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CN87107991A - 在大肠杆菌内表达的人类脱辅基脂蛋ai及其变异形式 - Google Patents

在大肠杆菌内表达的人类脱辅基脂蛋ai及其变异形式 Download PDF

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CN87107991A
CN87107991A CN198787107991A CN87107991A CN87107991A CN 87107991 A CN87107991 A CN 87107991A CN 198787107991 A CN198787107991 A CN 198787107991A CN 87107991 A CN87107991 A CN 87107991A CN 87107991 A CN87107991 A CN 87107991A
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met
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罗兰多·洛伦泽蒂
卢恰·莫纳科
马尔科·索里阿
拉法埃莱·帕隆巴
安东内尔·伊萨基
保罗·萨尔米恩托斯
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Farmitalia Carlo Erba SRL
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Abstract

一种能够在已转化的宿主内表达蛋白质的表达载体，所说的蛋白质能够使用抗人apoAI抗血清以ELISA方法检测，并且其具有下列式(1)的结构通式
Met-X-Y(1)：其中x是键、载体肽序列一其包括得自β半乳糖苷酶之N末端氨基酸残基的序列或含蛋白A之一个或多个1gG结合区域的序列、或者是人apoAI的前导序列；且Y代表人apoAI或其遗传变异型的序列。用这样的载体转化的宿主生产蛋白质，该蛋白质可用于治疗动脉粥样硬化和心血管疾病。

Description

本发明涉及用DNA重组技术生产人类脱辅基脂蛋白AI（apoAI）及其变异型。
动脉粥样硬化及其并发症（即冠心病）可能是世界上最严重的健康问题。已发现大量与疾病发展相关的危险因素、其中最重要的是高血浆胆固醇（CHL）水平。因而，已对人体内CHL代谢的研究作了大量工作。
脂蛋白运输系统把握着了解基因、饮食和激素相互作用以调节人体内血浆CHL及甘油三酯（TG）水平之机制的关键。血浆中脂蛋白的功能主要是将脂类由一个器官输送到另一器官。近年已经知道，它们不仅溶解疏水脂类，而且也可指定各不同类脂质所释放达到的身体部位。脂蛋白主要有四类：乳糜微粒（CM）、极低密度脂蛋白（VLDL）、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）。
为便于在血浆中运输，TG和胆固醇酯（LHLE）被包裹在脂蛋白颗粒中，在其中形成一个由极性磷脂（PL）的表面单层包绕的疏水核心。表面外壳还含有相对小量的未酯化CHL以及称为脱辅基脂蛋白（apo）的蛋白质。已鉴定出至少九种apo：AⅠ、AⅡ、AⅣ、B（48-100）、CⅠ、CⅡ、CⅢ、D和E。
特别引人关注的是有关血浆脂蛋白水平与冠血病（CHD）发展的危险性之间关系的研究。HDL和LDL均为CHL和CHLH的载体，但已证明LDL-CHL水平是正危险因素（Kannel等，Ann.Intern.Med.，90：85-91，1979），而HDL则是重要的负危险因子（Yaari等，Lancet，1：1011-1015，1981）。虽然有关这些脂蛋白的确切功能及作用方式尚不完全明瞭，但显然HDL可通过称为反向CHL运输（RCT）的机制特定地用于由外周组织中除去CHL并将其回输到肝脏内。
