CZ2001977A3

CZ2001977A3 - Kombinace účinných látek

Info

Publication number: CZ2001977A3
Application number: CZ2001977A
Authority: CZ
Inventors: Nathaniel Brown; Lynn D. Condreay; Douglas Fraser Gray; Marc Rubin
Original assignee: Glaxo Group Limited
Priority date: 1998-09-18
Filing date: 1999-09-17
Publication date: 2001-08-15
Also published as: EP1113802B1; AU755633B2; NO20011358D0; JP2002526441A; ES2223183T3; AR023661A1; HUP0103858A2; IL141844A0; AU6085199A; NO20011358L; PL358988A1; HUP0103858A3; CN1326349A; DE69918447D1; KR20010075192A; HK1035670A1; BR9913791A; DE69918447T2; ZA200101920B; KR100413312B1

Description

Oblast techniky

Vynález se týká kombinace účinných látek s protivirovým účinkem a farmaceutického prostředku, který takovou kombinaci obsahuje a je určen k léčení infekcí HBV včetně infekcí mutantami, odolnými proti inhibitorům replikace viru hepatitidy B nukleosidové i nenukleosidové povahy.

Dosavadní stav techniky

Hepatitida B je virové onemocnění, které se přenáší perorálně nebo parenterálně kontaminovaným materiálem, například krví, krevními produkty, kontaminovanými jehlami, sexuálním stykem nebo vertikálně z infikované matky na její potomky. V těch oblastech, kde toto onemocnění je běžné dochází při vertikálním přenosu v raném věku k chronickému nosičství hepatitidy B u poměrně velkého podílu populace. Předpokládá se, že přibližně 350 milionů lidí trpí chronickou infekcí virem hepatitidy B, přičemž přibližně 150 milionů z těchto lidí může zemřít na toto jaterní onemocnění v případě, že nebude účinně léčeno.

V současné době je běžným léčebným přístupem k infekci hepatitidy B pouze opakovaná aplikace interferonu. Při této léčbě může docházet k nepříjemným vedlejším účinkům, současně dochází k dlouhodobému příznivému vlivu pouze nejvýš u jedné třetiny léčených nemocných. Interferon je modulátor imunitního systému, který zvyšuje schopnost organismu, zejména jeho • · · · · • · · · ··· · • 4 · 4 4 4 imunitního systému bránit se proti onemocnění.

V literatuře se uvádí, že také lamivudin je účinný proti infekci HBV. V testech, trvájícíchdva roky bylo prokázáno, že u většiny nemocných po podávání této látky dojde k podstatnému snížení replikace viru, přičemž u % nemocných nebylo možno na konci druhého roku virus vůbec prokázat.

Adefovir má rovněž in vitro účinnost proti viru HBV a bylo také prokázáno, že perorálně podávaný prekursor adefoviru, adefovirdipivoxil je účinný proti replikaci HBV in vivo. Prostředek je nyní ve druhé fázi klinických zkoušek na nemocných s chronickou infekcí virem hepatitidy B.

V literatuře se také uvádí, že neexistuje zkřížená odolnost k PMEA v případě polymerázy DNA lidského hepatitidy B, zejména v případě exprese kodonů pro lamivudin (X. Xiong a další, Hepatology, sv. 26, č. 4, část 2, 1997, Abstract č. 1211).

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří kombinace účinných látek, která je tvořena (2R,cis)-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l, 3-oxathiolan-5-yl)-pyrimidin-2-onem nebo jeho farmaceuticky přijatelným derivátem a druhou účinnou látkou, bis-(pivaloyloxymethyl)-9-[(R)-2-(fosfonomethoxy)ethyl]adeninem nebo jeho farmaceuticky přijatelným derivátem, přičemž (2R, cis)-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-pyrimidin-2-on a druhá účinná látka jsou v kombinaci obsaženy v poměru ···· ·· ···· ·· • · · · ·· •·· · ···· ·· • 44 4 4444

40:1 až 1:1.

Použití kombinace podle vynálezu je výhodné v tom smyslu, že při tomto použití je možno zajistit ekvivalentní protivirový účinek při snížené toxicitě nebo zvýšení účinnosti vzhledem k synergii mezi použitými sloučeninami. Při použití celkově nižších dávek účinných látek patrně také dojde ke snížení frekvence vzniku odolných kmenů HBV.

Bylo zjištěno, že lamivudin poskytuje neočekávané výhody při použití v kombinaci s adefovirem. Tato kombinace vykazuje statisticky významný synergní účinek proti HBV. Výsledky prokazují, že také kombinace lamivudinu a adefovirdipivoxilu má synergní účinek proti HBV. Může tedy dojít k úplnějšímu potlačení viru po delší období, k omezení vzniku odolných mutant HBV a tím k lepším výsledkům při léčení chronické hepatitidy B. Současně je snížena toxicita použité kombinace. Vzhledem k synergnímu účinku je možno snížit celkovou dávku, například počet tablet, které je nutno denně podávat.

Je zřejmé, že pokud se uvádí léčení hepatitidy, týká se tento údaj jak léčení vzniklé infekce a jejích příznaků, tak prevence tohoto onemocnění.

Farmaceuticky přijatelné soli lamivudinu, adefoviru nebo adefovirdipivoxilu mohou být odvozeny od anorganických i organických kyselin. Jako příklad vhodných kyselin lze uvést kyselinu bromovodikovou, chlorovodíkovou, sírovou, dusičnou, chloristou, fumarovou, maleinovou, fosforečnou, glykolovou, mléčnou, salicylovou, jantarovou, toluen-p-sulfonovou, vinnou, [

• ···· ·· ···· ·· · • · · ··· · · · · • ··· · ···· · · · • · · · · ···· · octovou, citrónovou, methansulfonovou, mravenčí, benzoovou, jablečnou, naftalen-2-sulfonovou a benzensulfonovou. Další kyseliny, například kyselina šťavelová poskytují soli, které sice nejsou farmaceuticky přijatelné, je však možno je využít při přípravě solí jako meziprodukty pro získání sloučenin podle vynálezu a jejich farmaceuticky přijatelných adičních solí s kyselinami.

