CZ2002935A3 - Protilátky a deriváty protilátek k faktoru IX nebo faktoru IXa - Google Patents
Protilátky a deriváty protilátek k faktoru IX nebo faktoru IXa Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2002935A3 CZ2002935A3 CZ2002935A CZ2002935A CZ2002935A3 CZ 2002935 A3 CZ2002935 A3 CZ 2002935A3 CZ 2002935 A CZ2002935 A CZ 2002935A CZ 2002935 A CZ2002935 A CZ 2002935A CZ 2002935 A3 CZ2002935 A3 CZ 2002935A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- antibody
- factor
- antibodies
- fixa
- activity
- Prior art date
Links
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 title claims abstract description 44
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 title claims abstract description 28
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 title claims abstract description 25
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 title claims abstract description 23
- 230000002947 procoagulating effect Effects 0.000 claims abstract description 29
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 140
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 60
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 42
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 26
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 26
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 claims description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 8
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 claims description 7
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 claims description 6
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 claims description 5
- 230000003024 amidolytic effect Effects 0.000 claims description 5
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 claims description 3
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 claims description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 claims 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims 2
- 206010062713 Haemorrhagic diathesis Diseases 0.000 claims 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims 1
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 claims 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 126
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 125
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 125
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 109
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 60
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 58
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 57
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 57
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 55
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 51
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 50
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 47
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 46
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 40
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 30
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 28
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 27
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 27
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 24
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 24
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 23
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 21
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 19
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 18
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 17
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 16
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 16
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 13
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 13
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 12
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 11
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 10
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 10
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 10
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 10
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 10
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 10
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 10
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 10
- WRDABNWSWOHGMS-UHFFFAOYSA-N AEBSF hydrochloride Chemical compound Cl.NCCC1=CC=C(S(F)(=O)=O)C=C1 WRDABNWSWOHGMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 9
- 108010061932 Factor VIIIa Proteins 0.000 description 9
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 7
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 7
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 7
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 7
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 7
- 239000003805 procoagulant Substances 0.000 description 7
- 229940124135 Factor VIII inhibitor Drugs 0.000 description 6
- 101000712605 Theromyzon tessulatum Theromin Proteins 0.000 description 6
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 description 6
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 6
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 6
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 6
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 6
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 6
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 6
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 5
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 5
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 5
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 5
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 5
- 101710117290 Aldo-keto reductase family 1 member C4 Proteins 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 239000000306 component Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 4
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 4
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 4
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 3
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 3
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 3
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 3
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 3
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 3
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 3
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 3
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 3
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 3
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- KQJTXYQXRHCWKW-PJSBSAQXSA-N (4s)-4-[[(2s,3s)-2-benzamido-3-methylpentanoyl]amino]-5-[[2-[[(2s)-5-(diaminomethylideneamino)-1-(4-nitroanilino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-5-oxopentanoic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.N([C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)C(=O)C1=CC=CC=C1 KQJTXYQXRHCWKW-PJSBSAQXSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 229940123583 Factor Xa inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 2
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 2
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 2
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 108010031969 benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilide Proteins 0.000 description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 208000009429 hemophilia B Diseases 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000005556 structure-activity relationship Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical class CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N D-arginine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- 125000002038 D-arginyl group Chemical group N[C@@H](C(=O)*)CCCNC(=N)N 0.000 description 1
- 101100239628 Danio rerio myca gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 101001091269 Escherichia coli Hygromycin-B 4-O-kinase Proteins 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 229940123849 Factor IXa inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229940124014 Factor VIIIa inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010080805 Factor XIa Proteins 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000690301 Homo sapiens Aldo-keto reductase family 1 member C4 Proteins 0.000 description 1
- 101001116548 Homo sapiens Protein CBFA2T1 Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241000588701 Pectobacterium carotovorum Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N Propionic acid Substances CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001091268 Streptomyces hygroscopicus Hygromycin-B 7''-O-kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 208000027276 Von Willebrand disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000002052 anaphylactic effect Effects 0.000 description 1
- 108010018823 anti-inhibitor coagulant complex Proteins 0.000 description 1
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 229940031422 benefix Drugs 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 108090001015 cancer procoagulant Proteins 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012916 chromogenic reagent Substances 0.000 description 1
- 238000007820 coagulation assay Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000000586 desensitisation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 229940105776 factor viii inhibitor bypassing activity Drugs 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 102000054751 human RUNX1T1 Human genes 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000003367 kinetic assay Methods 0.000 description 1
- 229940124280 l-arginine Drugs 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- -1 pH 7.0 Chemical compound 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 108010087558 pectate lyase Proteins 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 108010091748 peptide A Proteins 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000008742 procoagulation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000000455 protein structure prediction Methods 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 108010012557 prothrombin complex concentrates Proteins 0.000 description 1
- 108010014806 prothrombinase complex Proteins 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 208000012137 von Willebrand disease (hereditary or acquired) Diseases 0.000 description 1
- 230000034365 zymogen activation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Protilátky a deriváty protilátek k faktoru IX nebo faktoru IXa
Oblast techniky
Vynález se týká protilátek a derivátů protilátek k faktoru IX nebo faktoru IXa.
Dosavadní stav techniky
Krevní sraženiny (tromby) vznikají sérií aktivací zymogenů, nazývanou koagulační (srážecí) kaskáda. V průběhu této enzymatické kaskády aktivovaná forma každého z těchto zymogenů (označovaných faktory) katalyzuje aktivaci toho následujícího. Tromby jsou usazeniny složek krve na povrchu stěny cév a jsou převážně tvořeny agregovanými krevními destičkami a nerozpustným zesítěným fibrinem. Tvorba fibrinu se uskutečňuje prostřednictvím trombinu omezenou proteolýzou fibrinogenu. Trombin je konečným produktem koagulační kaskády (K. G. Mann, Blood, 1990, sv. 76, str. 1-16).
Aktivace faktoru X komplexem aktivovaného faktoru IX (FIXa) a aktivovaného faktoru VIII (FVlila) je při koagulaci klíčovým stupněm. Absence složek tohoto komplexu nebo narušení jejich funkce je spojeno s poruchou srážlivosti krve nazývanou hemofilie (J. E. Sadler & E. W. Davie: Hemophilia A, Hemophilia B and von Willebranďs disease, v: G. Stamatoyannopoulos a spol. (vyd:): The molecular basis of blood diseases. W. B. Saunders Co., Philadelphia, 1987, str. 576-602. Hemofilie A značí (funkční) absenci aktivity faktoru VIII, zatímco hemofilie B je charakterizována absencí aktivity faktoru IX. V současnosti se léčba hemofilie A provádí substituční terapií podáváním koncentrátů faktoru VIII. Přibližně 20 až 30 % pacientů s hemofilií A si však vyvíjí inhibitory faktoru VTII (tj. protilátky proti faktoru VIII), čímž je inhibováň efekt podávaných preparátů faktoru VIII. Léčba pacientů s inhibitorem faktoru VIII je velmi obtížná a riziková a dosud existuje pouze omezený počet metod.
V případě pacientů s nízkou hladinou inhibitoru FVIII je možné, avšak nákladné, těmto pacientům podávat vysoké dávky faktoru VIII a tak neutralizovat protilátky proti faktoru VIII. Množství faktoru VIII nad množství, které je potřebné k neutralizaci inhibičních protilátek, pak má hemostatický účinek. V mnoha případech je možno uskutečnit desenzibilizaci, načež je pak možno opět aplikovat standardní léčbu faktorem VIII. Tato léčba vysokými dávkami faktoru VIII však vyžaduje velká množství faktoru VIII, je časově náročná
2· ·····« · · · * * • · ···· · · · ··· · ·· · · · · 9 9 9 9 a může zahrnovat vážné anafylaktické vedlejší reakce. Alternativně je možno provádět léčbu molekulami prasečího faktoru VIII.
Další nákladná metoda spočívá v odstraňování inhibitorů faktoru VIII mimotělní imunoadsorpcí na lektiny, které se váží na imunoglobuliny (protein A, protein G) nebo na imobilizovaný faktor VIII. Protože pacient musí být během této léčby napojen na aferezní přístroj, znamená tato léčba pro pacienta také velkou zátěž. Tímto způsobem je možno také léčit akutní hemoragii.
V současnosti je preferovanou terapií podávání koncentrátů komplexů aktivovaného protrombinu (activated prothrombin complex concentrates, APCC), například FEIBA® a AUTOPLEX®, které jsou vhodné pro léčbu akutní hemoragié i u pacientů s vysokým titrem inhibitoru (DE 31 27 318).
V intravaskulárním systému srážení krve je posledním stupněm aktivace faktoru X. Tato reakce je stimulována vazbou faktoru Vlila na faktor IXa a vznikem „tenázy“ komplexu sestávajícího z faktorů IXa, Vlila, X a fosfolipidu. Bez navázání FVIIIa nevykazuje FIXa žádnou nebo velmi slabou enzymatickou aktivitu ve vztahu k FX.
V několika posledních letech bylo charakterizováno několik možných vazebných míst pro faktor Vlila na faktor IXa a ukázalo se, že protilátky nebo peptidy, které se váží na tyto regiony, inhibují aktivitu FIXa (Fay a spol., J. Biol. Chem., 1994, sv. 269, str. 20522-20527, Lenting a spol., J. Biol. Chem., 1996, sv. 271, str. 1935-1940, Jorquera a spol., Circulation, 1992, sv. 86, abstrakt 2725). Inhibice koagulačních faktorů, jako je faktor IX, bylo dosaženo rovněž použitím monoklonálních protilátek s cílem zabránit vzniku trombózy (WO 97/26010).
Opačný efekt, tj. zvýšení aktivace faktoru X, zprostředkované faktorem IXa, bylo popsáno v Liles D. K. a spol. (Blood, 1997, sv. 90, dod. 1, 2054) jako vazba peptidu faktoru VIII (aminokyseliny 698-712) na faktor IX. Přesto se však tento efekt dostavuje pouze v nepřítomnosti faktoru Vlila, zatímco v přítomnosti faktoru Vlila je štěpení faktoru X, zprostředkované faktorem IXa/faktorem Vlila, tímto peptidem inhibováno.
Podstata vynálezu
S ohledem na možná rizika a vedlejší účinky, které mohou nastat při léčbě hemofilických pacientů, existuje potřeba terapie, která umožňuje efektivní léčbu pacientů
0 s inhibitorem FVIIL Cílem vynálezu je tedy poskytnout přípravek pro léčbu poruch krevní srážlivosti, který má zvláštní výhody pro pacienty s inhibitorem faktoru VIII.
Podle vynálezu je tohoto cíle dosaženo použitím protilátek nebo derivátů protilátek proti faktoru IX nebo faktoru IXa, které mají aktivitu kofaktoru faktoru Vlila nebo aktivační aktivitu pro faktor IXa a vedou ke zvýšení prokoagulační aktivity faktoru IXa. Působení těchto protilátek a derivátů protilátek aktivujících faktor IX a faktor IXa podle vynálezu překvapivě není negativně ovlivňováno přítomností inhibitorů, jako jsou inhibitory proti faktoru VIII a faktoru Vlila, ale naopak je v tomto případě tak zvýšena prokoagulační aktivita faktoru IXa.
Další výhodou vynálezu je, že podávání preparátu podle vynálezu umožňuje rychlé srážení krve i v nepřítomnosti faktoru VIII nebo faktoru Vlila, dokonce v případě pacientů s inhibitorem FVIIL Tyto prostředky jsou překvapivě účinné i v přítomnosti faktoru Vlila.
Protilátky a deriváty protilátek podle vynálezu tedy mají aktivitu typu kofaktoru FVIII, která v testu FVIII (například CO ATEST® v testu Imunochrom) po 2 hodinách inkubace vykazuje poměr pozadí (základní šum) k naměřené hodnotě alespoň 3. Výpočet tohoto poměru lze provést například podle schématu:
hodnota protilátky (OD 405) - srovnávací hodnota činidla > 3 hodnota myšího IgG (OD 405) - srovnávací hodnota činidla po dvou hodinách inkubace.
Protilátky podle vynálezu mají výhodně poločas životnosti alespoň 5 dní, přednostně alespoň 10 dní, avšak zejména alespoň 20 dní.
Dále je předmětem vynálezu preparát zahrnující protilátky a/nebo deriváty protilátek proti faktoru IX nebo faktoru IXa a farmaceuticky přijatelný nosič. Preparát podle vynálezu může navíc zahrnovat faktor IX a/nebo faktor IXa.
Dalším předmětem vynálezu je použití protilátek nebo derivátů protilátek ke zvýšení acidolytické aktivity faktoru IXa.
Protilátky a deriváty protilátek
Vynález zahrnuje také nukleové kyseliny kódující protilátky podle vynálezu a deriváty protilátek, expresní vektory, hybridomové buněčné linie a způsoby jejich výroby.
• ·
Protilátky jsou molekuly imunoglobulinů se specifickou aminokyselinou sekvencí, které se váží pouze na antigeny, které indukují jejich syntézu (resp. její imunogen), nebo na antigeny (nebo imunogeny), které jsou jim velmi podobné. Každá imunoglobulinová molekula je tvořena dvěma typy polypeptidových řetězců. Každá molekula má velké identické těžké řetězce (řetězce H) a dva lehké, rovněž identické řetězce (řetězce L). Polypeptidy jsou spojeny disulfidickými můstky a nekovalentními vazbami. In vivo jsou těžké a lehké řetězce vytvářeny na různých ribosomech, v buňce sestaveny a vylučovány jako intaktní imunoglobuliny (Roitt J. a spol., Immunology, druhé vyd., 1989).
Protilátky podle vynálezu a jejich deriváty a organické sloučeniny od nich odvozené zahrnují lidské a zvířecí monoklonální protilátky nebo jejich fragmenty, jednořetězcové protilátky a jejich fragmenty a miniprotilátky, bispecifické protilátky, „diabodies“, „triabodies“ nebo jejich di-, oligo- nebo multimery. Zahrnují rovněž peptidomimetika nebo peptidy odvozené od protilátek podle vynálezu, které například zahrnují jeden nebo několik CDR regionů, přednostně region CDR.
Vynález dále zahrnuje lidské monoklonální protilátky a peptidové sekvence, které jsou na základě souvislosti struktury s aktivitou produkovány umělými modelovacími procesy (Greer J. a spol., J. Med. Chem., 1994, sv. 37, str. 1035-1054).
Termín týkající se protilátek a derivátů protilátek aktivujících faktor IX/IXa může rovněž zahrnovat proteiny produkované expresí pozměněného regionu, kódujícího imunoglobulin, v hostitelské buňce, například „technicky modifikované protilátky“, jako jsou syntetické protilátky, chimérické nebo humanizované protilátky nebo jejich směsi, nebo fragmenty protilátek, kterým částečně nebo zcela chybí konstantní region, například Fv, Fab, Fab‘ nebo F(ab)‘2 atd. V těchto technicky modifikovaných protilátkách může být například nahrazena část nebo části lehkého a/nebo těžkého řetězce. Takové molekuly mohou například zahrnovat protilátky tvořené humanizovaným těžkým řetězcem a nemodifikovaným lehkým řetězcem (nebo chimérickým lehkým řetězcem) nebo naopak. Označení Fv, Fc, Fd, Fab, Fab‘ nebo F(ab)£2 se používají stejně jako v dosavadních pracích (Harlow E. a Lané D., „Antibodies, A Laboratory Manual“, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
Vynález rovněž zahrnuje použití fragmentů Fab a/nebo fragmentů F(ab)2, které jsou odvozeny od monoklonálních protilátek (mAb), které jsou zaměřeny proti faktoru IX/faktoru
IXa a vyvolávají zvýšení prokoagulační aktivity faktoru IXa.
Heterologní úseky základní struktury a konstantní regiony jsou výhodně vybrány z tříd a isotypů lidského imunoglobulinu, jako je IgG (subtypy 1 až 4), IgM, IgA a IgE. V průběhu imunitní odpovědi může dojít k přesmyku tříd imunoglobulinu, například k přesmyku z IgM na IgG; přitom se vymění konstantní oblasti, například z μ na γ. Přesmyk tříd může být vyvolán také řízené metodami genového inženýrství („rekombinace řízená na přesmyk tříd“), jak je známo z dřívějších zpráv (Esser C. a Radbruch A., Annu. Rev. Immunol., 1990, sv. 8, str. 717-735). Protilátky a deriváty protilátek podle vynálezu však nemusejí obsahovat výlučně lidské sekvence Ímunoglobulinových proteinů.
V jednom konkrétním provedení humanizovaná protilátka zahrnuje regiony určující komplement (CDR) z myších monoklonálních protilátek, které jsou vloženy do úseků základní struktury sekvencí zvolené lidské protilátky. Mohou být však použity i lidské regiony CDR. Výhodně jsou jednou nebo více výměnami CDR technicky pozměněny variabilní regiony v lidských těžkých a lehkých řetězcích. Je rovněž možno použít všech šesti CDR nebo různých kombinací méně než šesti CDR.
Humanizovaná protilátka podle vynálezu má výhodně strukturu lidské protilátky nebo jejího fragmentu a zahrnuje kombinaci charakteristik nezbytných pro terapeutickou aplikaci, například léčbu poruch srážlivosti u pacientů, zejména u pacientů s inhibitorem faktoru VIII.
Chimérická protilátka se od humanizované protilátky liší vtom, že zahrnuje celé variabilní regiony zahrnující úseky základní struktury těžkých a lehkých řetězců ne-lidského původu v kombinaci s konstantními regiony obou řetězců zíidského imunoglobulinu. Může být produkována například chimérická protilátka tvořená myšími a lidskými sekvencemi. Podle vynálezu mohou být protilátkami a deriváty protilátek také jednořetězcové protilátky nebo miniprotilátky (fragmenty scFv, které jsou například napojeny na sekvence bohaté na prolin a oligomerizační domény, například Pluckthun A. a Pack P., Immunotechnology, 1997, sv. 3, str. 83-105) nebo jednořetězcové Fv (sFv), které zahrnují celý vazebný region protilátky v jediném polypeptidickém řetězci. Jednořetězcové protilátky je možno například vytvářet napojením V-genů na oligonukleotid, který byl konstruován jako linkerová sekvence a spojuje C konec prvního V regionu sN koncem druhého V regionu, například v uspořádání Vhlinker-VL nebo VL-linker-Vn; jak Vh, tak Vl přitom mohou představovat N-terminální doménu (Huston JS a spol., Int. rev. Immunol., 1993, sv. 10, str. 195-217; Raag R. a Whitlow M., FASEB J., 1995, sv. 9, str. 73-80). Protein, který může být použit jako linkerová sekvence, může mít například délku až 150 Á, výhodně až 80 Á a zejména až 40 Á. Linkerové sekvence obsahující glycin a serin, resp. glutamin a lysin, jsou zvlášť výhodné pro • · ···«·· · · · · • · 9 99 · · · » ·
9999999 9 9 Λ 9 9 9
9 9999 999
999 9 99 99 ♦· 9999 svou flexibilitu, resp. rozpustnost. Výběr aminokyseliny je ovlivňován kriterii imunogenity a stability a rovněž závisí na tom, zda mají být tyto jednořetězcové protilátky vhodné pro fyziologické či průmyslové aplikace (například imunoafinitní chromatografií). Jednořetězcové protilátky mohou být přítomny také jako agregáty, například jako trimery, oligomery nebo multimery. Linkerové sekvence však mohou také chybět a ke spojení řetězců Vh a Vl může docházet přímo.
Bispecifické protilátky jsou makromolekulami heterobifunkční příčné spoje (crosslinkery), které mají dvě různé vazebné specifity v jediné molekule. Do této skupiny náležejí například bispecifické (bs) IgG, bs IgM-IgA, bs IgA-dimery, bs (Fab‘)2, bs(scFv)2, „diabodies“ a bs bis Fab Fc (Cao Y. a Suresh M.R., Bioconjugate Chem., 1998, sv. 9, str. 635-644).
Peptidomimetiky se rozumějí proteinové komponenty o nízké molekulové hmotnosti, které imitují přírodní peptidovou komponentu, nebo stempláty, které indukují tvorbu specifické peptidové struktury v sousední peptidové sekvenci (Kemp DS, Trends Biotechnol., 1990, str. 249-255). Peptidomimetika mohou být odvozena například od CDR3 domén. Metodická mutační analýza dané peptidové sekvence, tj. skanovací mutační analýza alaninu nebo kyseliny glutamové, umožňuje identifikaci peptidických zbytků kritických pro prokoagulační aktivitu. Jiná možnost zlepšení aktivity určité peptidové sekvence je použití peptidových knihoven spojené s vysoce propustným screeningem.
