že vektory, exprimující MGMT z RNA sestřižené k HIV-LTR, byly velmi účinně selektovány. Exprese MGMT neomezuje rozsah genové zátěže ani na MGMT ani na selekční geny. Tyto výsledky naznačují, že HIV-LTR promotorem v T buňkách může být exprimován libovolný gen. Podobné údaje byly získány u jiných než T buněk, což dokazuje, že exprese genů mRNA, sestřižené k HIV-LTR, může být použita pro expresi genů mnoha typů buněk.

Kromě toho, dvojcistronová povaha „MIG“ konstruktů dokazuje, že může být exprimováno více genů, když jsou vázány pomoci IRES. Příklady kromě shora uvedených zahrnují MGMT nebo jiné selekčně geny s chemokinem, interferonem nebo jiným genetickým antivirovým činidlem.

Příklad 6

Lidské CD4+ T buňky byly testovány na jejich citlivost vůči BG a BCNU. CD4+ buňky, zbavené CD14, byly vyčištěny z periferní krve s nebo bez mobilizace cytokinem. Tyto buňky byly kultivovány v 3 pg/ml PHA a 5 ng/ml IL-2 po dobu 5 až 7 dní před ošetřením BG a BCNU. Za příslušných podmínek v nepřítomnosti BFG a BCNU mohou být CD4+ buňky během 10 dnů v kultuře až lOOnásobně namnoženy. Testované dávky byly 0; 0,2; 0,5; 2; 5; 10; 20; 30 a 40 μΜ BG a 0,2, 5,10,20, 30 a 40 μΜ BCNU. Byla provedena serie třech experimentů.

Obrázek 11 ukazuje reprezentativní výsledky shora zmíněných testů. Množení bylo sníženo na 20násobné po 10 μΜ BG a μΜ BCNU a na přibližně lOnásobné nebo menší při 20 μΜ nebo více BCNU. Ošetření CD4+ buněk BCNU nevedlo k opoždění růstu. Na rozdíl od SupTl buněk, použitých ve shora uvedeném příkladu, nejsou tedy CD4+ buňky citlivé na nízkou dávku samotného BCNU. To svědčí o větší MGMT expresi primárních CD4+ buněk, i když je očekávána variabilita exprese MGMT na základě variability mezi donory T buněk.

Přítomnost BG i BCNU, obou v množství 10 μΜ nebo vyšším, byla nej lepší pro senzibilizaci CD4+ buněk, zatímco stejné senzibilizace buněk bylo dosaženo při 0,5 μΜ BG a 15 μΜ nebo více BCNU. Zvyšování dávky BG nezvyšovalo počet usmrcených buněk, zatímco se zvyšující se dávkou BCNU se zároveň zvyšovala i toxicita pro CD4+ buňky.

Jak je uvedeno na obrázku 11, hladina selekce se obecně zvýšila 5násobně ze základní 20% hladiny na 100 %. V jednom experimentu se selekce zvýšila z 3 % na více než 90 %. Po φ « ·· • * ··φ · φφ ΦΦΦΦ

Φ ΦΦΦ φ

φ ► ♦ φ φ selekci a jednom týdnu bylo pozorováno 10 až lOOOnásobné namnožení; namnožení 20 až

400násobné bylo pozorováno při 2,5násobku selekce, s průměrem 80násobného namnožení.

Příklad 7

Předchozí práce naznačuje korelaci mezi vyčištěním autotransplantátů kostní dřeně se zlepšeným přežíváním bez choroby po autologní transplantaci. Odstranění normálních T buněk z allotransplantátu bylo také použito pro snížení rizika imunitních reakcí mezi hostitelem a transplantátem. Obrázek 13A demonstruje účinnost transdukování tumorových buněk při jednom cyklu transdukce s použitím pNl(cPT)ASenvGFP. Obrázek 13B potvrzuje, že tumorové buňky mohou být selektivně a účinně usmrceny na rozdíl od CD4+ kmenových buněk, protože tyto posledně jmenované nevykazují významnou transdukci po jednom cyklu transdukce.