Soli, odvozené od příslušných baží zahrnují soli s alkalickými kovy, například sodnou sůl, soli s kovy alkalických zemin, například hořečnatou sůl, amonné soli a soli typu NR₄ ⁺, kde R znamená Cl-C4alkyl.

Výhodné estery lamivudinu, adefoviru nebo adefovirdipivoxilu je možno volit nezávisle z následujících skupin: (1) estery karboxylových kyselin, v nichž se nekarbonylová část esterové skupiny volí z alkylových skupin s přímým nebo rozvětveným řetězcem, může jít například o methyl, n-propyl, terc.butyl nebo n-butyl, cykloalkyl, alkoxyalkyl, jako methoxymethyl, aralkyl, jako benzyl, aryloxyalkyl jako fenoxymethyl, aryl, například fenyl, popřípadě substituovaný například atomem halogenu, Cl-C4alkylovou skupinou nebo Cl-C4alkoxyskupinou nebo může j ít o aminoskupinu, (2) sulfonátové estery, například alkylsulfonylestery nebo aralkylsulfonylestery, jako methansulfonylester, (3) estery s aminokyselinami, například L-valylester nebo L-isoleucylester a (4) fosfonátové estery. V těchto esterech, není-li uvedeno jinak, může jakákoliv alkylová skupina obsahovat 1 až 18, s výhodou 1 až 6 a zvláště 1 až 4 atomy uhlíku, cykloalkylová skupina s výhodou obsahuje 3 až 6 atomů uhlíku a arylovou skupinou v těchto • ··· · ·· ·· · · ·· · • · · · · · ···· • ··· · ···· · · · • · · · · · · · · φ • · · · ···· ······ ·· · · · ·· ··· esterech je s výhodou fenyl. V případě, že se uvádějí popsané látky, padají vždy v úvahu také jejich fyziologicky přijatelné soli.

Zvláště výhodnými estery jsou mono-, di- a trifosfátové estery lamivudinu, popřípadě blokované nebo jakékoliv jiné látky, které po podání nemocnému takové estery přímo nebo nepřímo uvolní.

Druhou účinnou látkou v kombinaci podle vynálezu je s výhodou bis(pivaloyloxymethyl)-9-[(R)-2-(fosfonomethoxy)ethyl]adenin nebo jeho farmaceuticky přijatelný derivát.

Pojem „farmaceuticky přijatelný derivát zahrnuje farmaceuticky přijatelné soli, estery nebo soli těchto esterů lamivudinu, adefoviru nebo adefovirdipivoxilu nebo jakoukoliv sloučeninu, která poé podání nemocnému může přímo nebo nepřímo uvolnit účinnou látku nebo její metabolit nebo zbytek s protivirovým účinkem.

Součást podstaty vynálezu tvoří svrchu uvedená kombinace pro použití k léčebným účelům, zvláště k léčeni infekce HBV včetně infekcí, při nichž je virus odolný proti inhibitorům replikace nukleosidové a/nebo nenukleosidové povahy.

Nemocnému se podává léčebně účinné množství kombinace podle vynálezu, s výhodou ve formě farmaceutického prostředku.

Je zřejmé, že sloučeniny, které tvoří kombinaci podle vynálezu, mohou být podávány současně v tomtéž • · » · · · · · · · · · · ··· · · · · · · ···· · ···· · · • · · · · ♦ · ♦ · farmaceutickém prostředku nebo v oddělených farmaceutických prostředcích nebo také následně. V případě, že jde o následné podání, neměl by být odstup mezi podáním první a druhé složky rak velký, aby došlo ke ztrátě příznivého synergního léčebného účinku obou složek kombinace. Je také zřejmé, že lamivudin a adefovirdipivoxil nebo farmaceuticky přijatelné deriváty těchto látek nebo adefovir je možno podávat jednotlivě. Lamivudin a adefovir dípívoxil nebo adefovir se s výhodou podávají současně nebo následně, zvláště současně.

S výhodou se kombinace podle vynálezu podává ve formě jediného farmaceutického prostředku.

Součást podstaty vynálezu tvoří také použití lamivudinu pro výrobu farmaceutického prostředku pro podávání současně nebo následně s adefovirem nebo adefovirdipivoxilem k léčení infekce HBV. Je zřejmé, že lamivudin, adefovirdipivoxil nebo adefovir mohou být použity pro výrobu společného farmaceutického prostředku.

Lamivudin a adefovirdipivoxil nebo adefovir jsou s výhodou v kombinaci přítomny v poměru, který zajišťuje synergní účinek.

K synergnímu účinku v kombinaci lamivudinu a adefovirdipivoxilu nebo adefcviru nebo farmaceuticky přijatelných derivátů těchto látek dochází při hmotnostním poměru těchto látek 40:1 až 1:1, s výhodou v hmotnostním poměru 25:1 až 15:1.

Každá z použitých látek v kombinaci je s výhodou přítomna v množství, při němž je účinná proti HBV v případě, že je použita samostatně.

Množství kombinace lamivudinu a adefoviru nebo adefovirdipivoxilu při použití proti infekci HBV se bude měnit v závislosti na různých faktorech, jako jsou způsob podání, složení farmaceutického prostředku, hmotnost nemocného, jeho věk a celkový zdravotní stav a také povaha a závažnost léčeného onemocnění, konečnou dávku musí vždy určit ošetřující lékař.

Obecně je možno uvést, že denní dávka pro lamivudin se bude pohybovat v rozmezí 0,1 až 50 mg/kg tělesné hmotnosti příjemce denně, s výhodou půjde o dávku 0,5 až 20 a zvláště 0,5 až 2 mg/kg hmotnosti, denně.

Sloučenina se s výhodou podává v celkovém množství 100 mg denně.