HDL的主要脱辅基脂蛋白是apoAⅠ，一些研究表明，血浆apoAⅠ水平与CHD之间反相关相似于文献中提到的HDL-CHL水平与CHD之间的反相关（Iskikawa等，Eur.J.Clin.Invest.，8：172-182，1978）。此外，HDL-CHL和apoAⅠ水平与血管造影可证明的冠状动脉硬化损害的严重程度反相关（Pearson等，Amer.J.Epidem.，109：285-295，1979;Maciejko等，New    Eng.J.Med.，309：385-389，1983）。由此可以认为，血浆中高浓度HDL影响CHD是通过延迟动脉粥样硬化形成和/或促进已有损伤的消退得以证实的。
HDL脱辅基脂蛋白（主要是apoAⅠ）与卵磷脂的复合物在体外促进游离CHL由细胞（包括培养的动脉平滑肌细胞）内流出（Stein等，Biochem.Biophys.Acta，380：106-118，1975）。给带有实验性动脉粥样硬化的动物静脉内灌注磷脂，可有利地影响这种流出过程（Adams等，J.Path.Bact.，94：77-87，1968），并使apoAⅠ/卵磷脂复合物以相似于天然HDL颗粒的速率由血浆中排除（Malmendier等，Clin.Chem.Acta，131：201-210，1983）。
给饲以CHL的兔静脉内输注apoAⅠ可使动脉损伤的面积减少50%。这表明apoAⅠ具有防止动脉硬化性损伤形成的作用，且可能是通过增加动脉壁对CHL的摄入达到的（Maclejko和Mao，Artheriosclerosis，2：407a，1982;Mao等，Fed.Proc.（USA），42，no7 pABSTRACT357，1983;Badimon等，Cardiovascular Disease186，1986ABSTRACT81）。
ApoAⅠ是HDL的主要蛋白质，约占70%，在血浆含量较多，浓度为1.0-1.2mg/ml（Schonfield等，J.Clin.Invest.，69：1072，1982）。血浆apoAⅠ是有243个氨基酸的单一多肽链，其一级结构是已知的（Brewer等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，80：623-630，1978）。apoAⅠ的细胞内存在形式为其267个氨基酸长的前体物;该较长的蛋白质的前18个N末端残基于细胞内被粗糙型内质网的信号肽酶裂解。新切断的apoAⅠ仍含有6个氨基酸的N末端延长部分;前体物转化为其成熟形式是由血浆和/或淋巴特异性蛋白酶完成的（Zarmis    and    Breslow，in    Advances    in    Human    Genetics，Harris    and    Hirschhorn    eds.，Plenum，125-215，1985）。
已证明apoAⅠ分子的C末端含有11或22个氨基酸的重复单元（MeLachlan，Nature，267：465-466，1979）;串联排列的片段并不是严格重复的，但氨基酸取代一般都保留了重复序列的相应位置中残基的化学类型。假定这些重复片段存在于中极两性的螺旋结构中（Segrest等，FEBS    Lett.，38：247-253，1974），据信这是apoAⅠ的基本生物学活性，即脂类结合和卵磷脂CHL酰基转移酶（LCAT）活化作用的重要结构要求。apoAⅠ的另外两个功能，即作为由受体识别HDL颗粒的配基，以及由外周组织中除去CHL，尚没有与apoAⅠ分子中的特定序列或区域联系起来。
第一个被描述的人类apoAⅠ的分子变异型是Milano（apoAⅠ-MⅠ）变异型（Franceschini等，J.Clin.Invest.，66：892-900，1980），并且是在属于同一宗族的33个被检对象中鉴定出来的。对于变异的脱辅基蛋白来说，它们都是杂合的，并是作为常染色体的显性性状遗传的。它们显示出可以显著地降低HDL-CHL浓度及缓解高甘油三酯血症，并与HDL水平负相关。可以确认的是变异型与特定病理条件之间没有关联;其显然可防止受影响个体的早期动脉硬化的发展（Gualandri等，Am.J.Hum.Gen.，1986，in    Press）。
