CZ20012967A3

CZ20012967A3 - Léčení neplodnosti

Info

Publication number: CZ20012967A3
Application number: CZ20012967A
Authority: CZ
Inventors: Christian Grondahl; Thomas Host Hansen; Alexander Rübig; Christa Hegele-Hartung
Original assignee: Novo Nordisk A/S
Priority date: 1999-02-24
Filing date: 2000-02-23
Publication date: 2001-12-12
Also published as: KR20010093280A; AU2794100A; CN1353617A; WO2000050066A1; DE60025905D1; EP1156822A1; BR0008468A; JP2002537349A; EP1156822B1; HUP0200157A2; US6585982B1; HUP0200157A3; DE60025905T2; ES2258445T3; ATE317266T1

Description

Od doby, kdy bylo v roce 1978 odrozeno prvé těhotenství po IVF, byly výsledkem této metody tisíce otěhotnění a otevřely se široké, nové oblasti výzkumu a léčení neplodných párů. Přesto zde ještě dnes existuje významná potřeba pro zlepšení postupů v léčení neplodnosti. Předpokládá se, že asi jeden ze sedmi párů pocítí problémy se sníženou plodností nebo neplodností.

IVF lidských vaječných zárodečných buněk se stalo běžně používaným způsobem pro léčení snížené ženské a mužské plodnosti. Standardní postup IVF zahrnuje dlouhou fázi hormonální stimulace pacientky, např. 30 dní, která je iniciována potlačením pacientčina vlastního folikulostimulačního hormonu (zde dále označovaného FSH) a luteinizačního hormonu (zde dále označovaného LH) pomocí hormonu uvolňujícího gonadotropiny (zde dále označovaného GnRH), což je následováno injekcemi exogenních gonadotropinů, např. FSH a/nebo LH, aby se zajistil vývoj mnoha preovulačních folikulů a odsání mnoha in vivo uzrátých vaječných zárodečných buněk těsně před ovulací. Odsátá vaječná zárodečná buňka je poté oplodněna in vitro a typicky tři dny kultivována před přenesením zpět do dělohy ve stadiu 4 až 8 buněk. Optimalizaci a zjednodušení tohoto postupuje věnováno nepřetržité úsilí. Nicméně celkový počet otěhotnění nemůže být současnými postupy léčení významně zvýšen nad 20 %. Ve velkém evropském • · průzkumu pacientek na IVF bylo zjištěno, že 7,2 vaječných zárodečných buněk z

11,5 odsátých vaječných zárodečných buněk na pacientku zahájilo meiózu těsně před oplodněním, pouze 4,3 vaječných zárodečných buněk bylo oplodněno a pouze 2,2 vaječných zárodečných buněk dosáhlo po oplodnění a kultivaci in vitro stádia 8buněčného embrya (ESHRE, Edinburgh, 1997).

Vzhledem k velmi nepředpověditelné kvalitě vývojového stavu embryí se dnes musí přenášet více než jedno embryo, aby byla rozumná šance na úspěch. Proto je běžné přenášet 2 až 3 embrya (v některých zemích až do 5 embryí), což nese velký vedlejší efekt mnohočetných těhotenství, s nepříjemnou situací a rizikem jak pro pacientku, tak děti. Navíc se odhaduje, že zvýšené nároky na zdravotní péči kvůli mnohočetnému porodu (dvojčata, trojčata atd.) převyšují celkové výdaje na IVF.

Současné léčení má tedy několik nevýhod, z nichž čtyři nej podstatnější jsou:

1. riziko ovariální hyperstimulace při injektování gonadotropinů, které je potenciálním zhoubným stavem, který vyžaduje hospitalizaci,

2. mnohočetná těhotenství (50 až lOOOkrát více, než je normální frekvence výskytu dvojčat a trojčat v uvedeném pořadí),

3. existence značných skupin pacientek, které nesnášejí současný způsob kvůli např. polycystickému ovariálnímu syndromu a mnoha diabetiček,

4. potenciální riziko rakoviny v dlouhodobé perspektivě.

Navíc jsou jako nevýhody zaznamenávány přírůstek hmotnosti, nadýmání, zvedání žaludku, zvracení, labilní nálada a jiné obtížné stavy u pacientek, spolu s neochotou pacientek si sobě aplikovat injekce.

Z dokumentu WO 96/00235 je známo, že k regulaci meiózy lze použít určité sterolové deriváty. Příkladem takového sterolu je 4,4-dimethyl-5a-cholesta-8,14,24-trien-3p-ol (zde dále označovaný jako FF-MAS).