V případě adefovirdipivoxilu se bude vhodná denní dávka pohybovat v rozmezí 0,01 až 10 mg/kg tělesné hmotnosti příjemce denně, s výhodou půjde o dávku 0,01 až 1 mg a zvláště 0,01 až 0,05 mg/kg hmotnosti denně.

Adefovirdipivoxil se obvykle podává v celkové denní dávce přibližně 10 mg.

V případě adefoviru se bude vhodná denní dávka pohybovat v rozmezí 0,01 až 10 mg/kg tělesné hmotnosti příjemce za den, s výhodou půjde o dávku 0,01 až 1 mg a zvláště 0,01 až 0,05 mg/kg hmotnosti denně.

Adefovir se obvykle podává v celkové denní dávce přibližně 10 mg.

ΦΦΦΦ • ΦΦΦΦ ·Φ • · Φ 4 4 · 4444

ΦΦΦ 4 Φ Φ ΦΦ Φ Φ Φ φ ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ Φ φ Φ Φ Φ Φ ΦΦΦ

ΦΦΦ ΦΦΦ ΦΦ ΦΦΦ ΦΦ ΦΦΦ

Pokud není uvedeno jinak, jsou všechny hmotnostní údaje, týkající se účinných složek přepočítány na účinnou látku jako takovou. V případě použití farmaceuticky přijatelných derivátů lamivudinu, adefovirdipivoxilu nebo adefoviru nebo v případě solvátů budou uváděná čísla úměrně zvýšena. Celková denní dávka se obvykle podává ve formě dvou, tří, čtyř, pěti, šesti nebo ještě většího počtu dílčích dávek, které jsou podávány v příslušných intervalech v průběhu dne. Dílčí dávka může například obsahovat 1 až 1500, s výhodou 5 až 1000 a zvláště 5 až 500 mg účinné látky. V případě potřeby je možno účinnou látku podávat také ve formě kontinuální infuze.

I když je možno podávat jednotlivé složky kombinace jako chemické látky, je výhodné je podávat ve formě farmaceutického prostředku. Farmaceutický prostředek podle vynálezu bude obsahovat kombinaci podle vynálezu spolu s jedním nebo větším počtem farmaceuticky přijatelných nosičů nebo pomocných látek a popřípadě spolu s dalšími účinnými složkami. Nosič musí být přijatelný v tom smyslu, že musí být kompatibilní s ostatními složkami prostředku a nesmí být škodlivý pro příjemce. V případě, že se složky kombinace podávají odděleně, podává se každá z nich s výhodou ve formě farmaceutického prostředku.

Kombinace lamivudinu a adefovirdipivoxilu nebo adefoviru nebo farmaceuticky přijatelných derivátů těchto látek, je s výhodou společně zpracována na farmaceutický prostředek spolu s jedním nebo větším počtem farmaceuticky přijatelných nosičů. S výhodou jde o lékovou formu pro jednotlivé podání, která obsahuje ·· ···· • · · · · ····· • · ·♦ · · · ··· · · • · · · · · ·· · · • ······· ··· ··· ·· ··· ·· ··· každou z účinných látek v množství 1 mg až 2 g, například 2 až 200 mg, může jít například o 25 až 150 mg lamivudinu a 5 až 60 mg adefoviru nebo adefovirdipivoxilu.

Farmaceutické prostředky mohou být s výhodou baleny jako blistr. Může jít o balení, připravené přímo pro jednotlivého nemocného. V tomto případě sama lékarna uloží příslušné dávky, propočítané pro určitého nemocného do blistru a doplní je příslušným návodem pro použití. Bylo prokázáno, že v případě těchto balení nemocný lépe spolupracuj e.

Je zřejmé, že zpracování jednotlivých účinných látek kombinace na takové balení může přispět ke správnému použití farmaceutického prostředku, což je rovněž žádoucí vlastností prostředku podle vynálezu.

Vynález se týká také dvojitého balení, které obsahuje lamivudin pro oddělené podávání a adefovirdipivoxil nebo adefovir nebo jejich farmaceuticky přijatelné deriváty, rovněž pro oddělené podání.

Farmaceutické prostředky mohou být určeny pro podání perorální, rektální, místní včetně transdermálního podání, podání ústní sliznicí a podání pod jazyk, dále může jít o podání nosní sliznicí, do pochvy nebo o parenterální podání včetně podání podkožního, nitrosvalového, nitrožilního a nitrokožního. Farmaceutické prostředky jsou obvykle zpracovány na lékové formy s obsahem jednotlivé dávky a je možno je připravit běžnými postupy. Obvykle se postupuje tak, že se účinná látka smísí s nosičem, tvořeným jednou nebo větším počtem pomocných látek. Výsledný výrobek je možno zpracovat na požadovaný tvar.

Prostředky podle vynálezu, vhodné pro perorálni podáni, mohou být zpracovány například na kapsle, oplatky nebo tablety, z nichž každá obsahuje předem stanovené množství účinné látky ve formě prášku nebo granulátu nebo také ve formě suspenze ve vodném nebo nevodném prostředí nebo ve formě emulze typu olej ve vodě nebo voda v oleji. Účinná látka může být také zpracována na mazání nebo pastu.

Tablety je možno vyrábět lisováním nebo odléváním, popřípadě při použití pomocných látek. Lisované tablety je možno připravit slisováním účinných složek ve volně sypné formě, například ve formě prášku nebo granulátu ve vhodném tabletovacím stroji. Materiál může obsahovat pomocné látky, jako pojivá, například polyvinylpyrrolidon, želatinu nebo hydroxypropylmethylcelulózu, kluzné látky, inertní ředidla, konzervační prostředky, desintegrační činidla, například sodnou sůl glykolátu škrobu, zesítěný polyvinylpyrrolidon nebo zesítěnou sodnou sůl karboxymethylcelulózy a také smáčedla nebo dispergační činidla. Odlévané tablety se připravují odlitím směsi práškového materiálu, zvlhčeného inertním tekutým ředidlem ve vhodném zařízení. Tablety mohou být povlékány nebo mohou být opatřeny dělicí rýhou a mohou být upraveny pro zpomalené nebo řízené uvolňování účinné látky, například s použitím různých podílů hydroxypropylmethylcelulózy tak, aby došlo k požadovanému profilu uvolňování účinné látky v průběhu času. Tablety mohou také být opatřeny enterosolventním povlakem tak, aby k uvolnění účinné látky došlo až ve dvanáctníku po průchodu žaludkem.