apoAⅠ-MⅠ分子中的氨基酸置换改变了变异型脱辅基蛋白的结构，导致有序α螺旋结构的还原并增加了疏水残基的暴露（Franceschini等，J.Biol.Chem.，260：16321-16325，1985）。变异型脱辅基蛋白的改型大大改变了分子的脂质结合性质，使之与脂类的联系比正常apoAⅠ更为迅速。脱辅基蛋白/脂质复合物相似于由正常apoAⅠ形成的复合物，但其更容易被变性剂破坏。在变异形式中存在半胱氨酸残基将有助于形成apoAⅡ及apoAⅠ二聚体的复合物;而这些蛋白质复合物则可能负责形成于“受影响的”被试个体中观察到的异常HDL颗粒。apoAⅠ-MⅠ的所有这些性质可有助于加速其分解代谢以及对组织脂类的有效摄取能力。
迄今已发现了apoAⅠ的其他几种遗传变异型（Brelow，Ann.Rev.Biochem.，54：699-727，1985），但一般说来，这些变异型与各种病理条件均无关联、或不能明显地改变携带者体内的脂蛋白代谢（参见下面表1）。
已有几个实验室制得了ApoAⅠ    cDNA克隆（Breslow，Ann.Rev.Biochem.，54：699-727，1985;Sharpe等，Nucl.Acids    Res.，12：3917-3932，1984）。mRNA长约890个碱基对（bp）并有一长35bp的5′非翻译序列，一个有801bp（编码267个氨基酸）的编码序列、一个翻译终止密码子和一54bp的3′非翻译序列，其后接有polyA尾部。附图1中显示了完整的cDNA核苷酸序列。
我们发现，DNA重组技术可成功地用于生产含apoAⅠ或其遗传变异型的蛋白质。变异型可以是apoAⅠ中的6-Ser被Thr取代（apoAⅠ-T6），apoAⅠ-MⅠ或者是结合有apoAⅠ-T6及apoAⅠ-MⅠ这两种突变的变异型（apoAⅠ-T6/MⅠ）。可使用抗apoAⅠ抗血清，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测这些蛋白质。这些蛋白质可以以融合蛋白的形式产生，其中apoAⅠ或其遗传变异型在其N末端与载体肽融合。
因此，本发明提供了一种能够在转化的宿主内表达蛋白质的表达载体，这种蛋白质可使用抗人apoAⅠ抗血清经LLISA法检测，且具有如（1）所示的结构通式：
（1）：
Met-X-Y    （1）
其中X是一个键，一个包含由β半乳糖苷酶N末端氨基酸残基推衍出之序列的载体肽序列，或含有蛋白A之一个或多个IgG结合区域序列的载体肽序列，或人apoAⅠ的前导序列（Pro    sequence）;Y代表人apoAⅠ或其遗传变异型的序列。
Met残基可归属为翻译起始密码子。可用能在其中表达所说蛋白的、并用这样一个表达载体转化的宿主来制备结构通式（1）的蛋白质。培养已转化的宿主并回收所产生出的式（1）的蛋白质。式（1）的蛋白质也构成本发明的一个部分。
在本发明的优选实施方案中，涉及到
A）.携带下列蛋白基因的重组质粒的构建：
1-apoAⅠ（见图1），
2-apoAⅠ-T6，
3-apoAⅠ-MⅠ，
4-apoAⅠ-T6/MⅠ，
5-具有下列N末端延伸部分的apoAⅠ：Thr-Met-Ile-Thr-Pro-Ser-Phe-Asp-Gly-Ser-Met-，（apoAⅠ-RP5），
6-具有下列N末端延伸部分的apoAⅠ：Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Met-（apoAⅠ-IP1），
7-结合有apoAⅠ-T6和apoAⅠ-RP5的蛋白质（apoAⅠ-RP5/T6），
8-结合有apoAⅠ-T6和apoAⅠ-IP1的蛋白质（apoAⅠ-IP1/T6），
9-结合有apoAⅠ-MⅠ和apoAⅠ-RP5的蛋白质（apoAⅠ-RP5/MⅠ），
10-结合有apoAⅠ-MⅠ和apoAⅠ-IP1的蛋白质（apoAⅠ-IP1/MⅠ），
11-结合有apoAⅠ-T6/MⅠ和apoAⅠ-RP5的蛋白质（apoAⅠ-RP5/T6/MⅠ），
12-结合有apoAⅠ-T6/MⅠ和apoAⅠ-IP1的蛋白质（apoAⅠ-IP1/T6/MⅠ），以及
13-具有下列N末端延伸部分的apoAⅠ：Arg-His-Phe-Trp-Gln-Gln（ProapoAⅠ），