• ♦ ·· · · ·· · ·♦ · · · · · ··· • · · · · · · ·· ····· · · · · · 4 ·i · · · ··· ·· ·· ·· 99«··

Termín látky MAS zde označuje látky, které ovlivňují meiózu vaječných zárodečných buněk. Konkrétněji jsou MAS látky sloučeniny, které v testu popsaném v příkladu 1 níže mají procentuální štěpení zárodečných měchýřků (zde dále označované GVB), které je významně větší, než u kontrolního pokusu. Zvýhodněnými MAS látkami jsou ty, které mají procento GVB alespoň 50 %, s výhodou alespoň 80 %.

Příklady MAS látek jsou uvedeny v dokumentech WO 96/00235, 96/27658, 97/00884, 98/28323, 98/54965 a 98/55498, konkrétněji v jeho nároku 1.

V dokumentu W095/000265 byly na nedospělých myších samicích testovány některé látky, které potenciálně regulují meiózu. Testované zvíře dostalo 48 hodin před tím, než bylo usmrceno zlomením vazu, jednu injekci lidského klimakterického gonadotropinu, která obsahovala 20 mezinárodních jednotek FSH a 20 mezinárodních jednotek LH. Poté byly vyjmuty vaječníky a umístěny do hypoxanthinového prostředí a byla z nich odstraněna vnější tkáň. Poté byly z folikulů odebrány vaječné zárodečné buňky, byly z nich odstraněny buňky s ovariálním vyklenutím a byly kultivovány v prostředí obsahujícím derivát, který reguluje meiózu.

V současné době se ukazuje, že in vitro zrání zárodečných buněk u lidí je velmi neúspěšné, navzdory značné zainteresovanosti a klinickému úsilí.

Jedním předmětem předloženého vynálezu je léčit neplodnost u lidí.

Dalším předmětem předloženého vynálezu je zlepšit dozrávání ženských vaječných zárodečných buněk

Dalším předmětem předloženého vynálezu je zlepšit soulad v jaderném, cytoplazmatickém a/nebo membránovém dozrávání vaječné zárodečné buňky.

Dalším předmětem předloženého vynálezu je zlepšit účinnost implantování ženských vaječných zárodečných buněk po in vitro dozrávání a oplodnění.

• · · · · ·· ·· ·«

Dalším předmětem předloženého vynálezu je zmenšit výskyt lidských preembryí s chromozomálními odchylkami (aneuploidie).

Dalším předmětem předloženého vynálezu je zlepšit průběh rýhování lidských preembryí.

Dalším předmětem předloženého vynálezu je zlepšit kvalitu lidských preembryí.

Podstata vynálezu

Překvapivě bylo zjištěno, že výsledky IVF lze podstatně zlepšit, jestliže se MAS látka přidá ve stádiu obvyklého způsobu provádění in vitro oplodnění, kde se očekává, že by dozrávání probíhalo in vivo.

Předložený vynález se stručně týká způsobu oplodnění žen in vitro, kde na ženu se během nepřetržitého období 30 dnů působí hypothalamickým hormonem a/nebo hormonem podvěsku mozkového nebo jejich agonistou nebo antagonistou nebo jejich aktivním derivátem, kde poté, co se odsají vaječné zárodečné buňky a aktivně se finálně dozrají nebo se dozrání vaječné zárodečné buňky synchronizuje stykem s MAS látkou in vitro. Zvýhodněná provedení tohoto vynálezu jsou ta, která jsou uvedena v nárocích níže.

V souvislosti s ženským cyklem je jedna cesta provedení IVF podle tohoto vynálezu následující:

Mezi dnem 21 jednoho cyklu a dnem 15 následujícího cyklu: Působením GnRH na ženu jsou stimulována vajíčka, např. přípravkem Synarel (400 až 600 pg na den).

Mezi dny 6 až 15 druhého cyklu: Působením FSH na ženu jsou stimulována vajíčka, např. přípravkem Gonal-F, Puregon nebo Humegon (150 až 400 mezinárodních jednotek na den).

• · 4 4 4 4 4 · ·· • 444 4 · 4 444 4444 • 444»444

444 44 44 44 44444

Dny 15 až 16 druhého cyklu: Působením HCG na ženu jsou stimulována vajíčka, např. přípravkem Pregnyl nebo Profasi (2000 až 5000 mezinárodních jednotek na den).

Den 18 druhého cyklu: Ženě se odeberou vajíčka.