.«.-.τΛΛΐ •9 «999

Kombinace podle vynálezu se s výhodou podává perorálně.

Prostředky, určené pro místní podání ústní sliznicí zahrnují například kosočtverečné tablety, které obsahují účinnou složku v ochuceném základu, obvykle jde o sacharózu a akácii nebo tragakanth, dále může jít o pastilky, obsahující účinnou složku v inertním základu, například ve směsi želatiny a glycerolu nebo sacharózy a akácíe a také o ústní vody, které obsahují účinnou látku ve vhodném kapalném nosiči. Prostředky pro rektální podání mohou mít formu čípků s použitím vhodného základu, například kakaového másla nebo salicylátu.

Místní podání je možno uskutečnit také pomocí transdermální iontoforézy.

Prostředky, vhodné pro podání do pochvy mohou mít formu pesaru, tamponu, krému, gelu, pasty, pěny nebo spreye, tyto prostředky obsahují kromě účinné látky vhodné nosiče pro uvedené prostředky.

Farmaceutické prostředky pro rektální podání jsou obvykle zpracovány na čípky, které obsahují jednotlivou dávku. Vhodným nosičem je kakaové máslo nebo jiné běžné materiály. Čípky je možno připravit smísením účinné složky s roztaveným nebo změkčeným základem, načež se směs nalévá do forem, v nichž se zchladí.

Farmaceutické prostředky pro parenterální podání zahrnují vodné a nevodné izotonické sterilní injekční roztoky, které mohou obsahovat antioxidační činidla,

444 • 4 •

• 444

4« • 44444 •4 •4»* pufry, bakteriostatické látky a rozpuštěné sloučeniny k zajištěni izotonicity s krví příjemce. Může také jít o vodné nebo nevodné sterilní suspenze, obsahující suspenzní činidla a zahušťovadla a také o liposomy nebo další mikročásticové systémy, určené pro aplikaci krevním proudem do různých orgánů. Tyto prostředky mohou být dodávány v ampulích nebo lahvičkách s obsahem jednotlivé dávky nebo většího počtu dávek a mohou také být skladovány v lyofilizované formě, k níž se přidává sterilní kapalný nosič, například voda pro injekční podání bezprostředně před použitím. Injekční roztoky a suspenze je možno těsně před podáním připravit také ze sterilních prášků, granulátů a tablet.

Výhodné lékové formy jsou takové lékové formy, které obsahují denní dávku nebo zlomek denní dávky.

Kromě svrchu uvedených složek mohou farmaceutické prostředky s obsahem kombinace podle vynálezu obsahovat ještě další účinné látky a další pomocné látky, jako jsou sladidla, zahušťovadla a lá~ky pro úpravu chuti.

Účinné látky kombinace podle vynálezu je možno připravit běžným způsobem. Způsob výrobu lamivudinu je popsán v mezinárodních patentových přihláškách WO 91/17159 a WO 95/29174.

Způsoby výroby adefoviru jsou popsány v evropském patentovém spisu číslo 206459.

Způsob výroby adefovirdipivoxilu je popsán v evropském patentovém spisu č. 481214.

* ····	·*	···*	··	•
·· ·	9 ·	•	* ·	··
• · ··	• ·	···	•	•
• · ·	•	•	• 9	• ·	•
• ·	•	•	•	•	•	•
	··		··	«··

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu předmětu vynálezu. Pod pojmem „účinná složka se v průběhu příkladů rozumí lamivudin, adefovirdipivoxil nebo adefovir nebo fyziologicky funkční deriváty uvedených látek.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Tablety

Následující prostředky A, B a C byly připraveny granulací složek za vlhka při použití roztoku polyvinylpyrrolidonu s následným přidáním stearanu horečnatého a slisováním.

Prostředek A	mg/tableta
Účinná složka A	100
Účinná složka B	30
Laktóza	105
Polyvinylpyrrolidon	7
Sodná sůl glykolátu	škrobu 10

Stearan hořečnatý

255

Prostředek B____________mg/tableta

Účinná složka A 100

Účinná složka B

Laktóza

Avicel PH 101

	14
Polyvinylpyrrolidon	7
Sodná sůl glykolátu	škrobu 10
Stearan hořečnatý	3
	155
Prostředek C	mg/tableta
Účinná složka A	100
Účinná složka B	5
Laktóza	100
Škrob	25
Polyvinylpyrrolidon	2
Stearan hořečnatý	2

234

Následující prostředky D a E byly připraveny přímým slisováním směsi složek. Laktóza, použitá v prostředku E je laktóza pro přímé lisování (Dairy Crest - Zeparox).

Prostředek D	mg/tableta
Účinná Účinná Předem	složka A složka B gelatinizovaný škrob NF 15	100 30 75
205

Prostředek E_____________mg/tableta

Účinná složka A 100

Účinná složka B 5

Laktóza

Avicel

225

Prostředek F (s řízeným uvolňováním)

Tento prostředek je možno připravit granulací složek za vlhka při použití roztoku polyvinylpyrrolidonu s následným přidáním stearanu hořečnatého a lisováním.

mg/tableta

Účinná složka A 100 Účinná složka B 30 Hydroxypropylmethylcelulóza 28 (Methocel K4M Prémium)

Laktóza 13 Polyvinylpyrrolidon 7 Stearan hořečnatý______________2

180

Uvolnění účinné látky trvá 6 až 8 hodin a je zcela ukončeno až po 12 hodinách.

Příklad 2: Kapsle

Prostředek A

Kapsle se připravují smísením složek prostředku D z příkladu 1, směs se naplní do dvoudílných kapslí z tvrdé želatiny. Dále uvedený prostředek B se připraví obdobným způsobem.

