CN88100965A

CN88100965A - 脂质体组合物及其制备

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Publication number: CN88100965A
Application number: CN198888100965A
Authority: CN
Inventors: 口直; 伊贺勝美; 小川泰亮
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1987-02-25
Filing date: 1988-02-25
Publication date: 1988-09-07
Also published as: US5019394A; DE3867866D1; EP0280492A2; ATE71834T1; EP0280492B1; EP0280492A3; CA1322171C; DK86988D0; KR880009636A; HUT52943A; HU203278B; DK86988A

Abstract

用带用饱和脂酰基的磷脂及具有较高的克拉夫特温度、浓度超过临界胶束浓度的阴离子表面活性剂构成脂质体膜，由脂质体膜可以制备包裹药物的脂质体组合物，所得到的组合物在静脉给药后可以在血液中长时间稳定地循环。

Description

本发明是关于脂质体组合物及其制备方法。

通过静脉注射包裹药物的脂质体制剂，将药物送到特定位置的药物输送系统（DDS）的设想已经得到了推广〔G.Gregoria-dis等。Receptor-mediated targeting of drugs，plenum press，New York，P.243～266（1980）〕。在药物输送系统（DDS）中，对于上述脂质体制剂要求的基本特征在于，静脉注射的脂质体在血液中能长时间稳定。然而，由于与类脂（膜的成分）、血液中成分（如脂蛋白）的相互反应，因此脂质体本身在血液中不是十分稳定的。此外，根据其物理性质和生化特性，网状内皮组织系统（RES）将静脉注入的脂质体看作为是外来物质，结果易于从血液中将它清除。于是，与预期的结果相反，静脉注入包裹药物的脂质体会迅速地从血液中清除掉。因此，如何使血液中的脂质体稳定并避免被网状内皮组积系统（RES）识别，以便延长在血液中被清除的时间是一个重要的研究课题。例如，据报道，通过加入胆甾醇作为脂质体膜的成分，可以增加脂质体在血液中的稳定性〔C.G.Knight，“Liposomes;from physical structure to therape-utic applications”，Elsevier，North Holland，P310～311（1981）〕。但是，据说加入的效果在很大程度上仍然依赖于脂质体膜原有的组成〔Biochemica et Biophysica Acta，839，1～8（1985）〕。另外还有报道，用含有唾液酸基团的糖蛋白使脂质体膜的表面包衣并作为脂质体膜的成分，可以抑制向RES的输送〔chem.pharm.Bull.，34，2979～2988（1986）〕。Biochemica et Biophysica Acta，497，760～765（1977）的报道与上述结果相反，它认为含有唾液酸的糖蛋白主要是输送到肝脏（RES的器官）。

另一方面，几乎没有报告认为表面活性剂可以用作为脂质体膜的成分。其理由是，通常认为表面活性剂会使脂质体膜的结构不稳定〔Cell Technology（Saibo Kougaku），2，1136（1983）〕，更确切地说，表面活性剂过去经常用来破坏膜〔Biochemica et Biophysica Acta，551，295（1979）〕。应用表面活性剂制备脂质体可能唯一已知的方法是，使离子型表面活性剂与类脂的均匀混合物，混悬于水相中，使其浓度低于表面活性剂在水相中的临界胶束浓度，结果得到单薄片状的脂质体〔未经审查的日本专利公开公报№89633/1984〕。按照该方法得到的脂质体制剂经静脉注射，会迅速地从血液中清除掉，未能够满意地实现DDS的目的。

按以上所述，虽然包裹药物的脂质体可以通过静脉注射用于药物输送系统（DDS）这一想法是已知的，但是用普通方法制备的脂质体制剂在静脉注射后会迅速地从血液中清除，因此实际上尚未研究出实现DDS目的的有效方法。

在上述情况下，本发明的发明人研究出在血液中长时间稳定地运行脂质体组合物的各种方法。结果本发明人发现，在克拉夫特温度为37℃或37℃以上的某些表面活性剂（即阴离子表面活性剂）存在下，用含有饱和脂酰基的磷脂构成的脂质体膜制备的脂质体组合物在血液中是稳定的，并且在进一步研究之后完成了本发明。

本发明关系到：（1）在脂质体中包裹药物的脂质体组合物，其中脂质体膜是由具有饱和脂酰基的磷脂以及克拉夫特温度为37℃或37℃以上的阴离子表面活性剂构成，（2）制备包裹药物的脂质体组合物的方法，其特征在于，上述脂质体膜是由乳剂或悬浮液构成，该乳剂或悬浮液是用带有饱和脂酰基的磷脂以及克拉夫特温度为37℃或37℃以上、浓度超过临界胶束浓度的阴离子表面活性剂的水介质制备。