Den 18 až 19 druhého cyklu: Vajíčka dozrávají s MAS látkou, aby se stimulovala meióza. V tomto doplňkovém dozrávacím krokuje koncentrace MAS látky v rozmezí 0,1 až 100 μπιοΐ/l, např. 10 až 20 pmol/l. Doba pro tento dozrávací krok je v rozmezí 1 až 60 hodin. Jestliže se preovulační folikuly indukují luteinizačním hormonem nebo jeho agonistou nebo antagonistou nebo jeho aktivním derivátem a/nebo lidskými choriogonadotropiny nebo jejich agonistou nebo antagonistou nebo jejich aktivním derivátem, aby proběhla luteinizace, dozrávání vaječných zárodečných buněk s MAS látkou trvá 1 až 15 hodin, s výhodou 6 hodin. Jestliže se však preovulační folikuly neindukují, aby luteinizovaly s luteinizačním hormonem nebo jeho agonistou nebo antagonistou nebo jeho aktivním derivátem a/nebo lidskými choriogonadotropiny nebo jejich agonistou nebo antagonistou nebo jejich aktivním derivátem, dozrávání vaječných zárodečných buněk s MAS látkou trvá 15 až 60 hodin.

Dny 19 až 21 druhého cyklu: Vajíčka se oplodní in vitro.

Ode dne před odsátím dostává žena estrogen, např. valerát estrogenu (denně 2krát 10 mg). O dva dny později také denně dostane progestogen, např. přípravek Progestane vagetoria, který způsobí, že vystýlka dělohy je připravenější pro přijetí budoucích embryí. Trvání tohoto působení se pro každou pacientku určí individuálně. Lékař si může vybrat z mnoha estrogenů a progestogenů. Den 21 druhého cyklu: Jedno nebo více embryí se přenesou do dělohy ženy.

Výše uvedený popis je označen s přidáním MAS na existujícím záznamu

IVF postupu, aby se zlepšila účinnost dozrávání ovlivňováním konečného nebo celkového dozrávání nebo synchronizace u vaječné zárodečné buňky. Alternativně • · · · · 9 9 9

999 9 9 9 999 9 9 9 • · · · · · ·· ·· 44 44 lze MAS použít k záchraně vaječných zárodečných buněk v cyklech, které by jinak byly přerušeny kvůli zřejmé hyperreakci na FSH. V tomto případě by zodpovědný klinik podle estradiolového profilu, ultrazvukového vyšetření (reakce jako na PCO) zvážil přerušení, čímž by se vyhnulo působení HCG. Vaječné zárodečné buňky se odsají v době mezi dny 15 až 16, místo působení HCG.

Kromě doplňkového dozrávacího kroku s MAS látkou je výše uvedené IVF provedeno obvyklým způsobem. I když se očekává, že pomocí tradičního IVF postupu jsou vajíčka dostatečně uzrátá, neočekávalo by se, že by přidání tohoto doplňkového dozrávacího kroku mělo jakýkoliv další efekt.

Většina kroků ve výše uvedeném léčení a postupu se provádí známým způsobem a zbylé kroky se provádějí notoricky známým způsobem. Více detailů o odstranění vaječných zárodečných buněk z folikulů ve vaječníku, kultivaci izolovaných vaječných zárodečných buněk, použitém kultivačním prostředí, oplodnění spermií a přenosu embrya do vejcovodu lze nalézt v literatuře, např. v patentové přihlášce USA číslo 5 693 534, která je zde zahrnuta v odkazech.

Podle tohoto vynálezu se MAS látka přidá k použitému kultivačnímu prostředí. V tomto prostředí je množství MAS látky v rozmezí 0,01 až 100 pmol/l, s výhodou v rozmezí 0,1 až 100 pmol/l.

Přednostní důvod pro působení na ženu v nepřetržitém období 30 dnů hypothalamickým hormonem a/nebo hormonem podvěsku mozkového nebo jejich agonistou nebo antagonistou nebo jejich aktivním derivátem je získání četných preovulačních folikulů.