Aplikace shora uvedeného na odstranění tumorových buněk z autologního štěpu kostní dřeně začíná kultivací kostní dřeně nebo sběrem periferních kmenových krevních buněk. CD34+ buňky jsou purifikovány na koloně CD34 protilátky a potom transdukovány podmíněně se replikujícím vektorem při MOI rovné 2 až 400 po dobu 2 až 16 hodin. Buňky se popřípadě inkubují v přítomnosti jednoho nebo více aktivačních faktorů, jako jsou cytokiny, s cílem buď asistované transdukce nebo udržování těchto buněk. Poté jsou buňky přeneseny do subjektu, který má být léčen.

Schopnost podobně zasahovat T buňky v cizím štěpu používá podmíněně se replikujících vektorů v kombinaci s vysoce účinným stabilním protokolem transdukce, podobně jako v US patentové přihlášce čísla (teprve má být přiděleno), podané dne 31. srpna 2000 pod ě. spisu 397 zástupce 272 000 400, pro selektivní transdukci T buněk.

Příklad 8

Obrázek 14, panel B, ukazuje účinné pseudotypování HIV-1 vektorů podle vynálezu s různými obálkovými proteiny.

Stejné původní titry u lentivirového vektoru, pseudotypováného s VSV-G obálkovým proteinem, mohou být účinně zvýšeny purifikaci buď vysokorychlostní centrifugací nebo diafiltrací. Vektor pNl(cPT2)ASenvGFP byl obalen s pVirPacl.2Rz2. Následující tabulka ukazuje (a) celkový protein ve vzorku, (b) titr vektoru ve vzorku a (c) stupeň vyčištění vektoru od cizího materiálu ve vzorku.

·» ··«· • · • ··« • · • · * * · · • · · ·♦ ♦♦ 999 ·· ···«

9 9

9 9

9 9 9

Β · * 9

99

Krok procesu	Celkový protein, mg	Titr vektoru, TU/ml	Stupeň vyčištění (násobek)
Start po vyěiření	3207	5,9 x 10°	N.A.
Koncentrování	722	8,2 x 10'	61,7
Diafiltrace	224	6,8 x 108	1650

Jak je vidět z tabulky, je obsah celkového proteinu ve vzorku supematantu vektoru po vyčiření od buněčných zbytků 3027 mg, zatímco titr vektoru je v tomto stadiu 5,9 x 10⁶. Vzorek je poté koncentrován ultrafiltrací, přičemž je celkový obsah proteinu v tomto vzorku 722 mg a titr vektoru se zvýší na 8,2 x 10⁷, při 61,7násobném stupni vyčištění. Po koncentraci ultrafiltrací je vzorek diafiltrován, přičemž dojde k dalšímu snížení celkového obsahu proteinu ve vzorku na 224 mg, za zvýšení titru vektoru na 6,8 x 10⁸ na ml a 1650násobnému stupni vyčištění. Tím je dokázáno, že nevektorové cizí proteiny mohou být odstraněny a lentivirový vektor, který je pseudotypován s VSV-G, může být vyčištěn shora uvedeným způsobem.

Shora uvedené skutečnosti mohou být využity ve spojení s vektory, produkovanými v Hela-tat buněčných liniích, poskytujících titry 1O¹⁰, jak je znázorněno na obr. 16.

Příklad 9

Alternativní helperové konstrukty pro pseudotypování podmíněně se replikujících vektorů byly vyvinuty umístěním VSV-G exprese pod kontrolu, závislou na Rev. Protože mRNA, obsahující RRE, nejsou exprimovány v nepřítomnosti Rev, bylo postulováno, že jsou defektní v důsledku přítomnosti cis represivních sekvencí (CRS), umístěných v genech gag/pol, pol a env. Bylo publikováno, že CRS vychytává mRNA v jádru, destabilizuje mRNA nebo brání mRNA v asociaci s ribozomy. Přítomnost CRS a Rev, umístěných in trans, kombinovaná se sestřihem mRNA, může tak být použita pro regulaci exprese genu.