用于制备本发明脂质体组合物的带有饱和脂酰基的磷脂（以下一般简称为磷脂），包括其中脂酰基为饱和脂酰基的甘油基磷脂和鞘氨醇磷脂。这样的磷脂包括其中二个脂酰基各带有8个或8个以上碳原子的饱和烷基，至少一个脂酰基带有10个或10个以上（最好为12～18）碳原子的饱和烷基。更合乎需要的是其中二个饱和脂酰基各带有12～18个碳原子的饱和烷基。这样的磷脂有氢化卵磷脂〔使来自于动物和植物的卵磷脂（如蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂）氢化而得〕、半合成的磷脂〔通过组合月桂酰、肉豆蔻酰、棕榈酰、硬脂酰等（例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇及鞘磷脂）而得到〕。更具体地说，最好应用其中相转移温度通常为20℃～80℃的磷脂。例如，可以应用具有下面括号中观察到的相转移温度的磷脂：二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC，23.9℃），棕榈酰肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（PMPC，27.2℃），肉豆蔻酰棕榈酰磷脂酰胆碱（MPPC，35.3℃），二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC，41.4℃），硬脂酰棕榈酰磷脂酰胆碱（SPPC，44.0℃），棕榈酰硬脂酰磷脂酰胆碱（PSPC，47.4℃），二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC，54.9℃），二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺（DMPE，50℃），二棕榈酰磷脂酰乙醇胺（DPPE，60℃），二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE，60℃以上），二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸（DMPS，38℃），二棕榈酰磷脂酰丝氨酸（DPPS，51℃），二硬脂酰磷脂酰丝氨酸（DSPS，50℃或50℃以上），二肉豆蔻酰磷脂酰甘油（DMPG，23℃）、二棕榈酰磷脂酰甘油（DPPG，41℃），二硬脂酰磷脂酰甘油（DSPG，55℃），二棕榈酰鞘磷脂（DPSM，41℃）和二硬脂酰鞘磷脂（DSSM，57℃）。

用于本发明的克拉夫特温度为37℃或37℃以上的阴离子表面活性剂（以下一般简称为阴离子表面活性剂），带有硫酸根或磺酸根是有益的。本发明中优先选用克拉夫特温度为37℃～90℃的表面活性剂。上述阴离子表面活性剂可用下述通式表示：

R-Xm-（Y₁或Y₂）n-Z

其中R为有12个或12个以上碳原子并可用硫酸根取代的烷基;

X为-CONH-，-COO-，

;

Y₁为-CH₂CH₂-，

或-CH₂CH₂CH₂-;

Y₂为-OCH₂CH₂-，

或-OCH₂CH₂CH₂-;

Z为-SO^- ₃M⁺或-SO^- ₄M⁺（M为碱金属元素）;m为零（直接相连）或1;n是零（直接相连）～2的整数，条件是当X为-CONH-或- 时，Y₂为零（直接相连），当X为

时，n为零（直接相连）。

以R表示的烷基一般有12～25个碳原子，用硫酸根取代的烷基最好各有16～25个碳原子，其中硫酸根可以与碱金属离子（钠、钾、锂）配对成偶合离子。

阴离子表面活性剂的实例叙述如下：

具有硫酸根的阴离子表面活性剂有烷基硫酸酯的盐类，例如十六烷基硫酸钠（克拉夫特温度：43℃）和十八烷基硫酸钠（克拉夫特温度：58℃）;烷基二硫酸酯的盐类，例如十六烷基二硫酸钠（克拉夫特温度：39℃）;和十八烷基二硫酸酯钠（克拉夫特温度：45℃）;烷基醚硫酸酯的盐类，例如十八烷基醚硫酸酯钠（克拉夫特温度：46℃）和十八烷基二醚硫酸酯钠（克拉夫特温度：40℃）;脂肪酸链烷醇酰胺硫酸酯的盐类，例如棕榈酰乙醇酰胺硫酸酯钠（克拉夫特温度：42℃），硬脂酰乙醇酰胺硫酸酯钠（克拉夫特温度：53℃），棕榈酰丙醇酰胺硫酸酯钠（克拉夫特温度：47℃）和硬脂酰丙醇酰胺硫酸酯钠（克拉夫特温度：57℃）。具有磺酸根的阴离子表面活性剂有链烷烃磺酸盐类，例如十二烷磺酸钠（克拉夫特温度：38℃），十四烷磺酸钠（克拉夫特温度：48℃），十五烷磺酸钠（克拉夫特温度：48℃），十六烷磺酸钠（克拉夫特温度：57℃），十七烷磺酸钠（克拉夫特温度：62℃）和十八烷磺酸钠（克拉夫特温度：70℃）;烷基苯磺酸盐类，例如十二烷基苯磺酸钠（克拉夫特温度：40℃），十四烷基苯磺酸钠（克拉夫特温度：43℃），十六烷基苯磺酸钠（克拉夫特温度：46℃）和十八烷基苯磺酸钠（克拉夫特温度：56℃）;酰氧基乙磺酸盐类，例如肉豆蔻酰氧基乙磺酸钠（克拉夫特温度：39℃），棕榈酰氧基乙磺酸钠（克拉夫特温度：51℃）和硬脂酰氧基乙磺酸钠（克拉夫特温度：51℃）;以及酰基牛磺酸盐类，例如棕榈酰牛磺酸钠（克拉夫特温度：43℃），硬脂酰牛磺酸钠（克拉夫特温度：58℃），棕榈酰甲基牛磺酸钠（克拉夫特温度：43℃），和硬脂酰甲基牛磺酸钠（克拉夫特温度：58℃）。在上述阴离子表面活性剂中，由于用酰基牛磺酸盐或酰基甲基牛磺酸盐制得的脂质体制剂在血液中十分稳定，并且工业上能够供应，所以特别优先选用它们。