Prostředek B__________________mg/kapsle

Účinná složka A 100

Účinná složka B 5

Laktóza

Sodná sůl glykolátu škrobu

Stearan horečnatý

	186
Prostředek C	mg/kapsle
Účinná složka A	100
Účinná složka B	30
Macrogel 4000	170
	300
Kapsle prostředku C se	připraví tak, že se roztaví
Macrogel 4000, účinná látka	se v němž disperguje a
tavenina se plní do dvoudílných kapsli z tvrdé želatiny
Prostředek D	mg/kapsle
Účinná složka A	100
Účinná složka B	5
Lecithin	50
Arašídový olej	50

205

Kapsle prostředku D se připravuji tak, že se účinná složka disperguje ve směsi lecithinu a arašídového oleje a směs se plní do elastických kapslí z měkké želatiny.

Prostředek E (kapsle s řízeným uvolněním)

Kapsle s řízeným uvolněním se připraví tak, že se složky a, b a c vytlačí vytlačovacím zařízením s následnou sferonizací a usušením vytlačeného materiálu. Sušené pelety se pak opatří povlakem pro řízení uvolňování (d) a plní se do dvoudílných kapslí z tvrdé • · • · · · želatiny.

mg/kapsle

(a)	Účinná složka	A	100
	Účinná složka	B	30
(b)	Mikrokrystalická celulóza	60
(c)	Laktóza		60
(d)	Ethylcelulóza		6

256

Příklad 3: Injekční prostředek

Prostředek A

Účinná složka A Ί00 mg

Účinná složka B 5 mg

Roztok kyseliny chlorovodíkové

0,1 M nebo roztok hydroxidu sodného

0,1 M do pH 4,0 až 7,0

Sterilní voda do 10 ml

Účinná složka se rozpustí ve většině vody s teplotou 35 až 40 °C a pH se upraví na 4,0 až 7,0 kyselinou chlorovodíkovou nebo hydroxidem sodným podle potřeby». Rak se směs doplní vodou na příslušný objem a zfiltruje se sterilizačním filtrem do sterilní lahvičky s tmavého skla s objemem 10 ml (typ 1), lahvička se těsně uzavře sterilním uzávěrem a překryje se těsnící fólií.

	18	• · · · • · · • ··· • • • · · · · ·
Prostředek B
Účinná složka A		12 5 mg
Sterilní bezpyrogenní	fosfátový

pufr pH 7 do

5 ml

Příklad 4: Injekce pro nitrosvalové podáni

Účinná složka A	100 mg
Účinná složka B	30 mg
Benzylalkohol	0,067 g
Glykofurol 75	0,94 g
Voda pro injekční podání do	3,00 ml

Účinná složka se rozpustí v glykofurolu. Přidá se benzylalkohol a po jeho rozpuštění se přidá voda do objemu 3 ml. Pak se směs zfiltruje přes sterilizační filtr a plní do sterilních lékovek z tmavého skla s objemem 3 ml (typ 1), lékovky se těsně uzavřou.

Příklad 5: Sirup

Účinná složka A

Účinná složka B

Roztok sorbitolu

Glycerol

Benzoát sodný

100 mg mg

0,6 g

0,85 g

0,0025 g

Broskvová příchuť 17.42.3169

0,0125 ml

Čištěná voda do

5,00 ml

Účinná složka se rozpustí ve směsi glycerolu a většiny čištěné vody. Pak se k roztoku přidá vodný roztok benzoátu sodného, roztok sorbitolu a nakonec broskvová příchuť. Objem se doplní čištěnou vodou a směs se důkladně promisí.

Příklad 6: Čípky

	mg/čípek
Účinná složka A	100
Účinná složka B	30
Tuhý tuk (Witepsol H15 - Dynamit Nobel)	1770
	1900

Pětina Witepsolu H15 se roztaví v nádobě, opatřené parní manžetou při teplotě nejvýš 45 °C. Účinná látka se nechá projít sítem s průměrem otvorů 200 μπι a přidá se za míchání k roztavenému základu při použití míchacího zařízení Silverson s hlavou, zajišťující střihavé namáhání, směs se mísí až do vytvoření homogenní disperze. Pak se při udržování směsi na teplotě 45 °C přidá ke suspenzi zbývající množství Witepsolu H15 a suspenze se míchá až do homogenity. Pak se celá suspenze nechá projít sítem z nerezové oceli s průměrem otvorů 250 μπι a za stálého míchání se nechá zchladnout na. 40 °C. Při teplotě 38 až 40 °C se směs plní po podílech 2,02 g do plastických forem s objemem 2 ml. Výsledné čípky se nechají zchladnout na teplotu místnosti.

Příklad 7: Pesary

Účinná složka A

Účinná složka B

Bezvodá dextróza mg/pesar

100

160

• · · · • · ···· • · ·

Bramborový škrob

150

Stearan horečnatý

418

Svrchu uvedené složky se smísí a pesary se připraví přímým slisováním směsi.

Biologické zkoušky

Příklad 8

Buňky lidského hepatoblastomu, linie Hep-G2-2.2.15, které konstitutivně produkují infekční HBV, byly naočkovány na mikrotitrační plotnu s 96 vyhloubeními při hustotě 5 x 10³ buněk na jedno vyhloubení. Pak byly buňky vystaveny působení kombinace lamivudinu a PMEA ve trojím opakování. Živné prostředí s obsahem uvedených účinných látek bylo doplňováno každý druhý den po dobu 9 dnů, po této době byly supernatanty odděleny a analyzovány na obsah HBV.

Kombinace lamivudin/PMEA byla podrobena dalším dvěma zkouškám v trojím opakování. Při pokusu 1 byl použit lamivudin v koncentraci 100 nM až 0,14 nM (vždy trojnásobné ředění ve sloupcích a PMEA, 9-[(R)-2-(fosfonomethoxy)ethyl]adenin, adefovir byl užit v koncentraci 1 mikroM až 10 nM, ředěný vždy 3,16x v řadách. Pokus 2 byl prováděn s ředěním lamivudinu 100 nM až 0,045 nM, ředění vždy 3x ve sloupcích a při použití PMEA v ředění 5 mikroM až 0,16 nM, ředění vždy 3,16x v řadách. Obě látky byly ředěny na oddělených mikrotitračních plotnách s 96 vyhloubeními a pak přeneseny na plotny, obsahující buňky v souvislé vrstvě.