Systém Rev/RRE/CRS byl použit pro kontrolu VSV-G exprese způsobem závislým na Rev. Konstrukty helperu pro tento přístup obsahují 5' sestřihové donorové místo; HIV-2 RRE a 3' sestřihové akceptorové místo (výhodně pro tat/rev); CRS fragment z HIV-2 pol oblasti pro snížení pravděpodobnosti rekombinace s vektory, založenými na HIV-1, a popřípadě neindukovatelný promotor, jako je CNV okamžitý raný (immediate early, IE) promotor, místo libovolných indukovatelných promotorů. RNA, kódující VSV-G, i když produkuje bez indukce, je stále regulována přítomností Rev, protože pouze nesestřižená RNA může být exportována a exprimována v cytoplazmě bez Rev. Exprese VSV-G je stále zprostředkována pomocí Rev, protože Rev působí proti zadržování transkriptů v jádře, kontrolovanému sestřihem mRNA a CRS.

·< *»·*· to ·· • · toto· ♦· ·· ·· to ♦ to »♦· • 9· ·· toto· to · • · to « « • ·· • to ·« to· · *

Je výhodné, když donorovým místem není syntetické 5' β-globinové sestřihové donorové místo, ale sestřihové donorové místo nativního HIV nebo analogu HIV. HIV-2 RRE je 280 bp fragment, obsahující jak HIV-2 RRE, tak i sestřihové akceptorové místo pro tat/Rev a CRS je 550 bp interní fragment sekvence HIV-2 pol. CRS a RRE elementy z HIV-2 mohou být připraveny pomocí PCR. Neomezující příklady takových helperových konstruktů zahrnují pCGCSRRE, pCGCRSRzRRE a další, uvedené na obrázku 15A až 15E. Konečné plazmidové konstrukty byly potvrzeny vícenásobnou digescí restrikčními enzymy. Zatímco pEH-GP a pCMV-GP jsou konstrukty, které konstitutivně exprimují gag-pol polyprotein, v případě potřeby mohou být použity i jiné promotory, včetně lentivirového nebo HIV promotoru.

Obrázek 17 ukazuje výsledky použití mnoha různých kombinací sestřihových donorů pro expresi VSV-G, závislou na Rev. Jak je ukázáno, má odstranění tetracyklinu za výsledek expresi, závislou na Rev.

Další příklady kombinací sestřihových donorových míst, rovněž jako uzanční sekvence, jsou uvedeny níže. I když mohou být použity všechny, jsou výhodné HIV major, HIV-1 env, HIV-2 major a analogické kombinace sestřihových donorových míst.

UZANČNÍ SESTŘIHOVÝ DONOR: BETA-GLOBINOVÝ SESTŘIHOVÝ DONOR: HIV MAJOR SESTŘIHOVÝ DONOR :

HIV-1 ENV SESTŘIHOVÝ DONOR:

HIV-2 ENV SESTŘIHOVÝ DONOR:

HIV-2 MAJOR SESTŘIHOVÝ DONOR: ANALOGOVÝ SESTŘIHOVÝ DONOR:

NNNNAGGTAAGTNNN (SEQ ID NO:7) NGGGCAGGTAAGTAT (SEQIDNO:8) NNGACTGGTGAGTAN (SEQ ID NO:9) AAAGCAGTAAGTAGT (SEQ ID NO: 10) AGACAAGTGAGTAAG (SEQ ID NO:11) NNGAAGGTAAGTGCN (SEQ ID NO: 12) CTTCAGGGTGAGTTNN (SEQ ID NO: 13)

Příklad 10

Pro zjištění vhodných podmínek pro skladování vektorů před použitím byly testovány různé skladovací pufry a podmínky. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 18. Možnost uchovávat vektory při -20 °C a ve farmaceuticky přijatelných pufrech, aniž by docházelo k významným ztrátám při opětném získání vektoru, má ohromnou výhodu pro udržování vektoru před použitím. Skladování může být také samozřejmě snadno prováděno při asi -80 °C, asi -20 °C a asi 4 °C v jiných farmaceuticky přijatelných prostředcích.