下面叙述制备本发明脂质体的方法。

制备本发明的脂质体组合物，通常使相转移温度在37～60℃的范围内，最好为40～55℃。通过选用合适种类及其组合比例的磷脂和阴离子表面活性剂，可以调节相转移温度。用测热法，例如用微分扫描式量热计（DSC），或者通过测量包裹在脂质体内药物释放的量，可以确定脂质体膜的相转移温度。为了使脂质体膜的相转移温度在上述范围内，每100份重量的磷脂应用0.5～50份重量，最好为5～20份重量的阴离子表面活性剂。通过调节脂质体膜的相转移温度在上述范围内，可以顺利地达到本发明的目的-使得到的脂质体组合物在血液中被清除的时间延长。

对于本发明的脂质体组合物制剂，应用含有阴离子表面活性剂并且其浓度超过临界胶束浓度的水介质。临界胶束浓度可用通常的方法测定，例如，可以通过研究阴离子表面活性剂的物理性质（如表面张力、渗透压系数和电导率）与浓度之间的关系而测定〔Masayuki Nakagaki和Naofumi Koga，“Drug physicochemistry（YakuhinButsurikagaku）”3rd dn.，P.111（1969），Nankodo〕。因此，应用上述测量结果作为制备水介质的指南，可以使阴离子表面活性剂的浓度超过临界胶束浓度，并且可以使阴离子表面活性剂与磷脂用量的比例在上述范围内。在高于克拉夫特温度下将阴离子表面活性剂溶于水介质中，或者在低于克拉夫特温度下将阴离子表面活性剂悬浮于水介质中，可以制得上述水介质。最好是将可溶于水的药物溶解在上述水溶液中，如果需要，可以加入其它可溶的添加剂（例如调节渗透压的盐类和糖类，调节pH的缓冲剂）。根据治疗的目的以及药物的效果决定药物的含量。

用制得的水介质及磷脂制备乳剂和悬浮液，以便按照制备REV、MLV、SUV和其他脂质体制剂本身已知的方法构成脂质体。例如，可按下法用乳剂制备脂质体组合物。首先，将磷脂溶于有机溶剂（如二乙醚、异丙醚、氯仿，可以单独应用，也可以用其组合物）中，并将上述阴离子表面活性剂的水介质加入，按常规方法，可以制得W/O型的乳剂。用该W/O型乳剂，按照Proc.Natl，Acad.Sci，USA，75，4194（1978）所述方法，或按未经审查的日本专利公开公报№118415/1980所述方法，可以制得脂质体组合物。制备乳剂所用的有机溶剂的量一般为所包括的液体量的2～10倍。每1毫升所包括的液体用10～100微摩尔的磷脂。通常最好预先将磷脂溶于有机溶剂中。

为了得到W/O型的乳剂，常规的方法是应用例如搅拌、加压法和声波处理法进行乳化作用。用具有20千赫兹的探针型声波处理器进行声波处理1～20分钟，可以得到均匀的乳剂。由于本发明的方法中应用了阴离子表面活性剂，所以容易进行乳化，可以得到很好的均匀乳剂。

应用常规的方法，可以从所得到的W/O型乳剂中除去溶剂。例如，可以用旋转蒸发器除去溶剂。最好在温度为40℃或40℃以上，开始时在压力60～400毫米汞柱下进行蒸发，在残留物形成了凝胶之后，于100～700毫米汞柱下进行蒸发。进一步蒸发除去溶剂，可以得到反相蒸发囊〔（reverse-phase evaporation vesicle），REV〕脂质体制剂。该脂质体为单片状或微片状（通常为约10层或少于10层的双面脂膜），并可以包裹药物。

另一方面，可按上述相同的方法制得磷脂在有机溶剂中的溶液，减压蒸发溶液中的有机溶剂，形成磷脂薄膜，然后加入含有药物的阴离子表面活性剂的水介质，并允许在40℃或40℃以上分散，得到多层囊〔（multilamellar vesicles），MLV〕脂质体制剂。将得到的MLV制剂用带有探针的声波处理器振摇，得到小的单薄片囊〔（small unilamellar vesicle），SUV〕脂质体制剂。

制备本发明脂质体组合物的方法也适用于稳定的多层囊〔（stable plurilamellar vesicle），SPLV〕（未经审查的日本专利公开公报№500952/1984）和脱水-再水化囊（C.Kirby等，Biotechnology，Nov.，979（1984）〕。在药物为脂溶性的仅略微溶于水的情况下，按上述方法将药物溶于类脂的有机溶剂溶液中，通过包裹药物，可以得到脂质体组合物。应用象这样的脂质体制剂，或者如果需要，可以用例如核微孔过滤器或凝胶过滤法使颗粒大小合乎需要之后应用。在应用之前最好通过离心法、凝胶过滤法或渗析法除去未包裹的游离药物。