Buňky byly pěstovány ve 150 mikrolitrech v prostředí RPMI 1640, doplněném 2 mM L-glutaminu a 10 % fetálního telecího séra. Před přidáním účinné látky bylo odebráno 120 mikrolitrů prostředí, ponecháno bylo pouze 30 mikrolitrů na vrstvě buněk, aby nedošlo k vysušení. Pak bylo přidáno 90 mikrolitrů čerstvého prostředí bez účinné látky a 30 mikrolitrů 5násobného ředění účinných látek. Lamivudin a PMEA byly podrobeny zkouškám také na plotnách v týž koncentracích jednotlivě. Údaje byly podrobeny úpravám s ohledem na kontrolní hodnoty, získané na buňkách bez účinných látek a byly vyjádřeny v procentech kontrolní hodnoty pro analytické účely.

Postup, užitý pro detekci HBV byl popsán v publikaci Jansen RW, Johnson LC, Averett, DR. High-Capacity in vitro assessment of anti-hepatitis B virus compound selectivity by a virion-specific polymerase chain reaction assay. Antimicrob Agents Chem 1993; 37 (3): 441447. Detekce HBV byla prováděna „vychytáním viru ze supernatantu na plotny, opatřené povlakem Anti-HBsAg, promytím, denaturací k uvolnění HBV DNA, pak byla uskutečněna metoda PCR při použití biotinylovaných primerů, na biotinylované produkty PCR byl vázán streptavidin za současné hybridizace při použití sondy, načež byl přidán substrát a byla odečtena optická hustota kolorimetrické reakce. Na každé plotně bylo uskutečněno ředění standardizovaného supernatantu s obsahem HBV a koncentrace HBV DNA ve zkušebních vyhloubeních byla vypočítána ze získané standardní křivky pro HBV. Použitelný rozsah detekce je nejméně 0,045 až 45 fg HBV DNA, takže je možno prokázat 30 kopií genomu. Vzorky byly podrobeny zkouškám při použiti pozitivních kontrol (0,448 fg/mikrolitr DNA plasmidu) a negativních kontrol

(prostředí RPMI, doplněné 2 nM L-glutaminu a 10 % fetálniho telecího séra.

Průměrná hodnota IC₅₀ a standardní odchylka pro tuto hodnotu ve trojím opakování byly vypočítány při použití SAS nelineární regrese, odpovídající Hillově rovnici pro každou křivku závislosti účinku na koncentraci. V případě, že mohlo být uskutečněno pouze jediné stanovení hodnoty IC50 pro určitou kombinaci dávek, byla užita standardní chyba z nejbližších koncentrací. Frakčni inhibiční koncentrace FIC50 byly vypočítány pro každou kombinaci a vyneseny ve formě isobologramu podle publikace Berenbaum, M. C., 1985, The Expected Effect of a Combination of Agents: the Generál Solution. J. Theor. Biol. 114, 413-431. Aby bylo možno vyjádřit statistickou významnost synergie nebo antagonismu, byl použit nepárový t-test pro srovnání součtu párových hodnot FIC50 s teoretickou hodnotou 1. Hodnoty P nižší než 0,05 byly považovány za statisticky významné. Srovnání hodnot P z různých pokusů musí být hodnoceno velmi pečlivě vzhledem k tomu, že se při pokusech užívá různých koncentračních rozmezí, použitelných při vytváření isobologramu. V některých případech nebylo možno využít všechny zkoušené koncentrace pro výpočet IC₅₀ vzhledem k tomu, že bylo dosaženo inhibice ve větším rozsahu než 50 % pro všechny použité dávky.

Na obr. 1 je znázorněn isobologram, získaný kombinací výsledků z obou pokusů, tento isobologram prokazuje statisticky významnou synergii.

Přiklad 9

Hodnota IC₅₀ pro PMEA byla stanovena proti divokému typu WT a proti HBV, odolnému proti lamivudinu, k jehož přechodné expresi dochází v dále popsané buněčné kultuře. Postup byl prováděn tak, že buňky HepG2 byly podrobeny přechodné transfekci plasmidem, obsahujícím genom HBV se sekvencí divokého typu nebo obsahující mutace genu pro reverzní transkriptázu, odolnou proti působení lamivudinu: M552I, M552V, L528M, L528MM552V. Již dříve bylo stanoveno, že pouze mutace M552I a L528MM552V je možno pozorovat u nemocných, infikovaných HBV, u nichž vzniká odolnost proti léčení lamivudinem, přestože také mutace M552V a L528M částečně přispívají ke ztrátě citlivosti na lamivudin při replikaci HBV in vitro podle publikace Allen MI, Deslauriers M, Andrews CW, Tipples GA, Walters KA, Tyrrell DLJ, Brown N for the Lamivudine Clinical Investigation Group, and Condreay LD.

Identification and characterization of mutations in hepatitis B virus resistant to lamivudine. Hepatology 1998; 27: 1670-1677. Buňky HepG2 byly naočkovány na plotny s 96 vyhloubeními Costar při použití 6300 buněk na jedno vyhloubení ve 150 mikrolitrech prostředí pro pěstování těchto buněk, šlo o Eaglovo prostředí v Dulbeccově modifikaci, DMEM, obsahující 10 % fetálního telecího séra. Buňky byly inkubovány přes noc při teplotě 37 °C. V případě každého vyhloubení vylo v průběhu transfekce inkubováno 75 ng DNA plasmidu a 0,5 mikrolitrů lipofectaminu (Gibco) 30 minut při teplotě místnosti v 12,5 mikrolitrech OptiMem (Gibco) před přidáním směsi DNA/lipofectamin k buňkám. Každé vyhloubení bylo propláchnuto 150 mikrolitry prostředí DMEM bez dalších přísad. Směs DNA/lipofectamin byla přidána do každého vyhloubení v celkovém objemu 150 mikrolitrů v prostředí

OptiMem. Buňky byly inkubovány s uvedenou směsí 5 hodin při teplotě 37 °C. Po této inkubaci bylo do každého vyhloubení přidáno 150 mikrolitrů prostředí DMEM s obsahem 20 % séra a plotny byly inkubovány přes noc při teplotě 37 °C. Pak bylo prostředí nahrazeno 150 mikrolitry prostředí pro buňky HepG2 nebo tímtéž prostředím s obsahem PMEA.