•Μ · ♦ ·· 94«· • · · * 4 ··· · « ♦ 4 « ·· 4«« •4 9 44 • 4

4 ·

4 « « 4 4

4« 49 •4 4«

Přikladli

Tento příklad popisuje aminokyselinovou sekvenci chimérického HIV CTL epitopu pro použití vynálezu v praxi. Tato sekvence (SEQ ID NO: 18) obsahuje první methionin (M) pro iniciaci translace, následovaný různými souvislými podsekvencemi, odpovídajícími pl7, p24, pl5, Pol, Rev, gpl20env, gp41env, resp. nef.

MKIRLRPGGNKKYKLKHIVWASRELERFGSEELRSLYNTVAVLYCVHQ

KIEVKDTKEALDTENRNQESQNYPIVQNLGQMVHQALSPRTLNAWVKVIEEKAFSPEVIPMFSALSEGATP

QDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKATINEEAAEWDRLHPVHAGPIAPGQ

MREPRGTSTLQEQIAWMTNNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPVSI

FRDYVDRFYKTLRAEQATQEVKNWMTETLLVQNANPDCKTILKALL

EDMMTACQGVGGPGHKARLVQEGHQMTCDCTERQANFGNFPQSRLEPTAPPEITLWQRPLVDTVLEDMNLVLVGPTPVNISPIETVPVKLGPKVKQWPLA

LVEICTEMEKEGKISKIGPTVLDVGDAYFSVPLDEDFRKYTAFTIPSIW

KGSPAIFQSSMTINPDIVIYQYMDDLYVDLEEGQHRTKIEELRQHLLR

WGFTTPDKKPIKLPEKESWLVGKLNWASQIYAGIKVKQLIITEEAELE

ILKEPVHGVYQIYQEPFKNLKTGDVKQLTEAVKJTTESIVIWPIQKETW

ETWWTEYWPLVKLWYQLEPIVGAETFYVDGAANKALQDSGLEVNIV

TDSQYALGIESELVSQUEQLLAWVPAHKGYEEAjEVIETAYFILKLLLW

KGEGAVISGWILNTYRVKGIRKNYAENLWVTVYYGVPVWKEATTTLFCASDAKAYDPNPQE

WLHEDIISLWDQSLKKLTPLCVTLNCSFNVTTLINTSYTLINCKSSTIT

QACPKCKNVSTVQCRPWSTQLLLNGSLAEEDIVSIEINCTRPNNNTRK

KITLGPGRVLYTTGENNTLKQIVEKLREIKQFKPEIVMHSFNCGGEFFY «<· ·«

CNSTQLFLPCRIKQIINRWQEVGKAMYAPPIEGQIRCLSNITGVKIEPLG

VAPTKAKRRWQRRAIEAQQHLGIKQLQARVLAVERYLKDQQLLGITTVPWNASWWYIKI

FIMIVGVLSIVNRVRQGYSPLSFQTHRLVDGFLTLLYHRLIDLLLIAKR

GRRGWAALKYSLLNATAIAVDRVIEIVQRTCRAILHIPRRIRQGLERAL

LWPAIRERMVGFPVRPQVPLRPMTYKAAHDLSHFLKEKGGLEGLIYSQ

KRQDILDLWVYHTQGFFPDWQNYTPGPGTRYPLCFGWCFKLVPVVL

MWKFDSKLAFHHVARELHPEYFKDCPriklad 12

Tento příklad poskytuje souhrn provedení tohoto vynálezu, jak jsou popsána shora. Tento vynález zahrnuje podmíněně se replikující virový vektor, obsahující gen (nebo jinou nukleovou kyselinu), který má být exprimován, a jednu nebo více prvních nukleotidových sekvencí, přičemž se tento vektor (a) replikuje v hostitelské buňce pouze při komplementaci s divokým typem kmenem viru, helperovým virem nebo helperovým vektorem, z nichž každý je citlivý na přítomnost uvedené jedné nebo více prvních nukleotidových sekvencí; (b) je rezistentní na přítomnost uvedené jedné nebo více prvních nukleotidových sekvencí a (c) obsahuje jednu nebo více substitucí, inzercí nebo delecí, které snižují pravděpodobnost vzniku replikačně kompetentního vektoru.