就用于药物输送系统（DDS）而言，对应用于本发明的药物没有特别的限制，可以包括抗肿瘤剂，例如铂化合物（如顺氯氨铂、Carboplatin Spiroplatin），阿霉素，丝裂霉素C，放线菌素，袢环丝裂菌素，博来霉素，5-氟尿嘧啶（5-FU）和甲氨蝶呤;淋巴细胞活素，例如天然的和基因重组体干扰素（α、β、γ、），以及天然的和基因重组体白细胞间素（interleukins）;具有生理活性的肽，例如二氧化锰脱变位酶〔（manganese superoxide desmutase），SOD〕及其衍生物二氧化物脱变位酶PEG〔（superoxide desmutase PEG），PEG-500〕（未经审查的日本专利公开公报№16685/1983和EPC专利申请公开№0210761）;β-内酰胺类抗菌素，例如Sulfagecin;氨基苷类抗菌素，例如庆大霉素、链霉素和卡那霉素;维生素类，例如维生素B₁₂，辅助酶Q;抗原生动物剂，例如葡甲胺锑酸盐;酶，例如碱性磷酸酶;抗凝血剂，例如肝素;抗过敏剂，例如amlexanox;免疫活化剂，例如胞壁酰二肽（muramyl dipeptide）、胞壁酰三肽（muramyl tripeptide）和TMD-66〔Cancer Gann 74（2），192-195（1983）〕;循环系统剂，例如心得安;代谢活化剂，例如谷胱甘肽。由于本发明的目的，本发明特别适用于水溶性的药物。这样的药物包括其中在辛醇与水之间分配系数的对数为10或小于10的药物。按有效量应用药物。

根据治疗的目的应用本发明的脂质体组合物，例如可以静脉注射或滴注适当剂量生理盐水的悬浮液或乳剂。

本发明的脂质体组合物的特征在于，应用具有饱和脂酰基的磷脂，和具有高的克拉夫特温度并且其浓度超过临界胶束浓度的阴离子表面活性剂。

静脉给药后，本发明的脂质体组合物可以长时间稳定地在血液中循环通过身体，这可以减少药物的毒性，增加药物对特定组织的靶作用，并且可以提高药物的持久治疗效果。特别是当高温时，服用本发明的具有抗肿瘤作用的脂质体组合物预期可以提高治疗效果，为此，最好应用脂质体膜的相转移温度在40～55℃的脂质体组合物。

图1、2和3表明，在实验实例1-2中，给大白鼠静脉注入包裹6-羧基荧光素（6-CF）的脂质体组合物后，时间与血中6-CF浓度之间的关系。图4表明，在实验实例2-2中，给大白鼠静脉注入包裹6-CF或CDDP的脂质体组合物后，时间与血中浓度之间的关系。假定血液体积为体重10%，那么血中浓度以剂量的百分率表示。

实例

本发明以下述实例、试验实例和实验实例具体地加以叙述。

实例1

在1升烧杯中，将270毫克DPPC和30毫克DSPC溶于70毫升1∶1的氯仿与异丙基醚的混合液中。预先制备10毫升6-羧基荧光素（6-CF）的水溶液（pH7），并使其渗透压与生理盐水相同，然后于室温下将30毫克硬脂酰甲基牛磺酸钠（SMT）加入。SMT几乎不溶解，但是在温度高于克拉夫特温度时，由于形成胶束而迅速地溶解。然后，将该溶液加到磷脂在有机溶剂中的溶液，并用探针型声波处理器（ohtake，日本）进行乳化，得到W/O型的乳剂。以50瓦的声波处理器处理30秒，并重复10次。将该乳剂置于旋转蒸发器中，在60℃于减压下蒸去有机溶剂，得REV。在开始阶段，使蒸发器中的压力显著降低，但在蒸发有机溶剂过程中调节压力，以防止暴沸。残留在REV中少量的有机溶剂通过吹入氮气进一步蒸发除去。然后加适量生理盐水到REV中，并加到10毫升。通过1.2微米过滤器（Acrodisc，Gelmen）过滤，通过渗析膜（Spectrapor，Spectrum Medical）透析，用生理盐水交换24小时，得到包裹6-CF的脂质体组合物。在该脂质体中6-CF的包裹比率为33.2%，通过对脂质体中包裹的6-CF的定量而测得（注1）。

（注1）脂质体中6-CF的数量及包裹比率的计算

0.1毫升脂质体组合物用磷酸盐缓冲的生理盐水（PBS，pH7.2）稀释100倍，然后进一步用含0.02%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）的PBS稀释100倍，于60℃加热30分钟，以便破坏脂质体。在脂质体悬浮液中总的6-CF的量可以通过测量溶液荧光的强度而测定（Hitachi，F3000荧光分光光度计，激发波波长494纳米，测量波波长515纳米）。另取0.1毫升脂质体组合物，用PBS稀释10000倍，其中2.5毫升通过离心过滤器（Centrisart，SM13249E，Sartorius）过滤，在脂质体悬浮液中未包裹的游离的6-CF的量可通过测量滤液荧光的强度而测定。