Hypothalamické hormony jsou hormony přítomné v lidském hypothalamu. Hormony podvěsku mozkového jsou hormony přítomné u člověka ve žláze podvěsku mozkového. Gonadotropní hormony jsou hormony vylučované u obratlovců předním lalokem podvěsku mozkového a savčí placentou a kontrolují aktivitu pohlavních žláz. Chemicky to jsou glykoproteiny. Příklady gonadotropních ··· · · ·· *· ·· • · · · · · • · · · · • ··· ' « · • · · · ·♦ ·· ·· · hormonů jsou FSH, LH a choriogonadotropin, např. lidský choriogonadotropin (zde označovaný HCG). FSH stimuluje růst ovariálních folikulů a jejich vaječných zárodečných buněk ve vaječníku a tvorbu semenných buněk ve varlatech. FSH může být např. klimakterický FSH nebo rekombinantní FSH. U žen aktivuje LH tkáň vaječníků produkující estrogen, aby produkovala progesteron, patrně podporuje konečné fáze vývoje ovariálních folikulů, iniciuje konečné dozrávání vaječné zárodečné buňky, indukuje ovulaci a u savců iniciuje vývoj žlutého tělíska. Tyto hormony jsou známé. Pro odborníka v oboru je zřejmé, že lze alternativně použít i agonisty nebo antagonisty těchto hormonů. Pro odborníka v oboru je také zřejmé, že lze alternativně použít aktivní analogy těchto hormonů. Některé z těchto agonistů, antagonistů a analogů jsou známé a jiné lze připravit notoricky známým postupem. Příklady takových známých postupů jsou chemická syntéza a genetické inženýrství.

Ve zvýhodněném provedení se předložený vynález týká způsobu nebo použití, kde během nepřetržitého období 30 dnů se na uvedenou ženu působí alespoň 7 dnů, s výhodou alespoň 10 dnů, výhodněji alespoň 14 dnů hypothalamickým hormonem a/nebo hormonem podvěsku mozkového nebo jejich agonistou nebo antagonistou nebo jejich aktivním derivátem.

V dalším zvýhodněném provedení se předložený vynález týká způsobu nebo použití, kde je žena léčena z neplodnosti a/nebo se zlepšuje dozrávání jejích vaječných zárodečných buněk a/nebo se zlepšuje synchronizace jaderného, cytoplazmatického a/nebo membránového dozrávání vaječné zárodečné buňky a/nebo se zlepšuje plodnost jejích vaječných zárodečných buněk a/nebo se zlepšuje účinnost implantace jejích vaječných zárodečných buněk po in vitro dozrávám a oplodnění.

V dalším zvýhodněném provedení se předložený vynález týká způsobu nebo použití, kde nepřetržitým obdobím je jeden menstruační cyklus.

·· ♦· ·» ·· • · · · · · » • · · ♦ · ·· ····* · ····· * » ♦ » · ·· ·· ·· ···«

V dalším zvýhodněném provedení se předložený vynález týká způsobu nebo použití, kde dozrávání vaječných zárodečných buněk s MAS látkou trvá 15 až 60 hodin.

V dalším zvýhodněném provedení se předložený vynález týká způsobu nebo použití, kde preovulační folikuly se indukují luteinizačním hormonem (LH) nebo jeho agonistou nebo antagonistou nebo jeho aktivním derivátem a/nebo lidským choriogonadotropinem (HCG) nebo jeho agonistou nebo antagonistou nebo jeho aktivním derivátem, aby luteinizovaly.

V dalším zvýhodněném provedení se předložený vynález týká způsobu nebo použití, kde dozrávání vaječných zárodečných buněk s MAS látkou trvá 1 až 15 hodin, s výhodou 6 hodin.

V dalším zvýhodněném provedení se předložený vynález týká způsobu nebo použití, kde dávkování použité MAS látky je 0,01 až 100 μπιοί/ΐ, s výhodou 0,1 až 100 pmol/l.

V dalším zvýhodněném provedení se předložený vynález týká způsobu nebo použití, kde MAS látkou je jedna z látek uvedených ve WO 96/00235, 96/27658, 97/00884, 98/28323, 98/54965 a 98/55498, konkrétněji látky popsané v jeho nároku 1.

V dalším zvýhodněném provedení se předložený vynález týká způsobu nebo použití, kde MAS látkou je FF-MAS.

Dále se předložený vynález týká použití hypothalamického hormonu a/nebo hormonu podvěsku mozkového nebo jejich agonisty nebo antagonisty nebo jejich aktivního derivátu ve výrobě hormonálního produktu, který se podává ženě, které se během nepřetržitého období 30 dnů podává hypothalamický hormon a/nebo hormon podvěsku mozkového nebo jejich agonista nebo antagonista nebo jejich aktivní derivát a z které se okamžitě po uvedeném období odsaje jedno nebo více vaječných zárodečných buněk, kde poté je/jsou uvedená(é) vaječná(é) zárodečná(é) ·» ·« *9 ·· *· *♦ · * · 9 < · · · 9 • · 9 < · t · 99

999 9 9 « 9·9 < · * • · · r999 • · · *9 «9 «9 999 buňka(buňky) kultivována/kultivovány ve vhodném prostředí obsahujícím zde definovanou MAS látku, kde poté je/jsou uvedená(é) vaječná(é) zárodečná(é) buňka(buňky) oplodněna/oplodněny mužským spermatem a kde se poté výsledné(á) embryo(a) přenese/přenesou do ženy.