Termín protilátky a deriváty protilátek může rovněž zahrnovat činidla, která byla získána analýzou dat týkajících se vztahu struktura-aktivita. Tyto sloučeniny mohou být rovněž používány jako peptidomimetika (Grassy G. a spol., Nátuře Biotechnol., 1998, sv. 16, str. 748-752; Greer J. a spol., J. Med. Chem., 1994, sv. 37, str. 1035-1054).
Příklady hybridomových buněk exprimujících protilátky nebo deriváty protilátek podle vynálezu byly uloženy podle Budapešťské smlouvy dne 9. září 1999 pod čísly 99090924 (#198/A1), 99090925 (#198/B1) a 99090926 (#198/BB1) a 16. prosince 1999 pod čísly 99121614 (#193/A0), 99121615 (#196/C4), 99121616 (#198/D1), 99121617 (198/T2), 99121618 (#198/G2), 99121619 (#198/AC1) a 99121620 (#198/U2).
Metody produkce:
Protilátky podle vynálezu mohou být připraveny známými metodami, například běžnými hybridomovými technikami nebo pomocí genových knihoven fágového zobrazení,
přeskupením imunoglobulinového řetězce nebo humanizačními metodami (Harlow E. a Lané D., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Produkce protilátek a derivátů protilátek podle vynálezu může být například prováděna běžnými hybridomovými metodami (Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, ed. Harlow a Lané, str. 148-242). Podle vynálezu lze k tomu použít člověka a také ne-lidské druhy, jako je hovězí dobytek, prasata, opice, kuřata a hlodavce (myši, krysy). Mohou být použity například normální imunokompetentní myši Balb/c nebo FIXdeficitní myši (myši deficitní na faktor IX mohou být získány u Dr. Darrela Stafforda na Universitě Severní Karoliny, Chapel Hill). Imunizace může být prováděna například faktorem IX, faktorem IXaa nebo kompletně aktivovaným faktorem IXaP nebo jejich fragmenty.
Hybridomy se volí s ohledem na skutečnost, že protilátky a deriváty protilátek v supernatantech hybridomových buněk se vážou na faktor IX/faktor IXa a vyvolávají zvýšení prokoagulační aktivity faktoru IXa. Zvýšení prokoagulační aktivity může být prokázáno testovacími metodami, známými z dřívějšího stavu techniky pro měření aktivity typu faktoru VIII, například chromogenními testy.
Alternativně mohou být protilátky a deriváty protilátek podle vynálezu produkovány také rekombinačními metodami. Přitom je možno známými metodami určit sekvenci DNA protilátek podle vynálezu a exprimovat celou DNA protilátky nebo její části ve vhodných systémech. Mohou být použity rekombinantní produkční metody, například s použitím fágovéhó zobrazení, syntetických a přírodních knihoven, exprese protilátkových proteinů ve známých expresních systémech nebo exprese v transgenních zvířatech (Jones a spol., Nátuře, 1986, sv. 321, str. 522-525; Phage Display of Peptides and Proteins, A Laboratory Manual, 1996, ed. Kay a spol., str. 127-139; US 4 873 316, Vaughan TJ. a spol., Nátuře Biotechnology, 1998, str. 535-539; Persic L. a spol., Gene, 1997, str. 9-18; Ames R.S., a spol., J. Immunol. Methods, 1995, str. 177-186).
Exprese rekombinantně produkovaných protilátek může být uskutečněna pomocí běžných expresních vektorů, jako jsou bakteriální vektory, například pBr322 a jeho deriváty, pSKF, nebo eukaryotické vektory, například pMSG a SV40. Sekvence, které kódují protilátku, mohou být opatřeny regulačními sekvencemi, které regulují replikaci, expresi a sekreci z hostitelské buňky. Tyto regulační sekvence zahrnují promotory, například CMV nebo SV40, a signální sekvence.
·· ··· · »· ·
Expresní vektory mohou zahrnovat rovněž selekční a amplifikační markéry, jako je gen dihydrofolát reduktázy (DHFR), hygromycin B fosfotransferáza, thymidin kináza atd.
Používané komponenty vektorů, jako jsou selekční markéry, replikony, zesilovače transkripce, mohou být získány komerčně nebo připraveny běžnými metodami. Vektory mohou být konstruovány pro expresi v různých buněčných kulturách, například pro savčí buňky jako CHO, COS, fibroblasty, hmyzí buňky, kvasinky nebo bakterie jako E. coli. Výhodně se používají takové buňky, které umožňují optimální glykosylaci exprimovaného proteinu. Zvlášť výhodný je vektor pBax (viz obr. 17), který je exprimován v buňkách CHO nebo v SK-Hep.
Produkce fragmentů Fab nebo fragmentů F(ab)2 může být uskutečňována známými metodami, například štěpením mAb proteolytickými enzymy, jako je papain a/nebo pepsin, nebo rekombinačními metodami. Tyto fragmenty Fab a F(ab)2 mohou být také připravovány s použitím genové knihovny fágového zobrazení (Winter a spol., 1994, Ann. Rev. Immunol., 12:433-455). '*
Deriváty protilátek mohou být připravovány rovněž známými metodami, například molekulárním modelováním, například podle Grassy a spol., Nátuře Biotechnol., 1998, sv. 16, str. 748-752, nebo Greer J. a spol., J. Med. Chem., sv. 37, str. 1035-1054, nebo Rees A. a spol., „Protein Structure Prediction: A practical approach“, ed. Stemberg M.J.E., IRL Press, 1996, kap. 7-10, str. 141-261.
Čištění protilátek a derivátů protilátek podle vynálezu může být prováděno rovněž známými metodami, například srážením síranem amonným, afinitním čištěním (protein GSepharose), ionexovou chromatografií nebo gelovou chromatografií. Jako zkušebních metod ke zjištění, zda se protilátky a deriváty protilátek podle vynálezu váží na faktor IX/faktor IXa, zvyšují prokoagulační aktivitu faktoru IXa nebo mají aktivitu typu faktoru VIII, je možno použít těchto metod: jednostupňová koagulační zkouška (Mikaelsson a Oswaldson, Scand. J. Haematol., Suppl., 33, str. 79-86, 1984) nebo chromogenní tesy, například CO ATEST VIII:C® (Chromogenix) nebo Immunochrom (Immuno). V zásadě mohou být použity všechny metody používané pro stanovení aktivity faktoru VIII. Jako kontrola může být použit slepý pokus, například s nespecifickou myší protilátkou IgG.
Předkládané protilátky a deriváty protilátek jsou vhodné pro terapeutické použití při léčba poruch srážlivosti, například v případě hemofilie A, pro pacienty s inhibitorem faktoru VIII atd. Podávání může být prováděno jakoukoli metodou vhodnou pro efektivní podání • Μ* terapeutického činidla pacientovi, například orální, subkutánní, intramuskulámí, intravenózní nebo intranasální aplikací.
Terapeutická činidla podle vynálezu mohou být vyráběna jako preparáty, které zahrnují dostatečné množství protilátek nebo derivátů protilátek jako účinnou složku ve farmaceuticky přijatelném nosném materiálu. Tato činidla mohou být přítomna buď v kapalné nebo práškové formě. Preparáty podle vynálezu mohou navíc obsahovat směsi různých protilátek, jejich derivátů a/nebo organických sloučenin, od nich odvozených, stejně jako směsi tvořené protilátkami a faktorem IX a/nebo faktorem IXa. Faktor IXa může být přítomen jako faktor IXaa a/nebo faktor IXaP. Příkladem vodného nosiče je například fyziologický roztok. Roztoky jsou sterilní, přičemž se sterilizace uskutečňuje běžnými metodami.
Protilátky a deriváty protilátek podle vynálezu mohou být přítomny ve formě lyofilizované pro skladování a před aplikací mohou být suspendovány ve vhodném rozpouštědle. Tato metoda se ukázala jako všeobecně výhodná pro běžné imunoglobuliny a v tomto případě mohou být aplikovány známé metody lyofilizace a rekonstituce.
Protilátky a deriváty protilátek podle vynálezu mohou být navíc používány v průmyslových aplikacích, například pro čištění faktoru IX/faktoru IXa pomocí afinitní chromatografie nebo jako komponenty detekčních metod (například testů ELISA), nebo jako činidla pro identifikaci a interakci s funkčními doménami cílového proteinu.
Vynález bude podrobněji popsán s ohledem na připojené obrázky a příklady provedení, na něž se však neomezuje.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 znázorňuje výsledky screeningu supematahtů kultur hybridomových buněk na aktivitu typu FVIII. Chromogennímu testu byly podrobeny předem vybrané klony z fuzních experimentů č. 193, 195 a 196.
Obr. 2 ukazuje výsledky screeningu na aktivitu typu faktoru VIII zprostředkovanou IgG v supernatantech hybridomové buněčné kultury základní plotny.
Obr. 3 znázorňuje subklonování klonu 193/CO, konkrétně výsledky prvního klonovacího cyklu.
Obr. 4 znázorňuje porovnání chromogenní aktivity typu FVIII a reaktivity faktoru IX při ELISA u hybridomových kultur odvozených z výchozího klonu 193/CO.
ftftft · ft · ftftft· ft · · ft · · · ftftft · ♦· • ft ··♦· ♦ » ft ft « ft · * • ft · · ft ft · ftftft «· ·♦ ·*· ·
Obr. 5 zobrazuje výsledky měření chromogenní aktivity několika základních klonů a subklonů.
Obr. 6A ukazuje aktivitu typu FVIII protilátek proti FIX/FIXa 193/AD3 a 196/AF2 v porovnání s lidským FVIII, TBS pufrem a médiem buněčné kultury. Po fázi lag vyvolaly obě protilátky štěpení chromogenního substrátu, jak lze soudit ze vrůstající optické hustoty.
Obr. 6B zobrazuje srovnání chromogenní aktivity faktoru VIII, 196/AF1, 198/AC1/1 a myšího IgG.
Obr. 7A ukazuje porovnání kinetiky tvorby faktoru Xa působením faktoru VIII a 196/AF2 s přídavkem a bez přídavku specifického inhibitoru faktoru Xa.
Obr. 7B ukazuje porovnání kinetiky tvorby faktoru Xa působením faktoru VIII, myšího IgG a protilátky anti-faktor IX/IXa 198/AM1 s přídavkem a bez přídavku specifického inhibitoru faktoru Xa Pefabloc Xa®.
Obr. 8A zobrazuje měření závislosti aktivity typu faktoru VIII u čištěné protilátky proti faktoru IX/IXa 198/AC1/1 v přítomnosti a nepřítomnosti fosfolipidů, FIXa/FX a vápenatých iontů.
Obr. 8B znázorňuje měření závislosti tvorby FXa působením protilátky proti FIXa 196/AF1 v přítomnosti fosfolipidů, Ca2+ v FIXa/FX.
Obr. 8C ukazuje tvorbu FXa působením nespecifické myší protilátky IgG.
Obr. 9 je grafické znázornění koagulačních časů plasmy s deficitem faktoru VIII v testu APTT s použitím různých koncentrací protilátky proti faktoru IX/IXa 193/AD3.
Obr. 10A ukazuje, že v přítomnosti faktoru IXa způsobuje protilátka 193/AD3 snížení koagulačního času plasmy s deficitem faktoru VIII.
Obr. 10B ukazuje snížení srážlivosti, závislé na dávce, působením protilátky 193/AD3 v přítomnosti inhibitorů faktoru IXa a faktoru VIII.
Obr. 11 znázorňuje chromogenní aktivitu protilátek 198/A1, 198/B1 a 198/AP1 v přítomnosti a nepřítomnosti lidského FIXap.
Obr. 12 znázorňuje primerové sekvence pro amplifikaci genů variabilního těžkého řetězce myší protilátky.
Obr. 13 znázorňuje primerové sekvence pro amplifikaci genů variabilního lehkého (kappa) řetězce myší protilátky.
Obr. 14 znázorňuje DNA a odvozenou proteinovou sekvenci scFv z hybridomové buněčné linie 193/AD3 (SEQ ID NO 81a 82).
Obr. 15 znázorňuje DNA a odvozenou proteinovou sekvenci scFv z hybridomové buněčné linie 193/K2 (SEQ ED NO 83 a 84).
Obr. 16 znázorňuje DNA a odvozenou proteinovou sekvenci scFv z hybridomové buněčné linie 198/AB2 (subklon 198/B1) (SEQ ED NO 85 a 86).
Obr. 17 znázorňuje DNA a dedukovanou proteinovou sekvenci scFv odvozenou z buněčné linie 198/A1 (SEQ ID NO 87 a 88).
Obr. 18 demonstruje chromogenní aktivitu typu FVIII u peptidů Al/3 v přítomnosti 2,9nM lidského FIXa. Pomíchaná verze peptidů Al/3, peptid Al/5, nevyvolává tvorbu FXa.
Obr. 19 demonstruje závislost chromogenní aktivity typu FVIII u peptidů Al/3 na přítomnosti lidského FIXa. V nepřítomnosti lidského FIXa peptid Al/3 nevyvolává vznik FXa. Kontrola s pufrem, prázdný imidazolový pufr, je označena IZ.
Obr. 20 ukazuje, že chiralita zbytků Arg nehraje významnou úlohu pro chromogenní aktivitu peptidů Al/3-rd a Al/3-Rd-srmb.
Obr. 21 ukazuje, že přídavek 2,4 μΜ peptidů Bl/7 k reakční směsi vedl k měřitelné tvorbě FXa.
Obr.....22 ukazuje, že přídavek FX-specifického inhibitoru vyvolává významné snížení reakce. Pokud nebyl přítomen FIXa a k reakční směsi byl přidán FX, nedošlo k syntéze FXa.
Obr. 23 znázorňuje vektor pBax-IgGl.
Obr. 24 ukazuje zvýšení amidolytické aktivity FIXa v přítomnosti protilátky 198/B1 (obr. 24A) a IgM protilátky 198/AF1 (obr. 24B).
Obr. 25 demonstruje chromogenní aktivitu typu FVIII fragmentu protilátky 198/A1 v přítomnosti 2,3 nM lidského FIXa. Jako pozitivní kontrola byla použita intaktní protilátka 198/A1 a 7,5 pM FVHI. Jako negativní kontrola byl použit pufr (IZ).
Obr. 26 znázorňuje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci fuzního proteinu 198AB2 scFv-alkalická fosfatáza (ORF expresního vektoru pDAP2-198AB2#100, SEQ Π) NO 89 a 90).
Geny pro domény VL a VH protilátky 198/AB2 (198/AB2 je identický subklon 198/B1) byly odvozeny z odpovídajících hybridomových buněk, jak je popsáno v příkladu 10.
• 4 •4 4444
PCR produkt VH-genu byl štěpen s použitím Sfil-AscI a PCR-produkt VL-genu byl štěpen pomocí AscI a Notl. Geny VH a VL byly spojeny přes místo AscI a vloženy do vektoru pDAP2, štěpeného pomocí Sfil-Notl (Kerschbaumer R. J. a spol., Immunotechnology 2, 145150, 1996; přírůstkové číslo GeneBank U35316). PelB leader: vedoucí sekvence pektát lyázy B Erwinia carotovora', His tag: histidinová značka pro iontovou chromatografii.
Obr. 27 demonstruje chromogenní aktivitu typu FVIII fragmentu dvou fuzních proteinů fragmentu scFv protilátky 198/B1 (subklon AB2) a alkalické fosfatázy (198AB2#1 a 198AB2#100) v přítomnosti 2,3 nM lidského FIXa. Jako pozitivní kontrola byl použit 7,5 pM FVIII.
Obr. 28 znázorňuje aminokyselinovou a nukleotidovou sekvenci pZipl98AB2#102 (SEQ ID NO 91 a 92).
Obr. 29 znázorňuje aminokyselinovou a nukleotidovou sekvenci fúzního proteinu scFv mAB#8860-alkalické fosfatázy (vektor pDAP2-8860scFv#ll, SEQ ID NO 93 a 94). Geny pro domény VH a VL protilátky #8860 byly odvozeny od odpovídajících hybridomových buněk, jak je popsáno v příkladu 10. PCR produkt VH genu byl štěpen pomocí AscI a Notl. Geny VH a VL byly spojeny přes místo AscI a vloženy do vektoru pADP2, štěpeného pomocí SfilNotl (Kerschbaumer R. J. a spol., Immunotechnology 2, 145-150, 1996; přírůstkové číslo GeneBank U3 5316).
Obr. 30 znázorňuje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci zipového fúzního proteinu mAB #8860 scFv-leucin (miniprotilátka; vektor p8860-Zip#1.2, SEQ ID NO 95 a 96). Z mAB #8860 byl odvozen gen fragmentu scFv a byl přesunut z vektoru pDAP28860scFv#ll do plasmidu pZipl, štěpeného pomocí Sfil-Notl (Kerschbaumer R. J. a spol., Analytical Biochemistry 249, 219-227, 1997; přírůstkové číslo GeneBank U94951).
Obr. 31 demonstruje chromogenní aktivitu typu FVIII miniprotilátky 198/B1 (subklon AB2) 198AB-Zip#102 v přítomnosti 2,3 nM lidského FIXa. Jako pozitivní kontrola bylo použito 4,8 pM FVIII, zatímco nepříbuzná miniprotilátka (8860-Zip#l .2) a prázdný reakční pufr (IZ) sloužily jako negativní kontroly.
Obr. 32 představuje schematické znázornění plasmidu pMycHisó.
Obr. 33 znázorňuje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci části plasmidu pMycHisó lišící se od vektoru pCOCK (SEQ ID NO 97 a 98). Vektor pMycHisó byl konstruován štěpením vektoru pCOCK (Engelhardt a spol., 1994, Biotechniques, 17:44-46) pomocí Notl a EcoRI a vložením oligonukleotidů: mychis6-co: 5’ ggccgcag
| 0 0 0 · | 00 0 0 | 0 0 0 0 0 | 00 0 | • | 00 0 · |
| 0 0 0 0· | 0 0 0 | 0 0 | 0 | 0 | 0 |
| 9 0 0 0 0 | 0 · • 0 | 0 0 0 0 | 0 00 | • | 0 00 0 0 |
aacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatggggcggcacatcaccatcaccatcactaataag 3‘ (SEQ ID NO 79) a mycchis-ic: 5‘ aattcttattagtgatggtgatggtgatgtgccgccccattcagatcctcttctgagatgagtttttgttctgc (SEQ ID NO 80).
Obr. 34 znázorňuje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci 198AB2 scFv (napojeného na c-myc tag a His6 tag): ORF expresního vektoru pMycHis6-198AB2#I02. Vektor pMycHisó byl konstruován štěpením vektoru pCOCK (Engelhardt a spol., 1994, Biotechniques 17, 44-46, 1994) pomocí Notl a EcoRI a vložením těchto tepelně hybridizo váných oligonukleotidů:
(5‘-GGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATGGGGCGGCACA TCACCATCACCATCACTAATAAG-3‘ (SEQ ID NO 103) a
5‘-TTATTAGTGATGGTGATGGTGATGTGCCGCCCCATTCAGATCCTCTTCTGAGA TGAGTTTTTGTTCTGC-3‘ (SEQ ID NO 104). Vzniklý vektor, nazvaný pMycHisó, byl štěpen pomocí Sfil-Notl a byl do něj přenesen gen scFv 198AB2 z vektoru pDAP2198AB2#100.
Obr. 35 znázorňuje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci mAB #8860 scFv napojeného na c-myc tag a na His6 tag (vektor p8860-M/H#4c, SEQ ID NO 101 a 102). Plasmid pMycHisó byl štěpen pomocí Sfil a Notl a byla do něj vnesena DNA sekvence kódující protein scFv 8860#ll z pDAP2-8860scFv#l 1 (viz obr. 29) za vzniku plasmidu p8860-M/H#4c.
Obr. 36 demonstruje chromogenní aktivitu typu FVIII scFv fragmentu 198/B1 (subklon AB2) (MycHis-198AB2#102) v přítomnosti 2,3 nM lidského FIXa. Jako pozitivní kontrola byl použit 4,8 pM FVIII, zatímco jako negativní kontroly sloužila nepříbuzná scFv (8860-M/H#4c) a prázdný reakční pufr (IZ).