包裹比率＝〔（在脂质体组合物中6-CF总量）-（在脂质体组合物中游离的6-CF的量）〕/（用于制备脂质体组合物的6-CF的量）×100

实例2

用15毫克SMT代替实例1中30毫克SMT，并按实例1类似的方法处理，得到6-CF包裹比率为34.9%的脂质体组合物。

实例3

用45毫克SMT代替实例1中30毫克SMT，并按实例1类似的方法处理，得到6-CF包裹比率为39.4%的脂质体组合物。

实例4

用60毫克SMT代替实例1中30毫克SMT，并按实例1类似的方法处理，得到6-CF包裹比率为46.3%的脂质体组合物。

实例5

用30毫克棕榈酰甲基牛磺酸（PMT）钠代替实例1中30毫克SMT，并按实例1类似的方法处理，得到6-CF包裹比率为32.3%的脂质体组合物。

实例6

用30毫克十八烷磺酸钠（ODS）代替实例1中30毫克SMT，并按实例1类似的方法处理，得到6-CF包裹比率为33.3%的脂质体组合物。

实例7

用15毫克ODS代替实例1中30毫克ODS，并按实例1类似的方法处理，得到6-CF包裹比率为24.1%的脂质体组合物。

实例8

用45毫克ODS代替实例1中30毫克ODS，并按实例1类似的方法处理，得到6-CF包裹比率为38.3%的脂质体组合物。

实例9

用60毫克ODS代替实例1中30毫克ODS，并按实例1类似的方法处理，得到6-CF包裹比率为40.1%的脂质体组合物。

实例10

用210毫克DPPC和90毫克DSPC代替实例1中270毫克DPPC和30毫克DSPC，并按实例1类似的方法处理，得到6-CF包裹比率为24.1%的脂质体组合物。

实例11

用300毫克DPPC代替实例1中270毫克DPPC和30毫克DSPC，并按实例1类似的方法处理，得到6-CF包裹比率为35.2%的脂质体组合物。

实例12

用210毫克DPPC和90毫克DSPC代替实例1中270毫克DPPC和30毫克DSPC，并按实例1类似的方法处理，得到6-CF包裹比率为28.3%的脂质体组合物。

实例13

用300毫克DPPC代替实例6中270毫克DPPC和30毫克DSPC，并按实例1类似的方法处理，得到包裹比率为34.6%的脂质体组合物。

实例14

用30毫克棕榈酰牛磺酸（PT）钠代替实例1中30毫克SMT，并按实例1类似的方法处理，得到6-CF包裹比率为22.4%的脂质体组合物。

实例15

将360毫克DPPC和40毫克DSPC置于1升烧杯内，用40毫升氯仿溶解，于旋转蒸发器上蒸去有机溶剂，在玻璃壁上形成了类脂膜，残留在膜上的微量有机溶剂经吹入氮气除去。将用于实例1并于60℃保存的含40毫克SMT的10毫升6-CF溶液于60℃加到制得的膜上，通过旋转使其扩散，得到MLV脂质体。获得的MLV制剂用实例1中的50瓦探针型声波处理器进行声波处理约10分钟，得到SUV。按实例1类似的方法，再将该制剂过滤和透析，得到6-CF包裹比率为5.7%的脂质体组合物。

实例16

用280毫克DPPC和120毫克DSPC代替实例15中360毫克DPPC和40毫克DSPC，并按实例15类似的方法处理，得到6-CF包裹比率为6.3%的脂质体组合物。

实例17

用400毫克DPPC代替实例15中360毫克DPPC和40毫克DSPC，并按实例15类似的方法处理，得到6-CF包裹比率为6.0%的脂质体组合物。

实例18

用40毫克PMT代替实例15中40毫克SMT，并按实例15类似的方法处理，得到6-CF包裹比率为6.8%的脂质体组合物。

实例19

用40毫克ODS代替实例15中40毫克SMT，并按实例15类似的方法处理，得到6-CF包裹比率为6.5%的脂质体组合物。

实例20

用40毫克棕榈酰牛磺酸（PT）钠代替实例15中40毫克SMT，并按实例15类似的方法处理，得到6-CF包裹比率为6.0%的脂质体组合物。

实验实例1-1

制备不含阴离子表面活性剂的脂质体组合物的对照物，并分别使其与上述实例1，10，11，15，16和17得到的脂质体组合物相对应。按实例1类似的方法，用200毫克含不饱和脂酰基的蛋黄磷脂酰胆碱、100毫克胆甾醇和30毫克SMT代替实例1中270毫克DPPC、30毫克DSPC和30毫克SMT，制备另外的脂质体组合物的对照物。制备与该制剂相对应的无SMT的脂质体组合物的对照物。用十二烷基硫酸钠（SDS，克拉夫特温度：9℃）代替实例15中SWT制备另外的脂质体组合物的对照物。