Pro snížení pravděpodobnosti vzniku replikačně kompetentního vektoru poskytuje vynález vektory, které obsahují sekvence degenerované s ohledem na jednu nebo více sekvencí helperového konstruktu, obsahu nukleových kyselin hostitelské buňky nebo na jiných nukleových kyselin. Kromě toho helperové konstrukty pro použití ve spojení s těmito vektory pro jejich zabalení. Tyto helperové konstrukty mohou také obsahovat sekvence degenerované s ohledem na jednu nebo na více sekvencí vektoru, obsahu nukleových kyselin hostitelské buňky nebo jiných nukleových kyselin.

Vektory podle tohoto vynálezu mohou také obsahovat jednu nebo více sekvencí, které cílí na helperový konstrukt. Tyto sekvence obsahují genetická antivirová činidla a jsou výhodně (nebo kódují) ribozymy nebo antisense nukleovými kyselinami. Výhodné ribozymy a antisense sekvence jsou schopny se párovat na základě komplementarity bází s příslušnými cíly pomocí

*« ι·<ν • φ · • · φφφ ♦ φ φ φ • · φ «φ φφφ • φ · ·· φ φ • φ φ φ φ φ φ φ ·· φφ • φ φφ

G-U párování bází, kromě standamího párování bází A-T, A-U a G-C. Helperové konstrukty podle vynálezu mohou obdobně také obsahovat sekvence stejného typu pro cílení na vektor.

Helperové vektory podle vynálezu mohou také obsahovat jednu nebo více sekvencí, které ovlivňují umístění nebo buněčný transport RNA, exprimováných helperem, v porovnání s vektorem. Helperové vektory mohou například obsahovat intron, heterologní RRE v porovnání s vektorem, nebo heterologní sekvenci gag v porovnání s vektorem. Helperové vektory mohou také obsahovat degenerovanou gag a/nebo pol sekvenci(e) v porovnání s vektorem, takže je společná lokalizace těchto helperových a vektorových RNA méně pravděpodobná. Helperové vektory mohou také obsahovat sestřihová donorová místa, takže signály (sekvence) pro zabalení a pro RRE jsou z RNA odstraněny, aby bylo zabráněno jejich společné lokalizaci s vektorovými RNA. Tato sestřihová donorová místa mohou být také přítomna v helperových vektorech proto, aby došlo k různému transportu vektoru v porovnání s helperovým vektorem nebo s divokými typy virů.

Helperové vektory podle tohoto vynálezu mohou být také schopny pseudotypizace vektorů podle vynálezu. Exemplární příklady zahrnují VSV-G, RDI 14, virus vztekliny, GALV a chimérické obálkové proteiny. Helperové vektory podle vynálezu jsou také výhodně odvozeny od viru, heterologního vzhledem k vektoru. Příkladem jsou helperové vektory, odvozené od HIV-2. Způsoby podle vynálezu zahrnují použití těchto helperových vektorů pro replikaci vektorů podle vynálezu. Exemplární vektory podle tohoto vynálezu zahrnují pNl a pN2 serie, uvedené na obrázku 1A až 1K, zvláště s odstraněním nebo se substitucí GFP sekvencí. Je výhodné, když si tyto vektory uchovají alespoň antisense sekvenci nebo sekvenci, obsahující cPT. Exemplární helperové konstrukty podle vynálezu zahrnují pVirPac sérii, jak je uvedeno na obrázku 6A až 6G, s ribozymy nebo bez nich.

Všechny vektory a helpery podle vynálezu mohou být degenerovány, jak je popsáno shora, nebo v jiných částech konstruktů, pokud je nutno. Výhodná degenerace je vzhledem ke kodonům, výhodně používaným v lidských buňkách. Tyto vektory a helpery mohou mít rovněž chimérický charakter, takže jsou odvozeny od různých, přirozeně se vyskytujících, rovněž jako syntetických nukleových kyselin. Výhodné chimérické konstrukty obsahují jak HIV-1, tak i HIV-2 sekvence. Obzvláště výhodné vektory však jsou odvozeny od HIV-1 nebo kódují HIV-1 Tat protein. Jindy tyto vektory nekódují Tat protein, ale tento je dodáván helperovým vektorem, divokým typem viru nebo hostitelskou buňkou.