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Imunizace imunokompetentních myší a vytvoření hybridomových buněk vylučujících protilátku anti-FIX/IXa
Skupiny 1 až 3 normálních imunokompetentních myší Balb/c ve stáří 5 až 8 týdnů byly imunizovány intraperitoneální (i.p.) cestou 100 pg antigenu (dávky 100 μΐ). V typickém experimentu byly myši inokulovány buď rekombinantním lidským srážecím faktorem (F) IX
4444
44 4 · · · ♦
444 44 «
4444 444 · · 4 4 · φ·*· 444
44 44 44 4444 (Benefix™), lidským aktivovaným FIXaa (Enzyme Research Laboratories, šarže FIXaa 1190L) nebo lidským FIXaP (Enzyme Research Laboratories, šarže HFIXaP 1332 AL) s pomocnou látkou Al(0H)3 nebo KFA.
Jednotlivé myši dostaly v různých dobách posilovači dávku 100 pg antigenu (dávky 100 μΐ i.p.) a dvou dnech byly usmrceny. Byly odebrány slezinné buňky a fúzovány smyelomovými buňkami P3 X63-Ag8 6.5.3 v podstatě postupem popsaným v Lané a spol., 1985 (J. Immunol. Methods, sv. 81, str. 223-228). Každý fuzní experiment byl očíslován zvlášť, tj. #193, 195, 196 nebo 198.
Hybridomové buňky byly kultivovány na 96jamkových plotnách na makrofágové živné vrstvě (přibl. 105 buněk/ml) a selektovány v médiu HAT (médium RPMI-1640 doplněné antibiotiky, 10 % FCS, Na-pyruvátem, L-glutaminem, 2-merkaptoethanolem a HAT (HAT lOOx: 1,0x10'2 M hypoxanthinu vH20 (136,1 mg/100 ml H2O), 4,0xl0'5 M aminopterinu vH20 (1,76 mg/100 ml H2O) a 1,6χ10'3 M thymidinu vH2O (38,7 mg/100 ml H2O). Médium bylo poprvé vyměněno po 6 dnech a pak dvakrát týdně. Po 2 až 3 týdnech bylo médium HAT změněno na médium HT (médium RPMI-1640 doplněné antibiotiky, 10 % FCS, Na-pyruvátem, L-glutaminem, 2-merkaptoethanolem a HT) a později (po dalším 1 až 2 týdnech) na normální růstové médium (médium RPMI-1640 doplněné 10 % FCS, Napyruvátem, L-glutaminem a 2-merkaptoethanolem) (viz: HYBRIDOMA TECHNIQUES, EMBO, SKMB Course 1980, Basilej).
V jiné sadě experimentů byly pro imunizaci a následnou produkci hybridomů použity myši C57B16 deficitní na FIX (Lin a spol., 1997, Blood, 90:3962). Protože myši s knockoutovaným (k.o.) FIX neexprimují endogenní FIX, považuje se dosažitelné spektrum anti (a) FIX za odlišné ve srovnání s normálními myšmi Balb/c (v důsledku chybějící tolerance).
Příklad 2: Zjišťování aktivity typu FVIII v supematantech hybridomových buněk vylučujících protilátku anti-FIX/FIXa
Za účelem zjišťování aktivity typu FVIII protilátek anti-FIXa, vylučovaných hybridomovými buňkami, byl použit komerčně dostupný zkušební kit COATEST VIII:C/4® (Chromogenix). Test byl prováděn v podstatě podle pokynů výrobce s touto modifikací:
Aby se umožnil screening s vysokou propustností, bylo měřítko testu zmenšeno na formát mikrotitrační plotny. Stručně řečeno byly 25 μΐ alikvoty hybridomových supernatantů • to ···· * to • · · « • to ·· • · to · · · · to to · toto · • · · · · · · • · · to · · · • to toto ·· ···· přeneseny do jamek mikrotitrační plotny (Costar, #3598) a ohřátý na 37 °C. Podle návodu výrobce byl rekonstituován chromogenní substrát (S-2222), syntetický inhibitor trombinu (I2581), faktor (F) IXa a FX ve sterilní vodě a FIXa/FX byl smísen s fosfolipidem. Pro každou reakci bylo 50 μΐ roztoku fosfolipid/FIXa/FX spojeno s 25 μΐ CaCl2 (25 mM) a 50 μΐ koktejlu substrát/inhibitor. Pro zahájení reakce bylo 125 μΐ tohoto premixu přidáno k hybridomovému supernatantu v mikrotitračních plotnách a inkubováno při 37 °C. V různých dobách (30 min až 12 h) byla pomocí přístroje Labsystems iEMS Reader MF™ odečítána absorbance vzorků při 405 nm a 490 nm proti slepému reagentu (MLW, buněčné kultivační médium místo hybridomového supernatantu). Aktivita typu FVIII pro vzorky byla počítána z porovnání absorbance vzorků proti absorbanci zředěného referenčního standardu FVIII (IMMUNO AG # 5T4AR00) pomocí software GENESIS™.
Výsledky screeningu na aktivitu typu FVIII v supematantech kultur hybridomových buněk jsou znázorněny na obr. 1. Předem zvolené klony odvozené z ťuzních experimentů #193, #195 a #196 (viz výše) byly podrobeny výše popsanému chromogennímu testu FVIIL Klony 193/M1, 193/N1 a 193/P1 jsou subklony odvozené od základního klonu 193/CO (viz dále). Základní klon 195/10 byl odvozen z fuzního experimentu #195 a klony 196/AO, 196/BO a 196/CO byly odvozeny z fuzního experimentu #196. V typickém screeningovém experimentu bylo přibližně 1000 klonů (v 96 jamkách) z jednoho fuzního experimentu podrobeno pre-screeningu na aktivitu typu FVIII. Vybrané klony pak byly kultivovány ve větším měřítku (3 až 5 ml supernatantu) a znovu podrobeny chromogennímu testu. Jako negativní kontrola bylo na každé plotně testováno kultivační médium buněk (MLW).
Jamky vykazující buď vysokou aktivitu typu FVIII nebo podstatnou aktivitu typu FVIII byly podrobeny subklonování. Proces selekce a subklonování je popsán pro screening a subklonování buněčné linie produkující IgG (tj. 193/CO), ale byl prováděn přesně stejně i pro klon produkující IgM (tj. 196/CO, viz dále, obr. 5).
Proces selekce spočíval v tom, že nejprve byly všechny hybridomové buněčné klony odvozené z jednoho fuzního experimentu naneseny na deset 96jamkových ploten, které tak vytvořily tzv. „základní plotny“. Jednotlivé pozice (jamky) na základní plotně obsahovaly obvykle více než jeden klon hybridomových buněk (obvykle 3 až 15 různých klonů). Poté byla testována protilátka vylučovaná pouze několika tisíci buněk. Tyto buňky rostly za podmínek sub optimálních pro produkci protilátky, o níž je známo, že nejlepší je v umírajících buňkách. Očekávaná koncentrace specifické protilátky anti FIX v supernatantu tedy může být ·· ··»· • · · · · · · » a · a a a a a a a a a · a a a a » a a a* ta ·· aaaa v rozmezí 10'12 až 10'14 M. To vysvětluje, proč bylo nutno prodloužit inkubační doby oproti standardním testům pro FVIII.
Výsledky scřeeningu na FVIII aktivitu zprostředkovanou IgG v supernatantech hybridomové buněčné kultury základní plotny jsou znázorněny na obr. 2. Supernatanty byly podrobeny chromogennímu testu na FVIII. Jsou uvedeny výsledky odvozené z páté základní plotny ťuzního experimentu č. #193 (myši Balb/c imunizované FIXaoc). Absorbance byla odečítána po 4 hodinách inkubace při 37 °C. Pozice ES byla identifikována jako vykazující aktivitu typu FVIII významně vyšší než slepý pokus (MLW). Tato hotovost buněk byla označena 193/CO a byla dále subklonována (obr. 3). Protože každá jamka základní plotny obsahuje více než jeden hybridomový buněčný klon, byly buňky z jediné pozitivní jamky rozšířeny a naneseny s vypočtenou hustotou 2 až 0,2 buněk/jamku na 96jamkovou plotnu. Supernatanty byly opět testovány na aktivitu typu FVHI a pozitivní polohy byly podrobeny dalšímu cyklu subklonování. S každým klonem vykazujícím aktivitu typu FVIII byly pro získání homogenní buněčné populace provedeny typicky tři až čtyři súbklonovací cykly. Zde jsou uvedeny výsledky chromogenniho testu subklonů 193/C0. Po 4 hodinách inkubace při 37 °C byla odečtena absorbance. Značnou vykazovaly aktivitu typu FVIII polohy A6 a D5, které byly označeny 193/M1, resp. 193/P1. Tyto dva klony byly podrobeny dalšímu cyklu subklonování. Jako negativní kontrola bylo na každé plotně testováno prázdné kultivační médium (MLW(H1)).
Porovnání chromogenní aktivity typu FVIII a FIX-ELISA reaktivity hybridomových kultur v malém měřítku (3 ml) je znázorněno na obr. 4. Předtím, než bylo učiněno rozhodnutí, zda se má základní klon (nebo subklon) dále subklonovat, byly vypěstovány klony v měřítku 3 až 5 ml a supernatanty byly znovu testovány. Graf ukazuje výsledky ELISA specifické pro FIX a chromogenní aktivitu typu FVIII základního klonu 193/C0 a všech jeho subklonů, které byly identifikovány jako pozitivní a znovu zkontrolovány. Jak v případě ELISA, tak chromogenní ch testů, které jsou zde znázorněny, byly odečteny hodnoty slepých pokusů (absorbance samotného chromogenniho reagentu). Klon 193/M1 byl subklonován a poskytl klony 193/V2, 193/M2 a 193/U2. Další klony z druhého cyklu pocházely z 193/P1, 193/AB2 a 193/P2 a byly subklonovány. 193/AF3, 193/AB3 a 193/AE3 jsou subklony 193/AB2. Zbylé klony ze třetího cyklu pocházely z 193/P2. Konečně byly subklonovány 193/AF3 (-»193/AF4), AE3 (-+193/AE4, 193/AL4, 193/AN4 a 193/AO4) a 193/AD3 (^193/AG4, 193/AH4, 193AD4, 193/AI4, 193/AK4).
·« · · · · · · «·«««· · ··· · · · · · * · · · • »· 4· ···*··
Z každého íuzního experimentu bylo identifikováno několik (5 až 15) základních klonů (vybraných ze základní plotny) a podrobeno subklonování. Po 3 cyklech subkíonování byla většina buněčných linií homogenní, jak demonstruje ELISA a chromogenní analýza aktivity (viz obr. 4), stejně jako sekvenční analýza cDNA. Konkrétní základní klon a všechny jeho subklony produkují tutéž protilátku vážící FIX/FIXa. Existují však velké rozdíly v proteinových sekvencích protilátek klonů odvozených od různých základních klonů (viz příklad 11). Většina hybridomových buněčných linií exprimuje protilátky z podtřídy IgG (tj. klony #193, #198, jako 198/A1, 198/B1, 198/BB1). Byli ale rovněž schopni vybrat nějaké klony exprimující protilátky IgM.
Byla stanovena chromogenní aktivita hybridomového supematantu některých významných základních klonů a subklonů. Absorbance byla měřena po 1 h 30 min a 3 h 30 min inkubace při 37 C (obr. 5).. V kontrastu ke všem klonům ze 193. fuze produkoval klon 196/CO a jeho subklon 196/AP2 FIX/FIXa-specifickou IgM protilátku, která dávala silnou chromogenní aktivitu i po kratší době inkubace.
U Evropské sbírky buněčných kultur (ECACC) byly v souladu s Budapešťskou smlouvou uloženy tyto buněčné linie: 98/B1 (č. ECACC 99090925); 98/A1 (č. ECACC 99090924); 98/BB1 (č. ECACC 99090926); 98/AO (č. ECACC 99121614); 196/C4 (č. ECACC 99121615); 198/D1 (č. ECACC 99121616); 198/T2 (č. ECACC 99121617); 198/G2 (č. ECACC 99121618); 198/AC1 (č. ECACC 99121619) a 198/U2 (č. ECACC 99121620).
Za účelem hlubší analýzy biochemických vlastností určitých protilátek byly expandovány homogenní hybridomové buněčné linie exprimující různé protilátky s aktivitou typu FVIII a použity k expresi daných protilátek ve větším měřítku (100 až 1000 ml). Tyto protilátky byly před použitím v dalších experimentech afinitně čištěny (viz příklad 3).
Příklad 3: Vazebné vlastnosti faktoru IX/FIXa^p) pro protilátky vykazující aktivační aktivitu FIX/FIXa
Faktor IX a obě aktivované formy FIX, FIXaa a FIXaP (FIX/FIXa<a>p))byly zředěny TBS (25 mM Tris HCI, 150 mM NaCl, pH 7,5) na konečnou koncentraci 2 pg/ml. Plotny Nunc Maxisorp pro ELISA byly povlečeny 100 pl roztoku FIX/FIXa<a,p) s použitím standardního postupu (4 °C, přes noc) a několikrát promyty TBST (TBS, 0,1 obj. % Tween 20). 50 μΐ hybridomového supematantu bylo v poměru 1:1 zředěno 50 μΐ TBST/2 % BSA a přidáno na povlečenou plotnu ELISA. Po 2 h inkubace při teplotě místnosti (room
99
9 9
9 • · tětt »999 » *
9 9
9 9 9 9
9 9 9 9
99 99
9»9 temperature, RT) byly plotny čtyřikrát promyty TBST a inkubovány (2 h, RT) se 100 μΙ/jamku anti-myší IgG (Fc-specifické) protilátky konjugované s peroxidázou (Sigma, #A0168) ve zředění 1:25000. Jamky byly pětkrát promyty TBST a nakonec obarveny 100 μΐ čerstvě připraveného barvicího roztoku (10 ml 50mM citrátu sodného, pH 5, doplněného 100 μΐ OPD (60 mg OPD/ml) a 10 μΐ 30% H2O2). Reakce byla zastavena přídavkem 50 ml H2SO4 a byla zaznamenána optická hustota při 492 nm a 620 nm pomocí odečítače mikrotitračních ploten Labsystems iEMS Reader MF™ s použitím software GENESIS™.
V určitých případech byla místo ELISA s anti-myším IgG provedena ELISA s antimyším IgM.
Čištění myšího IgG ze supernatantů kultury hybridomových buněk
Hybridomový supernatant (100 až 500 ml) byl doplněn pufrem 200 mM Tris/HCl (pH 7,0) a pevným NaCI na konečnou koncentraci 20 mM Tris, resp. 3 M NaCI. Pak byl supernatant vyčiřen odstředěním po dobu 10 min při 5500 x g. 1 ml afinitní chromatografická kolona s proteinem G (Protein G Sepharose Fast Flow, Amersham-Pharmacia) byla promyta 15 ml 20 mM Tris/Cl o pH 7,0 a pak ekvilibrována 10 ml 20 mM Tris/Cl pufru o pH 7,0 s obsahem 3 M NaCI. Na kolonu byl pak gravitačně nanesen hybridomový supernatant s obsahem 3 M NaCI. Kolona byla promyta 15 ml 20 mM Tris/Cl pufru, pH 7,0, s obsahem 3 M NaCI. Navázaný IgG byl pak eluován pomocí 12 ml pufru glycin/HCl o pH 2,8 a byly sbírány 1 ml frakce. Ke každé frakci bylo pro neutralizaci přidáno 100 μΐ 1 M Tris, pH 9,0. Frakce obsahující IgG byly identifikovány smísením 50 μΐ se 150 μΐ barvicího roztoku (BioRad koncentrát, zředěný 1:5 vodou) v jamkách mikroplotny. Pozitivní frakce byly spojeny a zkoncentrovány na 1 ml v ultrafiltračním zahušťovači (Centricon Plus 20, Amicon) podle pokynů výrobce. Koncentrát byl zředěn 19 ml TBS (20 mM Tris/Cl pufru o pH 7,0 s obsahem 150 mM NaCI) a znovu zkoncentrovány na 1 ml. Stupeň ředění-koncentrování byl ještě dvakrát opakován za účelem převedení IgG do TBS.
Čištění myšího IgM ze supernatantů hybridomových buněk
100 až 500 ml supernatantu kultury hybridomových buněk bylo zkoncentrováno na 5 až 10 ml buď ultrafiltračním zahušťovačem (Centricon Plus 20, Amicon) podle pokynů výrobce nebo srážením síranem amonným (nasycení 40 %, 0 °C) a opětným rozpuštěním koncentrátu v 5 až 10 ml TBS. V každém případě byl koncentrát dialyzován proti 20 mM
Tris/Cl pufru o pH 7,4 s obsahem 1,25 M NaCl a dále zahuštěn na 1 ml v ultrafiltračním zahušťovači Centricon Plus 20 (Amicon). IgM byl z tohoto koncentrátu čištěn pomocí přečišťovacího kitu ImmunoPure IgM (Pierce) podle pokynů výrobce. Frakce odebrané během eluce z kolony s maltózovým vazebným proteinem byly testovány na IgM, spojeny, zahuštěny a převedeny do TBS, jak je popsáno pro IgG.
Stanovení koncentrace IgG v čištěných preparátech
Celkový obsah IgG 280 nm - byla měřena extinkce příslušných ředění. E280 = 1,4 odpovídá 1 mg/ml proteinu.
IgG specifický pro faktor IXa (kvantitativní ELISA)
Jamky mikroplotny (Nunc Maxisorp) byly přes noc při 4 °C inkubovány s2 pg/ml faktoru IXa zředěného v TBS (25 mM Tris/HCl, pH 7,5, s obsahem 150 mM NaCl). Jamky byly čtyřikrát promyty TBST (25 mM Tris/HCl, pH 7,5, s obsahem 150 mM NaCl a 0,1 obj. % Tween 20). Jako standardní monoklonální AB byl použit HIX1 anti-FIX (přesný). Standard i vzorky byly zředěny TBST s obsahem 2 obj. % BSA. Standardní řada ředění a příslušná ředění vzorků byly inkubovány 2 h při teplotě místnosti na plotně ELISA. Plotny byly čtyřikrát promyty TBST a inkubovány (2 h, RT) se 100 μΙ/jamku anti-myší IgG (Fcspecifické) protilátky konjugované s peroxidázou (Sigma, #A-0168) ve zředění 1:25000. Jamky byly pětkrát promyty TBST a nakonec obarveny 100 μΐ čerstvě připraveného barvicího roztoku (10 ml 50mM citrátu sodného, pH 5, doplněného 100 μΐ OPD (60 mg OPD/ml) a 10 μΐ 30% H2O2). Reakce byla zastavena přídavkem 50 ml H2SO4 a po 30 min byla zaznamenána optická hustota při 492 nm a 620 nm pomocí odečítače mikrotitračních ploten Lab Systems iEMS Reader MF™ s použitím software GENESIS™.
Příklad 4: Protilátky anti-FIX/FIXa vykazující aktivitu typu FVIII v chromogenním testu
Několik hybridomových klonů produkujících protilátky anti-FIX/FIXa bylo až čtyřikrát subklonováno a vzniklá monoklonální hybridomová buněčná linie byla použita k získání supernatantu obsahujícího monoklonální protilátku. Protilátky isotypu IgG, odvozené z těchto supernatantů, byly čištěny na afinitních kolonách a dialyzovány proti TBS (viz výše). Protilátky IgM byly použity jako nečištěné frakce supernatantu. Se dvěma sadami reprezentativních protilátek byly provedeny tyto experimenty: 193/AD3 a 198/AC1/1 (isotyp • · ······ ·· ·· • · « ·· · · · · · • · · · · · · · · ······· · · · · · · · ···· ··· ··· · ·· · · ·· ·· · ·
IgG, protilátka 198/AC1/1 je preparát z původního hybridomového klonu 198/AC1, tj. kultivuje se (zmrazená) lékovka obsahující buňky 198/AC1 a získají se protilátky. Pro tyto experimenty se pak použije supernatant.) a 196/AF2 a 196/AF1 (isotyp IgM) (obr. 6A a 6B).
Stručně řečeno byly alikvoty 25 μΐ vzorku obsahujícího monoklonální protilátku (nečištěný hybridomový supernatant nebo, je-li to uvedeno, určité množství FIX specifické protilátky) přeneseny do jamek mikrotitračních ploten a zahřátý na 37 °C. Chromogenní substrát (S2222), syntetický inhibitor trombinu (1-2581), faktor (F) IXa a FX byly rekonstituovány ve sterilní vodě a FIXa/FX byl smísen s fosfolipidy podle pokynů dodavatele. Na každou reakci bylo smíseno 50 μΐ roztoku fosfolipid/FIXa/FX s 25 μΐ CaCl2 (25 mM) a 50 μΐ koktejlu substrát/inhibitor. K zahájení reakce bylo 125 μΐ tohoto premixu přidáno k roztoku monoklonální protilátky v mikrotitračních plotnách a inkubováno při 37 °C. V různých intervalech (5 min až 6 h) byla odečítána absorbance vzorků při 405 nm a 490 nm proti čistému reagentu (médium buněčné kultury místo hybridomového supematantu) pomocí odečítače mikrotitračních ploten Labsystems iEMS Reader MF™ s použitím software GENESIS™.
Časový průběh aktivity typu FVIII u monoklonálních protilátek 193/AD3 (isotyp IgG) a 196/AF2 (isotyp IgM) v porovnání s lidským FVIII (12 a 16 mU/ml), TBS a s médiem buněčné kultury je znázorněn na obr. 6A. Po lag fázi vyvolaly obě protilátky štěpení chromogenního substrátu, jak lze soudit ze vzrůstající optické hustoty naměřené při vlnové délce 405 nm.
Časový průběh aktivity typu FVIII u monoklonálních protilátek 198/AČ1/1 (isotyp IgG, 10 pg/ml) a 196/AF1 (isotyp IgM, nečištěný supernatant) v porovnání s lidským FVIII (16 mU/ml) a 10 pg/ml myšího IgG je znázorněn na obr. 6B. Po lag fázi vyvolaly obě protilátky štěpení chromogenního substrátu, jak lze soudit ze vzrůstající optické hustoty naměřené při vlnové délce 405 nm.
Příklad 5: Aktivita typu FVIII u anti-FIX/FIXa protilátek vytváří faktor Xa a je závislá na fosfolipidu, FIXa/FX a Ca2+
Aktivita faktoru VIII se obvykle stanovuje chromogenním testem a/nebo srážecím testem na bázi APTT. Oba typy testů jsou založeny na tvorbě faktoru Xa zprostředkované FVIIIa/FIXa. V případě chromogenního testu FVIII bude vznikající faktor Xa následně reagovat s chromogenním substrátem, což může být monitorováno spektroskopicky, například • · • ·· ·
v odečítači ELISA. Ve srážecím testu na bázi APTT se volný faktor Xa bude spojovat s FVa a na povrchu fosfolipidů v tzv. protrombinázovém komplexu a bude aktivovat protrombin na trombin. Trombin pak vyvolává tvorbu fibrinu a konečně vznik sraženiny. Základem obou zkušebních systémů je tvorba faktoru Xa komplexem FVHIa/FIXa.
Pro prokázání, aktivita typu FVIII, vyskytující se u anti-FIX/FIXa protilátek, skutečně generuje faktor Xa, byl proveden následující experiment. Několik 25 μΐ alikvotů nečištěného hybridomového supernatantu 196/AF2 (isotyp IgM) bylo přeneseno do jamek mikrotitrační plotny a zahřáto na 37 °C. Jako pozitivní kontrola bylo 16 mU Recombinate™ zředěno do hybridomového média (196 HM 007/99) a zpracováno přesně stejným způsobem jako hybridomový supernatant. Jako negativní kontrola bylo použito prázdné hybridomové médium. Chromogenní substrát (S-2222), syntetický inhibitor trombinu (1-2581), faktor IXa a FX byly rekonstituovány ve sterilní vodě a FIXa/FX byl smísen s fosfolipidy podle pokynů dodavatele. Pefabloc Xa®, faktor Xa-specifický proteinázový inhibitor (Pentapharm, Ltd.), byl rekonstituován vodou na konečnou koncentraci 1 mM/Ί, Na každou reakci bylo spojeno 50 μΐ roztoku fosfolipid/FIXa/FX s 25 μΐ CaCl2 (25 mM) a 50 μΐ koktejlu substrát/inhibitor trombinu. K zahájení reakce bylo 125 μΐ tohoto premixu přidáno ke vzorkům v mikrotitračních plotnách a inkubováno při 37 °C. Pokud je to uvedeno, bylo přidáno 35 μΜ Pefabloc Xa®. V různých intervalech (každých 5 min až 6 h) byla odečítána absorbance při 405 nm a 490 nm proti prázdnému reagentu (médium buněčné kultury) s použitím odečítače mikrotitračních ploten Labsystems iEMS Reader MF™ s použitím software GENESIS™.
Výsledky stimulace faktoru IXa aktivitou typu FVIII vykazovanou protilátkou IgM 196/AF2 anti-FIX/FIXa při tvorbě faktoru Xa, jak lze soudit ze snadno měřitelného štěpení chromogenního substrátu S-2222 (srv. „16 mU FVIII“ a „196/AF2“) je znázorněno na obr. 7A. Aktivita faktoru Xa je efektivně blokována FXa-specifickým inhibitorem „Pefabloc Xa®“ (srv. „196/AF2“ proti „196/AF2 35 μΜ Pefabloc Xa®“), což ukazuje, že byl skutečně generován FXa.
Stejný experiment byl proveden s použitím čištěných preparátů IgG klonu 198/AM1 (obr. 7B). Čištěný IgG byl zředěn TBS na konečnou koncentraci 0,4 mg/ml a 25 μΐ (tj. celkovou 10 pg), přenesen do jamek mikrotitrační plotny a zahřát na 37 °C. Jako pozitivní kontrola byl použit FVIII odvozený z 6 mU plasmy. 10 pg nespecifického myšího IgG (Sigma, 1-5381) sloužilo jako negativní kontrola. Test byl prováděn výše popsaným způsobem.
• · ······ ·· ·· • « 4 · · 4 4 4 4 4 ······· · «44 9 9 • · 9 9·· 9 · · • ·« A · · ·· ·· ···«
Další experimenty ukazují, že stimulace faktoru IXa aktivitou typu FVIII projevovanou IgG anti-FIX/FIXa protilátkou 198/AM1 generuje faktor Xa, jak lze soudit ze snadno měřitelného štěpení chromogenního substrátu S-2222 (obr. 7b). Faktor VIII a protilátka 198/AM1 opět generují FXa, který je efektivně blokován FXa specifickým inhibitorem „Pefabloc Xa®“. Jako negativní kontrola byl testován nespecifický myší IgG (Sigma. 15381).
V další sadě experimentů byla demonstrována závislost buď čištěných protilátek antiFIX/FIXa (IgM, obr. 8A) nebo nečištěných protilátek odvozených ze supernatantů buněčné kultury (IgG, obr. 8B) na přítomnosti fosfolipidů (PL), FIXa/FX a Ca2+. Jako kontrola byl použit myší IgG (obr. 8C). Aktivita typu faktoru VIII byla testována v podstatě výše popsaným způsobem. Kde je to uvedeno, byla z reakce vynechána buď směs FIXa/FX, PL nebo Ca2+. V různých intervalech byla odečítána absorbance vzorků při 405 nm a 490 nm proti prázdnému reagentu (pufr místo čištěné protilátky) v odečítači mikrotitračních ploten Labsystems iEMS Reader MF™. Výsledky jsou znázorněny na obr. 8A, 8B a 8C.
Závislost aktivity typu FVIII čištěné protilátky anti-FIXa 198/AC1/1 (isotyp IgG, koncentrace použitá v celém pokusu byla 10 μg/ml) na přítomnosti fosfolipidů (PL), FIXa/FX a Ca2+ je dále znázorněna na obr. 8a. Jak je snadno patrné, pouze v kompletním testu, zahrnujícím protilátku, PL, Ca2+ a FIXa/FX, dochází k přiměřené tvorbě FXa. Závislost aktivity typu FVIII supernatantu buněčné kultury obsahujícího nečištěnou protilátku isotypu IgM anti-FIX/FIXa (196/AF1) na přítomnosti fosfolipidů, FIXa/FX a Ca2+ je znázorněna na obr. 8B.
Opět, jak již bylo ukázáno pro čištěný preparát IgG (obr. 8A), protilátku 198/AC1/1, pouze kompletní test, zahrnující PL, Ca2+, FIXa/FX, poskytuje přiměřenou tvorbu FXa. K demonstraci specifity reakce byl za stejných podmínek, jaké jsou popsány výše, testován celkový IgG, připravený z normální myší plasmy. Výsledky jsou znázorněny na obr. 8C. nebylo možno detekovat žádnou aktivitu typu FVIII. Podle očekávání není žádná aktivita 'detekovatelná v nepřítomnosti fosfolipidů, FIXa/FX a Ca2+. Všechny experimenty byly prováděny na mikrotitrační plotně a OD405 byla snímána každých 5 min po dobu 6 h.
Příklad 6: Určité protilátky anti-FIX/FIXa jsou v přítomnosti FIXa prokoagulační
Během normální homeostázy dochází k počáteční aktivaci FIX buď prostřednictvím dráhy tkáňový faktor (TF)/faktor Víla nebo později aktivovaným faktorem XI (FXIa). Po fc »« · · · · fc· ·· • * · ····· • · ···· ··· ··· · ·· ·· ·· ···· aktivaci se FIXa spojuje na povrchu destiček v membránově vázaném komplexu s FVIII.
Faktor IXa sám o sobě má vůči FX nízkou nebo žádnou enzymatickou aktivitu, ale v přítomnosti FVIIIa se stává vysoce aktivním. Pro demonstraci, že určité protilátky antiFIX/FIXa mají aktivitu typu FVIII a tudíž jsou prokoagulační v lidské plasmě s deficitem FVIII, byl proveden následující experiment. Ve standardním jednostupňovém srážecím testu na bázi aPTT byla použita různá množství protilátky 193/AD3 nebo myšího IgG (jako kontrola). Stručně řečeno byly 100 μΐ vzorky obsahující protilátku inkubovány ve srážecím analyzátoru KC10A se 100 μΐ činidla DAPTTIN (činidlo PTT pro stanovení času aktivovaného tromboplastinu; IMMUNO AG). Kde je to uvedeno, bylo v reakční směsi zahrnuto celkem 50 ng aktivovaného FIX. Po 4 min inkubace byla zahájena reakce přídavkem 100 μΐ CaCl2 (25 mM). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1 a na obr. 9.
| srážecí čas (s) | ||
| mg AB | 193/AD3 | myší IgG |
| 9 | 101,6 | 102,5 |
| 4,5 | 95,6 | 103,2 |
| 2,25 | 93,1 | 103,2 |
| 1,8 | 93,7 | 101,9 |
| 1,35 | 91,4 | 103,4 |
| 0,9 | 94,4 | 102,2 |
| 0,45 | 98,1 | 101,9 |
| 0,34 | 97,1 | 103,9 |
| 0,23 | 99,3 | 103,7 |
Tabulka 1: Srážecí časy plasmy s deficitem FVIII ve srážecím pokusu na bázi APTT s použitím různých množství prokoagulantu (193/AD3) a kontrolní protilátky (myší IgG) v přítomnosti 50 ng aktivovaného FIX (0,01 U FIX). Molární poměr protilátky v reakci a aktivovaného FIX je 10:1. Molární poměr mezi protilátkou a celkovým FIX (FIX a FIXa za předpokladu, že lidská plasma s deficitem FVIII obsahuje 1 U (5 μg) FIX) se pohybuje mezi 6:1 (9 pg protilátky v reakci) a 1:6 (0,23 pg protilátky v reakci). Při optimálním zkrácení srážecího času je molární poměr mezi protilátkou a celkovým FIX 1:1. Srážecí čas bez přídavku FIX je v rozmezí 120 s.
444444 · 4 4 4 4 · • 4 4 4 4 ··· • •4 4 4· 44 4 4 4444
Obr. 9 graficky znázorňuje srážecí časy plasmy s deficitem FVIII ve srážecím testu na bázi aPTT s použitím různých množství prokoagulantu (193/AD3) a kontrolní (myší IgG) protilátky v přítomnosti 50 ng aktivovaného FIX. U vzorků doplněných protilátkou 193/AD3 došlo ke zřetelnému zkrácení srážecích časů v závislosti na dávce. Tyto výsledky implikují, že protilátka 193/AD3 je v přítomnosti FIXa prokoagulační.
Příklad 7: Protilátky anti-FIX/FIXa jsou prokoagulační v přítomnosti inhibitorů FVIII a FIXa
Vážnou komplikací standardní substituční terapie FVIII je vývin alloprotilátek zaměřených proti FVIII, vedoucích k neutralizaci FVIII a ke stavu, kdy se pacientova krev přestane srážet.
Pro demonstraci, že určité protilátky anti-FIXa mají aktivitu typu FVIII i v přítomnosti inhibitorů FVIII byl proveden následující experiment. Ve standardním jednostupňovém srážecím testu na bázi APTT byla použita různá množství protilátky 193/AD3 nebo jako kontrola myší IgG. Stručně řečeno byly vzorky 100 μΐ protilátky ve srážecím analyzátoru KC10A inkubováriy buď se 100 μΐ plasmy s deficitem FVIII (obr. 10A) nebo plasmy s inhibitorem FVIII (kapacita inhibitoru 400 BU/ml, obr. 10B) a rovněž se 100 μΐ činidla DAPTTIN. V reakční směsi bylo navíc obsaženo celkové množství 50 ng aktivovaného FIXa.
Po 4 min inkubace byla reakce zahájena přídavkem 100 μΐ CaCl2 (25 mM). K zajištění rovných podmínek byly experimenty s použitím plasmy s deficitem FVIII a plasmy s inhibitorem FVIII prováděny paralelně. Výsledky jsou znázorněny na obr. 10A a 10B. Jak je demonstrováno již v příkladu 6, došlo ke zřetelnému zkrácení srážecích časů v závislosti na dávce u vzorků doplněných protilátkou 193/AD3 v přítomnosti inhibitorů FVIII.
Příklad 8: Protilátky anti-FIX/FIXa jsou prokoagulační v přítomnosti defektního FVIII a FIXa
Pro demonstraci, že určité protilátky anti-FIXa mají v přítomnosti defektního FVIII aktivitu typu FVIII, je možno provést následující experiment. Ve standardním jednostupňovém srážecím testu na bázi aPTT se použijí vzrůstající množství protilátky 193/AD3 nebo jako kontrola myší IgG. V tomto srážecím testu se použije plasma pacienta s hemofilií A s velmi nízkou srážecí aktivitou v důsledku přítomnosti defektního FVIII (DF8).
Stručně řečeno se vzorky 100 μΐ protilátky inkubují ve srážecím analyzátoru KC10A buď se 100 μΐ plasmy DF8 nebo FVIII-deficitní plasmy a rovněž se 100 μΐ činidla DAPTTIN.
V reakční směsi je navíc obsaženo celkové množství 50 ng aktivovaného FIXa. Po krátké • · • φ »♦···· φφ φφ φ φ φ φ · inkubaci se zahájí reakce přídavkem 100 μΐ CaCl2 (25 mM). K zajištění rovných podmínek se experimenty s použitím FVIII-deficitní plasmy a plasmy DF8 provádějí paralelně.
Příklad 9: Protilátky anti-FIX/FIXa s prokoagulační aktivitou v přítomnosti FIXa rozlišují mezi lidským a hovězím FIXa
FIX/FIXa-specifické monoklonální protilátky vybrané ze 198. fuzního experimentu byly čištěny z příslušných hybridomových supernatantů a kvantifikovány způsobem popsaným v příkladu 3. Tyto protilátky byly analyzovány v modifikovaném jednostupňovém srážecím testu (jak je popsáno v příkladu 6) a některé vykázaly prokoagulační aktivitu.
, Chromogenní aktivita těchto preparátů protilátek byla, měřena v tomto kinetickém testu tvorby FXa: 10 pg monoklonální protilátky (ve 25 μΐ) bylo přeneseno do jamek mikrotitrační plotny a zahřáto na 37 °C. Chromogenní substrát (S-2222), syntetický inhibitor trombinu (1-2581), faktor IXa a FX byly rekonstituovány-ve sterilní vodě a FIXa/FX (oba hovězí) byly smíseny s fosfolipidy podle pokynů dodavatele. Na každou reakci bylo 50 μΐ roztoku fosfolipid/FIXa/FX spojeno s 25 μΐ CaCl2 (25 mM) a 50 μΐ koktejlu substrát/inhibitor. K zahájení reakce bylo 125 μΐ tohoto premixu přidáno k roztoku monoklonální protilátky v mikrotitračních plotnách a inkubováno při 37 °C. V různých časech (5 min až 2 h) byla odečítána absorbance vzorků při 405 nm proti prázdnému činidlu (25 ml TBS místo monoklonálních protilátek) s použitím odečítače mikrotitračních ploten Labsystems iEMS Reader MF™ s použitím software GENESIS™. Stejné reakce byly prováděny paralelně, avšak na každou reakci bylo přidáno 50 ng lidského FIXa. Protilátky, které vykazovaly prokoagulační aktivitu, neměly chromogenní aktivitu v případě bovinního FIX, ale vykazovaly vysokou aktivitu, když byl přítomen lidský FIXa.
Obr. 11 znázorňuje časový průběh aktivity typu FVIII, vykazované monoklonálními protilátkami 198/A1, 198/B1 a 198/AP1 s přídavkem (+) a bez přídavku (-) 50 ng lidského FIXap. Jako kontrola byl použit nespecifický polyklonální myší IgG. 198/A1 a 198/B1 vykazují prokoagulační aktivitu (podobnou jako 193/AD3 v příkladu 6), zatímco 198/AP1 ne. Protilátka 198/BB1 měla stejný vzorec aktivity (data neznázorněna).
Další monoklonální protilátky vybrané ze 198. fuzního experimentu zahrnují 198/D1 (ECACC č. 99121616), 198/T2 (ECACC č. 99121617), 198/G2 (ECACC č. 9912118), 198/U2 (ECACC č. 99121620).
«·· · • ·
Příklad 10: Struktura a prokoagulační aktivita derivátů protilátek odvozených z anti-FIX/FIXa protilátek; subklonování variabilních domén protilátek z hybridomových buněčných linií 193/AD3, 193/K2, 198/A1 a 198/B1 (klonAB2)
Postup klonování: Mesengerová RNA byla připravena z 1x106 hybridomových buněk příslušné buněčné linie (buď 193/AD3, 193/K2, 198/A1 nebo 198/B1 (klonAB2)) s použitím „QickPrep® Micro mRNA Purification Kit“ (Pharmacia) podle pokynů výrobce. Odpovídající cDNA byla získána retrotranskripcí mRNA s použitím „Ready-To-Go-YouPrime-First Strand Beads kit“ (Pharmacia) podle pokynů výrobce. Sekvence kódující těžké a lehké řetězce byly konvertovány na odpovídající cDNA s použitím sady primerů. K reverznímu přepisu mRNA specifické pro těžký řetězec (VH) byla použita ekvimolámí směs oligonukleotidů MOCG1-2FOR (5‘ CTC AAT TTT CTT GTC CAC CTT GGT GC 3‘) (SEQ ID NO 1), MOCG3FOR (5‘ CTC GAT TCT CTT GAT CAA CTC AGT CT 3‘) (SEQ ID NO 2) a MOCMFOR (5‘ TGG AAT GGG CAC ATG CAG ATC TCT 3‘) (SEQ ID NO 3) (RTmixl). V téže zkumavce byla syntetizována cDNA specifická pro lehký řetězec (VL) s použitím primerů MOCKFOR (5‘ CTC ATT CCT GTT GAA GCT CTT GAC 3‘) (SEQ ID NO 4).
Kódující sekvence pro VH byly amplifikovány pomocí PCR s použitím příměrových sad znázorněných na obr. 12 a specifické cDNA, odvozené zvýše uvedené reverzní transkripční směsi (RTmixl), jako templátu. Geny řetězce VK byly amplifikovány s použitím příměrových sad znázorněných na obr. 13 a také s použitím RTmixl jako templátu. VH-PCT produkt byl štěpen pomocí Sfil-AscI a vložen do vektoru pADP2 digerovaného Sfil-AscI (přístupové číslo GeneBank U35316). Takto získané konstrukty pDAP2-VH byly nazvány pDAP2-193AD3/VH, pDAP2-198Al/VH, pDAP2-198AB2/VH (odvozen z protilátky 198/B1) a pDAP2-193/K2/VH. Plasmidy pak byly štěpeny pomocí AscI-Notl a byl do nich vložen odpovídající PCR produkt genu VK digerovaný AscI-Notl. Výsledné vektory byly označeny pDAP2-193/AD3scFv, pDAP2-198/AlscFv, pDAP2-198/AB2scFv (odvozen z protilátky 198/B1) a pDAP2-193/K2scFv a kódují VH gen a VL gen monoklonálních protilátek 193/AD3, 198/A1, 198/AB2 (odvozené z protilátky 198/B1) a 193/K2. Těžké a lehké řetězce jsou spojeny kódující sekvencí na umělý ohebný linker (G4SGGRASG4S; Engelhardt a spol., 1994), což umožňuje expresi varianty scFv příslušné protilátky.
Na obr. 14 je znázorněna DNA a dedukovaná proteinová sekvence scFv odvozeného z hybridomové buněčné linie 193/AD3. Nukleotidy 1 až 357 kódují variabilní doménu těžkého řetězce, nukleotidy 358 až 402 umělý ohebný linker a nukleotidy 403 až 726 '/V.·· • · ··· · • ·· · variabilní region lehkého řetězce. Proteinová sekvence CDR3 regionu těžkého řetězce má sekvenci YGNSPKGFAY (SEQ ED NO 5) a je uvedena tučně. Je znázorněna umělá linkerová sekvence (G4SGGRASG4S).
Na obr. 15 je znázorněna DNA a dedukovaná proteinová sekvence scFv odvozeného z hybridomové buněčné linie 193/K2. Nukleotidy 1 až 363 kódují variabilní doménu těžkého řetězce, nukleotidy 364 až 408 umělý ohebný linker a nukleotidy 409 až 747 variabilní region lehkého řetězce. Proteinová sekvence CDR3 regionu těžkého řetězce má sekvenci DGGHGYGSSFDY (SEQ ID NO 6) a je uvedena tučně. Je znázorněna umělá linkerová sekvence (G4SGGRASG4S).
Na obr. 16 je znázorněna DNA a dedukovaná proteinová sekvence scFv odvozeného z hybridomové buněčné linie 198/AB2 (odvozené z protilátky 198/B1). Nukleotidy 1 až 366 kódují variabilní doménu těžkého řetězce, nukleotidy 367 až 411 umělý ohebný linker a nukleotidy 412 až 747 variabilní region lehkého řetězce. Proteinová sekvence CDR3 regionu těžkého řetězce má sekvenci EGGGFTVNWYFDV (SEQ ED NO 7) a je uvedena tučně. Je také znázorněna umělá linkerová sekvence (G4SGGRASG4S).
Na obr. 17 je znázorněna DNA a dedukovaná proteinová sekvence scFv odvozeného z hybridomové buněčné linie 198/A1. Nukleotidy 1 až 366 kódují variabilní doménu těžkého řetězce, nukleotidy 367 až 411 umělý ohebný linker a nukleotidy 412 až 747 variabilní region lehkého řetězce. Proteinová sekvence CDR3 regionu těžkého řetězce má sekvenci EGGGYYVNWYFDV (SEQ ID NO 8) a je uvedena tučně. Je znázorněna také! umělá linkerová sekvence (G4SGGRASG4S).
Příklad 11: Prokoagulační aktivita peptidů odvozených z CDR3 regionů anti-FIX/FIXa protilátek
V zásadě je možno molekulu protilátky považovat za biologický instrument prezentace kombinační řady peptidových prvků v trojrozměrném prostoru (viz Gao a spol., 1999, PNAS, 96:6025). proto může být protilátka (nebo derivát protilátky, například scFv, Fab atd.) použita buď jako nástroj pro detekci funkčně významných domén specifického cílového proteinu nebo na druhé straně pro vymezení aminokyselinových sekvencí specificky zprostředkujících určité interakce, tj. aktivaci nebo zvýšení aktivity FIXa vůči fyziologickému substrátu FX. Posledně uvedený proces vedl ke zhodnocení mnoha peptidických sekvencí odvozených z CDR3 regionu těžkého řetězce (CDR3h) jako prostředků pro posílení FIXa.
• ft
Zvýšení prokoagulační aktivity peptidů, které takovou aktivitu vykazují, může být provedeno obměnami sekvencí v regionech peptidů kritických pro zprostředkování zvýšení aktivity FIXa. Jako možný krok směrem k peptidickým sekvencím se zvýšenou prokoagulační aktivitou se mapuje vazebné místo protilátky, např. 198/A1 nebo 198/B1, na molekule FIXa s použitím sekvenčních porovnávacích analýz, kompetitivních vazebných testů, Westernových blottingových analýz a kompetitivních ELISA analýz. Protože krystalová struktura FIX je známa, použije se následně molekulární modelování ke zpřesnění polohy např. peptidů odvozených od 198/B1 ve vazebném místě 198/B1 lidského FIXa.
Na druhé straně, metodická mutační analýza dané peptidické sekvence, jako jsou peptidické sekvence odvozené zCDR3h 198/A1 nebo 198/B1, například „alaninová skanovací mutační analýza“, umožňuje identifikaci peptidických zbytků kritických pro prokoagulační aktivitu. Jinou možností zlepšení aktivity určité peptidické sekvence je použití peptidových knihoven v kombinaci s vysoce propustným screeningem.
Antigenové vazebné místo protilátky je odvozeno zjuxtapozice šesti „komplement určujících regionů (CDR)“ na N-terminálním konci dimeru VL-HL (nebo oblasti Fv). Příspěvek jednoho regionu CDR ke specificitě protilátky pro daný antigen se může značně lišit, ale obecně se má za to, že zvláštní vliv má CDR3 region těžkého řetězce (CDR3h), tzn. pro rozpoznání antigenu může být vysoce důležitá konkrétní proteinová sekvence regionu CDR3h. Uvádí se, že délka regionů CDR3h se značně liší a je v rozmezí 4 až 25 aminokyselin (Borreback, str. 16).
Dále je uveden příklad metodické mutační analýzy peptidických sekvencí. Ke zlepšení rozpustnosti/prokoagulační účinnosti peptidů odvozených z CD3 regionu anti-FIX/FIXa protilátek byly změněny jak N-terminální, tak C-terminální aminokyselinové sekvence. Kromě toho byla konstruována a analyzována řada mutovaných peptidů.
Princip této studie je dokumentován na řadě peptidů odvozených z regionu CDR3h protilátek 198/A1 a 198/B1. Původní peptid Al (viz tabulku 2) je odvozen z regionu CDR3h protilátky 198/A1 a peptid BI je odvozen z regionu CDR3h protilátky 198/B1 (viz příklad 10, obr. 16 a 17). Označení „pomíchaná verze“ znamená, že peptid má stejné aminokyseliny, ale v náhodném pořadí.
• a··
| peptid | sekvence | aminokyseliny | MW (D) | pí | poznámka |
| Al | EGGGYYVNWYFDV (SEQ ED NO 9) | (13 aa) | 1569 | 7,2 | snížená rozpustnost |
| Al/1 | VYGFGWGYEVNDY (SEQ ID NO 10) | (13 aa) | 1569 | 7,1 | pomíchaná verze Al |
| Al/2 | EEEEGGGYYVNWYFDEEE (SEQ ID NO 11) | (18 aa) | 2244 | 5,8 | kyselé pl, rozpustný |
| Al/3 | RRREGGGYYVNWYFDRRR (SEQ ED NO 12) | (18 aa) | 2407 | 9,9 | zásadité pl, rozpustný |
| Al/4 | EYGEGYGEVNEYDEFEWE (SEQ ED NO 13) | (18 aa) | 2244 | 5,8 | pomíchaná verze Al/2 |
| Al/5 | VRYRNRYRWGYRGRFGDE (SEQ ID NO 14) | (18 aa) | 2407 | 9,9 | pomíchaná verze Al/3 |
| Al/3- scr3 | RRRGEYGVYWNGDFYRRR (SEQ ID NO 15) | (18 aa) | 2407 | 9,9 | pomíchaná verze Al/3 |
| Al/3- Rd | RdRdRdEGGGYYVNWYFDRdRdRd (SEQ ID NO 16) | (18 a a) | 2407 | 9,9 | peptid Al/3, ale L-Arg nahrazen D- Arg |
| Al/83- Rd- srmb | RdRdRdGEYGVYWNGDFYRdRdRd (SEQ ED NO 17) | (18 aa) | 2407 | 9,9 | pomíchaná verze Al/3- Rd |
Tabulka 2, Seznam řady peptidů odvozených od protilátky 198/A1. Je uvedena délka peptidů (aa, počet aminokyselin), vypočtená molekulová hmotnost (MW, v daltonech (D)) a statistický isoelektrický bod (pl); D-Arg se zkracuje jako Rd.
V první sérii experimentů jsme zlepšili rozpustnost původní peptidické sekvence CDR3h (Al; EGGGYYVNWYFDV) odstraněním C-terminálního zbytku Val a přidáním několika zbytků s nábojem na N- i C-terminální konec peptidů. Vzniklé peptidy Al/2 (kyselý
pl), Al/3 (bazický pl) a jejich pomíchané verze Al/4, Al/5 a Al/3scr3 byly snadno rozpustné v různých tlumivých systémech při fyziologickém pH.
Za účelem analýzy aktivity typu FVIII (aktivace FIXa) u těchto peptidů byl vyvinut testovací systém, založený na komerčně dostupném FVIII testu (viz příklady 2 a 4). Základním principem je, že bez kofaktoru má FIXa velmi omezenou aktivitu vůči svému přirozenému substrátu FX. Pouze v přítomnosti látky s aktivačními vlastnostmi FIXa, tj. FVIII nebo látky vykazující aktivitu typu FVIII, je produkováno podstatné množství FXa štěpením FX přes komplex FIXa/aktivátor. Množství vznikajícího FXa se monitoruje na základě štěpení chromogenního substrátu. Princip revidovaného chromogenního testu je popsán pro dva reprezentativní peptidy: Al/3 a Al/5 (tabulka 2). Stručně řečeno byly alikvoty 25 pl zásobního roztoku peptidu (v imidazolovém pufru (IZ); 50 mM imidazolu, 100 mM NaCl, pH 7,2) přeneseny do jamek mikrótitrační plotny a ohřátý na 37 °C. Chromogenrií substrát FXa (S-2222), syntetický inhibitor trombinu (1-2581), hovězí FIXa a hovězí FX bylý rekonstituovány ve sterilní vodě a FIXá/FX byly smíseny s fosfolipidem podle pokynů dodavatele. Protože peptidy nereagují s hovězím FIXa (který se ve zkušebním kitu vyskytuje jako směs s hovězím FX), bylo přidáno 2,9 nM (ve většině případů 2,3 nM) lidského FIXa (ERL) (viz příklad 11, obr. 19).;Na každou reakci bylo 50 pl roztoku fosfolipid/FIXa/FX spojeno s25 pl CaCl2 (25 mM) a 50 pí koktejlu substrát/inhibitor. K zahájení reakce bylo k roztoku peptidu v mikrótitrační plotně přidáno 125 pl tohoto premixu a inkubováno při 37 °C. V různých časech (5 min až.2 h) byla odečítána absorbance vzorků při 405 nm a 490 nm proti prázdnému činidlu s použitím odečítače mikrotitračních ploten Labsystems iEMS Reader MF s použitím software GENESIS . Výsledky tohoto experimentu jsop znázorněny v příkladu 11 a na obr. 18. Peptid Al/3 v přítomnosti 2,9 nM lidského FIXa Vyvolával snadno měřitelnou tvorbu FXa, zatímco pomíchaná verze Al/5 byla inaktivní. Navíc při testování za srovnatelných podmínek neposkytl významnou chromogenní aktivitu ani kyselý peptid Al/2 ani pomíchané verze Al/4 a Al/3-scr-3 (data neznázorněná). Za účelem demonstrace, že peptid Al/3 jako základní protilátka 198/A1 nereaguje s hovězím FIXa a FX, byl proveden experiment znázorněný na obr. 19. Peptid Al/3 byl inkubován výše popsaným způsobem s (Al/3 (24 μΜ), +hFIXa) a bez (Al/3 (24 μΜ), bez hFIXa), 2,3 nM lidského FIXa (hFIXa). V kontrolním zařízení jsme k reakční směsi přidali prázdní ředicí pufr (IZ), doplněný 2,3 nM hFIXa. Jak je znázorněno na obr. 19, reakce probíhá pouze v přítomnosti lidského FIXa.
♦ fcfc* • · • · • · fc
* · · · · · · · • · · · fc · · • fcfcfc fcfc fcfcfcfc
Obr. 18 demonstruje chromogenní aktivitu typu FVIII peptidu Al/3 v přítomnosti 2,9 nM lidského FIXa (hFIXa). Pomíchaná verze peptidu Al/3, peptid Al/5, nevyvolává tvorbu FXa. Obr. 19 demonstruje závislost chromogenní aktivity typu FVIII peptidu Al/3 na přítomnosti lidského FIXa (hFIXa). V nepřítomnosti lidského FIXa peptid Al/3 nevyvolává tvorbu FXa. Kontrola, prázdný imidazolový pufr, je označena IZ.
Peptidy byly analyzovány rovněž na schopnost zkracovat dobu srážení u plasmy deficitní na FVIII. Jednostupňový srážecí test na bázi aPTT byl prováděn v podstatě tak, jak je popsáno (viz příklad 6). Srážecí časy (doba od zahájení reakce do vytvoření „sraženiny“ byly porovnávány buď proti FVIII, kontrolnímu pufru (IZ) nebo kontrolnímu peptidu (pomíchaná verze). Výsledky dvou typických srážecích experimentů, prováděných se dvěma různými činidly aPTT (DAPTTIN a Pathromtin SL) jsou uvedeny v tabulkách 3A a 3B.
| exp. 1 | konc. peptidu | bez FIXa (s) | bez FIXa (s) | průměr (s) | 2,2 nM FIXa (s) | 2,2 nM FIXa (s) | průměr (s) |
| IZ | 0 | 107,7 | 106,8 | 107 | 93,1 | 94,5 | 94 |
| Al/3 | 15 μΜ | 78,2 | 77,1 | 78 | 59,3 | 59,9 | 60 |
| 12,5 μΜ | 80,2 | 80,6 | 80 | 60,2 | 58,9 | 60 | |
| 7,5 μΜ | 97,8 | 97,9 | 98 | 73,1 | 72,7 | 73 | |
| 2,5 μΜ | 105,2 | 104,8 | 105 | 91,1 | 91 | 91 | |
| Al/3- scr3 | 15 μΜ | 122,5 | 122 | 122 | 106,1 | 105,5 | 106 |
| 12,5 μΜ | 116 | 117,6 | 117 | 103,1 | 104,5 | 104 | |
| 7,5 μΜ | 114,2 | 113,9 | 114 | 100,8 | 100,6 | 101 | |
| 2,5 μΜ | 107,8 | 107,4 | 108 | 96,3 | 95,2 | 96 |
·« tt··
4 · · 4 · * • » · · · · • · · 4 · · · · 4 4 4 4 4
44 4 · 4444
| exp. 2 | konc. peptidu | bez FIXa (s) | bez FIXa (s) | průměr (s) | 2,2 nM FIXa (s) | 2,2 nM FIXa (s) | průměr (s) |
| IZ | 0 | 111 | 109,7 | 110 | 94,7 | 95,5 | 95 |
| Al/3 | 12,5 μΜ | 83,6 | 85,5 | 85 | 56,7 | 56,7 | 57 |
| 10 μΜ | 79,1 | 78,5 | 79 | 63,1 | 62,5 | 63 | |
| 7,5 μΜ | 100,1 | 100,5 | 100 | 71,6 | 73,9 | 73 | |
| 5 μΜ | 103,4 | 104,8 | 104 | 77 | 76 | 77 | |
| 2,5 μΜ | 110,1 | 108,9 | 110 | 88 | 88,8 | 88 | |
| 1,25 μΜ | 108,7 | 109,3 | 109 | 90,7 | 90,8 | 91 |
Tabulka 3A. Srážecí aktivita peptidů Al/3 a Al/3-scr (pomíchaná verze Al/3) v plasmě deficitní na FVIII buď v přítomnosti nebo v nepřítomnosti („bez“) 2,2 nM lidského FIXa. Jsou uvedeny dva nezávislé reprezentativní experimenty (exp. 1 a exp. 2). Všechny srážecí experimenty byly prováděny dvojmo. Jsou uvedeny srážecí časy pro jednotlivé experimenty a průměrné srážecí časy v sekundách (s). Experimenty uvedené v tabulce 3 A byly prováděny s použitím aPTT činidla DAPTTIN (Baxter Hyland Immuno). Ve srovnání s pufrem jako kontrolou (IZ, imidazolový pufr) vyvolával peptid Al/3 způsobem závislým na dávce zkrácení srážecího času. Zkrácení srážecího času se značně zvýraznilo přídavkem 2,2 nM aktivovaného lidského FIX do reakční směsi. Pomíchaná verze peptidu Al/3, Al/3-scr-3, nevykazovala zkrácení srážecího času. V koncentraci na 2,5 μΜ se pomíchaný peptid stal inhibičníma vlastně srážecí čas prodlužoval, peptidy Al/1, Al/2, Al/4 a Al/5 neposkytly žádné zkrácení srážecího času, což ukazuje, že nemají prokoagulační aktivitu (data neznázorněna).
>· ·*·· » to to* toto • to · ·· · ···· • toto tototo «« ·
| konečná konc. | bez FIXa ω | bez FIXa (s) | průměr (s) | 2,2 nM FIXa (s) | 2,2 nM FIXa (s) | průměr (s) | |
| IZ | 0 | 131,8 | 132,1 | 132 | 107,9 | 108,7 | 108 |
| FVIII | 12,5 mU/ml | 68,9 | 69 | 69 | 52,9 | 53,6 | 53 |
| 6,25 mU/ml | 77,8 | 77,9 | 78 | 58,6 | 58,9 | 59 | |
| Al/3 | 15 μΜ | 152,8 | 149,3 | 151 | 75,4 | 75,2 | 75 |
| 10 μΜ | 135,7 | 134,6 | 135 | 76,2 | 79,8 | 78 | |
| 5 μΜ | 152,6 | 155,6 | 154 | 86,6 | 90,2 | 88 | |
| 1 μΜ | 138,3 | 138,8 | 139 | 103,7 | 105,9 | 105 |
Tabulka 3B. Srážecí aktivita peptidu A1/3 v plasmě deficitní na FVIII, kdy se jako činidlo aPTT použije Pathromtin SL (DADE Behring). Srážecí experimenty byly prováděny dvojmo, buď v přítomnosti nebo v nepřítomnosti („bez“) 2,2 nM lidského FIXa. Jsou uvedeny srážecí časy pro jednotlivé experimenty a průměrné srážecí časy v sekundách (s). Jako pozitivní, resp. negativní kontrola byl použit faktor VIII, resp. imidazolový pufr (IZ).
V kontrastu k experimentům uvedeným v tabulce 3 A byly experimenty uvedené v tabulce 3B prováděny s použitím aPTT činidla Pathromtin SL. V přítomnosti FIXa vyvolával peptid Al/3 způsobem závislým na dávce zkrácení srážecího času, zatímco v nepřítomnosti FIXa nebylo zkrácení srážecího času detekovatelné.
V další sérii experimentů jsme vytýčili zlepšení stability peptidu Al/3 v plasmě (například ochranu před proteolytickou degradací). Jeden přístup spočíval v náhradě N- a Cterminálních L-Arg zbytků zbytky D-Arg (reprezentované peptidy Al/3-rd a Al/3-Rd-srmb). Peptidy Al/3-rd a Al/3-Rd-srmb (pomíchaná verze peptidu) pak byly podrobeny analýze chromogenním testem a srážecím testem na bázi aPTT. Tyto experimenty ukázaly, že výměna koncových zbytků L-Arg za zbytky R-Arg nemění aktivitu typu FVIII, měřeno chromogenním testem, což ukazuje, že chiralita zbytků Arg nehraje v chromogenní aktivitě významnou roli (obr. 20). Navíc jednostupňová srážecí aktivita na bázi aPTT, i když byla poněkud snížena, zůstala detekovatelná (tabulka 4).