实验实例1-2

将按上述实例1获得的脂质体组合物、以同样方法制备但不含阴离子表面活性剂的脂质体组合物，分别按0.1-0.5毫升给大白鼠静脉注射，测定从血液中被清除的时间（注2）;其结果见图1。如图1所示，含阴离子表面活性剂的脂质体在血中的浓度（-·-）高于不含阴离子表面活性剂的脂质体对照物（…X…）。将实例1、6、10、15、18、19和20中得到的脂质体组合物，分别按0.1-0.5毫升给大白鼠静脉注射，给药后1小时，血液中残留的脂质体的量分别比按同样方法制备但不含阴离子表面活性剂的脂质体对照物高9.7、11.9、26.4、2.7、2.3、2.8和2.2倍。另一方面，如图2所示，由蛋黄磷脂酰胆碱和胆甾醇制得的含阴离子表面活性剂的脂质体（-·-）与脂质体对照物（…X…）同样迅速地从血液中清除。给大白鼠静脉注射0.2毫升由上述实验实例1-1得到的含SDS的脂质体（…X…），或者静脉注射0.2毫升按同法制备但不含SDS的脂质体（-·-），它们从血液中被清除的情况用图3表示。上述图示的结果清楚地表明，用含饱和脂酰基的磷脂以及克拉夫特温度为37℃或37℃以上的阴离子表面活性剂作为脂质体膜的成分，制得的本发明脂质体组合物的特征在于，与脂质体对照物相比，静脉注射后能够显著地延长从血液中被清除的时间。

实验实例1-3

给大白鼠静脉注射由上述实例1、15、18和19得到的脂质体组合物，以及由实验实例1-1得到的脂质体组合物，为了研究脂质体输送到网状内皮组织（RES）的情况，测定肝脏中6-CF的浓度（注2）;结果见表1。其结果表明，脂质体从血液中被清除的时间延长，而输送到RES（例如肝脏）的脂质体减少。

表1给药后1小时在肝脏中脂质体的浓度（%）

脂质体制剂有阴离子表面活性剂无阴离子表面活性剂

实例1 16.7 30.1

实例15 16.9 44.7

实例18 19.1 44.7

实例19 15.0 44.7

（注2）测定血和肝脏中6-CF脂质体的浓度

将10毫升PBS加到0.2毫升取自尾静脉的肝素化的血液中，得到血悬浮液。该血悬浮液经离心（3000转/分钟，10分钟），向0.5毫升上清液中加入0.05毫升Triton X-100，并于60～70℃加热，以便破坏脂质体。通过测量6-CF释放的荧光测定血中脂质体浓度。在切开腹部和去血之后，摘除的肝脏浸入含有0.02% Triton X-100的PBS中，并加至100毫升。用匀浆器（Polytron，Kinematica）匀化，于60～70℃加热，得到组织匀浆，其中全部6-CF均已分离出来。将组织匀浆超速离心（50000g，10分钟），并稀释20～50倍，经0.45微米的膜过滤器（Acrodisk，Gelman）过滤，通过测量滤液的荧光来测定肝脏中脂质体的浓度。

实验实例1-4

随着进行脂质体膜的相转移（从凝胶变为液晶），用连有程序温度系统的荧光计，通过连续测量从脂质体中释放出6-CF的量，研究由实例1、2和6得到的脂质体组合物以及不含阴离子表面活性剂的对照组用PBS（含2%血浆）稀释10000倍的各稀释液的放热情况。从放热曲线测得的开始放热温度及相转移温度列于表2，用热分析系统（SEIKO I and E，SSC50000型，2℃/分钟）测量相转移温度。开始放热温度与相转移温度相互是密切有关的。表2脂质体膜的相转移温度（℃）及脂质体中6-CF的开始放热温度（℃）

脂质体组合物相转移温度开始放热温度

实例1 42.3 36.1

实例6 43.7 39.3

实例10 42.8 36.3

没有表面活性剂 41.9 37.9

实例21

用500微克/毫升的顺氯氨铂（CDDP）在生理盐水中的溶液代替由实例1得到的6-CF溶液，并按实例1类似的方法处理，得到CDDP包裹比率为23.5%的脂质体组合物，并且相转移温度为42.7℃。

（注3）脂质体中CDDP含量的测定

将0.1毫升脂质体组合物悬浮在5毫升生理盐水中，取2.5毫升悬浮液冷冻干燥，加热;得到已破坏的脂质体约2.5毫升通过Centrisalt过滤，向0.1毫升滤液中加入2毫升含10%二乙基二硫代氨基甲酸盐（DDTC）的0.1N NaOH溶液，并于室温保持30分钟，生成的加合物用5毫升正-己烷萃取，萃取液用高效液相色谱分析（注：Zorbax CN，溶液：正-己烷/异丙醇＝8/2;UV＝250纳米），测定脂质体悬浮液中总的CDDP的量。取约2.5毫升脂质体残留在生理盐水中的溶液通过Centrisalt过滤，残留的未包裹在脂质体中游离的CDDP的量在相同的条件下按上述方法测定。

实例22

用500微克/毫升顺氯氨铂（CDDP）的生理盐水溶液代替实例2中的6-CF溶液，并按实例2类似的方法处理，得到CDDP包裹率为21.4%的脂质体组合物。

实例23

用500微克/毫升顺氯氨铂（CDDP）的生理盐水溶液代替实例3中的6-CF溶液，并按实例3类似的方法处理，得到CDDP包裹率为25.8%的脂质体组合物。

实例24

用500微克/毫升顺氯氨铂（CDDP）的生理盐水溶液代替实例5中的6-CF溶液，并按实例5类似的方法处理，得到CDDP包裹率为24.0%的脂质体组合物。

实例25

用500微克/毫升顺氯氨铂（CDDP）的生理盐水溶液代替实例6中的6-CF溶液，并按实例6类似的方法处理，得到CDDP包裹率为21.8%的脂质体组合物，相转移温度为43.9℃。