Vektory podle vynálezu také výhodně nekódují nebo neexprimují virové akcesorické proteiny. Tyto vektory mohou také obsahovat nukleovou kyselinu, která zmenšuje, minimalizuje nebo zabraňuje virové infekci, když je přítomna v hostitelské buňce, nebo dodává této buňce

9999

9 9 • · 999 ·· ·· rezistenci proti toxickým činidlům. Příklady těchto nukleových kyselin zahrnují protein buněčného povrchu nebo neúplný CCR5 protein, výhodně CCR5Á32T protein. Jiné příklady zahrnují nukleové kyseliny, kódující rezistenci vůči léčivu nebo ěinidlu.poškozujícímu DNA, výhodně multispecifickou rezistenci vůči léčivům, nebo variantu MGMT, zvláště variantu G156A. Další příklady zahrnují nukleové kyseliny kódující transdominantní fenotyp. Exemplárním příkladem je transdominantní HIV-1 gag sekvence.

Vektory podle vynálezu mohou také obsahovat sekvence, napomáhající expresi heterologní sekvence. Exemplárním příkladem je izolační sekvence. Vektory mohou také obsahovat sekvenci, která zlepšuje transdukci vektoru do buněk. Exemplárním příkladem je zde popsaná sekvence o 545 párech bází, obsahující cPT, i když mohou být také použity menší nebo větší fragmenty, obsahující cPT. Vektory mohou rovněž obsahovat LTR pro expresi genů, rovněž jako nukleových kyselin, včetně LTR, modifikovaných ve zde popsaných vazebných místech pro transkripci. Tyto modifikované LTR jsou výhodně obsaženy v lentivirových vektorech. Způsoby podle vynálezu zahrnují použití těchto vektorů.

Vektory podle vynálezu mohou také exprimovat nejméně dva geny při použití vhodně umístěných sestřihových míst nebo IRES elementů. Vektory mohou být také zabaleny do virových částic s jedním nebo více chimérickými obálkovými proteiny, které stimulují cílové nebo hostitelské buňky pro transdukci. Kromě toho mohou být vektory zabaleny v buňkách, kde helperem je protein nebo tento helper obsahuje systém Rev/RRE/CRS pro regulaci exprese genů. Způsoby podle vynálezu zahrnují použití takových vektorů.

Vektory podle vynálezu mohou být také použity pro selektivní usmrcení transdukovaných buněk ve spojení s podávaným činidlem, které normálně není pro netransdukované buňky toxické. Je výhodné, když tyto vektory účinkují spíše přes produkci molekuly nukleové kyseliny než proteinu. Exemplárním příkladem je produkce molekuly anti-MGMT antisense nebo ribozymové nukleové kyseliny. Způsoby podle vynálezu zahrnují použití takových vektorů.

Vynález také poskytuje způsoby pro skladování vektorů podle vynálezu.

Všechny zde citované literární odkazy, včetně patentů, patentových přihlášek a publikací, jsou zde zahrnuty ve své celistvosti citací. Tak jak jsou zde použity, jsou všechny odborné termíny, zde prezentované v jednotném čísle, zamýšleny tak, aby zahrnovaly jak jednotné, tak i množné číslo.

I když byl tento vynález zde popsán s důrazem na jeho výhodná provedení, je odborníkům v této oblasti techniky zřejmé, že v těchto výhodných provedeních je možno •9 ♦ «·· • · • *·· ····

Φ · Φ* · připravit a provést změny a vynález lze prakticky aplikovat jinak, než jak je konkrétně zde popsáno. Předkládaný vynález je zamýšlen tak, aby tyto změny a jiná provedení zahrnoval. V souhlase s tím vynález zahrnuje všechny modifikace, obsažené v duchu a v rozsahu tohoto vynálezu, jak je definován v připojených patentových nárocích.