Buňky 2.2.15 byly naočkovány na plotny Costar s 96 vyhloubeními v množství 2250 buněk na vyhloubení ve 150 mikrolitrech úplného prostředí RPMI s obsahem 10 % fetálního telecího séra, pak byly buňky inkubovány přes noc při teplotě 37 °C. Prostředí bylo nahrazeno 150 mikrolitry úplného prostředí nebo prostředím s obsahem požadované koncentrace PMEA.

Buňky po transfekci i buňky 2.2.15, stabilně produkující HBV byly podrobeny působení běžného prostředí bez účinných látek nebo prostředí s obsahem PMEA, prostředí bylo obnoveno ve dnech 1, 3 a 5. Konečná koncentrace PMEA byla 25, 5, 1, 0,2, 0,04 mikroM pro kultury po transfekci plasmidem WT a pro kontrolní buňky

2.2.15 nebo 125, 25, 5, 1 a 0,2 mikroM pro všechny kultury, podrobené transfekci mutovaným plasmidem.

Množství HBV DNA bylo stanoveno v prostředí, v němž byly buňky pěstovány ve dni 7 způsobem podle publikace Jansen RW, Johnson LC, Averett, DR. High-Capacity in vitro assessment of anti-hepatitis B virus compound selectivity by a virion-specific polymerase chain reaction assay. Antimicrob Agents Chem 1993; 37 (3): 441447. Další podrobnosti jsou uvedeny v příkladu 8.

• 0

Cytotoxicita účinných látek byla stanovena barvením DNA při použití bisbenzimidu (H33342.3HC1.4 H₂0, Calbiochem Company, La Jolla CA) . Po oddělení živného prostředí byly buňky fixovány 30 minut 70% ethanolem. Buňky byly propláchnuty prostředím, prostým séra a inkubovány s bisbenzimidem jako barvivém pro DNA v koncentraci 33 mikrogramů/ml celkem 1 hodinu při teplotě 37 °C v prostředí, prostém séra. Fluorescenční hodnoty pro každé vyhloubení byly stanoveny při použití odečítacího zařízení Millipore Cytofluor 2350 (excitace 355 nm, emise 460 nm, jednotky byly určeny odhadem). Hodnoty CC50 pro každou sloučeninu (jde o koncentraci sloučeniny, která je cytotoxická pro 50 % buněk) byly stanoveny z procentuální údajů o toxicitě pro každou koncentrace sloučeniny ve srovnání s buňkami bez přítomnosti účinné látky při použití dále popsaného postupu.

Křivky závislosti účinku na koncentraci byly vytvořeny z každého konstruktu při přechodné transfekci tak, aby odpovídaly Hillově rovnici (y = Vmax * (1-(χ^Λη/(k^An+x^An) ) ) při použití nelineární regrese pro stanovení hodnoty IC50 (koncentrace účinné látky, která vyvolá inhibici produkce HBV DNA na 50 % ve srovnání s odpovídajícími kulturami bez účinné látky) a pro stanovení CC50 pro PMEA. Vypočítaná hodnota IC50 pro každý konstrukt je uvedena spolu s 95% mezemi spolehlivosti pro geometrické průměry n replikací. Program JMP (SAS, Cary NC) byl použit k vyhodnocení Studentova t-testu pro údaje, znamenající statisticky významné rozdíly mezi skupinami. IC50 pro PMEA proti WT HBV, produkovanému buňkami 2.2.15 (0,43

•		4 *	4444	4 4
• ·	4	• 4	4	• 4 4
•	¥4»	• 4	4 4 4	4 4
•	4 4	• 4	4	• 4 4
•	4	• 4	4	’ 4 4
		• 4	• 44	44 4

mikroM) byla srovnatelná s IC50 (0,7 mikroM) při použiti téže buněčné linie podle publikace Heijtink RA, De Wilde GA, Kruining J, Berk L, Balzarini J, De Clercq E, Holý A, Schalam SW. Inhibitory Effect of 9-(phosphonylmethoxyethyl)-adenine (PMEA) on Human and Duck Hepatitis B Virus Infection. Antiviral Research 1993; 21 (2), 141-153.

Tabulka 1. Srovnání IC₅₀ pro PMEA in vitro při použití WT HBV a HBV s obsahem mutací, odolných proti lamivudinu.

HBV konstrukf IC₅₀ PMEA (95%CI)	x-nás. změny 10^-.
2.2.15	0.43 uM (0.3 - 0.7 uM)	-
WT	0.53 uM (0.34 - 0.8 uM)
L528M/	1.3 uM (0.4-4.3 uM)⁺	2.5
M552V '
M552I	7.5 uM (1.8-32 uM)*	14
M552V	9.8 uM (3.1 - 31 uM)**	18 !
L528M	0.87 uM (0.4 - 2.0 uM)	1.6 í

* Statisticky významný rozdíl hodnoty IC₅₀ mezi mutantou HBV a WT HBV, p < 0,05.

+ Statisticky významný rozdíl mezi hodnotami IC₅₀, p < 0,05.

Pro buňky HepG2 byla cytotoxická hodnota IC50 pro PMPA vyšší než 125 mikroM, cytotoxická hodnota IC50 pro PMEA byla v rozmezí 25 až 40 mikroM.