实例26

用500微克/毫升顺氯氨铂（CDDP）的生理盐水溶液代替实例7中的6-CF溶液，并按实例7类似的方法处理，得到CDDP包裹率为21.9%的脂质体组合物。

实例27

用500微克/毫升顺氯氨铂（CDDP）的生理盐水溶液代替实例8中的6-CF溶液，并按实例8类似的方法处理，得到CDDP包裹率为24.9%的脂质体组合物。

实例28

用500微克/毫升顺氯氨铂（CDDP）的生理盐水溶液代替实例10中的6-CF溶液，并按实例10类似的方法处理，得到CDDP包裹率为23.3%的脂质体组合物。

实例29

用500微克/毫升顺氯氨铂（CDDP）的生理盐水溶液代替实例11中的6-CF溶液，并按实例11类似的方法处理，得到CDDP包裹率为27.7%的脂质体组合物，相转移温度为41.9℃。

实例30

用500微克/毫升顺氯氨铂（CDDP）的生理盐水溶液代替实例12中的6-CF溶液，并按实例12类似的方法处理，得到CDDP包裹率为24.0%的脂质体组合物。

实例31

用500微克/毫升顺氯氨铂（CDDP）的生理盐水溶液代替实例13中的6-CF溶液，并按实例13类似的方法处理，得到CDDP包裹率为24.5%的脂质体组合物，相转移温度为42.5℃。

实例32

用500微克/毫升顺氯氨铂（CDDP）的生理盐水溶液代替实例14中的6-CF溶液，并按实例14类似的方法处理，得到CDDP包裹率为25.0%的脂质体组合物。

实例33

用500微克/毫升顺氯氨铂（CDDP）的生理盐水溶液代替实例15中的6-CF溶液，并按实例15类似的方法处理，得到CDDP包裹率为4.8%的脂质体组合物。

实例34

用500微克/毫升顺氯氨铂（CDDP）的生理盐水溶液代替实例16中的6-CF溶液，并按实例16类似的方法处理，得到CDDP包裹率为5.0%的脂质体组合物。

实例35

用500微克/毫升顺氯氨铂（CDDP）的生理盐水溶液代替实例17中的6-CF溶液，并按实例17类似的方法处理，得到CDDP包裹率为5.2%的脂质体组合物。

实例36

用500微克/毫升顺氯氨铂（CDDP）的生理盐水溶液代替实例18中的6-CF溶液，并按实例18类似的方法处理，得到CDDP包裹率为4.3%的脂质体组合物。

实例37

用500微克/毫升顺氯氨铂（CDDP）的生理盐水溶液代替实例19中的6-CF溶液，并按实例19类似的方法处理，得到CDDP包裹率为4.9%的脂质体组合物。

实例38

用500微克/毫升顺氯氨铂（CDDP）的生理盐水溶液代替实例20中的6-CF溶液，并按实例20类似的方法处理，得到CDDP包裹率为4.7%的脂质体组合物。

实验实例2-1

按实例21、28、29、33、34和35制得的各个脂质体组合物对照物的方法，制备不含阴离子表面活性剂的脂质体组合物。

实验实例2-2

分别给大白鼠静脉注射实例1的脂质体组合物和实例15的脂质体组合物，比较直到注射后6小时血中6-CF浓度和CDDP浓度（注4），结果见图4。假定CDDP脂质体组合物与6-CF脂质体组合物具有类似的性能，那么在任何时间上CDDP的浓度（-·-）与6-CF的浓度（…X…）相类似。此外由实例21、22、25、26和29得到的脂质体组合物与6-CF脂质体组合物具有一样高的数值。这些结果表明，与脂质体组合物的对照物相比，用含饱和脂酰基的磷脂和克拉夫特温度为37℃或37℃以上的阴离子表面活性剂制备的本发明脂质体组合物的特征在于，静脉给药后从血中被清除的时间延长。

（注4）血中CDDP浓度的测量

将2毫升PBS加到0.2毫升取自尾静脉的肝素化的血液中，得到血悬浮液。该悬浮液经离心得到上清液，向1毫升上清液中加入1毫升DDTC溶液;用上述测定CDDP含量的类似方法测定血中总的CDDP含量。

实验实例2-3

测定上述实例21组合物中SMT的含量（注5），结果表明，对于脂质体组合物制剂，保持约90%的量。该数值比23.5%的CDDP包裹率高得多，这说明SMT肯定构成了脂质体膜，并说明在脂质体膜中每1000个磷脂分子就有约150个SMT分子。

（注5）SMT含量的测定

将15毫克亚甲基兰、6克浓硫酸和25克无水硫酸钠溶于蒸馏水中，得到500毫升反应试验溶液。向5毫升该反应试验溶液中加入10毫升稀释10000倍的脂质体组合物及5毫升氯仿，充分振摇后使其分为二层，测定氯仿层的吸收值（653纳米）。测定不同浓度SMT溶液（小于10PPm）的吸收值，绘制校准曲线。用实验实例2-1中没有SMT的脂质体组合物进行空白试验。

实例39

用308微克蛋白质/毫升白细胞间素2〔interleukin2，（IL-2）〕（在25毫摩尔醋酸铵溶液中，PH6）的水溶液代替实例11中的6-CF溶液，并按实例11类似的方法处理，得到本发明的脂质体组合物。

实例40

用308微克蛋白质/毫升IL-2的水溶液代替实例13中的6-CF溶液，并按实例13类似的方法处理，得到本发明的脂质体组合物。

实例41

用100微克/毫升袢环丝裂菌素的水溶液代替实例11中的6-CF溶液，并按实例11类似的方法处理，得到包裹袢环丝裂菌素的本发明脂质体组合物。

实例42

用100微克/毫升袢环丝裂菌素的水溶液代替实例13中的6-CF溶液，并按实例13类似的方法处理，得到包裹袢环丝裂菌素的本发明脂质体组合物。

实例43

用5毫克/毫升甲氨蝶呤的生理盐水溶液代替实例11中的6-CF溶液，并按实例11类似的方法处理，得到包裹甲氨蝶呤的本发明脂质体组合物。

实例44

用5毫克/毫升甲氨蝶呤的生理盐水溶液代替实例13中6-CF溶液，并按实例13类似的方法处理，得到包裹甲氨蝶呤的本发明脂质体组合物。

实例45

用200微克/毫升丝裂霉素C的生理盐水溶液代替实例11中的6-CF溶液，并按实例11类似的方法处理，得到包裹丝裂霉素C的本发明脂质体组合物。

实例46

用200微克/毫升丝裂霉素C的生理盐水溶液代替实例13中的6-CF溶液，并按实例13类似的方法处理，得到包裹丝裂霉素C的本发明脂质体组合物。

实例47

用1毫克/毫升阿霉素的生理盐水溶液代替实例11中的6-CF溶液，并按实例11类似的方法处理，得到包裹阿霉素的本发明脂质体组合物。

实例48

用1毫克/毫升阿霉素的生理盐水溶液代替实例13中的6-CF溶液，并按实例11类似的方法处理，得到包裹阿霉素的本发明脂质体组合物。

实例49

用3毫克/毫升博来霉素的生理盐水溶液代替实例11中的6-CF溶液，并按实例11类似的方法处理，得到包裹博来霉素的本发明脂质体组合物。

实例50

用3毫克/毫升博来霉素的生理盐水溶液代替实例13中的6-CF溶液，并按实例13类似的方法处理，得到包裹博来霉素的本发明脂质体组合物。

Claims

1、在脂质体中包裹药物的脂质体组合物，其中膜是由带有饱和脂酰基的磷脂与克拉夫特温度为37℃或37℃以上的阴离子表面活性剂构成。

2、根据权利要求1所述的组合物，其中脂质体膜的相转移温度为37～60℃。

3、根据权利要求1所述的组合物，其中阴离子表面活性剂可以用下述通式表示：

R-Xm（Y₁或Y₂）-Z

其中R为由硫酸根取代有的有12或12个以上碳原子的烷基，

X为-CONH-，-COO-， ;

Y₁为-CH₂CH₂-，

或-CH₂CH₂CH₂-;

Y₂为-OCH₂CH₂-，

或-OCH₂CH₂CH₂-;

Z为-SO^- ₃M⁺或-SO^- ₄M⁺（M为碱金属元素）;

m为零（直接连接）或1;n为零（直接连接）～2的整数，条件是当X为-CONH-或-

时，Y₂为零（直接连接），并且当X为

时，n为零（直接连接）。

4、根据权利要求1所述的组合物，其中阴离子表面活性剂是酰基牛磺酸的盐或酰基甲基牛磺酸的盐。

5、根据权利要求1所述的组合物，其中药物在辛醇与水之间的分配系数的对数为10或小于10。

6、根据权利要求1所述的组合物，其中药物可以是抗肿瘤剂、淋巴细胞活素、具有生理活性的肽、抗菌素、维生素、抗原生动物剂、酶、抗凝血剂、抗过敏剂、免疫活化剂、循环系统剂或代谢活化剂。

7、根据权利要求6所述的组合物，其中抗肿瘤剂为铂化合物。

8、根据权利要求7所述的组合物，其中铂化合物为顺氯氨铂。

9、根据权利要求6所述的组合物，抗肿瘤剂包裹在脂质体中，其中膜的相转移温度为40～55℃。

10、制备包裹药物的脂质体组合物的方法，该方法包括（1）制备克拉夫特温度为37℃或37℃以上、浓度超过临界胶束浓度的阴离子表面活性剂的水介质，（2）将得到的水介质与带有饱和脂酰基的磷脂混合，制得乳剂或悬浮液，其中将有效量的药物加到过程（1）和/或（2）中，（3）将得到的乳剂或悬浮液制备脂质体囊，脂质体膜由上述表面活性剂和磷脂构成。

11、根据权利要求10所述的方法，这里用制备REV、MLV、SUV或SPLV的方法制备脂质体囊。

12、根据权利要求10所述的方法，其中每100份重量的磷脂用0.5～50份重量的阴离子表面活性剂。