Claims (22)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Podmíněně se replikující virový vektor, zahrnující gen, který má být exprimován, a jednu nebo více prvních nukleotidových sekvencí, kde tento vektor:

   (a) se replikuje v hostitelské buňce pouze při komplementaci divokým typem kmene viru, helperovým virem nebo helperovým vektorem, z nichž každý je citlivý na přítomnost uvedené jedné nebo více prvních nukleotidových sekvencí;

   (b) je rezistentní na přítomnost uvedené jedné nebo více prvních nukleotidových sekvencí a (c) obsahuje jednu nebo více substitucí, inzercí nebo delecí, které snižují pravděpodobnost vzniku replikačně kompetentního vektoru.
2. 2. Vektor podle nároku 1, kde uvedená jedna nebo více substitucí je degenerací kodonu, přednostně používaného v lidských buňkách.
3. 3. Vektor podle nároku 1, kde tímto vektorem j e chimérický vektor, zahrnující sekvence z HIV-1 a HIV-2.
4. 4. Vektor podle nároku 1, kde tento vektor nekóduje ani neexprimuje virové akcesorické proteiny.
5. 5. Vektor podle nároku 1, kde tento vektor je odvozen od HIV-1 nebo kóduje HIV-1 Tat protein.
6. 6. Vektor podle nároku 1, kde touto jednou nebo více prvními nukleotidovými sekvencemi je jedna nebo více ribozymových nebo antisense sekvencí.
7. 7. Vektor podle nároku 1, kde tento vektor nekóduje ani neexprimuje Tat protein.
8. 8. Vektor podle nároku 1, dále zahrnující sekvenci nukleové kyseliny, která zmenšuje, minimalizuje nebo zabraňuje virové infekci, když je přítomna v hostitelské buňce, nebo činí tuto buňku rezistentní vůči toxickým činidlům.

   ···· ···
9. 9 · • · ·· <···· • 9 9 • · 994 • · · • · · ·· ··· ·· ···· • · 9 • 99 • · · • · · · ·· ··

   9. Vektor podle nároku 1, kde uvedená první nukleotidová sekvence kóduje transdominantní fenotyp.
10. 10. Vektor podle nároku 1, kde tento vektor dále zahrnuje insulatorovou sekvenci.
11. 11. Vektor podle nároku 1, dále zahrnuj ící LTR nebo modifikovanou LTR pro regulaci exprese sekvence nukleové kyseliny, přítomné v uvedeném vektoru.
12. 12. Vektor podle nároku 1, dále zahrnující HIV sestřihová místa nebo vnitřní

    IRES.
13. 13. Helperový vektor, který j e schopný komplementovat vektor podle kteréhokoliv z předcházejících nároků.
14. 14. Helperový vektor podle nároku 11, kde tento helperový vektor je dále schopný pseudotypovát uvedený podmíněně se replikující vektor.
15. 15. Helperový vektor podle nároku 11, dále zahrnuj ící j eden nebo více ribozymů nebo antisense sekvencí, cílených na uvedený podmíněně se replikující vektor.
16. 16. Helperový vektor podle nároku 11, kde tento vektor je odvozen HIV-2.
17. 17. Vektor podle kteréhokoli z nároků 1 až 12, zabalený do virové částice, zahrnující jeden nebo více chimérických obálkových proteinů.
18. 18. Helper, schopný komplementovat vektor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, kde tímto helperem je protein.
19. 19. Způsob exprese jedné nebo více zájmových nukleových kyselin, vyznačující se tím, že se použije vektor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12 nebo 17.

    • · · · · · · • · · ··· · · · • · · · · · · · · • ·· · ···· • · · · · · » ·· ··
20. 20. Způsob produkce vektoru podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12 nebo 17, vyznačující se tím, že se použije vysokorychlostní centrifogace a žádná ultracentrifogace.
21. 21. Způsob usmrcování buněk, vyznačuj ící se t í m, že se buňky transdukují vektorem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12 nebo 17.
22. 22. Způsob selektování hematopoetických kmenových buněk, vyznačující se tím, že se populace buněk, obsahující hematopoetické kmenové buňky, uvede do kontaktu s cytotoxickým činidlem, poté co tyto buňky byly v kontaktu s vektorem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12 nebo 17.