4 4* ·*·· ·* . >0
II * · 0 ···«· «·· · · * · '♦ · 9 ···« ··· ♦·♦· * • · ·»*· · · · ·«· · »· ·· ·* ·*«·
| konc. peptidu | bez FIXa (s) | bez FIXa (s) | průměr (s) | 2,2 nM FIXa (s) | 2,2 nM FIXa (s) | průměr (s) | |
| IZ | 0 | 110 | 109,1 | 110 | 96 | 96 | 96 |
| Al/3 | 15 μΜ | 77,8 | 78 | 78 | 56,1 | 55,5 | 56 |
| 12,5 μΜ | 99,4 | 100,5 | 100 | 65 | 68 | 67 | |
| 10 μΜ | 104,4 | 104,5 | 104 | 72 | 73,2 | 73 | |
| 7,5 μΜ | 105,2 | 105,2 | 105 | 80,7 | 80,5 | 81 | |
| 5 μΜ | 108,4 | 107,7 | 108 | 89,7 | 88,3 | 89 | |
| 2,5 μΜ | 107,9 | 107,6 | 108 | 93,6 | 93,3 | 93 | |
| 1,25 μΜ | 106,7 | 107 | 107 | 94,4 | 95 | 95 | |
| Al/3-Rd | 15 μΜ | 96,4 | 95,4 | 96 | 76,1 | 74,4 | 75 |
| 12,5 μΜ | 98 | 98,6 | 98 | 72,3 | 73,7 | 73 | |
| 10 μΜ | 93,5 | 95,8 | 95 | 74,2 | 77,2 | 76 | |
| 7,5 μΜ | 97,6 | 98,1 | 98 | 80,9 | 82,2 | 82 | |
| 5 μΜ | 99,2 | 99,1 | 99 | 86 | 85,1 | 86 : | |
| 2,5 μΜ | 102,7 | 103,4 | 103 | 94,4 | 94,7 | 95 | |
| 1,25 μΜ | 107,5 | 17,7 | 108 | 96,6 | 96 | 96 | |
| Al/3-Rd- srmb | 15 μΜ | 121,9 | 121,3 | 122 | 112,7 | 112,4 | 113 |
| 12,5 μΜ | 117,2 . | 118 | 118 | 108,1 | 107,8 | 108 | |
| 10 μΜ | 115,8 | 115,3 | 116 | 107,2 | 107,8 | 108 | |
| 7,5 μΜ | 114,666 | 113,6 | 114 | 107,6 | 106,6 | 107 | |
| 5 μΜ | 113,1 | 112,4 | 113 | 108,5 | 108,2 | 108 | |
| 2,5 μΜ | 111,9 | 111,9 | 112 | 105 | 104,2 | 105 | |
| 1,25 μΜ | 107,2 | 107,1 | 107 | 101,1 | 105,3 | 103 |
Tabulka 4. Jednostupňová srážecí aktivita peptidů Al/3, Al/3-Rd a Al/3-Rd-srmb (sekvence viz tabulka 2). IZ - pufr jako kontrola.
Obr. 20 demonstruje nezměněnou chromogenní aktivitu peptídu A 1/3-Rd. Peptidy v konečné koncentraci 12 μΜ nebo pufr jako kontrola (IZ) byly inkubovány v přítomnosti 2,3 nM lidského FIXa (+). Bylo zjištěno, že chromogenní aktivita peptidu Al/3 a Al/3-Rd je v podstatě nezměněná a poskytuje v chromogenním testu téměř identické výsledky. Pomíchaná verze peptidu Al/3, Al/5 stejně jako pufr nevyvolávaly významnou tvorbu FXa.
V další sérii experimentů jsme vytýčili stanovení individuální role jednotlivých aminokyselin sekvence peptidového jádra náhradou každého zbytku aminokyselinou alaninem (tabulka 5).
| peptid | sekvence | počet aminokyselin | MW (D) | pí | poznámka |
| Al/3 | RRREGGGYYVNWYFDRRR (SEQ ID NO 18) | (18 aa) | 2407 | 9,9 | zásaditý pí, rozpustný |
| Al/3-13 | RRRAGGGYYVNWYFDRRR (SEQ ID NO 19) | (18 aa) | 2349 | 10,4 | Ei-Ai |
| Al/3-1 | RRREAGGYYVNWYFDRRR (SEQ ID NO 20) | (18 aa) | 2421 | 9,9 | G2-A2 |
| Al/3-2 | RRREGAGYYVNWYFDRRR (SEQ ID NO 21) | (18 aa) | 2421 | 9,9 | G3-A3 |
| Al/3-3 | RRREGGAYYVNWYFDRRR (SEQ ID NO 22) | (18 aa) | 2421 | 9,8 | G4-A4 |
| Al/3-4 | RRREGGGAYVNWYFDRRR (SEQ ID NO 23) | (18 aa) | 2315 | 9,9 | y5-a5 |
| Al/3-5 | RRREGGGYAVNWYFDRRR (SEQ ID NO 24) | (18 aa) | 2315 | 9,9 | Y6-A6 |
»· ··· · « · • · ·
| Al/3-6 | RRREGGGYYANWYFDRRR (SEQ ED NO 25) | (18 aa) | 2379 | 9,9 | V7-A7 |
| Al/3-7 | RRREGGGYYVAWYFDRRR (SEQ ID NO 26) | (18 aa) | 2364 | 9,9 | Ns-As |
| Al/3-8 | RRREGGGYYVNAYFDRRR (SEQ ID NO 27) | (18 aa) | 2292 | 9,9 | W9-A9 |
| Al/3-9 | RRREGGGYYVNWAFDRRR (SEQ ID NO 28) | (18 aa) | 2315 | 9,9 | Y10-A10 |
| Al/3-10 | RRREGGGYYVNWYADRRR (SEQ ID NO 29) | (18 aa) | 2331 | 9,9 | Fii-An |
| Al/3-11 | RRREGGGYYVNWYFARRR (SEQ ID NO 30) | (18 aa) | 2363 | 10,5 | D12-A12 |
| Al/3- 12srmb | RRRYVYNGWGYFEGARRR (SEQ ED NO 31) | (18 aa) | 2363 | 10,4 | pomíchaná verze |
Tabulka 5. Jsou uvedeny peptidy určené k osvětlení role jednotlivých aminokyselin v sekvenci· peptidového jádra (E1G2G3G4Y5Y6V7N8W9Y10F11D12). Číselné indexy označují .polohu aminokyseliny v peptidu. Každá z aminokyselin byla postupně nahrazena alaninem, malou aminokyselinou bez náboje („alanine scan“). Jsou uvedeny rovněž délky peptidu (počet aminokyselin), vypočtená molekulová hmotnost (MW, vdaltonech (D)) a statistický isoelektrický bod (pí).
Každý z peptidů byl jednotlivě rozpuštěn v imidazolovém pufru (50 mM imidazolu, 100 mM NaCI, pH 7,2) a následně zředěn srážecím pufrem (50 mM imidazolu, 100 mM NaCI, 1 % lidského albuminu, pH 7,4) na požadovanou konečnou koncentraci. Peptidy byly analyzovány na chromogenní aktivitu a rovněž na schopnost snižovat srážecí čas v plasmě s deficitem FVIII. Jednostupňový srážecí test byl prováděn v podstatě výše popsaným způsobem (viz příklad 6). Srážecí časy (doba od zahájení reakce do vytvoření „sraženiny“) byly porovnávány buď proti pufru jako kontrole nebo proti kontrolnímu peptidu (pomíchaná verze). Některé z výsledků „alaninového skanování“ jsou uvedeny pro peptidy Al/3-2 a Al/33. Záměna G3-A3, jak je uvedena pro peptid Al/3-2, poskytuje v přítomnosti 2,2 nM lidského FIXa vysokou chromogenní aktivitu a silné snížení jednostupňového srážecího času (34 s při • · · · · · · ·· · « · · · · · · koncentraci 12,5 μΜ). Peptid Al/3-3 (G4-A4) vykazuje optimum chromogenní aktivity kolem konečné koncentrace 12 μΜ se sníženou aktivitou při vyšší nebo nižší koncentraci. Tento peptid je v jedno stupňovém srážecím testu poněkud inhibiční v nepřítomnosti FIXa při vyšších koncentracích (12,5 μΜ), ale v přítomnosti 2,2 nM FIXa se stává silně aktivním (31 s,
12,5 μΜ).
V další sérii experimentů jsme vytýčili stanovení individuální role jednotlivých aminokyselin sekvence peptidového jádra náhradou každého zbytku glutamovou kyselinou jako aminokyselinou (viz tabulka 6).
| peptid | sekvence | počet aminokyselin | MW (D) | Pí | poznámka |
| Al/3 | RRREGGGYYVNWYFDRRR | (18 aa) | 2407 | 9,9 | zásaditý pí, rozpustný |
| Al/3-22 | RRREEGGYYVNWYFDRRR (SEQ ID NO 32) | (18 aa) | 2479 | 9,5 | G2-E2 |
| Al/3-23 | RRREGEGYYVNWYFDRRR (SEQ ID NO 33) | (18 aa) | 2479 | 9,5 | G3-E3 |
| Al/3-24 | RRREGGEYYVNWYFDRRR (SEQ ID NO 34) | (18 aa) | 2479- | 9,5 | G4-E4 |
| Al/3-26 | RRREGGGEYVNWYFDRRR (SEQ ID NO 35) | (18 aa) | 2373 | 9,4 | y5-e5 |
| Al/3-27 | RRREGGGYEVNWYFDRRR (SEQ ID NO 36). | (18 aa) | 2373 | 9,4 | y6-e6 |
| Al/3-28 | RRREGGGYYENWYFDRRR (SEQ ID NO 37) | (18 aa) | 2437 | 9,5 | V7-E7 |
| Al/3-29 | RRREGGGYYVEWYFDRRR (SEQ ID NO 38) | (18 aa) | 2422 | 9,5 | Ng-Es |
| Al/3-30 | RRREGGGYYVNEYFDRRR (SEQ ID NO 39) | (18 aa) | 2350 | 9,5 | w9-e9 |
t
| Al/3-31 | RRREGGGYYVNWEFDRRR (SEQ ID NO 40) | (18 aa) | 2373 | 9,4 | Y10-E10 |
| Al/3-32 | RRREGGGYYVNWYEDRRR (SEQ ID NO 41) | (18 aa) | 2389 | 9,5 | Fii-En |
| Al/3-33 | RRREGGGYYVNWYFERRR (SEQ ID NO 42) | (18 aa) | 2421 | 9,9 | D12-E12 |
| Al/3- 34srmb | RRRGEYGEYWNGDFYRRR (SEQ ID NO 43) | (18 aa) | 2437 | 9,5 | pomíchaná verze |
Tabulka 6. Jsou uvedeny peptidy určené k osvětlení role jednotlivých aminokyselin v sekvenci peptidového jádra (E1G2G3G4Y5Y6V7N8W9Y10F11D12). Číselné indexy označují polohu aminokyseliny v peptidu. Každá z aminokyselin byía postupně nahrazena kyselinou glutamovou, záporně nabitou velkou aminokyselinou („glutamic acid scan“). Jsou uvedeny rovněž délky peptidů (počet aminokyselin), vypočtená molekulová hmotnost (MW, v daltonech (D)) a statistický isoelektrický bod (pí).
Každý z peptidů byl jednotlivě rozpuštěn v imidazolovém pufru (50 mM imidazolu, 100 mM NaCl, pH 7,2) a následně zředěn srážecím pufrem (50 mM imidazolu, 100 mM NaCl, 1 % lidského albuminu, pH 7,4) na požadovanou konečnou koncentraci . Peptidy získané pomocí „glutamic acid scan“ byly analyzovány na chromogenní aktivitu typu FVIII a rovněž na schopnost snižovat srážecí čas v plasmě s deficitem FVIII. Jednostupňový srážecí test byl prováděn v podstatě výše popsaným způsobem (viz příklad 6).
Peptid Al/3-24 vykazoval některé zajímavé vlastnosti. Molekula vykazovala v koncentracích mezi 6,5 μΜ a 12 μΜ vysokou chromogenní aktivitu typu FVIII, ale při vyšších koncentracích (až do 24 μΜ) aktivitu ztrácela. V nepřítomnosti lidského FIXa neměl tento peptid žádnou prokoagulační aktivitu, ale v přítomnosti 2, 2 nM hFIXa byl silně aktivní.
Ve druhé sérii experimentů jsme vytýčili zlepšení prokoagulační aktivity peptidické sekvence Bl, odvozené z CDR3H protilátky 198/B1. V prvním stupni jsme zlepšili rozpustnost původní peptidické sekvence (Bl; EGGGFTVNWYFDV) odstraněním Cterminálního zbytku Val a přidáním několika nabitých zbytků na N- i C-terminální konec peptidu. Vzniklé peptidy Bl/4, Bl/6 (kyselý pí), Bl/7 (bazický pí) a jejich pomíchané verze B1/5, B l/7scr3 jsou při fyziologickém pH snadno rozpustné v různých tlumivých systémech.
| peptid | sekvence | počet aminokyselin | MW (D) | Pí | poznámka |
| B1 | EGGGFTVNWYFDV (SEQ ID NO 44) | (13 aa) | 1491 | 6,0 | snížená rozpustnost |
| Bl/4 | REGGGFTVNWYFDR (SEQ ID NO 45) | (14 aa) | 1704 | 7,9 | rozpustný |
| Bl/5 | FGVGYRGETRNFDW (SEQ ID NO 46) | (14 aa) | 1704 | 8,0 | pomíchaná verze, rozpustný |
| Bl/6 | EEEEGGGFTVNWYFDEEE (SEQ ID NO 47) | (18 aa) | 2166 | 5,0 | kyselý pí, rozpustný |
| Bl/7 | RRREGGGFTVNWYFDRRR (SEQ ID NO 48) | (18 aa) | 2329 | 9,9 | zásaditý pí, rozpustný |
| Bl/7scr3 | RRRFGVGYGETNFDWRRR (SEQ ID NO 49) | (18 aa) | 2329 | 9,9 | zásaditý pí, rozpustný, pomíchaná verze |
Tabulka 7 představuje seznam řady peptidů odvozených od protilátky 198/B1. Jsou uvedeny rovněž délky peptidů (počet aminokyselin, aa), vypočtená molekulová hmotnost (MW, v daltonech (D)) a statistický isoelektrický bod (pí).
Peptidy Bl/4 a Bl/5 byly rozpustné v 50 mM Tris, 100 mM NaCl, pH = 6,5. Oba peptidy byly analyzovány chromogenním testem FVIII. Byla zjištěna určitá chromogenní aktivita u peptidu B1/4, ale ne u pomíchané verze B1/5 (data neznázorněna).
Poté byly analyzovány peptidy Bl/6, Bl/7 a Bl/7scr3. Každý peptid byl individuálně rozpuštěn v 50 mM imidazolu, 100 mM NaCl, pH 7,2, a pak ředěn buď ve srážecím pufru (50 mM imidazolu, 100 mM NaCl, 1 % lidského albuminu, pH 7,4) nebo v imidazolovém pufru na požadovanou konečnou koncentraci. Peptidy byly analyzovány na chromogenní aktivitu a na schopnost snižovat srážecí čas v plasmě s deficitem FVIII (tabulka 8 a 9). Jednostupňový • · · · srážecí test byl prováděn v podstatě výše popsaným způsobem (viz příklad 6). Srážecí časy (doba od zahájení reakce do vytvoření „sraženiny“) byly porovnávány buď proti pufru jako kontrole nebo proti kontrolnímu peptidu (pomíchaná verze).
Aktivita aktivující FIXa (aktivita typu kofaktoru FVIII) z peptidu Bl/7 byla ve výše opsaném chromogenním testu naměřena poprvé.
Jak je zobrazeno na obr. 21, přídavek 2,4 pM peptidu Bl/7 kreakční směsi vedl k dobře měřitelné tvorbě FXa. Naproti tomu přídavek 35 pM Pefabloc Xa, specifického inhibitoru proteázové aktivity FXa, vedl k významnému snížení štěpené reakce chromogenního substrátu (obr. 22), což demonstruje, že skutečně dochází k tvorbě FXa, zprostředkované peptidem-FIXa. Pokud se k reakční směsi nepřidal ani FIXa ani FX, syntéza FXa neprobíhala (obr. 22). Peptid Bl/6 ani kontrolní peptidy Bl/5 a Bl/7scr3 nevykazovaly žádnou aktivitu (data neznázoměna).
Obr. 21 demonstruje chromogenní aktivitu peptidu Bl/7. Peptid v konečné koncentraci 2,4 pM nebo pufr jako kontrola (IZ) byl inkubován v přítomnosti 2,3 nM lidského FIXa.
Na obr. 22 byl peptid Bl/7 v konečné koncentraci 2,4 pM nebo pufr jako kontrola (IZ) inkubován v přítomnosti 2,3 nM lidského FIXa (označeno buď „+2,3 nM hFIXa“ nebo „+“). Bylo zjištěno, že chromogenní aktivita peptidu Bl/7 je závislá na přítomnosti FIXa a FX, protože není detekovatelná žádná reakce, jestliže se FIXa a FX z reakční směsi vynechají (w/o FIXa/FX). pro potvrzení, že peptid Bl/7 skutečně zprostředkuje tvorbu FXa byl do reakční směsi přidán FXa specifický proteázový inhibitor Pefabloc Xa (35 pM Pefabloc Xa). Ve druhé sadě experimentů byl testován prokoagulační efekt peptidů Bl/6, B 1/7 a Bl/7scr3 vjednostupňovém srážecím testu na bázi aPTT. Experimenty byly prováděny v podstatě způsobem popsaným v příkladu 6. Výsledky jsou znázorněny v tabulkách 8 a 9.
βτ'3-?ί· • 4 4 · • ο • 4 ·
4 4
4*4 4
4 «44 4
4*44 ♦ 4 4 4
4 4 4 4
4 4 4 •4 44 4444
| peptid | 12,5 μΜ (-) | 1,25 μΜ (-) | 0,125 μΜ (-) | 12,5 ηΜ (-) | pufr (-) | poznámka |
| Bl/6 | 115 | 110 | 111 | 111 | 110 | |
| Bl/7 | 157 | 112 | 109 | 110 | 110 | |
| Bl/7scr3 | 115 | 105 | 106 | 105 | 107 |
Tabulka 8. Plasma deficitní na FVIII byla inkubována jednotlivě speptidem Bl/6, Bl/7scr3 nebo Bl/7 v nepřítomnosti aktivovaného lidského FIX. Jako negativní kontrola byl k deficitní plasmě přidán prázdný pufr. Jsou uvedeny srážecí časy pro jednotlivé kombinace. Za těchto podmínek se peptid Bl/7 ve své nejvyšší koncentraci (12,5 μΜ) stává inhibičním vůči procesu srážení, jak ukazuje prodloužený srážecí čas 157 sekund.
| peptid | 12,5 μΜ (+) | 1,25 μΜ (+) | 0,125 μΜ (+) | 12,5 nM (+) | pufr (+) | poznámka |
| Bl/6 | 103 | 100 | 101 | 100 | 100 | |
| Bl/7 | 83 | 92 | 99 | 99 | 100 | |
| Bl/7scr3 | 102 | 94 | 94 | 94 | 94 |
Tabulka 9. Plasma deficitní na FVIII byla inkubována jednotlivě speptidem Bl/6, Bl/7scr3 nebo Bl/7 v nepřítomnosti aktivovaného lidského FIX. Jako negativní kontrola byl k deficitní plasmě přidán prázdný pufr. Jsou uvedeny srážecí časy pro jednotlivé kombinace. V přítomnosti FIXa se peptid Bl/7 stává prokoagulačním, jak ukazuje snížený srážecí čas (83 sekund v porovnání se 102 sekundami pro pomíchaný peptid a 100 sekundami pro kontrolní pufr).
Příklad 12: Prokoagulační aktivita derivátů peptidů odvozených z CDR3 regionů antiFIX/FIXa protilátek v plasmě s inhibitorem FVIII
Pro zkoumání prokoagulační aktivity peptidu Al/3 v plasmě s inhibitorem FVIII byl proveden následující experiment, provedli jsme standardní jednostupňový srážecí test na bázi • · ♦ · aPTT, ale místo FV1II deficitní plasmy jsme použili plasmu s inhibitorem FVIII. Inhibiční schopnost plasmy byla 8,1 jednotek Bethesda na ml.
| konc. peptidů | bez FIXa (s) | bez FIXa (s) | průměr (s) | FIXa (s) | FIXa (s) | průměr (s) | |
| IZ | 0 | 104,8 | 103,6 | 104 | 94,2 | 94,1 | 94 |
| Al/3 | 12,5 μΜ | 85,8 | 85,3 | 86 | 61 | 60,2 | 61 |
| 10 μΜ | 88,4 | 87,9 | 88 | 61,3 | 61,8 | 62 | |
| 7,5 μΜ | 93,7 | 92,7 | 93 | 68,8 | 70,9 | 70 | |
| 5 μΜ | 101,5 | 101,1 | 101 | 81 | 82 | 82 | |
| 2,5 μΜ | 106,1 | 105,3 | 106 | 90,2 | 90,5 | 90 | |
| 1,25 μΜ | 104,5 | 104,3 | 104 | 91,3 | 91,4 | 91 |
Tabulka 10: K plasmě s inhibitorem FVIII byla (buď v přítomnosti 2,2 nM FIXa - „FIXa“ nebo v nepřítomnosti FIXa - „bez FIXa“) přidána různá množství peptidů Al/3 (12,5 μΜ až 1,25 μΜ). Jako negativní kontrola byl k plasmě přidán prázdný pufr (IZ). experimenty byly prováděny dvojmo a byl vypočten průměr, jsou uvedeny srážecí časy (v sekundách) jednotlivých kombinací. Je zřejmé, že peptid Al/3 zkracuje (způsobem závislým na dávce) srážecí čas plasmy s inhibitorem FVIII v přítomnosti FIXa, ale, i když v mnohem menším rozsahu, také v nepřítomnosti FIXa.
Příklad 13: Konverze 196/C4 IgM na IgGl
Protože některé protilátky IgM vykazují v chromogenních testech vysokou aktivitu typu FVIII, byly činěny pokusy tyto IgM protilátky převést na IgG protilátky (i když mohou vznikat i deriváty protilátek, jako je Fab, F(ab)2, scFv atd. Dále je podrobně popsáno získání genů variabilního regionu IgM. Nejprve byl opakovaným klonováním konstruován vektor pBax-IgGl (obr. 23) z vektoru pSI (Promega) a pEF/Bsd (Invitrogen). Z krve dárce se čistí Blymfocyty z těchto buněk se čistí maturovaná mRNA s použitím „micro-mRNA purification • · · · · ·
kit“ (Pharmacia). S použitím specifických primerů se pomocí „you-primefirst-strand-cDNA kit“ (Pharmacia) se připraví cDNA lidského kappa řetězce a lidského gamma 1 řetězce.
Kódující sekvence konstantní domény lidského lehkého kappa řetězce se z cDNA amplifikuje pomocí PCR s použitím specifických primerů.
Gen konstantního regionu lidského gamma 1 řetězce (CHl-hinge-CH2-CH3) se amplifikuje z cDNA pomocí PCR s použitím specifických primerů.
PCR produkt konstantní domény lehkého řetězce se digeruje s Xbal a Nhel a vloží se do digerovaného pSI. Vzniklý vektor se štěpí pomocí EcoRI a Xbal a vloží se tepelně hybridizované oligonukleotidy za vzniku vektoru pSI-Ckappa. Tepelně hybridizované oligonukleotidy poskytují vedoucí a Sacl-Xbal místa pro vložení variabilního regionu kappa řetězce. PCR produkt konstantního regionu lidského gamma 1 řetězce se digeruje s Spěl a BamHI a vloží do digerovaného pSI. Vzniklý vektor se štěpí pomocí Spěl a Notl a vloží se tepelně hybridizované oligonukleotidy za vzniku vektoru pSI-Cgamma. Tepelně hybridizované oligonukleotidy poskytují vedoucí a Xhol-BstEI místa pro vložení variabilního regionu těžkého řetězce, vektor pEF/Bad se digeruje s Nhel a Sfil, zarovná Klenowem a vloží se celá expresní kazeta pSI-Ckappa, vystřižená pomocí BglII a BamHI (po ošetření Klenowem). Vzniklý vektor se digeruje s EcoRI a HindlII a ošetří Klenowem. Pomocí BglII a BamHI se vystřihne celá expresní kazeta pSI-Cgamma a vloží se (po ošetření Klenowem). Vzniklý vektor se označuje pBax-IgGl.
Mezi místa Sacl-Xbal je možno vložit variabilní region lehkého řetězce za vzniku kompletní kódující sekvence lehkého kappa řetězce. Mezi místa Xhol-BstEI může být klonován variabilní region těžkého řetězce za vzniku kompletního genu těžkého řetězce IgGl. Oba otevřené čtecí rámce jsou exprimovány pod kontrolou promotoru SV40 a na 5‘ konci genů obsahují kódující sekvenci signálního peptidu pro sekreci těžkého a lehkého řetězce do endoplasmatického retikula. Transfekce do buněk COS umožňuje expresi IgGl se stejnými vazebnými vlastnostmi jako u původního IgM.
Dále se provede konstrukce plasmidu pBax-196/C4 amplifikací VH 196/C4 scFv (subklonováno způsobem popsaným v příkladu 10) pomocí PCR s použitím specifických primerů. PCR produkt se digeruje s Xhol a BstEII a vloží do pBax IgGl, digerovaného s Xhol a BstEII. VL 196/C4 se amplifikuje pomocí PCR s použitím specifických primerů. PCR produkt se digeruje s Sací a Xbal a vloží do pBax IgGl-VH, digerovaného s Sací a Xbal. Vzniklý vektor (pBax-196/C4) se transfektuje elektroporací do buněk COS a exprimují se
4* ···« ,« · a* » · · · * . . a a < · · · * * .* a a···»· · »«· » ·
A « ♦ · · 8.8 88 8 8 hybridní molekuly IgGl (myší variabilní region a lidský konstantní region) se stejnou specifitou jako u původního IgM.
Příklad 14: Aktivace amidolytické aktivity FIXa anti-FIXa protilátkami
Stručně řečeno bylo 20 μΐ faktoru IXa (obsahujícího 200 mU FIXa (Stago)) inkubováno při 37 °C s 200 μΐ reakčního pufru (50 mM TrisHCl pH 7,4, 100 mM NaCl, 5 mM CaCb a 40 % ethylenglykolu), 25 μΐ substrátu FIXa (CH3SO2-D-CHG-Gly-ArgpNA,AcOH, 10 μΜ/ml, Pentapharm LTD) v nepřítomnosti nebo přítomnosti různých množství anti-FIX protilátek 198/B1 (isotyp IgG) nebo 196/AF1 (isotyp IgM). Specifické štěpení FIXa substrátu bylo monitorováno v odečítači ELISA při 405 nm.
Přítomnost anti-FIX protilátek zvýšila amidolytickou aktivitu FIXa alespoň dvojnásobně.
Obr. 24 ukazuje zvýšení amidolytické aktivity FIXa v přítomnosti protilátky 198/B1 (obr. 24A) a protilátky 198/AF1 (obr. 24B).
Příklad 15: Aktivita typu FVIII vykazovaná fragmenty Fab odvozenými od anti-FIX/FIXa protilátek
Fab fragmenty anti-FIX/FIXa protilátek byly připraveny a čištěny podle standardních postupů. Stručně řečeno byl 1 ml protilátky 198/A1 (4 mg/ml v 50 mM imidazolu, 100 mM NaCl, pH 7,4) inkubován přes nocpři 37 °C s 87 μΐ fragmentačního pufru (IM Na acetát, 10 mM EDTA, 67,5 mg/ml L-cysteinu) a 0,25 mg papainu (mobilizovaného na agarózových kuličkách), preparát byl přefiltrován k odstranění papainu. Byl přidán L-histidin (konečná koncentrace 50 mM) a poté bylo pH upraveno na 7,0. Nakonec byl přidán pevný NaCl do konečné koncentrace 1 M.
Následně byl čištěn fragment 198/A1 vazbou na protein L: Použili jsme mobilizovaný protein L Plus ImmunoPure (Pierce) v koloně PHARMACIA XK 16/20 (objem gelu: 2 ml). Pufry pro chromatografii byly: 1) ekvilibrační pufr: 50 mM L-histidinu, pH 7,0, 1 M NaCl,
0,1 hm. % NaN3, 2) promývací pufr: 50 mM L-histidinu, pH 7,0, 0,1 hm. % NaN3, 3) eluční pufr: 100 mM glycinu, pH 2,5, 0,1 hm. % NaN3, 4) neutralizační pufr: 2 M Tris/Cl, pH 8,0.
Chromatografie byla prováděna v podstatě ve stupních 1 až 7, uvedených v tabulce 11.
Za účelem neutralizace nízkého pH elučního pufru bylo do frakcionačních zkumavek předloženo 0,2 ml Tris, pH 8,0.
·· • fc • fc • fc · • fcfc fc • fc · • fcfc • fcfc • · fcfcfcfc
| stupeň | pufr | průtok | objem | CV | frakce | |
| 1. | proplach kolony | eluční pufr | 2,0 ml/min | 10 ml | 5 | odpad |
| 2. | ekvilibrace | ekvilibrační | 2,0 ml/min | 10 ml | 5 | odpad |
| 3. | nástřik vzorku | vzorkový | 1,0 ml/min | xml | X | průtok |
| 4. | promytí 1 | ekvilibrační | 1,0 ml/min | 20 ml | 10 | průtok |
| 5. | promytí 2 | promývací | 1,0 ml/min | lOml | 5 | průtok |
| 6. | eluce | eluční | 1,0 ml/min | 15 ml | 7,5 | 1,0 ml frakce |
| 7. | neutralizace | promývací | 2,0 ml/min | 10 ml | 5 | odpad |
Tabulka 11
Konečný preparát 198/A1 Fab byl dialyzován proti 50 mM imidazoiu, 100 mM NaCl, pH 7,4 a analyzován v chromogenním testu FVIII výše popsaným způsobem (obr. 25). Ve srovnání sintaktní protilátkou má fragment 198/A1 Fab poněkud nižší aktivitu; Fab fragment však přesto vyvolává tvorbu FXa nezávisle na FIX. Obr. 25 demonstruje chromogenní aktivitu typu FVIII fragmentu protilátky 198/A1 Fab v přítomnosti 2,3 nM lidského FIXa. Jako pozitivní kontrolu jsme použili intaktní protilátku 198/A1 a 7,5 pM FVIIL Jako negativní kontrola byl použit pufr (IZ) místo 198/A1 Fab fragmentu nebo FVIII.
Příklad 16: Aktivita typu FVIII vykazovaná íuzními proteiny mezi scFv fragmenty antiFIX/FIXa protilátek a alkalickou fosfatázou E. coli.
Jednořetězcový fragment Fv (viz příklad 10) protilátky 198/B1 (subklon AB2) byl fúzován sN-koncem alkalické fosfatázy E. coli s použitím vektorového systému pDAP2 (Kerschbaumer a spol., 1996). Byly izolovány dva identické klony a označeny pDAP2198AB2#1 a pDAP2-198AB2#100 (obr. 26). Vzniklé fuzní proteiny byly exprimovány vE. coli, čištěny kovovou afinitní chromatografií (Kerschbaumer a spol., 1997) a analyzovány standardním chromogenním testem (obr. 27).
Obr. 27 demonstruje chromogenní aktivitu typu FVIII u dvou fuzních proteinů scFv fragment protilátky 198/B1 (subklon AB2) - alkalická fosfatáza (198AB2#1 a 198AB2#100) v přítomnosti 2,3 nM lidského FIXa. Jako pozitivní kontrolujeme použili 7,5 pM FVIII.
• Φ φφφφ
Příklad 17: Aktivita typu FVIII vykazovaná bivalentní miniprotilátkou.
Pro získání bivalentní miniprotilátky byl scFv fragment protilátky 198/B1 (subklon AB2) fúzován s amfipatickou helikální strukturou s použitím vektorového systému pZipl (Kerschbaumer a spol., Analytical Biochemistry 249, 219-227, 1997). Stručně řečeno byl gen scFv fragmentu 198/B1 izolován zplasmidu pDAP-198AB2#100 (příklad 16) digescí s Sfil a Notl. Fragment DNA byl gelově purifikován a vložen do vektoru pZipl digerovaného s Sfil/Notl. Vzniklý plasmid byl sekvenován a označen pZip-198AB2#102 (obr. 28). Paralelně jsme konstruovali verzi miniprotilátky z irelevantní monoklonální protilátky nazvané #8860. V prvním stupni byl sestaven jednořetězcový Fv fragment protilátky #8860 ve vektoru pDAP2. Klonování bylo prováděno v podstatě postupem popsaným v příkladu 10. Konstrukt byl označen pDAP2-8860scFv# 11 (obr. 29). Subklonováním scFv fragmentu obsaženého v pDAP2-8860scFv#l 1 do plasmidu pZipl (viz výše) vznikl konstrukt miniprotilátky p8860-Zip#1.2 (obr. 30). Protože protilátka #8860 nereaguje sFIX/FIXa (jak vyplývá z analýzy Westernovým blottingem a ELISA), představuje vhodnou negativní kontrolu. Následně byly v E. coli exprimovány proteiny miniprotilátky a čištěny z bakteriálních supernatantu vazbou na protein L tímto postupem: Pro afinitní chromatografii jsme použili mobilizovaný protein L Plus ImmunoPure (Pierce) v kolonách PHARMACIA XK 16/20 s objemem gelu 4 ml. Použité pufry byly: ekvilibrační pufr: 50 mM L-histidinu, pH 7,0, 1 M NaCl, 0,1 hm. % NaN3, promývací pufr: 50 mM L-histidinu, pH 7,0, 0,1 hm. % NaNs, eluční pufr: 100 mM glycinu, pH 2,5, 0,1 hm. % NaN3 a neutralizační pufr: 2 M Tris/Cl, pH 8,0.
Vzorky byly připraveny takto: Odstředěním bakteriální expresní kultury (11 000 x g, 4 °C, 10 min) byl získán supernatant bakteriální kultury, k 1 1 supernatantu bylo přidáno 470 g síranu amonného a roztok byl 1 h míchán na ledu k vysrážení proteinu. Sraženina byla 35 min při 2 °C peletována při 14 000 x g a znovu rozpuštěna ve 100 ml 20 mM Tris, pH 7,0. Koncentrát pak byl dialyzován proti 20 mM Tris, pH 7,0, byl přidán L-histidin do konečné koncentrace 50 mM a pH bylo upraveno na 7,0. Nakonec byl přidán pevný NaCl do konečné koncentrace 1 M. Přede nanesením na kolonu byl vzorek nejdříve 15 min odstřeďován při 16 000 x g při teplotě místnosti a pak přefiltrován přes sterilní filtr 0,45 pm.
Chromatografie byla prováděna v podstatě ve stupních 1 až 7, uvedených v tabulce 12. Za účelem neutralizace nízkého pH elučního pufru bylo do frakcionačních zkumavek předloženo 0,2 ml Tris, pH 8,0.
····*' · ··· · · • · · to · · · · • ·* ·· ·· to···
| stupeň | pufr | průtok | objem | CV | frakce | |
| 1. | proplach kolony | eluční pufr | 2,0 ml/min | 20 ml | 5 | odpad |
| 2. | ekvilibrace | ekvilibrační | 2,0 ml/min | 20 ml | 5 | odpad |
| 3. | nástřik vzorku | vzorkový | 1,0 ml/min | xml | X | průtok |
| 4. | promytí 1 | ekvilibrační | 1,0 ml/min | 40 ml | 10 | průtok |
| 5. | promytí 2 | promývací | 1,0 ml/min | 20 ml | 5 | průtok |
| 6. | eluce | eluční | 1,0 ml/min | 30 ml | 7,5 | 1,0 ml frakce |
| 7. | neutralizace | promývací | 2,0 ml/min | 20 ml | 5 | odpad |
Tabulka 12. Konečný preparát 198/B1 (subklon AB2) miniprotilátky (označený 198ABZip#102) a negativní kontrola 8860-Zip#1.2 byly dialyzovány proti 50 mM imidazolu, 100 mM NaCl, pH 7,4 a analyzovány v chromogenním testu FVIII výše popsaným způsobem (obr. 31).
Jak je z obr. 31 patrné, konstrukt miniprotilátky 198AB-Zip#102 vyvolává podstatnou tvorbu FXa (srv. s FVIII), zatímco miniprotilátka 8860-Zip#1.2 jako negativní kontrola nikoli.
Obr. 31 demonstruje chromogenní aktivitu typu FVIII miniprotilátky 198/B1 (subklon AB2) 198AB-Zip#102 v přítomnosti 2,3 nM lidského FIXa. Jako pozitivní kontrolu jsme použili 4,8 pM FVm, zatímco jako negativní kontroly sloužily nepříbuzná miniprotilátka (8860-Zip#l .2) a prázdný reakční pufr (IZ).
Příklad 18: Aktivita typu FVIII vykazovaná scFv fragmenty anti-FIXa/FIX protilátek
Byl exprimován jednořetězcový Fv fragment protilátky 198/B1 (subklon AB2) a scFv fragment protilátky #8860 s použitím vektorového systému pMycHisó. Vektor pMycHisó (obr. 32 a 33) byl konstruován štěpením vektoru pCOCK (Engelhardt a spol., 1994, Biotechniques, 17:44-46) pomocí Notl a EcoRI a vložením těchto oligonukleotidů: mychisóco: 5‘ ggccgcagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatggggcggcacatcaccatcaccatcactaataag 3‘ (SEQ ID NO 79) a mychis-ic: 5‘ aattcttattagtgatggtgatggtgatgtgccgccccattcagatcctcttctgag atgagtttttgttctgc 3‘ (SEQID NO 80).
Obr. 32 představuje schematické znázornění plasmidu pMyHisó. Sekvenční úsek cmyc se používá k detekci scFv fragmentu při analýze ELISA nebo Westernovým blottingem (Evan a spol., Mol. Cell Biol., 1985, 5(12), str. 3610-6). Sekvenční úsek His6 byl zahrnut pro usnadnění čištění scFv fragmentů chromatografií s kovovými ionty (Hochuli a spol., 1988, Bíotechnology, 6:1321-1325). Plasmid obsahuje PelB-vedoucí sekvenci promotoru lacZ genu (PlacZ) (viz legendu k obr. 26), počátek replikace E. coli (colElori) a počátek replikace fágu M13 (M13ori). Aby umožnil specifickou selekci, nese plasmid také gen pro enzym βlaktamázu (AmpR), zprostředkující rezistenci na antibiotikum ampicilin.
Gen 198/B1 (klon AB2)-scFv byl získán z plasmidu pDAP2-198AB2#100 (příklad 16) digescí s Sfil a Notl a byl vložen do pMycHisó, štěpeného pomocí Sfil/NotL Vzniklý plasmid byl označen pMycHis-198AB2#102. Obr. 34 znázorňuje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci 198AB2 scFv (napojeného na úseky c-myc a His6); vzniklý otevřený čtecí rámec expresního vektoru se nazývá pMycHis6-198AB2#102. Vektor pMYcHisó byl konstruován štěpením vektoru pCOCK (Engelhardt O. a spol., BioTechniques 17, 44-46, 1994) NotlEcoRI a vložením těchto tepelně hybridizovaných oligonukleotidů: 5‘-GGCCGCAGAACAA AAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATGGGGCGGCACATCACCATCACCATCACT AATAAG-3‘ (SEQ ID NO 103) a 5‘-TTATTAGTGATGGTGATGGTGATGT GCCGCCCCATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCTGC-3‘ (SEQ ID NO 104). Výsledný vektor, nazvaný pMycHisó, byl štěpen pomocí Sfil-Notl a do tohoto vektoru byl přenesen gen scFv 198AB2 z vektoru pDAP2-198AB2#100.
Analogicky ke konstruktu 198AB2 byl fragment #8860 scFv klonován z plasmidu označeného pDAP2-8860scFv klon 11. Čistý scFv protein ž #8860 byl označen 8860-M/H#4c (plasmid p8860-M/H#4c, obr. 35). Proteiny scFv byly exprimovány vE. coli a afinitně čištěny z bakteriálních supernatantů na kolonách s proteinem L (viz příklad 17). Konečné preparáty MycHisl98AB2#102 a 8860-M7H#4c byly dialyzovány proti 50 mM imidazolu, 100 mM NaCl, pH 7,4, a analyzovány v chromogenním testu FVIII, jak výše popsáno (obr. 36).
Jak je zřejmé z obr. 36, scFv konstrukt MycHis-198AB2#102 vyvolával podstatnou tvorbu FXa, zatímco negativní kontroly 8860-M/H#4c a prázdný reakční pufr nikoli.
Obr. 36 demonstruje chromogenní aktivitu typu FVIII u scFv fragmentu 198/B1 (subklon AB2) v přítomnosti 2,3 nM lidského FIXa. Jako pozitivní kontrolu jsme použili 4,8 • · · it 4000 • 0 »0
0 · · 0 · · ·* 0 0 0 ·· · 000009 · ··· · ·
4 0 9 · 000 • 00 0 9 000000 pM FVIII, zatímco nepříbuzný scFv (8860-M/H#4c) a prázdný reakční pufr (IZ) sloužily jako negativní kontroly.
Claims (24)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Protilátka nebo derivát protilátky proti faktoru IX/faktoru IXa, zvyšující prokoagulační aktivitu FIXa.
- 2. Protilátka nebo derivát protilátky podle nároku 1, kde tato protilátka nebo derivát protilátky zvyšuje prokoagulační aktivitu FIXa v přítomnosti inhibitorů FVIII.
- 3. Protilátka nebo derivát protilátky podle nároku 1, kde tato protilátka je vybrána ze skupiny zahrnující protilátky IgG, IgM, IgA a IgE.
- 4. Protilátka nebo derivát protilátky podle nároku 1, kde tato protilátka nebo derivát protilátky jsou vybrány ze skupiny zahrnující monoklonální protilátky, fragmenty protilátek, chimérické protilátky, humanizované protilátky, jednořetězcové protilátky, bispecifické protilátky, „diabodies“ a jejich di-, oligo- nebo multimery.
- 5. Derivát protilátky podle nároku 1, kde tento derivát protilátky zahrnuje peptid komplement určujícího regionu (CDR).
- 6. Derivát protilátky podle nároku 5, kde CDR peptidem je CDR3 peptid.
- 7. Derivát protilátky podle nároku 6, kde tento CDR3 peptid zahrnuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující: Tyr-Gly-Asn-Ser-Pro-Lys-Gly-Phe-Ala-Tyr; Cys-X-X-Tyr-Gly-Asn-Ser-Pro-Lys-Gly-Phe-Ala-Tyr-X-X-Cys, kdeX může být jakákoli požadovaná aminokyselina; Tyr-Gly-Asn-Ser-Pro-Lys-Gly-Phe-Ala-Tyr; Asp-Gly-Gly-His-Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Phe-Asp-Tyr; a Phe-Arg-Asn-Arg-Gly-Met-Thr-Ala-Leu-Leu-Lys-Val-Ser-Ser-Cys-Asp.
- 8. Protilátka nebo derivát protilátky podle nároku 1, kde variabilní region této protilátky nebo derivátu protilátky zahrnuje aminokyseliny 1 až 357 a/nebo aminokyseliny 403 až 726 podle obr. 14.• «· ·*»· ·· ·· * »· ····» ··· * · · ··»· · • ···» ··· • ·· ·♦ ·· ····
- 9. Protilátka nebo derivát protilátky podle nároku 8, kde tato protilátka nebo derivát protilátky navíc zahrnuje umělou linkerovou sekvenci.
- 10. Protilátka nebo derivát protilátky podle nároku 1, kde variabilní region této protilátky nebo derivátu protilátky zahrnuje aminokyseliny 1 až 363 a/nebo aminokyseliny 409 až 747 podle obr. 15.
- 11. Protilátka nebo derivát protilátky podle nároku 10, kde tato protilátka nebo derivát protilátky navíc zahrnuje umělou linkerovou sekvenci.
- 12. Protilátka nebo derivát protilátky podle nároku 1, kde variabilní region této protilátky nebo derivátu protilátky zahrnuje aminokyseliny 1 až 366 a/nebo aminokyseliny 412 až 747 podle obr. 16.
- 13. Protilátka nebo derivát protilátky podle nároku 12, kde tato protilátka nebo derivát protilátky navíc zahrnuje umělou linkerovou sekvenci.
- 14. Hybridomová buněčná linie, exprimující protilátku nebo derivát protilátky proti faktoru IX/faktoru IXa podle nároku 1.
- 15. Hybridomová buněčná line podle nároku 14, kde tato buněčná linie je vybrána ze skupiny zahrnující #196/AF1, #196/AF2, #193/AD3, #193/K2-1, #198/AC1/1, #198/AM1, #198/A1, #198/B1, #198/AP1, 198/A1, 198/B1, 198/BB1, 198/A1, 198/B1, 198/BB1.
- 16. Protilátka nebo derivát protilátky podle nároku 1, které jsou exprimovány hybridomovou buněčnou linií podle nároku 14.
- 17. Molekula DNA, kde tato molekula DNA kóduje protilátku nebo derivát protilátky podle nároku 1.
- 18. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že zahrnuje protilátku nebo derivát protilátky podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelný nosič.'944 909· • 4 90 9 00 9 99 9 9 999 0099 009 0 9 99 9 4 ···4 4 444 4444
- 19. Přípravek podle nároku 18, vyznačující se tím, že navíc zahrnuje faktor IXaa a/nebo faktor IXap.
- 20. Způsob léčení pacientů postižených poruchami srážlivosti krve, vyznačující se tím, že se pacientovi podává farmaceuticky účinné množství přípravku podle nároku 18.
- 21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že poruchy srážlivosti krve jsou vybrány ze skupiny zahrnující hemofilii A a hemoragickou diatézu.
- 22. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že dále zahrnuje stupeň výběru pacientů s inhibitorem hemofilie.
- 23. Způsob získávání protilátky nebo derivátu protilátky, které interagují s faktorem IX/faktorem IXa a zvyšují prokoagulační aktivitu faktorů IXa, vyznačující s e t í m, že- se imunokompetentní myš imunizuje antigenem vybraným ze skupiny zahrnující FIX, FIXaa, FIXaP nebo jejich fragmenty,- izolují se slezinné buňky imunizované myši,- produkují se hybridomové klony, supernatanty hybridomových buněk se podrobují screeningu na zvýšení prokoagulační aktivity faktoru IXa, izolují se a čistí protilátky nebo deriváty protilátek ze supernatantů hybridomových buněk, které vykazují zvýšení prokoagulační aktivity faktoru IXa.
- 24. Použití protilátky nebo derivátu protilátky podle nároku 1 ke zvyšování amidolytické aktivity faktoru IXa.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT0157699A AT411997B (de) | 1999-09-14 | 1999-09-14 | Faktor ix/faktor ixa aktivierende antikörper und antikörper-derivate |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2002935A3 true CZ2002935A3 (cs) | 2002-08-14 |
Family
ID=3516408
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2002935A CZ2002935A3 (cs) | 1999-09-14 | 2000-09-13 | Protilátky a deriváty protilátek k faktoru IX nebo faktoru IXa |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7033590B1 (cs) |
| EP (1) | EP1220923B1 (cs) |
| JP (2) | JP4313531B2 (cs) |
| CN (1) | CN1390258A (cs) |
| AT (2) | AT411997B (cs) |
| AU (1) | AU780775B2 (cs) |
| CA (1) | CA2384660A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ2002935A3 (cs) |
| DE (1) | DE60035356T2 (cs) |
| ES (1) | ES2288873T3 (cs) |
| HU (1) | HUP0203750A3 (cs) |
| PL (1) | PL354976A1 (cs) |
| RU (1) | RU2002109586A (cs) |
| SK (1) | SK3662002A3 (cs) |
| WO (1) | WO2001019992A2 (cs) |
Families Citing this family (52)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7563874B2 (en) | 1998-08-31 | 2009-07-21 | The Regents Of The University Of California | Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins |
| IT1306704B1 (it) * | 1999-05-26 | 2001-10-02 | Sirs Societa Italiana Per La R | Anticorpi monoclonali e suoi derivati sintetici o biotecnologici ingrado di agire come molecole antagoniste per il ngf. |
| AT411997B (de) * | 1999-09-14 | 2004-08-26 | Baxter Ag | Faktor ix/faktor ixa aktivierende antikörper und antikörper-derivate |
| US7297336B2 (en) * | 2003-09-12 | 2007-11-20 | Baxter International Inc. | Factor IXa specific antibodies displaying factor VIIIa like activity |
| WO2005035753A1 (ja) | 2003-10-10 | 2005-04-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 機能蛋白質を代替する二重特異性抗体 |
| JP5490734B2 (ja) * | 2003-10-10 | 2014-05-14 | 中外製薬株式会社 | 機能蛋白質を代替する二種特異性抗体 |
| JP5438880B2 (ja) * | 2003-10-10 | 2014-03-12 | 中外製薬株式会社 | 機能蛋白質を代替する二種特異性抗体 |
| EP2311945A1 (en) | 2003-10-14 | 2011-04-20 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Bispecific antibodies substituting for functional proteins |
| US10011858B2 (en) | 2005-03-31 | 2018-07-03 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association |
| EP2824183B1 (en) * | 2005-04-08 | 2020-07-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methods for producing bispecific antibodies |
| EP1760092A1 (en) * | 2005-08-26 | 2007-03-07 | Applied Research Systems ARS Holding N.V. | System for screening cells for high expression of a protein of interest |
| EP3345616A1 (en) | 2006-03-31 | 2018-07-11 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antibody modification method for purifying bispecific antibody |
| EP2006381B1 (en) | 2006-03-31 | 2016-02-03 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for controlling blood pharmacokinetics of antibodies |
| EP2101816B1 (en) | 2006-12-07 | 2013-08-14 | Novartis AG | Antagonist antibodies against ephb3 |
| EP2134749B1 (en) | 2007-03-22 | 2013-11-06 | The Regents of the University of California | Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins |
| EP4339294A3 (en) | 2007-09-26 | 2024-10-16 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in cdr |
| PT3078743T (pt) * | 2007-09-28 | 2020-07-15 | Portola Pharm Inc | Antídotos para inibidores do fator xa e métodos de utilização dos mesmos |
| AR071478A1 (es) | 2008-04-17 | 2010-06-23 | Baxter Healthcare Sa | Peptidos de bajo peso molecular con actividad procoagulante para el tratamiento de pacientes con deficiencia de factor v (fv), fvii, fviii, fx y/o fxi |
| WO2010014854A2 (en) | 2008-07-31 | 2010-02-04 | The Regents Of The University Of California | Antibodies that neutralize botulinum neurotoxins |
| JP2009292822A (ja) * | 2009-07-23 | 2009-12-17 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 機能蛋白質を代替する二種特異性抗体 |
| WO2011080322A1 (en) | 2009-12-30 | 2011-07-07 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Method of prognosing the outcome of acquired hemophilia and of treatment of hemophilia |
| WO2012047427A2 (en) | 2010-08-31 | 2012-04-12 | The Regents Of The University Of California | Antibodies for botulinum neurotoxins |
| US9334331B2 (en) | 2010-11-17 | 2016-05-10 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Bispecific antibodies |
| WO2012170969A2 (en) | 2011-06-10 | 2012-12-13 | Biogen Idec Ma Inc. | Pro-coagulant compounds and methods of use thereof |
| PL220297B1 (pl) * | 2012-11-07 | 2015-10-30 | Wrocławskie Ct Badań Eit & Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialności& | Epitop i jego zastosowanie |
| DK3050896T3 (da) | 2013-09-27 | 2021-07-19 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Fremgangsmåde til fremstilling af en polypeptid-heteromultimer |
| US10584147B2 (en) | 2013-11-08 | 2020-03-10 | Biovertiv Therapeutics Inc. | Procoagulant fusion compound |
| WO2015073587A2 (en) | 2013-11-18 | 2015-05-21 | Rubius Therapeutics, Inc. | Synthetic membrane-receiver complexes |
| MA40764A (fr) | 2014-09-26 | 2017-08-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité |
| TWI701435B (zh) | 2014-09-26 | 2020-08-11 | 日商中外製藥股份有限公司 | 測定ｆｖｉｉｉ的反應性之方法 |
| TWI700300B (zh) | 2014-09-26 | 2020-08-01 | 日商中外製藥股份有限公司 | 中和具有第ｖｉｉｉ凝血因子（ｆｖｉｉｉ）機能替代活性的物質之抗體 |
| JP2018518152A (ja) | 2015-03-27 | 2018-07-12 | ユニバーシティ オブ サザン カリフォルニア | 充実性腫瘍を処置するためのｌｈｒに指向されたｃａｒ ｔ細胞治療 |
| JP6843062B2 (ja) * | 2015-03-27 | 2021-03-17 | ユニバーシティ オブ サザン カリフォルニア | Ｃａｒ ｔ細胞免疫療法のための新規標的としてのｈｌａ−ｇ |
| JP7082484B2 (ja) | 2015-04-01 | 2022-06-08 | 中外製薬株式会社 | ポリペプチド異種多量体の製造方法 |
| WO2017115773A1 (ja) | 2015-12-28 | 2017-07-06 | 中外製薬株式会社 | Ｆｃ領域含有ポリペプチドの精製を効率化するための方法 |
| BR112018073660A2 (pt) | 2016-05-16 | 2019-02-19 | Baxalta Incorporated | anticorpos anti-fator ix pádua |
| SG11201901961SA (en) | 2016-09-06 | 2019-04-29 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Methods of using a bispecific antibody that recognizes coagulation factor ix and/or activated coagulation factor ix and coagulation factor x and/or activated coagulation factor x |
| CN110023339A (zh) * | 2016-09-23 | 2019-07-16 | Csl有限公司 | 凝血因子结合蛋白及其应用 |
| WO2018098363A2 (en) * | 2016-11-23 | 2018-05-31 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Bispecific antibodies binding to coagulation factor ix and coagulation factor x |
| AU2017383232B2 (en) | 2016-12-23 | 2024-09-12 | Novartis Ag | Factor XI antibodies and methods of use |
| WO2018141863A1 (en) | 2017-02-01 | 2018-08-09 | Novo Nordisk A/S | Procoagulant antibodies |
| GB201709970D0 (en) | 2017-06-22 | 2017-08-09 | Kymab Ltd | Bispecific antigen-binding molecules |
| MA50667A (fr) | 2017-09-29 | 2020-08-05 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Molécule multispécifique de liaison à l'antigène ayant une activité de substitution de la fonction de cofacteur du facteur viii de coagulation sanguine (fviii), et formulation pharmaceutique contenant ladite molécule en tant que principe actif |
| EP3713965A1 (en) * | 2017-11-22 | 2020-09-30 | Novartis AG | Reversal binding agents for anti-factor xi/xia antibodies and uses thereof |
| CN109837303A (zh) * | 2017-11-25 | 2019-06-04 | 深圳宾德生物技术有限公司 | 一种敲除pd1的靶向cd317的嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用 |
| CN109836496A (zh) * | 2017-11-25 | 2019-06-04 | 深圳宾德生物技术有限公司 | 一种靶向cd317的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用 |
| SG11202100418PA (en) * | 2018-08-01 | 2021-02-25 | Novo Nordisk As | Improved procoagulant antibodies |
| US11220554B2 (en) | 2018-09-07 | 2022-01-11 | Novo Nordisk A/S | Procoagulant antibodies |
| KR20210118085A (ko) | 2018-12-21 | 2021-09-29 | 키맵 리미티드 | 공통 경쇄를 갖는 ＦＩＸａｘＦＸ 이중특이적 항체 |
| JP2023512089A (ja) | 2020-01-30 | 2023-03-23 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | 二重特異性第ｖｉｉｉ因子模倣抗体 |
| CN116333145B (zh) * | 2023-04-14 | 2023-11-07 | 北京基科晟斯医药科技有限公司 | 结合活化凝血因子ix的抗体 |
| CN116120447B (zh) * | 2023-04-17 | 2024-09-06 | 北京纳百生物科技有限公司 | IFN-γ蛋白单克隆抗体及其应用 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT368883B (de) | 1980-07-22 | 1982-11-25 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung einer neuen blutgerinnungsfoerdernden praeparation auf basis von humanproteinen |
| US4873316A (en) | 1987-06-23 | 1989-10-10 | Biogen, Inc. | Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals |
| US5859205A (en) * | 1989-12-21 | 1999-01-12 | Celltech Limited | Humanised antibodies |
| WO1994005692A1 (en) * | 1992-08-27 | 1994-03-17 | Stichting Centraal Laboratorium Van De Bloedtransfusiedienst Van Het Nederlandse Rode Kruis | Antibodies specific for a haemostatic protein, their use for isolating intact protein, haemostatic compositions devoid of proteolytic cleavage products of the protein |
| DK128093D0 (da) * | 1993-11-12 | 1993-11-12 | Novo Nordisk As | Hidtil ukendte forbindelser |
| MA24512A1 (fr) | 1996-01-17 | 1998-12-31 | Univ Vermont And State Agrienl | Procede pour la preparation d'agents anticoagulants utiles dans le traitement de la thrombose |
| JP2002510321A (ja) * | 1997-07-03 | 2002-04-02 | スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション | 抗−第ＩＸ因子 Ｆａｂフラグメントの結晶構造およびペプチド模倣物デザインのための使用方法 |
| CA2341276C (en) * | 1998-08-28 | 2005-10-11 | Genentech, Inc. | Human anti-factor ix/ixa antibodies |
| AT411997B (de) * | 1999-09-14 | 2004-08-26 | Baxter Ag | Faktor ix/faktor ixa aktivierende antikörper und antikörper-derivate |
| US7297336B2 (en) * | 2003-09-12 | 2007-11-20 | Baxter International Inc. | Factor IXa specific antibodies displaying factor VIIIa like activity |
-
1999
- 1999-09-14 AT AT0157699A patent/AT411997B/de not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-09-13 ES ES00967666T patent/ES2288873T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-13 CN CN00815678A patent/CN1390258A/zh active Pending
- 2000-09-13 RU RU2002109586/13A patent/RU2002109586A/ru not_active Application Discontinuation
- 2000-09-13 JP JP2001523763A patent/JP4313531B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-13 SK SK366-2002A patent/SK3662002A3/sk unknown
- 2000-09-13 PL PL00354976A patent/PL354976A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2000-09-13 AU AU77759/00A patent/AU780775B2/en not_active Expired
- 2000-09-13 WO PCT/EP2000/008936 patent/WO2001019992A2/en active IP Right Grant
- 2000-09-13 EP EP00967666A patent/EP1220923B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-13 CA CA002384660A patent/CA2384660A1/en not_active Abandoned
- 2000-09-13 AT AT00967666T patent/ATE365799T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-09-13 DE DE60035356T patent/DE60035356T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-13 CZ CZ2002935A patent/CZ2002935A3/cs unknown
- 2000-09-13 HU HU0203750A patent/HUP0203750A3/hu unknown
- 2000-09-14 US US09/661,992 patent/US7033590B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2005
- 2005-03-28 US US11/093,103 patent/US7279161B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2005-12-28 JP JP2005380504A patent/JP2006111638A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2288873T3 (es) | 2008-02-01 |
| WO2001019992A2 (en) | 2001-03-22 |
| EP1220923B1 (en) | 2007-06-27 |
| DE60035356T2 (de) | 2008-02-14 |
| PL354976A1 (en) | 2004-03-22 |
| WO2001019992A3 (en) | 2001-09-27 |
| US7279161B2 (en) | 2007-10-09 |
| EP1220923A2 (en) | 2002-07-10 |
| AT411997B (de) | 2004-08-26 |
| US20050196397A1 (en) | 2005-09-08 |
| DE60035356D1 (de) | 2007-08-09 |
| SK3662002A3 (en) | 2002-07-02 |
| ATE365799T1 (de) | 2007-07-15 |
| ATA157699A (de) | 2004-01-15 |
| CA2384660A1 (en) | 2001-03-22 |
| AU7775900A (en) | 2001-04-17 |
| AU780775B2 (en) | 2005-04-14 |
| US7033590B1 (en) | 2006-04-25 |
| JP2003509049A (ja) | 2003-03-11 |
| RU2002109586A (ru) | 2004-03-10 |
| HUP0203750A3 (en) | 2005-01-28 |
| HUP0203750A2 (hu) | 2003-02-28 |
| JP4313531B2 (ja) | 2009-08-12 |
| CN1390258A (zh) | 2003-01-08 |
| JP2006111638A (ja) | 2006-04-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7033590B1 (en) | Factor IX/factor IXa activating antibodies and antibody derivatives | |
| AU2008351988B2 (en) | Anti-properdin antibodies | |
| EP2195024B1 (en) | Method of inhibiting complement activation with factor bb specific antibodies | |
| EP2321356B1 (en) | Monoclonal antibodies against tissue factor pathway inhibitor (tfpi) | |
| CZ299452B6 (cs) | Monoklonální, pozmenená, humanizovaná a chimerická protilátka a farmaceutický prostredek obsahujícípozmenenou protilátku | |
| EP1434802A1 (en) | Human tissue factor antibodies | |
| US9676842B2 (en) | Anti-properdin antibodies | |
| WO2004039842A2 (en) | Humanized tissue factor antibodies | |
| US20160002348A1 (en) | METHOD OF INHIBITING COMPLEMENT ACTIVATION WITH FACTOR Bb SPECIFIC ANTIBODIES AND USE THEREOF | |
| WO2020115281A1 (en) | Proteinaceous molecules binding factor ixa and factor x | |
| WO2020114615A1 (en) | Bispecific antibodies binding factor ixa and factor x | |
| WO2020114614A1 (en) | Proteinaceous molecules binding factor ixa and factor x | |
| JP6848016B2 (ja) | 組織因子経路インヒビター（ｔｆｐｉ）に対するモノクローナル抗体 | |
| JP2018038398A (ja) | 組織因子経路インヒビター（ｔｆｐｉ）に対するモノクローナル抗体 | |
| WO2020115283A1 (en) | Bispecific antibodies binding factor ixa and factor x | |
| JP2023106635A (ja) | 二重特異性抗原結合分子ならびに、それに関連する組成物、組成物の製造のための使用、キット、および方法 | |
| JP2018108089A (ja) | 組織因子経路インヒビター（ｔｆｐｉ）に対するモノクローナル抗体 |