Claims

Zastupuj e:

28 * ·«·· ·* ··«· ·· · • ♦ · · 4 · 4 4·· * ··♦ · 4 ··· 4 4« * 4 4 4 4 · * 44« 4 4 4 * ······ ·« ·♦« ,, P A T E N T 0 V É NÁROKY 1. Kombinace účinných látek, vyznačuj ící

se t i m, že je tvořena (2R,cis)-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl) -pyrimidin-2-onem nebo jeho farmaceuticky přijatelným derivátem a druhou účinnou látkou, bis-(pivaloyloxymethyl) -9-[(R) -2-(fosfonomethoxy)ethyl]adeninem nebo jeho farmaceuticky přijatelným derivátem, přičemž (2R, cis)-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl) -pyrimidin-2-on a druhá účinná látka jsou v kombinaci obsaženy v poměru 40:1 až 1:1.
2. Kombinace podle nároku 1, vyznačuj ící se t i m, že hmotnostní poměr uvedených látek se pohybuje v rozmezí 25:1 až 15:1.
3. Kombinace podle nároku 1 nebo 2 pro použití v lékařství.
4. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se t i m, že obsahuje kombinaci podle některého z nároků 1 až 3 spolu s jedním nebo větším počtem farmaceuticky přijatelných nosičů.
5. Farmaceutický prostředek pro léčení infekce HBV, vyznačující se tím, že obsahuje kombinaci, tvořenou (2R,cis)-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-1, 3-oxathiolan-5-yl) -pyrimidin-2-onem nebo jeho farmaceuticky přijatelným derivátem a druhou účinnou látkou, bis-(pivaloyloxymethyl) -9-[(R) -2-(fosfonomethoxy)ethyl]adeninem nebo jeho farmaceuticky přijatelným derivátem, přičemž (2R, cis)-4-amino-l-(229

-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl) -pyrimidin-2-on a druhá účinná látka jsou v kombinaci obsaženy v poměru 40:1 až 1:1.
6. Farmaceutický prostředek podle nároku 4 nebo 5, vyznačující se tím, že je upraven na jednotkovou dávkovou formu.
7. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 4 až 6, vyznačující se t i m, že je určen pro perorální podání.
8. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 5 až 7, vyznačující se tím, že obsahuje 25 až 150 mg lamivudinu a 5 až 60 mg adefovirdipivoxilu.
9. Farmaceutický prostředek podle nároku 8, vyznačující se tím, že obsahuje 100 mg lamivudinu a 10 mg adefovirdipivoxilu.
10. Způsob léčení savců, trpících infekcí HBV včetně člověka, vyznačující se tím, že se podává kombinace, tvořená (2R, cis)-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl) -pyrimidin-2-onem nebo jeho farmaceuticky přijatelným derivátem a druhou účinnou látkou, bis-(pivaloyloxymethyl)-9-[(R)-2-(fosfonomethoxy)ethyl]adeninem nebo jeho farmaceuticky přijatelným derivátem.
11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že se podává kombinace podle některého z nároků 1 až 3.
12. Způsob podle nároku 10 nebo 11, vyznačující se tím, kombinace podávají současně.

že se obě složky
13. Způsob podle nároku 10 nebo 11, vyznačující se tím, kombinace podávají následně.

že se obě složky
14. Způsob podle nároku 10 nebo 11, vyznačující se tím, podává ve formě společného farmaceutického že se kombinace prostředku.
15. Způsob podle některého z nároků 10 až 14, vyznačující se tím, že je určen pro léčení infekce HBV kmeny, odolnými proti nukleosidovým a/nebo nenukleosidovým inhibitorům replikace viru hepatitidy B.
16. Použití (2R,cis)-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl)-pyrimidin-2-onu pro výrobu farmaceutického prostředku pro současné nebo následné podávání spolu s bis-(pivaloyloxymethyl)-9-[(R)-2-(fosfono-methoxy)ethyl]adeninem při léčení infekce HBV.
17. Použití bis-(pivaloyloxymethyl)-9-[(R)-2-(fosfonomethoxy)ethyl]adeninu pro výrobu farmaceutického prostředku pro současné nebo následné podávání spolu s (2R, cis) -4-amino-l-(2-hydroxymethyl-l,3-oxathiolan-5-yl)-pyrimidin-2-onem při léčení infekce HBV.
18. Použití kombinace, tvořené (2R,cis)-4-amino-l-(2 • « ♦ ·

-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl) -pyrimidin-2-onem nebo jeho farmaceuticky přijatelným derivátem a druhé účinné látky, kterou je bis-(pivaloyloxymethyl)-9-[(R)-2-(fosfono-methoxy)ethyl]adenin nebo jeho farmaceuticky přijatelný derivát pro léčení infekce HBV.
19. Použití kombinace podle některého z nároků 1 až 3, pro léčení infekce HBV.
20. Použití kombinace, tvořené (2R,cis)-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl) -pyrimidin-2-onem nebo jeho farmaceuticky přijatelným derivátem a druhou účinnou látkou, bis-(pivaloyloxymethyl)-9-[(R) -2-(fosfonomethoxy) ethyl] adeninem nebo jeho farmaceuticky přijatelným derivátem, přičemž (2R, cis)-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl) -pyrimidin-2-on a druhá účinná látka jsou v kombinaci obsaženy v poměru 40:1 až 1:1 pro léčení infekce virem HBV, odolným proti nukleosidovému a/nebo nenukleosidovému inhibitoru.
21. Použití kombinace podle některého z nároků 1 až 3 pro léčení infekce HBV, odolným proti nukleosidovému a/nebo nenukleosidovému inhibitoru replikace viru hepatitidy B.
22. Balení, obsahující alespoň jednu účinnou složku ze skupiny (2R,cis)-4-amino-l-(2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl) -pyrimidin-2-onem nebo bis-

- (pivaloyloxymethyl) -9- [ (R) -2- (fosfonoethoxy) ethyl] adenin a informaci, týkající se použití obou účinných složek v kombinaci. Zastupuje: