CZ2002579A3 - Farmaceutický přípravek obsahující polypeptid BAFF-R - Google Patents

Description

Vynález se také týká použití činidel k léčení, potlačení nebo změně imunitní reakce, která zahrnuje signální dráhu mezi BAFF-R jeho ligandem, inhibice zánětů užitím protilátek specifických pro BAFF-R nebo jeho epitop.

Při léčebném využití vynálezu se podává terapeuticky účinné množství polypeptidu BAFF-R, chimérické molekuly obsahující polypeptid BAFF-R fúzovaný s heterologní aminokyselinovou sekvencí nebo homolog protilátky anti-BAFF-R.

Jiné provedení vynálezu se týká farmaceutického přípravku, který obsahuje polypeptid BAFF-R farmaceuticky přijatelný excipient.

Další provedení vynálezu poskytuje chimérickou molekulu, která obsahuje polypeptid BAFF-R fúzovaný s heterologním polypeptidem nebo aminokyselinovou sekvencí. Příkladem takové chimérické molekuly je molekula obsahující BAFF-R fúzovaný s úsekem Fc imunoglobulinů nebo se sekvencí značícího (tag) ·· ·· ·· • « · · * · · • · · · · • · · · · © • · · · · ···· ·· ···· epitopu.

Ještě další provedení vynálezu poskytuje protilátku, která se specificky váže na polypeptid BAFF-R. Tato protilátka je případně monoklonální protilátka.

Popis obrázků

Obrázek 1 ukazuje sekvenci nukleové kyseliny (SEKVENCE ID. Č. 2) cDNA humánního BAFF-R (BCMA) z ní odvozenou aminokyselinovou sekvenci (SEKVENCE ID. Č. 1) . Potenciální počátek translace je buďto nukleotid 219 nebo 228; doména bohatá na cystein (CRD) zahrnuje nukleotidy 240 až 341 ze SEKVENCE ID. Č. 2 (aminokyselinové zbytky 8-41 SEKVENCE ID. Č. 1); potenciální transmembránový úsek představují nukleotidy 375 až 459 SEKVENCE ID. Č. 2.

Obrázek 2 ukazuje sekvenci nukleové kyseliny (SEKVENCE ID. Č. 4) z ní odvozenou aminokyselinovou sekvenci (SEKVENCE ID. Č. 3) pJST538, plazmid kódující BAFF-R-Fc: nukleotidy 1-69, myší IgG-kappa signální sekvence; nukleotidy 70-222, BAFF-R (nukleotidy 1 až 153) ; nukleotidy 223 až 906,' humánní IgG.

Obrázek 3 ukazuje sekvenci nukleové kyseliny plazmidu pJST535, kódujícího úplný humánní BAFF-R odvozenou aminokyselinovou sekvenci.

Obrázek 4 ukazuje strukturní srovnání mezi TNF-R55 a BAFF-R.

Obrázek 5 ukazuje buňky 293EBNA transfekované buďto (a) CH269 (1,0 μ9) nebo (b) pJST535 (0,1 pg) , plazmidem exprimujícím úplný BAFF-R, a obarvené 0,5 μg/ml flag-hBAFF v testu na • ··

9 999 9 mikrodestičce.

Obrázek 6 (a) ukazuje FACS pokrytí buněk 293EBNA transfekovaných pJST535 a obarvených následovně: bez ligandu (černý histogram), 1 gg/ml flag-hCD40L (růžový) nebo flaghBAFF (zelený). Všechny vzorky pak byly barveny pomocí anti-flag M2 následované oslím anti-myším IgG jak je popsáno v příkladu 2.

Obrázek 6 (b) ukazuje FACS histogramy se statistickými daty z téhož experimentu. Barvení bylo následující: (1) nebarveno, (2) jen 7AAD, (3) 2. Krok a jen 7AAD, (4) 9 gg/ml flag-hBAFF, (5) 3 pg/ml flag-hBAFF , (6) 1 gg/ml flag-hBAFF, (7) 0,33 gg/ml flag-hBAFF, (8) 0,11 gg/ml flag-hBAFF, (9) flag-hCD40L 1 gg/ml.

Obrázek 7 ukazuje imunoprecipitace BAFF-R-Fc jak bylo popsáno v příkladu 4. Standardní molekulových hmotností v kDa je uveden na obrázku vlevo. Dráha (1) 12,5 ng flag-hTWEAK, (2)

12,5 ng flag-hBAFF, (3) imunoprecipitace flag-hBAFF s 0,5 ml BAFF-R-Fc upraveného média, (4) imunoprecipitace flaghTWEAK s 0,5 ml BAFF-R-Fc upraveného média, (5) imunoprecipitace bez ligandu s 0,5 ml BAFF-R-Fc imunoprecipitace flaghBAFF s 0,5 netransfekovaných 293EBNA, (7) imunoprecipitace flag-hTWEAK s 0,5 ml upraveného média z netransfekovaných 293EBNA.

upraveného média, (6) ml upraveného média z

Obrázek 8 ukazuje vynesení výsledků z proliferačního testu splenocytů, kde jsou impulzy za minutu (CPM) aktivity inkorporované do myších splenocytů vyneseny proti množství přidaného humánního BAFF ^g/ml).

Obrázek 9 ukazuje vynesení výsledků BAFF blokovacího testu,

kterým byla analyzována vazba BAFF na buňky Ráji, kde MFI (průměrná intenzita fluorescence) je vynesena proti množství R:hIgGl (ng/ml).

Obrázek 10(a) ukazuje vynesení exprese IgM proti CD1 ve FACS analýze pro Baff Tg myš, která dostala injekci h-Ig (střední panel) nebo hBCMA-Ig (spodní panel) a pro kontrolní myši divokého typu, které dostaly injekci PBS (horní panel), jak je popsáno v příkladu 11.

Obrázek 10(b) ukazuje vynesení exprese CD21 proti IgM ve FACS analýze, při vymezení vstupu pro IgD pozitivní populace u Baff Tg myší, které dostaly injekci h-Ig (střední panel) nebo hBCMA-Ig (spodní panel) a pro kontrolní myši divokého typu, které dostaly injekci PBS (horní panel), jak je popsáno v příkladu 11.

Obrázek 10 (c) ukazuje vynesení exprese CD21 proti IgM ve FACS analýze, při vymezení vstupu pro IgD pozitivní populace u Baff Tg myší, které dostaly injekci h-Ig (střední panel) nebo hBCMA-Ig (spodní panel) a pro kontrolní myši divokého typu, které dostaly injekci PBS (horní panel), 'jak je popsáno v příkladu 11.

Obrázek 11 ukazuje hmotnosti sleziny všech skupin Baff Tg myší (hmotnost je uvedena v mg +/- směrodatná odchylka).

Obrázek 12 ukazuje vynesení proteinurie (mg/dL) proti počtu injekcí u Baff Tg myší, kterým byl podáván PBS, hlg, hBCMA-Ig a u kontrolních myší.

Obrázek 13 ukazuje vynesení průměrné hodnoty průměrného to · • · ’ toto to <··· ·· · • to to · · to * · · • •to ·· ·· ·· ♦ ♦ ···· arteriálního tlaku (mmHg) u Baff Tg myší a kontrolních myší divokého typu.

Obrázek 14 ukazuje vynesení průměrného individuálního arteriálního tlaku (mmHg) u Baff Tg myší a kontrolních myší divokého typu.

Obrázek 15 ukazuje sloupcový graf procenta myší SNTF1, u kterých se projevila silná nefritida po podávání BAFF-R-Ig (BCMA-Ig), HulgG nebo PBS.

Obrázek 16 ukazuje celkový počet CDllc+ DC buněk (v milionech) u myší, kterým bylo podáváno in vivo 20 gg BCMA-Ig, 50 gg BCMAIg, HulgG nebo PBS. Vyšetřované buněčné populace CDllc+ DC byly: (1) CD8a- CD4-, (2) CD8a+ CD4-, and (3) CD8a-CD4+.

Definice

Termíny BAFF-R a BCMA užívané v popisu zahrnují nativní sekvence BAFF-R a varianty BAFF-R (které budou dále definovány). BAFF-R lze izolovat z různých zdrojů, jako např. z různých typů myších nebo humánních tkání nebo z dalších zdrojů, nebo může být připraven rekombinantními metodami nebo synteticky.

Termín nativní sekvence BAFF-R označuje polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci jako BAFF-R pocházeící z přírody. Taková nativní sekvence BAFF-R může být získána izolací z přírody nebo může být připraven rekombinantními metodami nebo synteticky. Patří sem také přirozeně se vyskytující zkrácené nebo secernované formy BAFF-R rozpustné formy obsahující např. sekvence [napr. extracelulární domény), přirozeně se vyskytující varianty (např.

·· • ·

- 10 alternativně sestřižené formy) a přirozeně se vyskytující alelické varianty BAFF-R. V jednom provedení vynálezu je nativní sekvence BAFF-R zralá nebo úplná nativní sekvence polypeptidu BAFF-R obsahující aminokyseliny 1 až 184 ze SEKVENCE ID. Č. 1 nebo fragment této sekvence.

Termín extracelulární doména BAFF-R nebo zkráceně BAFF-R ECD označuje formu BAFF-R, která je v podstatě bez transmembránové a cytoplazmatické domény BAFF-R. Obvykle, extracelulární doména BAFF-R obsahuje méně než 1% těchto transmembránových a cytoplazmatických domén, výhodně obsahuje

méně než 0,5%	těchto	domén. Případně BAFF-R ECD	obsahuj e
ami nokys e1i nové	zbytky	8 až 41 ze	SEKVENCE	ID.	Č.	1, nebo
ami nokys e1inové	zbytky	4 až 51 ze	SEKVENCE	ID.	Č.	1, nebo
aminokyselinové	zbytky	1 až 53 ze	SEKVENCE	ID.	Č	. 1. Ve
výhodném provedení	vynálezu	BAFF-R	ECD		obsahuj e
aminokyselinové	zbytky	1 až 51	ze SEKVENCE	ID.	v C. 1.
V dalším výhodném	provedení	BAFF-R	ECD		obsahuje
aminokyselinové	zbytky	1 až 50	ze SEKVENCE	ID.	v C. 1.

Odborníkovi je zřejmé, že transmembránové doména polypeptidu BAFF-R podle vynálezu je identifikována na základě kritérií rutinně užívaných v oboru pro identifikaci tohoto typu hydrofobní domény. Přesné hranice transmembránové domény mohou být různé, ale s velkou pravděpodobností se neliší o více než 5 aminokyselin na každém konci domény zde specificky uvedené. Takže BAFF-R ECD případně obsahuje aminokyseliny 8-41 (SEKVENCE ID. Č. 1).

Termín varianta BAFF-R označuje aktivní BAFF-R jak je definován dále mající alespoň 80% aminokyselinovou sekvenční identitu s dedukovanou aminokyselinovou sekvencí BAFF-R uvedenou zde jako SEKVENCE ID. Č. 1 pro úplnou nativní sekvenci BAFF-R nebo sekvenci BAFF-R ECD. K variantám BAFF-R patří např. polypeptidy BAFF-R, kde je přidán nebo odstraněn • 9 • · · · 1 • « · · · 9 · • 9 9 9 9 • 9 · 4 · » 99 jeden nebo více aminokyselinových zbytků na N-konci nebo C-konci SEKVENCE ID. Č. 1. Obvykle má varianta BAFF-R alespoň 80% nebo 85% aminokyselinovou sekvenční identitu, výhodněji alespoň 90% aminokyselinovou sekvenční identitu, a nejvýhodněji alespoň 95% aminokyselinovou sekvenční identitu s aminokyselinovou SEKVENCI ID. Č. 1.