Dále se předložený vynález týká použití hypothalamického hormonu a/nebo hormonu podvěsku mozkového nebo jejich agonisty nebo antagonisty nebo jejich aktivního derivátu a MAS látky pro výrobu léku pro ovlivňování in vitro oplodnění u lidí, kde se v nepřetržitém období 30 dnů použije při působení na ženu hypothalamický hormon a/nebo hormon podvěsku mozkového nebo jejich agonista nebo antagonista nebo jejich aktivní derivát, přičemž poté se použije MAS látka při in vitro dozrávání vaječné zárodečné buňky vajíčka nebo vajíček odebraných od této ženy.

Dále se předložený vynález týká farmaceutické soupravy, která má pro použití při oplodnění in vitro formu dávkovačích jednotek zahrnující samostatné dávkovači jednotky, přičemž uvedená souprava obsahuje samostatné dávkovači jednotky pro postupné denní podávání hypothalamického hormonu a/nebo hormonu podvěsku mozkového nebo jejich agonisty nebo antagonisty nebo jejich aktivního derivátu pro postupné denní podávání a 1 dávkovači jednotku MAS látky. Tato souprava má zvýhodněné znaky popsané výše.

Předložený vynález je dále popsán následujícími příklady, které však nejsou postaveny jako příklady, které vynález omezují. Znaky popsané v předchozím popisu, v následujících příkladech a v nárocích jsou jak samostatně, tak v jakékoliv své kombinaci materiálem realizace vynálezu v jeho různých formách.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 * ·· *51 ** ·· · ···· · * .

• » · ««·« ·* • · · · * · · *··'*· * f · * * · · * »»· »« «« .. «» _e

Způsob použitý pro výběr MAS látek

Vaječné zárodečné buňky byly získány z nedospělých samic myší (C57BL/6J x DBA/2J Fl, Bomholtgaard, Dánsko) o hmotnosti 13 až 16 gramů, které byly drženy za kontrolované teploty (20 až 22 °C), světla (světlo od 6,00 do 18,00 hodin) a relativní vlhkosti (50 až 70 %). Myši dostaly intraperitoneální injekci 0,2 ml gonadotropinů (Gonal-F, Serono) obsahující 20 mezinárodních jednotek FSH a po 48 hodinách byla zvířata zabita zlomením šíje. Vaječníky byly vyjmuty a vaječné zárodečné buňky byly pod stereomikroskopem izolovány v Hx-prostředí (viz níže) pomocí manuálního protržení folikulů párem standardních jehel číslo 27. Sférické vaječné zárodečné buňky, které měly neporušený zárodečný váček (zde dále označovaný GV) byly rozděleny na vaječné zárodečné buňky s ovariálním vyklenutím (zde označované CEO) a holé vaječné zárodečné buňky (zde označované NO) a umístěny do oc-minimálního základního prostředí (a-MEM bez ribonukleosidů, Gibco BRL, katalogové číslo 22561) doplněného 3 mg/ml hovězího sérového albuminu (BSA, Sigma, katalogové číslo A-7030), 5 mg/ml lidského sérového albuminu (HSA, Statens Seruminstitut, Dánsko), 0,23 mmol/1 pyruvátu (Sigma, katalogové číslo S-8636), 2 mmol/1 glutaminu (Flow, katalogové číslo 16801), 100 mezinárodních jednotek/ml penicilinu a 100 pg/ml streptomycinu (Flow, katalogové číslo 16-700), Toto prostředí bylo doplněno 3 mmol/1 hypoxantinem (Sigma, katalogové číslo H-9377) a označeno jako Hx-prostředí. Vaječné zárodečné buňky byly třikrát promyty v Hx-prostředí a vaječné zárodečné buňky o stejné velikosti byly rozděleny do CEO a NO skupin. CEO a NO buňky byly kultivovány v multimiskách se 4 otvory (Nuclon, Dánsko), v nichž každý otvor obsahoval 0,4 ml Hx-prostředí a testovanou látku v koncentraci 10 pmol/l. Jeden kontrolní otvor (to jest 35 až 45 vaječných zárodečných buněk kultivovaných v identickém prostředí bez přidání testované látky) byl vždy kultivován souběžně s 3 ·

• · · ···· * • ♦·· · * · ··< 9 « • · · · < _# ··* ·· 99 «· .

testovými otvory (35 až 45 vaječných zárodečných buněk na otvor s doplněnou testovanou látkou).

Vaječné zárodečné buňky byly kultivovány 24 hodin při 37 °C ve zvlhčené atmosféře 5 % CO₂ ve vzduchu. Na konci kultivační periody byl v uvedeném pořadí spočten za pomoci stereomikroskopu (Wildt, Leica MZ 12) počet vaječných zárodečných buněk s GV, GVB a pólovými tělísky (zde dále označované PB). Procentuální zastoupení GVB definované jako procento vaječných zárodečných buněk, u nichž nastalo GVB, z celkového počtu vaječných zárodečných buněk v tomto otvoru, bylo spočítáno jako:

% GVB = ((počet nastalých GVB + počet buněk s PB) / celkový počet vaječných zárodečných buněk) x 100

Příklad 2

Postup

Všechny pacientky na IVF ve věkovém rozmezí 20 až 45 let mohou potenciálně podstoupit toto léčení. Hormonální působení může být krátké nebo dlouhé, založené na gonadotropinu s nebo bez regulace hormonem podvěsku mozkového nebo s nebo bez použití antagonisty GnRH a s nebo bez použití HCG. Lze také využít i budoucí vhodné hormonální terapie určené pro IVF. Za ultrazvukové kontroly se odsají střední folikuly až folikuly o plné velikosti (velikost 10 až 25 mm, přednostně folikuly 16 až 22 mm).

V odsáté tekutině se vyhledají komplexy s ovariálním vyklenutím zárodečných buněk (COC) a jakmile jsou tyto pod stereomikroskopem identifikovány (s použitím či bez použití embryových filtrů), umístí se COC do kultivačního prostředí.

• · · · ·· · · ····· · ····· · ··· ·· ·· · · · · ···

Expozice FF-MAS se může různit od 1 do 60 hodin, přednostně 4 až 30 hodin a může být před, v době kratší než 24 hodin před a do 24 hodin po oplodnění. Jako kultivační prostředí vaječných zárodečných buněk lze použít nejrůznějších prostředí či složek prostředí, které jsou odborníkovi známy. K tomuto prostředí se může nebo nemusí přidat lidský sérový albumin (HSA). Jestliže se přidá, může mít koncentraci 0,1 až 100 mg/ml, přednostně 5 až 15 mg/ml nebo 0,5 až 1,5 % (V/V). Přípravek FF-MAS může být ve formě ethanolického zásobního roztoku, roztoku v DMSO nebo roztoku jiného organického rozpouštědla nebo může být ve formě FFMAS/HSA vysušených zapouzdřených zásobníků připravených k použití jen přidáním vhodného kultivačního prostředí. Koncentrace FF-MAS se může různit v rozmezí 0,1 až 100 pmol/l, výhodněji 10 až 30 pmol/l.

Po nebo během in vitro kultivování s FF-MAS mohou být vaječné zárodečné buňky oplodněny běžným IVF nebo intracytoplazmatickým injektováním spermie (zde označovaným ICSI) nebo pomocí budoucích oplodňovacích způsobů vedoucích k oplodněným zygotám. Vyvíjející se embryo lze přenést od prvého do šestého dne po oplodnění, přednostně během druhého až třetího dne, a to buď přenosem jednoho vajíčka nebo přenosem více vajíček.

Pacientka může být také před a po přenosu vajíčka v progesteronové a/nebo estrogenové terapii, podle individuálně sestavených postupů, aby se připravil a udržel vhodný receptivní stav vystýlky děložní sliznice.

Ve srovnání se známými postupy byly použitím výše uvedeného postupu získány lepší výsledky.

Příklad 3

Použití FF-MAS jako doplňku k standardnímu IVF postupu založenému na FSH

Na pacientku se působilo rekombinantním FSH s průměrnou denní dávkou 225 mezinárodních jednotek, s počátkem v prvém nebo druhém dni probíhajícího cyklu a byl použit GnRH antagonista, to jest Cetrorelix (denně 1 mg, podkožně, jeden vpich) v probíhajícím cyklu. V době podávání HCG, to jest přípravku Profasi (10 000 mezinárodních jednotek, jeden vpich) byly přítomny alespoň 3 folikuly o rozměru 17 mm nebo více. Folikuly byly odsáty a vaječné zárodečné buňky v metafázi II byly kultivovány v kultivačním systému pro vaječné zárodečné buňky, který obsahoval standardní in vitro prostředí pro oplodňování (IVF) (IVF 20 (které lze získat od Scandinavian IVF Science AB, Gothenburg, Švédsko)), doplněné lidským sérovým albuminem (0,8 %) a FF-MAS (5 pmol/l). Všechny vaječné zárodečné buňky byly kultivovány za normálních podmínek při 37 °C v inkubátoru. Každá vaječná zárodečná buňka byla kultivována v jednom otvoru na kultivační misce mající čtyři části, jako systému kultivačního prostředí. Trvání expozice kultivačnímu prostředí s jeho působením bylo 4 hodiny (±30 minut) před intracytoplazmatickým injektováním spermie (zde označovaným ICSI) a 20 hodin (± 1 hodina) po ICSI ve výše uvedeném IVF 20 prostředí. U preembryí byl vyhodnocen stav rýhování a fragmentace / morfologie ve dnech 1, 2 a 3 po ICSI. Výběr nej lepších preembryí po 3 dnech kultivace, typicky dvě preembrya, byl přenesen do pacientky. Pacientka dostávala estrogen, to jest Estrofem (6 mg/den) a progesteron, to jest Utrogestan (600 mg/den, mikromletý vaginální čípek), aby se vaginální slizniční výstélka pacientčiny dělohy stala citlivou a připravenou umožnit implantaci přenesených vajíček. Pokračování v podpůrné terapii steroidními hormony záviselo na pacientce a bylo odstaveno po 3 až 10 týdnech v závislosti na ultrazvukových vyšetřeních a krevním testování.

• ····· · ····· · • · · · · · · ····· ·· · · ·· ·

Příklad 4

Použití FF-MAS jako doplňku k standardnímu IVF postupu založenému na FSH

Na pacientku se působilo GnRH analogem, to jest přípravkem Synarel (nosní sprej, dva střiky denně) po alespoň 14 dnů (s počátkem v luteální fázi předchozího cyklu nebo dne 1 nebo 2 folikulámí fáze probíhajícího cyklu) a ovariální stimulací rekombinantním FSH s průměrnou denní dávkou 225 mezinárodních jednotek. V době podávání HCG, to jest přípravku Profase (10 000 mezinárodních jednotek, jeden vpich) byly přítomny alespoň 3 folikuly o rozměru 17 mm nebo více. Folikuly byly odsáty a vaječné zárodečné buňky v metafázi II byly kultivovány v kultivačním systému pro vaječné zárodečné buňky, který obsahoval standardní in vitro prostředí pro oplodňování (IVF) (IVF 20 (které lze získat od Scandinavian IVF Science AB, Gothenburg, Švédsko)), doplněné lidským sérovým albuminem (0,8 %) a FF-MAS (5 pmol/l). Všechny vaječné zárodečné buňky byly kultivovány za normálních podmínek při 37 °C v inkubátoru. Každá vaječná zárodečná buňka byla kultivována v jednom otvoru na kultivační misce mající čtyři části, jako systému kultivačního prostředí. Trvání expozice kultivačnímu prostředí s jeho působením bylo 4 hodiny (± 30 minut) před intracytoplazmatickým injektováním spermie (ICSI) a 20 hodin (± 1 hodina) po ICSI ve výše uvedeném IVF 20 prostředí. U preembryí byl vyhodnocen stav rýhování a fragmentace / morfologie ve dnech 1, 2 a 3 po ICSI. Výběr nejlepších preembryí po 3 dnech kultivace, typicky dvě preembrya, byl přenesen do pacientky. Pacientka dostávala estrogen, to jest Estrofem (6 mg/den) a progesteron, to jest Utrogestan (600 mg/den, mikromletý vaginální čípek), aby se vaginální slizniční výstélka pacientčiny dělohy stala citlivou a připravenou umožnit implantaci přenesených vajíček. Pokračování v podpůrné terapii steroidními hormony záviselo na pacientce a bylo zastaveno po 3 až 10 týdnech v závislosti na ultrazvukových vyšetřeních a krevním testování.

• · ·· · · · · ····· · · · · · · · ····· ·· · · · · ·

Příklad 5

Pomocí postupu popsaného v příkladu 3, s výhradou toho, že namísto použití FF-MAS v 5 pmol/l koncentraci, se FF-MAS použila v koncentraci 20 pmol/l, byly tímto postupem získány lepší výsledky než známými postupy.

Příklad 6

Pomocí postupu popsaného v příkladu 4, s výhradou toho, že namísto použití FF-MAS v 5 pmol/l koncentraci, se FF-MAS použila v koncentraci 20 pmol/l, byly tímto postupem získány lepší výsledky než známými postupy.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Způsob in vitro oplodnění u lidí, vyznačující se tím, že na ženu se během nepřetržitého období 30 dnů působí hypothalamickým hormonem a/nebo hormonem podvěsku mozkového nebo jejich agonistou nebo antagonistou nebo jejich aktivním derivátem, kde po odsátí vaječných zárodečných buněk se tyto nechají aktivně dozrát nebo se zesynchronizuje jejich dozrání in vitro v kontaktu s MAS látkou.

2. Použití hypothalamického hormonu a/nebo hormonu podvěsku mozkového nebo jejich agonisty nebo antagonisty nebo jejich aktivního derivátu při výrobě hormonálního produktu, určeného pro podávání ženě, které se během nepřetržitého období 30 dnů podává hypothalamický hormon a/nebo hormon podvěsku mozkového nebo jejich agonista nebo antagonista nebo jejich aktivní derivát a z níž se okamžitě po uvedeném období odsaje jedna nebo více vaječných zárodečných buněk, kde poté je/jsou uvedená(é) vaječná(é) zárodečná(é) buňka(buňky) kultivována/kultivovány ve vhodném prostředí obsahujícím zde definovanou MAS látku, kde poté je/jsou uvedená(é) vaječná(é) zárodečná(é) buňka(buňky) oplodněna/oplodněny mužským spermatem a kde se poté výsledné(á) embryo(a) přenese/přenesou do ženy.

3. Použití hypothalamického hormonu a/nebo hormonu podvěsku mozkového nebo jejich agonisty nebo antagonisty nebo jejich aktivního derivátu a MAS látky pro výrobu léku pro působení při in vitro oplodnění u lidí, kde se během nepřetržitého období 30 dnů použije při působení na ženu hypothalamický hormon a/nebo hormon podvěsku mozkového nebo jejich agonista nebo antagonista nebo jejich « ·· ·· ·· ·· ···· · · ♦ · · · · • ··· 9 · · 9 99 9 99

9 9 9 9 9 99

99 9 99 9 9 9 9 9 99 aktivní derivát a poté se použije MAS látka při in vitro dozrávání vaječné zárodečné buňky vajíčka nebo vajíček odebraných od této ženy.

4. Způsob nebo použití podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že se žena léčí z neplodnosti a/nebo pro zlepšení dozrávání jejích vaječných zárodečných buněk a/nebo pro zlepšení synchronizace jaderného, cytoplazmatického a/nebo membránového dozrávání vaječné zárodečné buňky a/nebo pro zlepšení plodnosti jejích vaječných zárodečných buněk a/nebo pro zlepšení účinnosti implantace po jejich in vitro dozrání a oplodnění.

5. Způsob nebo použití podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že v nepřetržitém období 30 dnů se na ženu působí alespoň 7 dnů, s výhodou alespoň 10 dnů, výhodněji alespoň 14 dnů hypothalamickým hormonem a/nebo hormonem podvěsku mozkového nebo jejich agonistou nebo antagonistou nebo jejich aktivním derivátem.

6. Způsob nebo použití podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že nepřetržitým časovým obdobím je jeden menstruační cyklus.

7. Způsob nebo použití podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že dozrávání vaječných zárodečných buněk s MAS látkou trvá 15 až 60 hodin.

8. Způsob nebo použití podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že u preovulačních folikulů se indukuje luteinizace luteinizačním hormonem (LH) nebo jeho agonistou nebo antagonistou nebo jeho

9 · · · · · · ··

99 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 · · 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

999 99 99 99 99 999 aktivním derivátem a/nebo lidským choriogonadotropinem (HCG) nebo jeho agonistou nebo antagonistou nebo jeho aktivním derivátem.

9. Způsob nebo použití podle předchozího nároku 8, vyznačující se tím, že dozrávání vaječných zárodečných buněk s MAS látkou trvá 1 až 15 hodin, s výhodou 6 hodin.

10. Způsob nebo použití podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 9, vyznačující se t í m, že dávkování MAS látky je 0,01 až 100 pmol/l, s výhodou 0,1 až 100 μπιοί/ΐ.

11. Způsob nebo použití podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 10, vyznačující se t í m, že MAS látkou je jedna z látek popsaných v dokumentech WO 96/00235, 96/27658, 97/00884, 98/28323, 98/54965 a 98/55498, konkrétněji látky popsané v jeho nároku 1.

12. Způsob nebo použití podle předchozího nároku 11, vyznačující se t í m, že MAS látkou je FF-MAS.

13. Farmaceutická souprava, vyznačující se tím, že má pro použití při in vitro oplodnění formu samostatných dávkovačích jednotek a uvedená souprava obsahuje samostatné dávkovači jednotky pro postupné denní podávání hypothalamického hormonu a/nebo hormonu podvěsku mozkového nebo jejich agonisty nebo antagonisty nebo jejich aktivního derivátu pro postupné denní podávání a 1 dávkovači jednotku MAS látky.