Procenta (%) aminokyselinové sekvenční identity vzhledem k sekvencím BAFF-R zde popsaným jsou definováno jako procenta aminokyselinových zbytků v kandidátní sekvenci, které jsou identické s aminokyselinovými zbytky v sekvenci BAFF-R po srovnání sekvencí (aligning) a případném vložení mezer, pokud je to nezbytné pro dosažení maximálního procenta identity, přičemž konzervativní substituce se za součást sekvenční identity. Srovnání sekvencí stanovení procenta aminokyselinové sekvenční sekvenční nepovažuj i pro účely identity lze provést různými způsoby, které jsou odborníkům známy, např. užitím veřejně dostupných počítačových programů jako je BLAST, ALIGN nebo Megalign (DNASTAR) software. Odborník je schopen určit vhodné parametry pro vyhodnocení srovnání sekvencí a vhodný algoritmus pro dosažení nej lepšího srovnání celé délky srovnávaných sekvencí.

Termín označený epitop (epitope tagged) užívané v popisu chimérického polypeptidu obsahujícího BAFF-R, nebo sekvence jeho domén, fúzovaný se značkovacím polypeptidem (tag polypeptide). Značkovací polypeptid (tag polypeptide) je polypeptid obsahující dostatek aminokyselin na to, aby poskytl epitop, proti kterému může být připravena protilátka, nebo který lze identifikovat jiným činidlem, přičemž je dostatečně krátký, aby nenarušoval aktivitu BAFF-R. Značkovací polypeptid musí být také dostatečně unikátní, aby protilátka v podstatě nemohla zkříženě reagovat s jinými epitopy. Vhodný značkovací polypeptid obecně obsahuje alespoň 6 obecně

99 • 9 * · • · ♦ • · · • · · >9 9999 aminokyselinových zbytků, obvykle 8 až 50 aminokyselinových zbytků (výhodně přibližně 10 až 20 aminokyselinových zbytků).

Termín izolovaný, pokud jde o polypeptidy zde popsané, označuje polypeptid, který byl identifikován a separován a/nebo izolován ze svého přirozeného prostředí. Kontaminující složky v jeho přirozeném prostředí jsou takové materiály, které by rušily diagnostické nebo terapeutické využití polypeptidů a zahrnují enzymy, hormony, a další proteinové nebo neproteinové soluty. Ve výhodném provedení vynálezu je polypeptid purifikován (1) do stupně postačujícího k získání alespoň 15 zbytků N-konce nebo interní aminokyselinové sekvence pomocí rotačního sekvenčního zařízení (spinning cup sequenator), nebo (2) do homogenity užitím SDS-PAGE za redukujících nebo neredukujících podmínek a pomocí barvení Coomassie modří nebo výhodně stříbrem. K izolovaným polypeptidům patří polypeptidy in šitu v rekombinantních buňkách, kde je nepřítomna alespoň jedna složka přirozeného prostředí BAFF-R. Obvykle je však izolovaný polypeptid připraven alespoň jedním purifikačním krokem.

Termín protilátka se v předkládaném popisu užívá v nej širším smyslu a specificky zahrnuje jednoduché BAFF-R monoklonální protilátky (včetně agonistických, t antagonistických a neutralizačních protilátek) a anti-BAFF-R protilátkové přípravky s polyepitopickou specificitou. Termín * monoklonální protilátka označuje protilátky získané z populace v podstatě homogenních protilátek, tj . individuální protilátky tvořící populaci jsou identické s výjimkou možných přirozeně se vyskytujících mutací, které mohou být přítomny ve velmi malém počtu.

Termín purifikovaný preparát nebo v podstatě čistý preparát polypeptidů označuje polypeptid, který byl separován od jiných proteinů, lipidů a nukleových kyselin, se kterými se • ·· · ·· ·· ·♦ ·· · 4 ♦ · 4 4 · ♦ ··· 4 4 4 4 · · • · 4 · 4 · · 4 4 · 4 4 4 4 · «·· ·· ···· »4 ·4·4

- 13 přirozeně vyskytuje. Výhodně je polypeptid také separován od ostatních substancí jako jsou např. protilátky, nosiče apod., které byly užity k purifikaci.

Termíny léčení, ošetřování a terapie se užívají ve smyslu léčebného, profylaktického a preventivního působení.

Termíny peptidy, proteiny a polypeptidy jsou v popisu užívány zcela zaměnitelně.

Termín biologicky aktivní znamená v případě proteinu, že má in vivo nebo in vitro aktivitu, která působí přímo nebo nepřímo. Biologicky aktivní fragmenty BAFF-R mají např. 70% aminokyselinovou homologii s aktivním místem receptoru, výhodněji alespoň 80%, a nejvýhodněji alespoň 90% homologii. Identita nebo homologie vzhledem k receptoru je definována jako procento aminokyselinových zbytků v kandidátní sekvenci, které jsou identické se zbytky BAFF-R v SEKVENCI ID. Č. 1, nebo které jsou identické s aminokyselinovými zbytky definované části SEKVENCE ID. Č. 1.

Termín savec označuje jakékoliv zvíře klasifikované jako savec, jako je např. kráva, kůň, pes, myš a kočka, včetně člověka. Ve výhodném provedení vynálezu je savec člověk.

Při realizaci předkládaného vynálezu bylo využito, pokud není výslovně uvedeno jinak, standardních 'postupů buněčné biologie, buněčných kultur, molekulární biologie, transgenní biologie, mikrobiologie, rekombinantní DNA a imunologie, které jsou odborníkům známy. Tyto metody jsou dostatečně popsány v odborné literatuře.

Dále se popis týká výhodných provedení vynálezu. Vynález BAFF-R a molekul příbuzných BAFF-R pro použití k ovlivnění růstu a zrání B lymfocytů a sekrece imunoglobulinu. Vynález se dále týká BAFF-R a molekul příbuzných BAFF-R pro použití k ovlivnění reakce imunitního systému, což je nutné při φ · · » • ·· ·· ·♦ • ♦ φ * • ♦ · • · · • · · · φ · onemocněních souvisejících s imunitním systémem. Navíc se vynález týká léčení rakoviny a poruch imunity, kdy se při genové terapii užívá gen BAFF-R nebo gen příbuzný BAFF-R.

BAFF-R a jeho homology produkované hostitelem transformovaným sekvencí podle vynálezu, a také nativní BAFF-R purifikovaný odborníkovi známým způsobem, nebo připravený ze známé aminokyselinové sekvence, jsou užitečné při mnoha aplikacích jako jsou např. protirakovinné, protinádorové a imunoregulační aplikace. Jsou užitečné také při léčení dalších nemocí.

Další aspekt předkládaného vynálezu se týká použití polypeptidu kódovaného izolovanou nukleovou kyselinou kódující BAFF-R při antisense terapii. Termín antisense terapie označuje podávání nebo in šitu vytváření oligonukleotidů nebo jejich derivátů, které specificky hybridizují v buněčných podmínkách s buněčnou mRNA a/nebo DNA kódující požadovaný ligand, takže inhibují expresi kódovaného proteinu tím, že inhibují jeho transkripci a/nebo translaci. Vazba se může uskutečnit na základě konvenční komplementarity baží nebo např. v případě vazby na dvojšroubovici DNA prostřednictvím specifických interakcí v hlavním zářezu dvojšroubovice. Obecně se antisense terapie týká celé řady různých metod v oboru užívaných, a v podstatě zahrnuje veškerou terapii založenou na specifické vazbě k oligonukleotidovým sekvencím.

Antisense konstrukt podle předkládaného vynálezu může být podáván ve formě expresního plazmidu, který po transkripci v buňce vede k tvorbě RNA, která je komplementární k alespoň části buněčné mRNA kódující BAFF-ligand. Alternativně, antisense konstrukt je oligonukleotidová sonda připravená ex vivo. Takové oligonukleotidové sondy jsou výhodně modifikovány na oligonukleotidy, které jsou rezistentní k endogenním nukleázám a jsou tudíž stabilní in vivo. Příklady

Λ « • 4

4 4 » · · ·

4 4 4 4 4 4 4 44··

- 15 molekul nukleové kyseliny pro použití jako antisense oligonukleotidy jsou fosforamidátové, fosforothioátové a methylfosfonátové analogy DNA (viz např. patentové dokumenty USA č. 5,176,996; 5,264,564; and 5,256,775). Navíc obecné principy konstrukce oligomerů užitečných pro antisense terapii byly přehledně popsány např. V publikacích Van Der Krol et al., (1988) Biotechniques 6:958-976; Stein et al. (1988) Cancer Res 48: 2659-2668, které jsou zahrnuty formou odkazu.

BAFF-R podle předkládaného vynálezu je, jak již bylo uvedeno výše, člen rodiny receptorů TNF. Tento protein, jeho fragmenty nebo homology mají proti široké terapeutické a diagnostické aplikace.

Polypeptidy podle vynálezu specificky interagují s BAFF, polypeptidem dříve popsaným v patentové přihlášce W099/12964, která je zahrnuta formou odkazu. Zde popsané peptidy a způsoby umožňují identifikovat molekuly, které specificky interagují s BAFF-R nebo jeho fragmentem.

Některá provedení předkládaného vynálezu se týkají použití peptidů odvozených z BAFF-R, které mají schopnost vázat se na BAFF. Fragmenty BAFF-R mohou být připraveny různými způsoby, např. rekombinantní technikou, využitím PCR, proteolytickým štěpením nebo chemickou syntézou. Interní nebo terminální fragmenty polypeptidu mohou být připraveny odstraněním jednoho nebo více nukleotidů z jednoho nebo obou konců nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid. Exprese takto mutované DNA poskytuje polypeptidové fragmenty.

Chimérické molekuly podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny metodami, které jsou odborníkům známy. Podle vynálezu se zamýšlí použití chimérických molekul obsahujících BAFF-R polypeptid (nebo jeho variant) fúzovaný s heterologní aminokyselinovou sekvencí, jako je např. IgG Fc doména imunoglobulinu. Výhodně jsou takové chimérické molekuly

Β · • · 999 9

- 16 rozpustné a obsahují rozpustný polypeptid BAFF-R. Ve výhodném provedení chimérická molekula obsahuje aminokyselinové zbytky 1 až 50 ze SEKVENCE ID. Č. 1 fúzované s doménou Fc.

Polypeptidové fragmenty mohou být také připraveny chemickou syntézou užitím postupů, které jsou odborníkům známy, jako je např. obvyklá Merrifieldova metoda chemické syntézy na pevné fázi užívající f-moc nebo t-boc. Tak např. peptidy a DNA sekvence mohou být libovolně rozděleny na fragmenty požadované délky bez překrývání nebo na překrývající se fragmenty požadované délky. Tyto metody budou níže podrobněj i popsány.

Příprava rozpustných forem BAFF-R

Rozpustné formy BAFF-R jsou často signálně účinné a tudíž mohou být podávány jako léčiva, která napodobují přírodní membránové formy. Je možné, že BAFF-R podle vynálezu jsou v přírodě secernovány jako rozpustné cytokiny, avšak v případě, že ne, je možné podpořit sekreci tím, že se gen upraví metodami genového inženýrství. Pro vytvoření rozpustné secernované formy BAFF-R by se odstranil na úrovni DNA N-koncový transmembránový úsek a některé úseky tzv. stonku, a nahradily by se vedoucí sekvencí (leader) typu I, alternativně typu II, která by umožnila účinné proteolytické štěpení ve zvoleném expresním systému. Odborník může měnit rozsah ponechané stonkové oblasti v konstruktu pro sekreci, aby optimalizoval jak vazebné vlastnosti k ligandů tak i účinnost sekrece. Tak např. konstrukty obsahující všechny možné délky stonku, tj. sekvence zkrácené na N-konci, se mohou připravit tak, že vzniknou proteiny, které začínají aminokyselinou 1 až 51. Výsledkem takové analýzy je pak stanovení optimální délky stonkového úseku.

Ve výhodném provedení vynálezu rozpustný BAFF-R et • 4 4 4 <4 4 4 4 4 · • 444 44 · 44 · φ··· 4 · 4 4 ·

4 4 4 4 4 · 4 *·· ··· 4« 4444 44 4444

- 17 polypeptid je izolovaná nativní sekvence BAFF-R polypeptidů obsahující aminokyselinové zbytky 1 až 51 ze SEKVENCE ID. Č. 1 nebo fragment této sekvence; izolovaný BAFF-R polypeptid mající alespoň 80% (a výhodněji 90%) aminokyselinovou sekvenční identitu s nativní sekvencí BAFF-R polypeptidů obsahující aminokyselinové zbytky 1 až 51 ze SEKVENCE ID. Č. 1 nebo fragment této sekvence; izolovaný BAFF-R polypeptid obsahující aminokyselinové zbytky 8 až 41 ze SEKVENCE ID. Č. 1 nebo fragment této sekvence, a izolovaná nativní sekvence polypeptidů BAFF-R obsahující aminokyselinové zbytky 1 až 50 ze SEKVENCE ID. Č. 1 a nebo fragment této sekvence.

Příprava protilátek reaktivních s BAFF-R předkládaný vynález se týká také protilátek, které koreceptory. monoklonální (viz např.

specificky reagují s BAFF-R nebo jeho Anti-protein/anti-peptidové antisérum nebo protilátky se připravují standardními postupy

Antibodies: Laboratory Manual ed. by Harlow and Lané (Cold Spring Harbor Press: 1988)). Savci jako např. myš, křeček nebo králík, se imunizují imunogenní formou peptidu. K postupům, kterým se proteinu nebo peptidu udělí imunogenicita patří konjugace s nosičem a další metody, které jsou odborníkům známy.

Imunogenní část BAFF-R nebo jeho koreceptorů se podává společně s adjuvans. Postup imunizace je možné monitorovat měřením titru protilátek v plazmě nebo v séru. Pro stanovení hladiny protilátek lze využít standardní postup ELISA nebo jiný formát imunotestu s imunogenem jakožto antigenem.

Protilátky ve výhodném provedení vynálezu jsou protilátky imunospecifické pro antigenní determinanty BAFF-R nebo jeho koreceptorů, např. antigenní determinanty polypeptidů SEKVENCE ID. Č,l, nebo blízce příbuzného homologu humánní nebo φ ··«· 9· ·« ♦ · · · · · · • «·· · · · • · · · · · ·· ···· ·· ···· jiného savčího původu (např. se 70, 80 nebo 90% homologií, výhodněji s alespoň 95% homologií.). V dalším výhodném provedení vynálezu protilátky antiBAFF-R nebo anti-BAFF-koreceptor v podstatě zkříženě nereagují (tj. reagují jen specificky) s proteinem, který je méně než z 80 % homologní se SEKVENCÍ ID. Č. 1; výhodně méně než z 90 % homologní se

1; a nej výhodně ji méně než z 95 % homologní C. 1. Výrazem v podstatě zkříženě nereagují se míní to, že protilátka má vazebnou afinitu k nehomolognímu proteinu, která představuje méně než 10 %, výhodněji méně než 5 %, a ještě výhodněji méně než 1 % vazebné afinity k proteinu SEKVENCE ID. Č. 1.

SEKVENCI ID. C se SEKVENCÍ ID

Termín protilátka jak je užíván v předkládaném vynálezu zahrnuje také protilátkové fragmenty, které specificky reagují s BAFF-R, nebo jeho koreceptory. Protilátky lze fragmentovat konvenčními metodami, které jsou odborníkům známé, a pak testovat užitečnost fragmentů stejným způsobem, který byl výše popsán pro celé protilátky. Tak např. fragmenty F(ab')₂ se připravují působením pepsinu na protilátku. Vzniklé fragmenty F(ab')₂ mohou být ještě ošetřeny tak, že se redukují disulfidické můstky a vzniknou fragmenty Fab’. K protilátkám podle vynálezu patří také biospecifické a chimérické molekuly mající aktivitu anti-BAFF-R nebo anti-BAFF-koreceptoru. Jak monoklonální tak i polyklonální protilátky (Ab) namířené proti BAFF-R, a jeho koreceptorům, a také protilátkové fragmenty, jako je např. Fab¹ a F(ab')2, mohou být použity pro blokování působení BAFF-R a jeho případných koreceptorů.

Různé formy protilátek mohou být připraveny užitím standardních technik rekombinantní DNA (Winter and Milstein, Nátuře 349: 293-299 (1991), vloženo formou odkazu). Tak např. se mohou zkonstruovat chimérické protilátky, kde doména vázající antigen ze zvířecí protilátky je spojena s humánní • Φ ·« 99 99

9 · 9 9 9 9

9 9 9 9

9 9 9 9

99 9 9 9 9 99 9 9 konstantní doménou (viz např. Cabilly et al., Patent U.S. 4,816,567, vloženo formou odkazu). Chimérické protilátky mohou redukovat pozorovanou imunogenní reakci vyvolanou normálními zvířecími protilátkami při klinickém použití u lidí.

Navíc mohou být synteticky připraveny rekombinantní humanizované protilátky, které rozpoznávají BAFF-R nebo jeho koreceptory. Humanizované protilátky jsou chiméry, které obsahují většinu sekvencí humánního IgG, do kterých byly vloženy úseky zodpovědné za specifickou vazbu antigenu.

Požadovaným antigenem se imunizují zvířata, izolují se z nich odpovídající protilátky a vyjmou se části sekvencí variabilních úseků zodpovědné za specifickou vazbu antigenu. Úseky vázající antigen pocházející ze zvířete se pak klonují do odpovídajícího místa genu pro humánní protilátku, ze kterého byly úseky pro vazbu antigenu odstraněny. Humanizované protilátky minimalizují použití heterologních (mezidruhových) sekvencí v humánních protilátkách a tudíž je menší pravděpodobnost, že vyvolají imunitní reakci u léčeného pacienta.

Konstrukci různých tříd rekombinantních protilátek lze také provést přípravou chimérických nebo humanizovaných protilátek obsahujících variabilní domény a humánní konstantní domény (CH1, CH2, CH3) izolované z různých tříd imunoglobulinů. Tak např. protilátky se zvýšenou valencí vazebných míst pro antigen mohou být rekombinantně připraveny klonováním vazebných míst pro antigen do vektoru nesoucího úseky humánních konstantních řetězců (Arulanandam et al., J. Exp. Med., 177: 1439-1450 (1993), zahrnuto formou odkazu).

Navíc mohou být ke změně vazebné afinity rekombinantních protilátek s jejich antigeny užity standardní metody rekombinantní DNA, kterými se změní aminokyselinové zbytky v sousedství míst vázajících antigen. Vazebná afinita * ···· ** ·· ©· ·· ♦ · · · · · · © © · · ···© ©· · ©· · • · · · · · © · · · • ·«·· ··· ··· ··· ·· ·©·· 99 9999 humanizovaných protilátek k antigenu může být zvýšena mutagenezí založenou na molekulovém modelování (Queen et al. , Proč. Nati. Acad. Sci. 86: 10029-33 (1989), zahrnuto formou odkazu).

Příprava analogů: příprava změněných sekvencí DNA a peptidů

Analogy BAFF-R se mohou lišit od přirozeně se vyskytujícího BAFF-R v aminokyselinové sekvenci, nebo způsobem, který se netýká sekvence, nebo oběma způsoby.

K jiným než sekvenčním (nesekvenčním) modifikacím patří in vivo nebo in vitro chemická derivatizace BAFF-R.

K nesekvenčním modifikacím tedy patří, aniž by však výčet byl omezující, změny v acetylaci, methylaci, fosforylaci, karboxylací nebo glykosylaci.

K výhodným analogům patří BAFF-R a jeho biologicky aktivní fragmenty, jejichž sekvence se liší od sekvence uvedené zde jako SEKVENCE ID. Č. 1 jednou nebo více konzervativními aminokyselinovými substitucemi, nebo jednou nebo více nekonzervativními aminokyselinovými substitucemi, delecemi nebo inzercemi, které neruší aktivitu BAFF-ligandu.

Ke konzervativním substitucím typicky patří substituce jedné aminokyseliny jinou aminokyselinou, která má podobné vlastnosti, např. substituce v rámci následujících skupin aminokyselin: valin - glycin; glycin - alanin; valin isoleucin - leucin; kyselina asparagové - kyselina glutamová; asparagin - glutamin; serin - threonin; lysin - arginin; a fenylalanin - tyrosin.

Využití vynálezu

Úplný gen BAFF-R (SEKVENCE ID. Č. 2) nebo jeho část mohou být užity jako hybridizační sondy pro cDNA knihovny, např. k izolaci dalších genů, které mají požadovanou sekvenční • «·»· ·» ·· »· *· φ φ » Φφφφ φφφφ φφφφ φ · φφ* · • φφφφ φφφφ φ φ φφφφ φφφ φφφ φφφ φφ φφφφ φφ φφφφ identitu se sekvencí BAFF-R popsanou zde jako SEKVENCE ID. Č. 2. Nukleotidové sekvence kódující BAFF-R mohou být také užity ke konstrukci hybridizačních sond pro mapování genů, které kódující BAFF-R a pro genetické analýzy jedinců s genetickými poruchami.

Lze navrhnout testy pro screening sloučenin, které napodobují biologickou aktivitu BAFF-R. K takovým, screeningovým metodám patří testy, které umožňují vysokokapacitní screening chemických knihoven a jsou tudíž zvláště vhodné k identifikaci malých molekul jakožto kandidátních léčiv. K uvažovaným malým molekulám patří syntetické organické nebo anorganické sloučeniny. Nukleové kyseliny kódující BAFF-R nebo jeho modifikované formy se mohou také užít pro přípravu transgenních zvířat nebo zvířat s vyřazenou funkcí daného genu (knock out), která jsou zase užitečná při screeningu a vývoji terapeuticky užitečných agens.

Jedno provedení vynálezu se týká stimulace růstu B lymfocytů, růstu a zrání B lymfocytů indukovaného dendritickými buňkami nebo produkce imunoglobulinu u zvířat užitím polypeptidu BAFF-R, a nebo kostimulace růstu B lymfocytů, růstu a zrání B lymfocytů indukovaného dendritickými buňkami nebo produkce imunoglobulinu u zvířat užitím polypeptidu BAFF-R a anti-T protilátek, CD40 ligandu nebo anti-CD40 ligandu. Týká se také inhibice růstu B lymfocytů, růstu a zrání B lymfocytů indukovaného dendritickými buňkami nebo produkce imunoglobulinu u zvířat užitím polypeptidu BAFF-R.

V jiném provedení se vynález týká BAFF-R pro použití k léčení autoimunitních poruch, hypertenze, kardiovaskulárních onemocnění, onemocnění ledvin, lymfoproliferativních onemocnění B lymfocytů, imunosupresivních onemocnění, « «··· ·· ·· »» »· • β * »··« ···« • ··> · · · β » · • ···· ···· · • ···· ··· ··« »·· » ·<··· »· ····

- 22 transplantací orgánů, zánětlivých onemocnění a také HIV. Patří sem i použití jakožto činidla k léčení, potlačení nebo změně imunitní reakce na které se podílí signální dráha mezi BAFF-R a jeho ligandem.

V jiném provedení vynález poskytuje farmaceutický přípravek obsahující polypeptid BAFF-R a farmaceuticky přijatelné excipienty. K vhodným nosičům pro polypeptid BAFF-R a jeho přípravky patří např. excipienty popsané v publikaci Remington's Pharmaceutical Sciences (16th ed., 1980, Mack Publishing Co., edited by Oslo et al.) Typicky se užívá vhodné množství farmaceuticky přijatelné soli, aby byl přípravek isotonický. K příkladům vhodných nosičů patří pufry jako rozoky solí, Ringerův roztok a roztok dextrózy. pH roztoku je výhodně 5 až 8, výhodněji 7,4 až 7,8. K dalším vhodným nosičům patří prostředky pro prodloužené/řízené uvolňování léčiva jako je semipermeabilní matrix z pevných hydrofobních polymerů, která je např. ve formě liposomů, filmů nebo mikročástic. Odborníkovi je zřejmé, že některé nosiče mohou být výhodnější v závislosti na určitém způsobu podávání koncentraci podávaného polypeptidu BAFF-R.

Podávání přípravků podle vynálezu se provádí např. injekcí (např. intravenózní, intraperitoneáíní, subkutánní, intramuskulární) nebo jinými způsoby jako je např. infúze, která zajistí podání v účinné formě do krevního oběhu.

Při realizace předkládaného vynálezu byly užity, pokud není výslovně uvedeno jinak, standardní postupy buněčné biologie, buněčných kultur, molekulární biologie, transgenní biologie, mikrobiologie, rekombinantní DNA a imunologie, které jsou odborníkům známy. Tyto metody jsou dostatečně popsány v odborné literatuře, viz např. Molecular Cloning: Laboratory Manual, 2nd edition. (Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds.),

Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, Volumes

- 23 I and II (D.N. Glover, ed) , 1985; Oligonucleotide Synthesis, (M.J. Gait, ed.), 1984; U.S. Patent No. 4,683,195 (Mullis et al. ,); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames and S.J. Higgins, eds.),1984,- Transcription and Translation (B.D. Hames and S.J. Higgins, eds.),1984,- Culture of Animal Cells (R.I. Freshney, ed). Alan R. Liss, lne., 1987; Immobilized Cells and

Enzymes, IRL Press,1986; Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Volumes 154 and 155 (Wu et al. , eds), Academie Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos, eds.),1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds.), Academie Press, London,1987; Handbook of Experiment Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds. ),1986,- Manipulating Mouše Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1986.

Pro ilustraci vynálezu jsou uvedeny následující příklady, které však žádným způsobem neomezují rozsah vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Detekce BAFF vazby k BAFF-R s použitím testu v destičkovém formátu

V tomto příkladu je popsána vazba BAFF k transfekovaným buňkám BAFF-R s použitím testu v destičkovém formátu (destičkového testu).

Kompletní humánní BAFF-R byl vytvořen z BJAB polyA+ RNA s použitím soupravy Superscriptll preamplification kit (Life

- 24 Technologies) k vytvoření cDNA templátu a amplifikován s Pful s použitím primerů komplementárních k 5' a 3' kódujícím sekvencím BAFF-R. PCR produkt byl klonován do CH269, derivátu pCEP4 (Invitrogen). Výsledný klon byl nazván pJST535. Humánní buňky embryonálních ledvin obsahující gen EBNA-1 (293EBNA) byly vysety na destičky se 6 jamkami potaženými fibronektinem a transfekovány lipofektaminem (Life Technologies) s buď pJST535 v různých ředěních nebo CH269 jako kontrolou pozadí. 48 hodin po transfekci byly transfekované buňky testovány na schopnost vázat rozpustný FLAG-hBAFF(aminokyseliny L83-L285) tak, jak je uvedeno dále. Všechny inkubace byly prováděny při teplotě místnosti. Kondicionovaná média byla odsáta z jamek a buňky byly promyty pufrem BHA (20mM HEPES pH 7,0, 0,5 mg/ml

BSA, 0,1% NaN₃) a inkubovány s 0,5 gg/ml FLAG-hBAFF naředěným v PBS obsahujícím lmM MgCl₂, lmM CaCl₂ a 0,1% NaN₃. Po 1 hodině inkubace byl roztok BAFF odstraněn a buňky byly promyty BHA. Buňky pak byly inkubovány po dobu 3 0 minut v roztoku PBS obsahujícím anti-FLAG monoklonální protilátku v koncentraci 1 gg/ml, 142 (Sigma) . Tento roztok byl odsát a buňky byly promyty BHA. Buňky byly poté inkubovány po dobu 30 minut v 1:3000 ředění kozího proti-myšího IgG F(ab)'2 (Jackson ImunoResearch) konjugovaného s alkalickou fosfatázou. Tento roztok byl odsát a buňky byly promyty BHA. Aby se snížilo množství značeného pozadí způsobené endogenní alkalickou fosfatázou, byly buňky inkubovány po dobu 15 minut ve 2,5mM levamisolu (Vektor Laboratories) ředěném v lOOmM NaCI, lOOmM Tris-Cl pH 9,5 a 5mM MgCl₂. Pro chromogenní detekci alkalické fosfatázy byl roztok inhibitoru odsát a buňky byly inkubovány s roztokem barviva fast red a naftolfosfátu (Pierce). Značení bylo pozorováno a fotografováno v mikroskopu při malém zvětšení.

• · · · • ·

- 25 Ukládání barviva fast red bylo pozorováno u všech jamek transfekovaných s plazmidem exprimujícím BAFF-R, pJST535. Četnost signálu se snižovala, jak klesalo množství plazmidu transfekovaného do buněk. V buňkách transfekovaných kontrolním expresním vektorem, CH269, nebylo pozorováno žádné značení. V transfekovaných buňkách také nebylo pozorováno žádné značení, když byl FLAG-hBAFF vypuštěn ze značícího protokolu nebo když byl FLAG-hBAFF nahrazen jiným členem rodiny ligandu TNF, FLAG-značený LIGHT. Tudíž BAFF značení buněk transfekovaných BAFF-R je specifické.

Příklad 2

FACS analýza vazby BAFF k buňkám transfekovaným BAFF-R

Tento příklad popisuje detekci vazby BAFF k transfekovaným buňkám BAFF-R s použitím FACS analýzy.

Plazmid kódující kompletní BAFF-R, pJST535, byl transfekován do buněk 293EBNA s použitím soupravy FuGene6 (Boehringer Mannheim). 24 nebo 48 hodin po transfekci byly buňky odstraněny z destiček s použitím 5mM EDTA v PBS a počítány. Buňky byly promyty dvakrát pufrem FACS (PBS obsahující 10% fetální bovinní sérum, 0,1% NaN₃ a 10 μg/ml hlgG (Jackson ImunoResearch), a poté bylo inkubováno 2,5 x 10⁵ buněk po dobu 1 hodiny na ledu s FLAG-hBAFF naředěným ve FACS pufru v koncentraci v rozmezí od 9 μg/ml do 0,037 μg/ml. Buňky byly promyty FACS pufrem a inkubovány s anti-FLAG monoklonální protilátkou, M2, v koncentraci 5 μg/ml po dobu 30 minut na ledu. Buňky byly promyty FACS pufrem a inkubovány po dobu 3 0 minut na ledu v roztoku obsahujícím 1:100 ředění oslího protimyšího IgG F(ab')2 konjugovaného s R-fykoerythrinem a 10 μg/ml • · · · · · · · ···· ·· · ·· · • · · · · «··· · • ···· · · · ··· ··· ·· ···· ·· ····

- 26 7-AAD. Poté, co byly buňky promyty FACS pufrem, byly resuspendovány ve FACS pufru obsahujícím 1% paraformaldehyd. Následovala FACS analýza, kdy byly 7-AAD pozitivní (mrtvé) buňky vyloučeny.

Výsledky FACS analýzy ukázaly, že frakce buněk, které byly transfekovány BAFF-R, jsou schopné vázat BAFF. Při BAFF koncentraci 9 gg/ml, přibližně 28% buněk váže BAFF při průměrné intenzitě fluorescence (MFI) 366. Při použití samotné PE-značené oslí proti-myší reagencie posun buněk významný.

Pouze 1,3% buněk mělo MFI 23,5, přičemž průměr ze všech buněk byl 5,5. Signál buněk transfekovaných BAFF-R se snižoval s klesajícím množstvím BAFF. V koncentraci 100 ng/ml mělo 8,76% buněk MFI 78,9.

Příklad 3

FACS analýza interakce BAFF/BAFF-R včetně GFP markéru

V tomto příkladu je popsána schopnost BAFF vázat se na buňky transfekované společně (ko-transfekované) BAFFR a GFP reportérovým plazmidem.

Buňky 293EBNA byly transfekovány pJST535 a GFP reportérovým plazmidem, jak bylo popsáno v příkladu 2. Reportérový plazmid kóduje GFP molekulu ukotvenou v membráně. S použitím ko-transfekce dvou plazmidů analyzovali původci procento transfekovaných buněk, které byly schopné vazby BAFF. Buňky byly odstraněny z destiček a podrobeny BAFF vazbě a detekci, jak bylo popsáno v příkladu 2. Opět byla zahrnuta 7AAD, aby se odečetly mrtvé buňky. Vzorky byly analyzován FACS a vyneseny do grafu. Pravý horní kvadrant představuje buňky s navázaným BAFF (fykoerythrin pozitivní) a exprimující GFP.

• · · · ·· · · · · · · • · · · · ···· ··· ·· · ·· ·

Ačkoliv se zdá, že ne všechny GFP transfekované buňky váží BAFF, existuje významná frakce buněk v pravém horním kvadrantu ve srovnání s kontrolami. 33 % transfekovaných buněk jsou v pravém horním kvadrantu ve srovnání s 8 %. Je možné, že j e nezbytný určitý stupeň exprese BAFF-R, aby se projevila vazba BAFF k buňkám. Je také možné, že je nezbytný ko-receptor je pro interakci s vysokou afinitou a že tento receptor je na buňkách 293EBNA limitující.

Příklad 4

Imunoprecipitace FLAG-hBAFF fúze BAFF-R-Fc

Tento příklad popisuje specifickou interakci FLAG-hBAFF s BAFF-R-Fc, molekulou složenou z domény bohaté na cystein (CRD) BAFF-R fúzované k Fc doméně humánního IgGl.

CRD BAFF-R byly vytvořena pomocí RT-PCR z BJAB polyA+ RNA jako v příkladu 1 s použitím jako 3' primeru oligonukleotidu komplementárního k nukleotidům 132-152 z hBAFF-R kódující sekvence. Výsledný PCR fragment byl klonován do CH269 po směru od myší IgG-kappa signální sekvence a v protisměru od Fc skupiny humánního IgG. Tento konstrukt byl nazván pJST538. Konstrukt pJST538 nebo CH269 byly transfekovány do 293EBNA prostřednictvím lipofektaminu. Kondicionovaná média a buněčné extrakty byly sklizeny 20 hodin po transfekci. Buňky byly solubilizovány ve 20mM Tris pH7,5/50mM NaCl/0,5% NP40/0,5% deoxycholové kyselině a debris odstraněno stočením. Alikvot kondicionovaného média a buněčné extrakty byly spojeny se stejným objemem redukčního pufru 2x SDS, povařeny a podrobeny SDS-PAGE a Western přenosu. Aby se ověřila exprese, byla membrána zkoušena v 1:3000 ředění myšího anti-humánního IgG • 9 • 9 9·· 9 · 9 9 99 • 9 9 9999 ·

9999 99 9 99 9

99*9 «999 9

9999 999

999 999 99 9999 9« 9999

- 28 konjugovaného s křenovou peroxidázou (HRP) v 5% odtučněném sušeném mléce v TBST při teplotě místnosti po dobu 30 minut a promyta TBST. Membrány (bloty) byly vyvolány ECL (Amersham) a exponovány na film.

Imunoprecipitace byly prováděny inkubací 25 ng buď FLAGhBAFF nebo FLAG-hTWEAK s 0,5 ml kondicionovaného média z 293EBNA transfekovaných buď pJST538 nebo CH269 ve 4°C po dobu 1 hodiny s třepáním, a pak následovalo přidání of 3 0 μΐ ProteinA-Sepharose (Pharmacia) a pokračovalo třepání přes noc. ProteinASepharose perličky byly promyty dvakrát s PBS a resuspendovány ve vzorku redukčního pufru 2xSDS. Po SDS-PAGE a Western přenosu byly bloty inkubovány s anti-FLAG monoklonální protilátkou M2 (Sigma) v koncentraci 5 gg/ml v 5% odtučněném sušeném mléce v TBST při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Bloty byly promyty TBST a inkubovány s 1:3000 ředění kozího proti-myšího IgG konjugátu s HRP (Jackson ImunoResearch) v 5% odtučněném sušeném mléce v TBST při teplotě místnosti po dobu 3 0 minut. Bloty byly vyvolány ECL (Amersham) a exponovány na film.

Po transfekci pJST538 do buněk 293EBNA byla detekována exprese protein o velikosti přibližně 43kD jak v buněčném extraktu, tak v kondicionovaném médiu analýzou Western blotu s myším anti-humánním IgG (Jackson ImunoResearch), což ukazovalo, že fúze BAFF-R-Fc byla účinně exprimována a sekretována.

Při imunoprecipitacích byl pozorován pás pouze jako výsledek inkubace BAFF-R-Fc a FLAG-hBAFF. Tento pás se pohyboval společně s přímo naneseným vzorkem FLAG-hBAFF. Žádná další dráha nevytvořila signál, což ukázalo, že interakce mezi BAFF-R-Fc a FLAG-hBAFF je specifická.

• ·4·4 44 f 4* 44 • 44 · · · 4 4444 •444 44 4 44 4 · 4 · 4 4444 4 • 4444 444

Příklad 5

Vytvoření rozpustných forem receptoru

Aby se vytvořil inhibitor receptoru pro použití u člověka, je nutná cDNA sekvence extracelulární domény humánního receptoru. Jestliže je známa myší forma, je prováděn screening humánních cDNA knihoven s použitím myší cDNA sekvence a v této oblasti jsou tyto manipulace prováděny rutinně. S humánní cDNA sekvencí lze navrhnout oligonukleotidové primery, aby se pomocí PCR amplifikovala extracelulární doména receptoru bez transmembránových a intracelulárních domén. Typicky je zahrnuta většina aminokyselin mezi TNF doménou spojenou s posledním disulfidickým můstkem a transmembránovou doménou. Lze měnit množství stonkových oblastí zahrnutých pro optimalizaci potence výsledného rozpustného receptoru. Tento amplifikovaný úsek je upraven metodami genetického inženýrství tak, aby zahrnoval vhodná restrikční místa pro klonování do různých vektorů pro vytváření fúzni chiméry s C-koncem Ig. Nebo lze vložit stop signál na 3' konec a vytvořit rozpustnou formu receptoru bez pokusu použít přístup s fúzni chimérou Ig. Výsledné vektory mohou být exprimovány ve 'většině systémů používaných v biotechnologiích včetně kvasinek, hmyzích buněk, bakterií a savčích buněk, a pro všechny typy exprese existují příklady. Různé humánní Fc domény mohou být připojeny, aby se optimalizovaly nebo eliminovaly interakce FcR a komplementu, je-li to žádoucí. Nebo mohou být použity mutované formy těchto Fc domén, aby byly selektivně odstraněny interakce FcR nebo komplementu, či připojení sacharidů N-připojených k Fc doméně, což má určité výhody.

• φ · · φφφ

- 30 Příklad 6

Příprava agonistických nebo antagonistických protilátek

Výše popsané rozpustné formy receptoru mohou být použity pro imunizaci myší a pro vytváření monoklonálních protilátek (mAbs) obvyklými metodami. Výsledné mAbs, které jsou identifikovány pomocí metod ELISA, mohou být dále podrobeny screeningu na to, zda mají agonistickou aktivitu, a to buď jako rozpustné protilátky nebo imobilizovány na umělé hmotě v různých in vitro buněčných testech. Často usmrcení buněčné linie HT29 je obvyklý systém, který je citlivý na signalizaci prostřednictvím mnoha TNF receptorů. Jestliže tato linie nemá zkoumaný receptor, může být tento kompletní receptor stabilně transfekován do linie HT29, aby se umožnilo fungování cytotoxického testu. Nebo mohou být tyto buňky použity v přístroji Cytosensor, aby se určilo, zda aktivace receptoru může vyvolat změnu pH, která je indikátorem signálního jevu. Rodina TNF receptorů v tomto uspořádání signalizuje dobře a tato metoda nevyžaduje znalost aktuálních biologických jevů spouštěných receptorem. Agonistické mAbs mohou být humanizované pro klinické použití. Tento postup může být také použit pro charakterizaci antagonistických mAbs. Pro tyto mAbs je charakteristický nedostatek agonistické aktivity a schopnost inhibovat interakce receptoru-ligandů, jak monitorováno technikami ELISA, technikou klasické vazby nebo metodou BIAcore. Konečně, indukce sekrece chemokinů různými buňkami jako reakce na agonistickou protilátku může tvořit základ pro screeningovou metodu (test).

- 31 Příklad. 7

Screening inhibitorů interakce receptor-ligand

S použitím fúzního proteinu receptor-Ig, lze provádět screening kombinačních knihoven na molekuly, které mohou vázat přímo receptor. Tyto molekuly mohou být poté testovány v testech ELISA s použitím fúzního proteinu receptor-Ig a rozpustné formy ligandů na schopnost inhibovat interakce receptor-ligand. Tato ELISA může být použita přímo k provádění screeningu různých knihoven s přírodními produkty spod. na inhibiční sloučeniny. Receptor může být transfekován do buněčné linie, jako je například linie HT29, aby vznikl biologický test (v tomto případě cytotoxický), který pak vytvoří test vhodný pro screening.

Příklad 8

BAFF-R-IgG vyvolává snížení počtu B lymfocytů u normálních myší

Osm týdnů staré samice myší BALB/c byly zakoupeny od The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) . Myši (3/skupina) dostaly i.p. buď PBS, 400 gg fúzního proteinu humánního BAFF-R-hulgGI (hBAFF-R-Ig) (dodávaný firmou Teresa Cachero, Biogen), nebo 400 μg purifikovaného humánního IgG (HulgG) (Sandoz, Bazilej, Švýcarsko) ve dnech -8, -5, -1 a +2. Myši dostaly 100 μΐ 10% ovčích červených krvinek (SRBC) (Colorado Sérum Company, Denver, CO) v den 0.

V čase utracení zvířat byla odebírána krev prostřednictvím punkce srdce do zkumavek obsahujících EDTA a červené krvinky ···♦ »♦ ·· ·· ·· • ···· ···· • ·· ·· · · · · • · · · · · · ··· ·· ···· ·· ···· byly lyžovány v hypotonickém pufru. Krev byla také odebírána bez EDTA pro sérové preparáty. Jednoduché buněčné suspenze byly připraveny ze slezin a mezenterických lymfatických uzlin (MLN) a červené krvinky byly lyžovány v hypotonickém pufru. Byla prováděna průtoková cytometrie s použitím PE-konjugované anti-CD45R/B220, anti-syndekan/CD138 a anti-B7.2 a FITCkonjugovaného anti-IgM a anti-CD45R/B220. Všech mAbs byly zakoupeny od firmy Pharmingen (San Diego, CA) . Stručně, Fc receptory byly blokovány přípravkem Fc Block (Pharmingen) v koncentraci 10 gg/ml po dobu 15 minut na ledu, pak následovalo přidání PE- a FITC-konjugovaných mAbs a byly inkubovány na ledu po dobu 20-30 minut. Buňky byly lx promyty a suspendovány v 0,5% paraformaldehydu. Data fluorescence buněk byla získána na průtokovém cytometru FACSCalibur™ (Becton Dickinson, San Jose, CA) a analyzována s použitím softwaru CELLQuest™ (Becton Dickinson).

Po ošetření s hBAFF-R-Ig nastala přibližně 50% redukce počtu B lymfocytú v periferní krvi a ve vyšetřených periferních lymfatických orgánech. B220^high IgM^low B lymfocyty odpovídaly za 23,4% a 21,5% buněk u myší ošetřených PBS a HulgG, v daném pořadí, zatímco tato populace představovala pouze 9,9% buněk u myší ošetřených hBÁFF-R-Ig. Počet plazmatických buněk (syndekan/CD138+) také lehce poklesl, s 5,7% a 4,8% přítomnými v krvi myší ošetřených PBS a myší ošetřených HulgG, v daném pořadí, ve srovnání s 3,9% u myší ošetřených hBAFF-R-Ig. B7.2 molekula byla zvýšena na 3,1 % a 4,5% B220+ buněk u myší ošetřených PBS a myší ošetřených

HulgG, v daném pořadí, ve srovnání s 1,9% u myší ošetřených hBAFF-R-Ig.

B220^hl9h B lymfocyty ve slezině byly výrazně redukovány u myší ošetřených hBAFF-R-Ig, představovaly 18,8%, ve srovnání s 36,7% a 40% u myší ošetřených PBS a HulaG, v daném pořadí.

• 444 44 «4 4» 44 • · 4 4 4 4 4 · 4

444 ·4 444 4

4 4 4 4 4 4

444 44 4444 44 4444

Tento pokles byl pozorován u obou subpopulací, IgM^hl9h a IgM^low (viz tabulka 8A) . Žádná změna nebyla pozorovaná v nově vytvořeném kompartmentů B lymfocytů ve slezině, B220^low IgM^hl9h (data nejsou ukázána). Počet plazmatických buněk (syndekan/CD138+) také lehce poklesl s 3,3% a 3,4% přítomnými ve slezině myší ošetřených PBS a myší ošetřených HulgG, v daném pořadí, ve srovnání s 2,4% u myší ošetřených hBAFF-R-Ig.

MLN projevovaly pokles B220+ B lymfocytů s 14,1 % přítomnými u myší ošetřených hBAFFR-Ig ve srovnání s 26,7% a 35,8% u myší ošetřených PBS a myší ošetřených HulgG, v daném pořadí. Data jsou shrnuta v tabulce 8A.

Tabulka 8A

Populace B lymfocytů u myší¹ ošetřených hBAFF-R-Ig, PBS a HulgG

Krev PBS	B22 0hÍ9h IgMlow 23,4 ± 5,7	Syndekan 5,7 ± 1,5	B7.2/B220low 3,1 ± 0,5
HulgG	21,5 ± 4,5	4,8 ± 0,9	4,5 ± 1,0
HBAFF-R-Ig	9,9 ± 1,8	3,9 ± 0,6	1,9 ± 0,5
Slezina PBS	B220hish IgMlow 27,8 + 1,6	B220hÍ9h IgM+ 11,9 ± 1,6	Syndekan 3,3 ± 0,8
HulgG	30,5 + 2	11,8 ± 1,0	3,4 ± 0,7
HBAFF-R-Ig	10,6 ± 0,2	8,4 ± 0,2	2,4 ± 0,2
MLN PBS	B220 + 26,7
HulgG	35,8 + 3,3
HBAFF-R-Ig	14,1 ± 5,9

¹ myši byly ošetřeny tak, jak bylo popsáno v části Materiál a metody a data jsou udána jako procento + směrodatná odchylka • »*©· ·· »· ·· »· • · » · 9 · · * « © φ • · ·· · fc · 9 9 « • · · · · · · · · © • ·©·· ··· ··· ©·© ·· ·»·· ·· ··©·

Snížené procento B7.2+ B lymfocytů v krvi a plazmatických buněk v krvi a slezinách u myší ošetřených hBAFF-R-Ig po imunizaci s SRBCs svědčí pro to, že existuje inhibice aktivace a/nebo maturace B lymfocytů a potenciálně zvýšená eliminace aktivovaných B lymfocytů. Velmi malé procento antigenně specifických B lymfocytů bylo aktivováno a odpovídalo na nějaký antigen, v tomto případě SRBC. Protože ošetření hBAFF-R-Ig mělo za následek takovou dramatickou redukci procenta B lymfocytů ve všech vyšetřovaných tkáních, ~50%, zdá se, že aktivita hBAFF-R-Ig také cílí na klidové, zralé B lymfocyty.

Předpokládá se tedy, že fúzní protein BAFF-R může být použit jako léčivo s klinickou aplikací u nemocí zprostředkovaných B lymfocyty. K těmto nemocem patří ty, které jsou autoimunitní povahy, jako je například systémový lupus erythematosus, myasthenia gravis, autoimunitní hemolytická anémie, idiopatická trombocytopenická purpura, antifosfolipidový syndrom, Chagasova nemoc, Gravesova nemoc, Wegenerova granulomatóza, polyarteriitis progresivní glomerulonefritida. Léčivo je chorob plazmatických buněk , jako je například mnohočetný myelom, Waldenstrómova makroglobulinémie, ' nemoc těžkých řetězců, primární amyloidóza nebo amyloidóza s imunocyty a idiopatická monoklonální gamapatie Onkologické cíle zahrnují karcinomy, leukémie a pocházející z B lymfocytů.

nodosa a rychlá také použitelné u íočeti v sy η >· :ezky< sdružená (MGUS). lymfomy « *·Φ· Φ· *» ·· φφ ·*· · » ♦ · C » · · • ··· · · · · · « • ···· · · · · · • · * · · ··· *·· ·*· »« ·«·· 4· Φ···

Příklad 9

Blokování proliferace Β lymfocytů indukované BAFF in vitro použitím rozpustného BAFF-R

V tomto příkladu původci prokázali, že rozpustný fúzní protein BAFF-R:hIgGl je schopný blokovat proliferaci B lymfocytů indukovanou BAFF v myších splenocytech.

Myší splenocyty (5 x 10⁵ buněk/ml) z myší Balb/c byly izolovány a pěstovány na 96 jamkových destičkách ve 100 μΐ RPMI (Life Technologies) doplněném 10% fetálním telecím šerem (JRH), 2 mM glutaminem, 100 jednotkami/ml penicilinu a 100 mg/ml streptomycinu (Life Technologies). Pak byla přidána různá množství humánního BAFF, humánního BAFF-R:hIgGl v koncentraci 10 μg/ml nebo humánního Ig, jakož i 10 μg/ml anti-myšího povrchového těžkého řetězce μ (Jackson ImunoResearch) . Po 4 8 hodinách v tkáňové kultuře ve 3 7°C byl buňkám podán impuls po dobu 24 hodin 1 μθί/jamku [methyl³H]thymidinu (Dupont NEN) a buňky byly sklizeny s použitím přístroje na sklízení buněk Tomtec (Orange, CT). Radioaktivita byla měřena scintilačním počítačem pro kapaliny Betaplate (Pharmacia Biotech).

Obrázek 8 ukazuje výsledky test proliferace splenocytů. Jsou ukázány impulsy za minutu (CPM) inkorporovaná do myších splenocytů oproti množství přidaného humánního BAFF. Stupeň anti-μ nebo fúzního proteinu nebo kontrolního hlgG je udržován v konstantní koncentraci 10 μg/ml. Plné čtverečky představují stupeň proliferace indukované samotným BAFF. Plná kolečka představují proliferaci buněk s BAFF a anti-μ. Křivka s prázdnými trojúhelníčky představuje inhibici pozorovanou, když je přidán BAFF-R:h!gGlBAFF s anti-μ plus BAFF-R:hIgGl.

• · < · ·· · ·

Prázdný kosočtverec představuje inhibici pozorovanou při použití kontrolního humánního Ig.

Přidání BAFF plus anti-μ má za následek proliferací myších splenocytů in vitro. Hladina ³H thymidinu inkorporovaného do buněk je významně vyšší než hladina získaná, když je ke splenocytům přidán buď samotný BAFF nebo samotná anti-μ. Ošetření splenocytů se samotným BAFF má za následek inkorporaci ³H thymidinu pouze při velmi vysokých koncentracích. Přidání samotného anti-μ nemá za následek proliferací. Když byl přidán kontrolní humánní Ig v koncentraci 10 μg/ml ke splenocytům se stupajícím množstvím BAFF a anti-μ v koncentraci 10 μg/ml, nastal mírný pokles stupně proliferace. Na rozdíl od toho, když byl do testu přidán fúzní protein humánní BAFF-R:hIgGl v koncentraci 10 pg/ml za stejných podmínek, rozsah proliferace byl redukován na stupeň pozorovaný pro ošetření samotným BAFF. To ukazuje, že fúzní protein BAFF-R:hIgGl je schopen inhibovat proliferací splenocytů indukovanou BAFF a anti-μ.

Příklad 10

Blokáda vazby BAFF k buňkám Ráji použitím BAFF-R:hIgGl

V tomto příkladu je popsána preinkubace BAFF s fúzním proteinem BAFF-R:hIgGl, která má za následek redukci BAFF vazby k buněčné linii Ráji lymfomu z B lymfocytů.

V tomto FACS testu bylo 200 ng/ml FLAG-značeného (FLAG-tagged) humánního BAFF preinkubováno buď s humánním BAFF-R:hIgGl nebo humánním LTPR:hIgGl ve dvojkových ředěních v rozmezí od 2 0 pg/ml do 3 9 ng/ml nebo bez fúzního proteinu po • ·

- 37 dobu 30 minut na ledu. Inkubace byla prováděny ve FACS pufru obsahujícím PBS bez Ca²⁺ nebo Mg²⁺ a 10% FCS (JRH) a 0,05% azid sodný. Po preinkubaci byla směs BAFF-fúzního proteinu přidána k 5 x 10⁶ Ráji (ATCC) buněk/ml. Tato inkubace probíhala po dobu

0 minut na ledu a buňky byly poté promyty 2 ml FACS pufru ve °C. Aby se detekoval navázaný BAFF, byla k buňkám přidána anti-FLAG protilátka M2 (Sigma) v koncentraci 5 μg/ml a inkubována po dobu 3 0 minut na ledu. Buňky byly opět promyty, jak uvedeno výše, a poté byly inkubovány s 1:100 ředěním oslího proti-myšího Ig (Jackson ImunoResearch) konjugovaného s PE po dobu 3 0 minut na ledu. Pak byly buňky opět promyty FACS pufrem, byly fixovány 1% paraformaldehydem a odečítány přístrojem FACS® (Becton Dickinson a Co.)

Obrázek 9 ukazuje výsledky BAFF blokujícího testu. Jsou ukázány MFI (průměr intenzity fluorescence) údaje, které jsou výsledkem analýzy FACS® vyšetřující vazbu BAFF k buňkám Ráji. Plné čtverečky představují data, kdy humánní BAFF-R:hIgGl byla preinkubována s BAFF před vazbou k buňkám. Kroužky ukazují křivku, která je důsledkem přidání nespecifického fúzního proteinu, humánního LTpR:hIgGl, k BAFF. Osa x představuje množství fúzního proteinu přidaného k BAFF v koncentraci 200 ng/ml před inkubací s buňkami.

Když nebyl s humánním BAFF preinkubován žádný fúzní protein, průměrná intenzita fluorescence (MFI) vzorku byla 80. Když byl s BAFF preinkubován humánní LTpR:hIgGl, dokonce i v koncentraci 20 μg/ml, detekce vazby BAFF k buňkám Ráji byla nezměněna. Když byl ale s BAFF preinkubován humánní BAFFR:hIgGl, nastalo podstatné snížení MFI, až k 20-25, dokonce i při koncentraci fúzního proteinu 625 ng/ml. Pozadí MFI pro tento pokus bylo 7. BAFF-R :hIgGl je tedy velmi účinný při blokování vazby BAFF k B lymfocytům Raj i.

• ·

- 38 Příklad 11

BAFF-R-IgG zmírňuje autoimunitní chorobu typu lupus u transgenních myší

Tento příklad popisuje účinek BAFF-R-Ig na snížení počtu periferních B lymfocytů a inhibici rozvoje splenomegalie a nefritidy.

V pokuse byly použity pět měsíců staré BAFF transgenní (Tg) myši (C57BL/6) a věkově srovnatelné kontrolní myši.

U BAFF Tg myší se manifestovaly onemocnění lymfocytů a autoimunitní fenotyp podobný k systémovému lupus erythematosus (Mackay et al., 1999). Tento fenotyp zahrnuje zvýšení periferních populací B lymfocytů včetně přechodné (Tl) a 2 (T2) , zralé (Μ) , marginální zóny (MZ) a B lymfocytů _CD1high/_IgMhigh_>

Myši dostaly i.p. PBS, 400 gg purifikovaného humánního IgG (hlg) (Sandoz, Bazilej, Švýcarsko) (3/skupina) nebo 400 gg fúzního proteinu humánního BAFF-R-hulgGI pocházejícího z buněk CHO (hBCMA-Ig) (2/skupina) ve dnech 0, 4, 7, 11, 14, 18, 21,

25, 28, 32, 35 a byly utraceny v den 40.

V čase utracení zvířat byla zvážena slezina a byly připraveny jednoduché buněčné suspenze po lýzi červených krvinek v hypotonickém pufru. Byla prováděna průtoková cytometrie s použitím FITC-konjugováné anti-CD2l/CD35, PE-konjugované anti-IgD a antiCDl, anti-CD45R/B220 konjugované s Cychrome a anti-IgM konjugované s biotinem. Všechny mAbs byly zakoupeny od firmy Pharmingen (San Diego, CA) . Stručně, Fc receptory byly blokovány činidlem Fc Block (Pharmingen) v koncentraci 10 gg/ml po dobu 10 minut na ledu, pak následovalo přidání mAbs konjugovaných s biotinem po dobu • ···· ·· ·· ·· ·· ··· · · ♦ · · · · · • · · · · · · · · · • · · · · · · · ··· ··· ·» ···· ·· ···· minut na ledu, buňky byly lx promyty, pak následovalo přidání Abs konjugovaných s FITC, PE, Cychrome, streptavidin APC a FcBlock v koncentraci 10 gg/ml. Buňky byly inkubovány po dobu 30 minut na ledu, lx promyty a suspendovány v 0,5% paraformaldehydu. Data fluorescence buněk byla získána na přístroji FACSCalibur (průtokový cytometr, Becton Dickinson, San Jose, CA) a analyzována s použitím softwaru CELLQuest (Becton Dickinson).

Výskyt proteinů v moči myší byl měřen s použitím reagenčních proužků Multistix 10 SG pro analýzu moči (Bayer Corp., Diagnostics Division).

Výsledky jsou ukázány v tabulkách 11A a 11B níže.

Tabulka 11A

Analýza splenocytů ve 3 měsících

Celkový počet buněk na slezinu (xlO⁶)

		TI	T2	MZ	Zralé
Myši BAFF	Tg
816E23		9,4	18	9	91
816E33		14	30	19	170
816E99		14	24	19	150
Průměr		13 +/- 2,6	24 +/- 6	16 +/- 5,7	140 +/- 41
Kontrolní	myši
816E2		5,3	5,8	3,1	73
816E4		2,4	3,7	1,9	44
Průměr		3,9 +/- 2	4,8 +/- 1,5	2,4 +/- 1	59 +/- 20

Sleziny myší Baff Tg starých 3 měsíce (n=3) a věkově srovnatelných kontrolních myší (n=2) byly izolovány a podrobeny analýzám FACS tak, jak bylo popsáno v části Materiál a metody. TI, T2, M a MZ buňky byly definovány expresí následujících povrchových markérů (hi:high - vysoký, lozlow nízký, int:intermediate - střední):

Tl:IgD', IgM^high, CD21¹⁰

MZ:IgD, IgM^hi, CD21

T2:IgD⁺, IgM^hi, CD21^hi

M:IgD⁺, IgM¹⁰, CD21^int

Tabulka 11B

Analýza splenocytů ve 10 měsících

Celkový počet buněk na slezinu (xlO⁶)

	TI	T2	MZ	Zralé
Myši BAFF Tg
802-39	13	100	34	630
823-3-11	7,5	43	6,6	200
823-3-13	3,1	50	15	180
Průměr	7,9 +/- 4,9	64 +/- 30	19 +/- 10	340 +/- 250
Kontrolní myši
823-3-22	0,7	6,5	1,4	56
802-64	0,28	5,4	1,3	38
823-14-13	0,45	3,4	0,16	38
Průměr	0,48 +/- 0,21	5,1 +/- 1,5	0,95 +/- 0,65	44 +/- 10

Myši Baff Tg staré 10 měsíců (n=3) a věkově srovnatelné kontrolní myši (n=3) byly podrobeny analýzám FACS tak, jak bylo popsáno v tabulce 1.

• « • · · · * ♦ • ·· ·

- 41 Po podávání hBAFF-R-Ig myším BAFF Tg byly významně redukovány populace TI, T2, Μ, MZ a CDl^hl9h/IgM^hl9h B lymfocytů ve slezině, ve srovnání s myšmi Baff Tg ošetřenými PBS a hlg, celkové počty TI, T2, Μ, MZ a CDl^high/lgM^hish B lymfocytů byly redukovány na počet podobný nebo nižší než u kontrolních myší ošetřených PBS (Fig. 10a, 10b, 10c).

BAFF-R-Ig ošetření myší Baff Tg mělo za následek zmírnění autoimunitního onemocnění zprostředkovaného Baff, jak bylo prokázáno pozorováním, že myši ošetřené BAFF-R měly sleziny normální velikosti, zatímco u kontrolně ošetřených myší Baff Tg byla prokázána splenomegalie (obr. 11) . Kromě toho byl u myší ošetřených BAFF-R-Ig inhibován rozvoj proteinurie, indikátoru renální dysfunkce, zatímco u kontrolně ošetřených myší Baff Tg se rozvinula nefritida, jak bylo zjišúováno zvýšením stupně proteinurie (viz obr. 12).

Myši transgenní v Baff měly vysoce zvýšené počty periferních B lymfocytů a další analýzy těchto myší odhalily zvýšení převážně subpopulací TI, T2 a MZ B lymfocytů. Přechodný stupeň vývoje B lymfocytů (TI a T2) je kontrolní bod, kdy jsou autoreaktivní B lymfocyty pravděpodobně odstraněny. CDl^hl/lgM^hl9h B lymfocyty, které mají tendenci usadit se v marginální zóně, byly také u myší Baff Tg vysoce zvýšené. Bylo ukázáno, že tato poslední populace B lymfocytů byla hlavní zdroj produkce autoprotilátek u lupoidních myší NZB/NZW. Ošetření myší Baff Tg s BAFF-R-Ig mělo za následek redukci populací TI, T2, MZ a CDl^hl B lymfocytů na počet podobný nebo nižší než počet nalezený u kontrolních myší divokého typu.

BAFF-R-Ig způsobil snížení počtu periferních B lymfocytů a inhiboval rozvoj splenomegalie a nefritidy. Tudíž, kromě jeho použitelnosti u systémového lupus erythematosus a lupusové • · nefritidy, účinek BAFF-R-Ig je také užitečný u B nemocí zprostředkovaných B lymfocyty, které jsou autoimunitní povahy, jako je například systémový lupus erythematosus, myasthenia gravis, autoimunitní hemolytická anémie, idiopatická trombocytopenická purpura, antifosfolipidový syndrom, Chagasova nemoc, Gravesova nemoc, Wegenerova granulomatóza, polyarteriitis nodosa a rychlá progresivní glomerulonefritida. Léčivo je také použitelné u chorob plazmatických buněk , jako je například mnohočetný myelom, Waldenstrómova makroglobulinémie, nemoc těžkých řetězců, primární amyloidóza nebo amyloidóza sdružená s imunocyty a idiopatická monoklonální gamapatie (MGUS). Onkologické cíle zahrnují karcinomy, leukémie a lymfomy pocházející z B lymfocytů.

Příklad 12

Průměrný arteriální tlak u BAFF trangenních myší

Tento experiment popisuje měření krevního tlaku u BAFF transgenních myší. Pozorování učiněná v průběhu vyhodnocování fenotypu BAFF transgenních myší ukazovala ' na potenciální hypertenzi u myší.

Baff Tg myši popsané již výše byly podrobeny anestezi ketaminem. Levá karotida byla incizí na krku obnažena. Do karotidy byl vložen katétr pro měření krevního tlaku a srdeční činnosti. Katétr byl spojen se tlakovým snímačem a krevní tlak byl měřen pomocí Gouldova datasběrného systému a Gouldova polygrafu (Po-Ne-Mah Data Acquisition systém and Gould polygraph). Z průběhu tlakových vln byl určen systolický tlak, diastolický tlak, průměrný tlak a srdeční frekvence. Byly užity dvě skupiny myší: BAFF transgenní myši (n=8) a kontrolní • 9

999 9 9

99

- 43 myši divokého typu (n=9).

Obrázek 13 ukazuje průměry z hodnot průměrných arteriálních tlaků, MAP (v mmHg) pro dvě skupiny myší. Jak je ukázáno, BAFF transgenní myší měly průměrný MAP 102 + 8 mmHg. kontrolní myši měly průměrný MAP 92 + 6 mmHg. Takže BAFF myši vykazovaly 10 mmHg zvýšení ve srovnání s kontrolním zvířaty, i když tento rozdíl nebyl statisticky průkazný (ANOVA).

Podrobnější analýza těchto dat je uvedena na obrázku 14, kde jsou uvedeny výsledky měření jednotlivých zvířat. U kontrolních myší divokého typu (BAFF-) distribuce hodnot vykazuje typické binomické rozdělení. Naproti tomu tlaky u BAFF transgenních myší (BAFF+) jeví distribuci do dvou skupin, jedna skupina v rozmezí 120 až 130 mmHg a druhá skupina v rozmezí 80 až 90 mmHg.

Jako populace mají BAFF transgenní myší tendenci k hypertenzi ve srovnání s negativními kontrolními myšmi.

Analýza individuálních hodnot arteriálního tlaku ukázala, že tlak dělí BAFF transgenní myši na dvě subpopulace, jednu s vysokým krevním tlakem a druhou s normálním krevním tlakem. Podávání rozpustného BAFF-R, fúzního proteinu nebo homologů protilátky může zmírnit účinky hypertenze.

Příklad 13

Léčení myší SNF_X s již rozvinutou nemocí podáváním BAFF-R-Ig zpomaluje progresi silné nefritidy

Samice myší stáří 21 týdnů (proteinurie 30 až j edenkrát týdně i.p (SWR x NZB)F1 vykazuj ící 100 mg/dl), . injekci 200 (SNFi) náchylné k lupusu ve příznaky mírné nefritidy dostávaly po dobu 8 týdnů pg fúzního proteinu humánního ·

• ···· ·· ·· ·· • · · * · · ♦ « • · ·· · · 9 · 9 9 • ···· t · · · ♦ • · · · 9 9 9 9 •99 999 99 9999 99 9999

- 44 BAFF-R-huIgGl (hBCMA-Ig), humánní IgG (HulgG) (Sandoz) nebo 200 μΐ PBS.

Moč každé myši byla monitorována týdně na proteinurii pomocí zařízení Albustix (Bayer Corp., Terrytown, NY) . Proteinurie vyšší než 100 mg/dl byla hodnocena jako závažná nefritida. BAFF-R-Ig byl produkován v tranzientně transfekovaných buňkách EBNA 293. Upravené médium z buněk 293 exprimujících hBCMA-Ig bylo naneseno na proteinovou kolonu. Protein byl eluován užitím pufru obsahujícího 25 mM fosfát, 100 mM NaCl, pH 2,8, po neutralizaci 1/20 objemu 0,5 M NaPO₄ pH 8,6. Frakce vybrané na základě měření OD280 byly analyzovány SDS-PAGE v redukujících a neredukujících podmínkách a dále Western bloty, aby byl identifikován purifikovaný protein.

Tři týdny po ukončení léčení 50 % myší léčených BAFF-R-Ig vykazovalo závažnou nefritidu, ve srovnání se 75 % a 87,5 % myší, které dostaly HulgG a PBS (viz obrázek 15) . Tato data ukazují, že rozpustný BAFF receptor, BCMA-Ig, působí tak, že blokuje autoimunitní nemoc zprostředkovanou B lymfocyty jako je lupusova nefritida, což vede ke značnému zpomalení progrese nemoci.

Příklad 14

Podávání BAFF-R-Ig normálním myším vede ke snížení počtu dendritických buněk (DC) ve slezině a atypické lokalizaci ve slezině

Samice sedm týdnů starých myší BALB/c (3/skupina) dostávaly 1 x týdně po dobu 4 týdnů i.p. injekci 20 μg nebo 50 gg humánního BAFF-R-IgGI (hBCMA-Ig), 50 μg humánního IgG (HulgG) nebo 100 μ PBS. Fúzní protein hBCMA-Ig byl purifikován • 9 9 · 9 9 9 ·· ·· ••9 · · 9 9 ·

99·· 99 9 ·

99·· 999 999 999 9· 9999 99 ·99·

- 45 ze supernatantu kultury trvale transfekovaných buněk. Sleziny byly získány 8 dnů po poslední injekci a ošetřeny kolagenázou (Sigma, katalog. č. C-5138) 1 hodinu při 37°C. Byla připravena suspenze jednotlivých buněk, červené krvinky (RBCú byly lyžovány v hypotonickém pufru a buňky byly opláchnuty 3x v PBS. Splenocyty byly připraveny pro průtokovou cytometrickou analýzu obarvením pomocí anti-CDllc-biotinu následovaném streptavidin-APC, anti-CD8a-cychrom a anti-CD4-FITC pro vyhodnocení populací DC.

V odděleném experimentu samice myší BALB/C (N=3) dostávaly po 4 týdny 1 x za týden i.p. injekci 100 μg hBCMA-Ig, pak byly odebrány sleziny a bleskově zamraženy v OCT užitím 2-methylbutanu zmraženém na C0₂. Byly připraveny kryořezy a fixovány v acetonu. Řezy byly inkubovány s anti-CDllc-biotinem následovaným streptavidin-AP a substrátem BCIP (Pierce) pro vizualizaci DC, monoklonální protilátkou MOMA-1 následovanou anti-potkanní IgG-HRP (Jackson ImmunoResearch) a substrátem 3,3'-diaminobenzidineem (Sigma, St. Louis MO, katalog, č. D-1293) pro vizualizaci metalofilních makrofágů, a anti-CD35-biotinem následovaným streptavidin-AP a substrátem (Alkaline Phosphatase Substráte Kit I, Vector, katalog, č. SK-5100) pro vizualizaci folikulárních deridritických buněk (FDC).

Myši in vivo léčeny podáváním 20 pg nebo 50 pg BCMA-Ig 1 x týdně po dobu 4 týdnů vykazovaly významné snížení (p<0,05 ve Studentově t-testu) počtu slezinných CDllc+ DC ve srovnání s kontrolami, kterým se podával HulgG nebo PBS. Toto snížení bylo pozorováno u všech zkoumaných populací CDllc+ DC: CD8aCD4-, CDB8+ CD4-, a CD8a-CD4+ (viz obrázek 16, tabulka 14A).

• «to·· ·· toto ·· to· to·· · · to to · · · · ···· ·· · ·· ·

Tabulka 14A

Podávání BAFF-R-Ig vede ke snížení počtu DC ve slezině

	PBS	HulgG	20 gg BCMA-Ig	50 gg BCMA-Ig
	Průměrný počet CD11+ DC (xlO6) + směrodat. odchylka
CD8a-CD4-	0,81 ± 0,15	0,49 ± 0,07	0,26 ± 0,04	0,35 + 0,05
CD8a+CD4-	0,36 + 0,02	0,35 ± 0,07	0,16 ± 0,02	0,2 + 0,02
CD8a-CD4+	0,92 ± 0,02	0,84 ± 0,15	0,4 ± 0,06	0,55 ± 0,04

Tento pokles slezinných DC, což jsou kritické buňky prezentující antigen, má dopad na aktivaci B lymfocytů, jejich zrání a celkovou humorální imunitu.

Zmražené řezy ze sleziny myší byly připraveny jak bylo popsáno v části Materiály a metody. Myši léčené BCMA-Ig vykazovaly atypický profil usazování DC, když byly vzorky obarveny anti-CDllc. DC jsou normálně lokalizovány uvnitř oblastí T lymfocytů v bílé dřeni a marginální zóně, s tím, že k jejich koncentraci dochází v můstkových kanálcích marginální zóny. Avšak bylo zjištěno, že DC z myší léčených BCMA-Ig se vyskytují podél hranice marginální zóny a jen několik málo bylo schopno migrovat hlouběji do bílé dřeně (data nejsou uvedena). Tudíž blokování interakce BAFF/BAFF-R užitím rozpustného receptoru BAFF se zdá narušovat profil osidlování DC, což zřejmě ovlivňuje jejich schopnost fungovat jako buňky prezentující antigen, a tudíž má důsledky pro aktivaci a zrání B lymfocytů a také humorální imunitu. Navíc sleziny myší léčených BCMA-Ig postrádají CD35+ FDC, jak bylo zjištěno imunohistochemickou analýzou (data neuvedena). Jelikož funkcí FDC je prezentovat antigen B-lymfocytům v germinálních centrech (GC), nedostatek těchto buněk může mít škodlivý • ···· ·· 99 99 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 99 9 9 9 9 9 9

účinek na strukturu GC a afinitní zrání B lymfocytů.

Odborníkovi je jasné, že jsou možné různé modifikace a varianty polypeptidů, přípravků a způsobů podle vynálezu, avšak v rámci shodné vynálezecké myšlenky předloženého vynálezu. I tyto případné modifikace a varianty spadají do rozsahu vynálezu, který je definován připojenými patentovými nároky a jejich ekvivalenty.

I

φφφφ φφ ·· • φ · » · · • · · φ * • φφφφ · ·· ·· φφφφ

Claims (8)

00(5 • · · · · · · · ·· · · • ···· ·«·· ··· ·· · ·· · PATENTOVÉ NÁROKY

1/19 §^ω |>^ω 1 ^Q - 8 g^QS^HS* co

ů vl 5 < XI CQ O CN O CN

ga.go.^_i^uj — 8 h o < ·< <

S—^ω8ι-6<

1. Použití sloučeniny vybrané ze skupiny obsahující:

a) polypeptid BAFF-R nebo jeho fragment,

b) chimérickou molekulu obsahující polypeptid BAFF-R nebo jeho fragment fúzovaný s heterologní aminokyselinovou sekvencí,

c) homolog protilátky anti-BAFF-R, pro výrobu farmaceutického přípravku pro inhibování růstu B lymfocytů u zvířat.

2/19

H ?

X S ^W ^^OQ ě^{4 J H}

0^LLLL^Q-CL^ Z £-< 6h U

a. <> > gcuc. ° >^LULU^H-L-^ > £ j^ZZrfJZZ g500 -iSoop<0<»3zz

Q.

QLL •J

IX £h ^Qá ω co p ω ω β > >

ΟΟρΟΟΟωω >s

CO

CL >

>

O

L>

ω cl > § O O £^00

-> § < <

-J § 2 2 »<

-j g σ σ e§ <

>8 tu > § 0 _ 0 o § 2 5 rh ·* t- §^hh »<

§C(C^2z| ϋ ”* ^H H goo g>>

2. Použití sloučeniny vybrané ze skupiny obsahující:

a) polypeptid BAFF-R nebo jeho fragment,

b) chimérickou molekulu obsahující polypeptid BAFF-R nebo jeho fragment fúzovaný s heterologní aminokyselinovou sekvencí,

c) homolog protilátky anti-BAFF-R, pro výrobu farmaceutického přípravku pro inhibování tvorby imunoglobulinů u zvířat.

3/19 ο g ζ is ω y ω <jj>

ω 8 z g z

ω §

w 8

O w

LL

Z ω

_i

V) <0

LL

O ^HS

CM CM CM P* ^Q§

0.8 z 8 >y

3 rd V rd rd xl< CO rd x*

CM

LjQ o

ω g cc ·<

α.

σ § ζ

~§ Η § Ζ 8

-§

α.

<

ζ

Ο <δ «Η «Η LO η ιη

Η rri α> ο Η <£>

«Η «Η Ο C0 CM VO

9 9 9 9 ·· 9 9

9 9 9 9 9 9 9 · 9 9 • 9 9 9 9 9 · 9 9 ·

9 9 9 9 · · » · φ * 9 · · 9 · 9 « ····»♦ 99 9 9 9 9 ·· 9 9 9 9

3. Použití sloučeniny vybrané ze skupiny obsahující:

a) polypeptid BAFF-R nebo jeho fragment,

b) chimérickou molekulu obsahující polypeptid BAFF-R nebo jeho fragment fúzovaný s heterologní aminokyselinovou sekvencí,

c) homolog protilátky anti-BAFF-R, pro výrobu farmaceutického přípravku pro inhibování růstu a zrání B lymfocytů indukovaného dendritickými buňkami u zvířat.

< *4 <5 O — *?^d<Sco < < o <

tu & —

E~* g^Q o co o g o g ω δ **4

LU y«y>H° *2 tu S lu

M g_8 rri

CN >Ó >Ó <

<

ΟΙ.

JO

O

CL 8 CO *4

O ..

ω f: u. g > g cc > ^ o o <

e^xš co *U M Uu

HHHHHHHHrirl

OpCOCNCN^COCOxPCO

4. Použití sloučeniny vybrané ze skupiny obsahující:

a) polypeptid BAFF-R nebo jeho fragment,

b) chimérickou molekulu obsahující polypeptid BAFF-R nebo jeho fragment fúzovaný s heterologní aminokyselinovou sekvencí,

c) homolog protilátky anti-BAFF-R, pro výrobu farmaceutického přípravku pro léčení autoimunitních nemocí.

5:

>

UJ

a.

UJ

UJ

OC

CL δ

o CL g o S rd rd CO O ω

ω δ *3 v- S5 ^x 3

L— <y ·<

rd rd O CO H cn rd rd

|5 O O H w w

0. Q.

g--._ázzg ^ř'oo8oo8

u.§ >3«X j2> 0 w«

Cd ^Wg

Z^² >- g σ§ o

*á

LU o

z

LU ω o . JL

I rd rd U>

τ}· co

O >Ó

Ω Ω rd

CN g X X g cc cc θ g-jjgoag

X A JL A.

d CD H ri CO rl H

N rl x# 05 Π M5 <q* rd rd CN

LU ω

iug aB

5. Použití inhibitoru růstu B lymfocytů vybraného ze skupiny obsahuj ící:

a) polypeptid BAFF-R nebo jeho fragment,

b) chimérickou molekulu obsahující polypeptid BAFF-R nebo jeho fragment fúzovaný s heterologní aminokyselinovou sekvencí,

c) homolog protilátky anti-BAFF-R, pro výrobu farmaceutického přípravku pro léčení hypertenze u zvířat.

6. Použití inhibitoru růstu B lymfocytů vybraného ze skupiny obsahuj ící:

a) polypeptid BAFF-R nebo jeho fragment,

b) chimérickou molekulu obsahující polypeptid BAFF-R nebo jeho fragment fúzovaný s heterologní aminokyselinovou sekvencí,

c) homolog protilátky anti-BAFF-R, pro výrobu farmaceutického přípravku pro léčení onemocnění ledvin u zvířat.

7. Použití inhibitoru růstu B lymfocytů vybraného ze skupiny obsahuj ící:

- 50 a) polypeptid BAFF-R nebo jeho fragment,

b) chimérickou molekulu obsahující polypeptid BAFF-R nebo jeho fragment fúzovaný s heterologní aminokyselinovou sekvencí,

c) homolog protilátky anti-BAFF-R, pro výrobu farmaceutického přípravku pro léčení lymfoproliferativních onemocnění B lymfocytů.

8. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, kde polypeptid

BAFF-R je rozpustný.

9. Použití podle nároku 8, kde rozpustný polypeptid BAFF-R obsahuje extracelulární doménu BAFF-R.

10. Použití podle nároku 9, kde extracelulární doména BAFF-R je fúzována s imunoglobulinem.

11. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, kde polypeptid

BAFF-R je vybrán ze skupiny obsahující:

a) nativní sekvenci polypeptídu BAFF-R obsahující aminokyselinové zbytky 1 až 184 ze SEKVENCE ID. Č. 1 nebo její fragment,

b) polypeptid BAFF-R mající alespoň 80% aminokyselinovou sekvenční identitu se sekvencí nativního polypeptídu BAFF-R obsahující aminokyselinové zbytky 1 až 184 ze SEKVENCE ID. Č. 1 nebo jeho fragment,

c) polypeptid BAFF-R mající alespoň 90% aminokyselinovou sekvenční identitu se sekvencí nativního polypeptídu BAFF-R obsahující aminokyselinové zbytky 1 až 184 ze SEKVENCE ID. Č. 1 nebo jeho fragment,

d) polypeptid BAFF-R obsahující aminokyselinové zbytky 1 až 51 ze SEKVENCE ID. Č. 1 nebo jeho fragment, • · ·* ···* • · ·© · · · · · · ♦ © ©·· » · · © · • · · · · · · · · ©· · · ·· ····

- 51 e) polypeptid BAFF-R obsahující aminokyselinové zbytky 8 až 41 ze SEKVENCE ID. Č. 1 nebo jeho fragment.

12. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11, kde homolog protilátky anti-BAFF-R je monoklonální protilátka.

13. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 11, kde homolog protilátky anti-BAFF-R obsahuje BCMA-IgG.

14. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13, kde zvíře je savec.

15. Použití podle nároku 14, kde savec je člověk.

16. Použití činidla schopného narušit spojení mezi BAFF-R a BAFF pro výrobu farmaceutického přípravku pro léčení, potlačení nebo změnění imunitní reakce zahrnující signální dráhu mezi BAFF-R a BAFF.

17. Použití protilátky specifické pro BAFF-R nebo jeho aktivní fragment pro výrobu farmaceutického přípravku pro inhibování zánětů.

18. Použití protilátky specifické pro BAFF-R nebo jeho epitop pro výrobu farmaceutického přípravku pro inhibování zánětů.

19. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid BAFF-R nebo jeho fragment a farmaceuticky přijatelný nosič.

20. Farmaceutický přípravek podle nároku • · ··· ·

- 52 vyznačující se tím, že polypeptid BAFF-R je vybrán ze skupiny obsahující:

a) nativní sekvenci polypeptidů BAFF-R obsahující aminokyselinové zbytky 1 až 184 ze SEKVENCE ID. Č. 1 nebo její fragment,

b) polypeptid BAFF-R mající alespoň 80% aminokyselinovou sekvenční identitu se sekvencí nativního polypeptidů BAFF-R obsahující aminokyselinové zbytky 1 až 184 ze SEKVENCE ID. Č. 1 nebo jeho fragment,

c) polypeptid BAFF-R mající alespoň 90% aminokyselinovou sekvenční identitu se sekvencí nativního polypeptidů BAFF-R obsahující aminokyselinové zbytky 1 až 184 ze SEKVENCE ID. Č. 1 nebo jeho fragment,

d) polypeptid BAFF-R obsahující aminokyselinové zbytky 1 až 51 ze SEKVENCE ID. Č. 1 nebo jeho fragment,

e) polypeptid BAFF-R obsahující aminokyselinové zbytky 8 až 41 ze SEKVENCE ID. Č. 1 nebo jeho fragment.

21. Farmaceutický přípravek podle nároku 19 vyznačující se tím, že fragment polypeptidů BAFF-R obsahuje extracelulární doménu BAFF-R fúzovanou s imunoglobulinem.

• · »····· ^V7

SEKVENCE 'ΟΝΝΝωΟΜ'» rN H CN

8 «<

_Λ o °s *§ „ Q Z gí «5 > 8 i- o

O ^JS (Λ z

σ

H >

X z

X <

LU