14-具有由葡萄球菌蛋白A提供的N末端延伸部分的、含541个氨基酸残基的蛋白质，并且从其N末端开始是由：（λ噬菌体之CRO蛋白的前11个氨基酸）-（葡萄球菌蛋白A的248个氨基酸（残基23至270））-（Pro-Gly-Asp-Ser-Thr）-（β半乳糖苷酶的后17个氨基酸）-（含蛋白水解酶肠激酶之识别序列的17个氨基酸，即Gly-Asp-Pro-Glu-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Ser-Arg-Gly-Ser-Met）-（apoAⅠ，apoAⅠ-T6，apoAⅠ-MⅠ或apoAⅠ-T6/MⅠ）所组成的;以及
B）这些基因在大肠杆菌（E.Coli）菌株中的表达。通过这些基因的表达，得到下列蛋白质：-选自Met-apoAⅠ、Met-apoAⅠ-T6、Met-apoAⅠ-MⅠ以及Met-apoAⅠ-T6/MⅠ的脱辅基脂蛋白;
-其中氨基酸序列Met-Thr-Met-Ile-Thr-Pro-Ser-Phe-Asp-Gly-Ser-Met与选自apoAⅠ、apoAⅠ-T6、apoAⅠ-MⅠ和apoAⅠ-T6/MⅠ的脱辅基脂蛋白融合的融合蛋白质;
-其中氨基酸序列Met-Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Met与选自apoAⅠ、apoAⅠ-T6、apoAⅠ-MⅠ和apoAⅠ-T6/MⅠ的脱辅基脂蛋白融合的融合蛋白质;
-脱辅基脂蛋白原ProapoAⅠ或ProapoAⅠ-MⅠ;以及
-由（λ噬菌体之CRO蛋白的前11个氨基酸）-（葡萄球菌蛋白A的248个氨基酸（残基23至270））-（Pro-Gly-Asp-Ser-Thr）-（β半乳苷酶的后17个氨基酸）-（含有蛋白水解酶肠激酶之识别序列的17个氨基酸，即Gly-Asp-Pro-Glu-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Ser-Arg-Gly-Ser-Met）-（apoAⅠ、apoAⅠ-T6、apoAⅠ-MⅠ或apo-T6/MⅠ）组成的融合蛋白质。
附图中：
图1显示相应于人apoAⅠ之成熟形式的完整核苷酸序列。就mRNA意义来说，该序列是以5′至3′方向显示的;下面一行显示氨基酸序列。
图2显示编码成熟人apoAⅠ基因之5′末端的重建。将得自质粒pAⅠ/A的DNA片段（于第一个Sau3AⅠ限制性酶切点处开始）连接到经退火和连接单链前体1-4而组装的合成的寡核苷酸连接物上。所得侧接有两个BamHⅠ限制位点的796bp片段即为编码成熟的apoAⅠ分子的片段。
图3涉及pLS66和pML11-20的核苷酸序列。序列显示了删除之前（pLS66，A）和删除后（pML11-20，B），pFCE4+的ATG起始密码子与apoAⅠ基因的开始部分之间的接合。
图4涉及pIL8-6和pIL8-Ⅰ的核苷酸序列。序列显示在pIL8-Ⅰ（A）中存在apoAⅠ-MⅠ突变（C→T），且pIL8-6（B）中存在apoAⅠ-T6突变（G→C）。
图5显示对pML11-20的免疫印迹分析（imunoblot    analysis）。将由亲合层析柱洗脱出的材料及标准人HDL部分的等分样品煮沸并以双份在12.5%SDS-PAGE板上电泳。按正文中所述的方法吸印到硝酸纤维素滤膜上。泳道：1-标准HDL;2-来自亲合层析柱的洗脱物;3-Mr标准品。
图6显示对pRP5和pUC9的免疫印迹分析。离心沉淀携带野生型pUC9或重组pRP5质粒（用IPTG诱导的）细菌培养物的等分样品并重新悬浮于适当缓冲液内，与标准人HDL部分平行进行凝胶电泳分离;将样品加热煮沸后加于12.5%SDS-PAGE板上电泳。按文中所述的方法吸印到硝酸纤维素薄膜上。泳道：1-Mr标准品;2-标准HDL;3-pUC9;4-pRP5。
图7显示质粒pLM8的构建，其中矩形方框指示如下：PROTA、AMP、LACZ和APOAⅠ：分别为编码蛋白A、β-内酰胺酶、β半乳糖苷酶和人类成熟apoAⅠ的基因;CRO：编码λCro蛋白前11个氨基酸的序列;T：蛋白A转录终止序列;F1：噬菌体f1包装序列;ORI：复制原点;EK.AD：由肠激酶识别的蛋白水解位点序列。质粒pLMs中的EcoRⅠ和ClaⅠ位点并不是唯一的。
图8显示5′proapoAⅠ序列的重建。
图9显示能表达ProapoAⅠ之载体pFC33的构建。
图10显示由pFC33表达的ProapoAⅠ的凝胶电泳及免疫印迹分析结果。泳道1：HDL标准品;泳道2：未重组的菌株;泳道3：proapoAⅠ;泳道4：分子量标准品。
根据本发明的表达载体为能够表达DNA序列、特别是表达载体所含之结构基因序列的载体。被表达的DNA序列是“在读码中”的、并与控制其表达的上游序列相关联。任何可利用的适当启动子系统，均要考虑到被表达的蛋白质及宿主的性质等。为此，可使用选自Pl、lac、tac和trp的某种启动子。在所提供的例子中，51调节序列是与欲被表达的apoAⅠ或其遗传突变型异源的。调节序列可以是lac或trp操纵子序列。换句话说，本发明的表达载体能表达某一异源蛋白质，其中所说的异源蛋白是apoAⅠ或其遗传突变型。优选的遗传突变型是apoAⅠ-T6、apoAⅠ-MⅠ和apoAⅠ-T6/MⅠ。
本发明的含编码式（1）蛋白质之DNA序列的表达载体均为典型的质粒。它们可以是单股链的。每个载体都是可复制的，有其复制原点。在表达apoAⅠ或其遗传突变型时，优选的表达载体是自质粒pECE4+衍生的;而表达融合蛋白质时，优选的表达载体是pUC8或pUC9衍生的，其中融合蛋白的载体序列含有自β半乳糖苷酶之N末端氨基酸残基得到的序列;使用pLM3时，载体序列含有蛋白A的一个或多个IgG结合区;而表达ProapoAⅠ或其遗传突变型时则优选pDS20。
为表达含apoAⅠ或其遗传突变型的蛋白质，可用依据于本发明的表达载体转化适当的宿主细胞。可使用细菌、酵母或哺乳动物细胞系等原核或真核宿主。典型的宿主是大肠杆菌菌株。应选择那些预期得到的蛋白质不能被细胞蛋白酶降解的宿主。因此，一般来说，可按下述方法制得含apoAⅠ或其遗传突变型的蛋白质：
1.选择已克隆的apoAⅠ    cDNA。
2.修剪cDNA，从而为apoAⅠ基因两端提供限制性酶切点，使之变得更易于被除去。这样便可能导致编码信号肽及前体肽之序列的删除。
3.将apoAⅠ基因以正确读码方向插入表达载体中。可引入突变T6和/或MⅠ。在操纵子中apoAⅠ基因或变异基因可以是唯一的结构基因。另外，当期望表达作为融合蛋白的apoAⅠ或其遗传变异型时，可提供在其5′末端连接有编码载体肽之DNA序列的基因。
4.用表达载体转化能使apoAⅠ或其遗传变异型得以在其中表达的宿主。
5.培养转化了的宿主并回收所得的预期蛋白质。
如此可获得没有一个或多个内含子的、编码apoAⅠ或其遗传变异型的基因，该基因可被插入到处于载体中启动子之转录控制下的读码框内。可在编码载体肽序列的DNA序列之后直接插入基因。因此，就启动子来说，可在载体内读码的翻译起始和终止密码子之间提供编码式（1）之蛋白质的DNA序列。相似地，亦可将编码proapoAⅠ或其遗传变异型的基因插入载体内。用所得表达载体转化宿主培养物，即导致所需蛋白质的产生。
可以自β半乳糖苷酶的N末端氨基酸残基得到融合蛋白质的载体肽部分。例如，可自β半乳糖苷酶的前15个N末端氨基酸序列得到。较好是残基5至15，更好是残基8至12。以这种方式制得的优选载体肽包括序列：
Thr-Met-Ile-Thr-Pro-Ser-Phe-Asp-Gly-Ser-Met或Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Met。
当表达掺入了这类载体肽的融合蛋白时，这些蛋白都是以Met开始的。这种情况适用于包括一个或多个蛋白A之IgG结合区的其他载体肽。包括蛋白水解酶如肠激酶、因子X或胶原酶之识别部位的氨基酸序列，可直接加在apoAⅠ或其变异型之氨基酸序列的前面。适宜的序列是：
Gly-Asp-Pro-Glu-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Ser-Arg-Gly-Ser-Met。
这就是肠激酶的识别序列。在载体序列中亦可存在其他氨基酸。例如在蛋白A序列和蛋白水解酶识别部位之间可以有多达30个残基的连接序列。载体序列的N末端部分可包括天然受表达载体内启动子控制的结构基因的第一部分残基，如多达20个残基。包括蛋白A之IgG结合区的融合蛋白是水溶性的，故可以认为在水溶液环境中是稳定的，并容易通过亲合层析如在IgG偶联的Sepharose柱上纯化成均一的蛋白质。
无论载体肽可提供有或没有N末端延伸部分，式（1）的重组体蛋白都基本上没有人类来源的其他蛋白质。换句话说，所提供的蛋白质基本上是纯的，不伴有通常与之相关联的其他蛋白质。
可将包含apoAⅠ或其遗传变异型的蛋白质用于治疗人或动物机体的病变。特别是可用于降低血浆胆固醇和/或甘油三酯水平，进而可用于治疗动脉粥样硬化和冠心病等心血管疾病。可以为预防或改善/治疗已有病理状态之目的给予该蛋白质。
因此根据本发明生产的蛋白质还可作为含有医药活性载体或稀释剂的医药组合物被提供。这样的组合物可以按已知方法配制。该蛋白质可通过胃肠道外如静脉内注射途径给药。
下列实施例旨在进一步阐明本发明。
实施例1
材料和方法
菌株和培养基
菌株：大肠杆菌K12JM101（Messing等，Nature，314：309-321，1981）、MC1061（Casadaban和Cohen，J.Mol.Biol.，138：179-207，1980）、71/18c1857（Lorenzetti等，Gene，39：85-87，1985）、RL841（Kenkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：488-492，1985）、CAG629（rpoH165、10n-;C.A.Gross，Madison，Wisconsin）。
培养基：当需要时所有菌株均生长在添有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基（LA培养基）中。适当情况下，可向培养基内加入1mMIPTG以抑制lac启动子。
酶、酶促反应及DNA纯化
Sigma公司（St.Louis，MO，USA）生产的溶菌酶。Boehringer公司（Mannheim，DE）、BRL有限公司（Gaitheshurg，MD，USA）或New England Biolabs公司（Beverly，MA，USA）生产的限制性核酸内切酶;T4连接酶及所有其他酶均得自Boehringer公司。除特别指出者外，所有酶促反应都是按照厂商的产品说明书所述方法完成的。在琼脂糖水平凝胶板或聚丙烯酰胺垂直凝胶板上分离用限制性核酸内切酶消化所得到的DNA片段，以改良的电洗脱方法，使用ISCO1750型浓缩器（ISCO公司，Lincoln，NE，USA）由凝胶基质中提取并在Elutip-d柱（Schleicher    and    Schuell，Keene，NH，USA）上进一步纯化。
对细菌提取中的apoAⅠ进行识别的酶免疫测定（ELISA）
将离心收集的细胞重新悬浮于溶胞缓冲液（50mM Tris-Cl PH7.0，30mM NaCl、0.1%NaN3、10mg/L苯甲基磺酰氟）中。制成含1mg/ml溶菌酶的溶液并于4℃搅拌30分钟。经5次反复冻融后，按下述方法对提取物作酶免疫检测。用在单体内产生的抗人apoAⅠ抗血清（Boehringer，Mannheim、DE）的适当稀释液包被标准的96孔微量滴定板，于4℃过夜。用含有0.05%Tween-20和0.01%硫柳汞的10mM Tris-Cl（pH8.0）洗3次后，加入50μl apoAⅠ标准品（TAGO公司，Burlingame，CA，USA）的连续稀释液，并于37℃保温1小时。用同一缓冲液洗3次后，加入50μl经硫酸铵沉淀而进一步纯化的兔抗人apoAⅠ抗血清的适当稀释液（Immuno有限公司，Dunton Green，Nr.Sevenoaks.Kent，GB）。于37℃作用1小时并洗3次以上之后，用New England Nuclear公司（Boston，MA，USA）提供的蛋白A-辣根过氧化物酶药盒，按制造商所述的方法对各小井染色。
羊抗人apoAⅠ与Affigel    10的偶联
羊抗apoAⅠ抗体（Boehringer，Manneheim，DE）的制备：20ml未稀释的抗体溶液于4℃对0.1M磷酸盐缓冲液（PH7）透析过夜，同时搅拌;然后离心使所有碎片与上清分离。
Affigel    10（Bio-Rad公司，Richmond，CA）的制备：取40ml凝胶于室温下平衡，然后用半倍体积异丙醇再用两倍体积双蒸水反复洗涤（4-5次）;过滤干燥凝胶并转入50ml加有已经透析之抗体的falcon试管中。搅拌下将试管于4℃保温8小时并加入1ml浓度为1M的甘氨酸乙酯;继续保温过夜。然后用下列溶液反复洗涤凝胶：
-100ml    PBS+0.1%叠氮钠;
-100ml    1M乙酸;
-100ml    0.1M磷酸盐缓冲液（PH7）+0.5M    NaCl;
-100ml    PBS+0.1%叠氮钠;
装柱并用装填缓冲液（loading    buffer，PBS+10mg/l    PMSF+10mg/L    Pepstatin    A）平衡。
免疫印迹分析
使用Laemmli方法跑聚丙烯酰胺板电泳（以适当浓度）分离样品。然后使用印迹转移装置（tranblot    apparatus，Rio-Rad），以0.2mA电流，在25mMTris碱、192mM甘氨酸、20%甲醇中，4℃处理4小时，将凝胶转移到硝酸纤维素滤膜上。用双蒸水洗滤膜后再于轻轻摇动下加PBS+3%BSA一起保温1小时。再次用双蒸水洗滤膜并与已用PBS作1∶250稀释的第一抗体（与用于ELISA法中的第二抗体相同）一起于室温下保温1小时。用PBS和PBS+0.05%Tween20洗两次后，将滤膜与1∶7500稀释的第二抗体（在羊体内产生的抗兔IgG并已与辣根过氧化物酶结合;Bio-Rad）在室温下保温1小时。将滤膜洗两次以上，然后用4-氯-1-萘酚染色。
结果
apoAⅠ基因的51末端重建
由具有信号肽、肽原（Propeptide）和完整成熟apoAⅠ蛋白之编码序列的人肝cDNA文库（Sharpe等，Nucl.Acids Res.，12：3917-3932）中得到编码apoAⅠ的全长cDNA克隆（pAⅠ/A）。我们重新构建了基因的51末端在于除去成熟apoAⅠ第一个密码子上游的所有序列。为此目的，用EcoRI和BamHI酶切质粒PAⅠ/A，分离含有cDNA插入片段的890bp片段并由1%琼脂糖凝胶中回收之。于部分消化条件下，用San3AⅠ酶限制性切断该片段，并将混合物与磷酸化的合成连接物连接以制得适于在大肠杆菌中表达之密码子的最佳化序列，所设计的连接物旨在重新构建编码成熟蛋白前9个氨基酸的序列。连接物制备方法如下：用磷酸三酯法（Crea和Horn，Nucl.Acids Res.，8：2231-2348，1980）合成四个寡聚核苷酸：
1.51-GATCCATGGACGAGCC-31
2.51-ACCGCAGAGTCCATGG-31
3.51-CGGTGGCTCGTCCATG-31
4.51-GATCCCATGGACTCTG-31
将所有四种寡核苷酸以等摩尔量连接在一起，用Sau3AⅠ处理连接混合物，由聚丙烯酰胺凝胶上洗脱并纯化连接物。所得连接物的序列在图2中示出。
用BamHI消化含有纯化的接接物及部分Sau3AⅠ酶切之apoAⅠ片段的连接混合物。由聚丙烯酰胺凝胶中纯化得到一790bp片段，并连接到用小牛肠磷酸酶处理过的BamHⅠ酶切的pAT153-pvuⅡ8上。转化MC1061后，与作为探针的磷酸化寡核苷酸3杂交以筛选重组体。分离阳性菌落，并通过限制性酶切及依照Maxam和Gilbert方法（Methods    Enzymol.，65：499-560，1980）经部分化学降解来分析其序列以进一步定性。将在正确方向上位定连接物的质粒定名为PAⅠ/12。
如此重建的基因的51末端，其前面是以ATG起始密码子及BamHⅠ粘性端开始的。使用这一方案，即可将编码成熟apoAⅠ的序列移到在Shine-Dalgarno序列之后携带有BamHⅠ位点的任何表达载体上。
使用pFCE4+构建重组载体
纯化含有修变之apoAⅠ基因的BamHⅠ片段并再克隆到pFCE4+（Lorenzetti等，1985）的BamHⅠ位点上。用双脱氧链终止法作序列分析以证实所得构建物中的插入片段具有正确定向。该质粒被定名为pLS66。
使用这一方案，就已存在于载体中的ATG起始密码子来说，apoAⅠ是被插入到读码之外的。因此，下一步就是通过将apoAⅠ基因直接定位于该ATG密码子之后来重建读码框。
读码框内定位（in-frame    positioning）
可利用pFCE4系统，使用寡核苷酸“桥”完成已克隆基因的读码框内定位，这些寡核苷酸“桥”具有互补于碱基伸长部分的序列，而该伸长部分在一侧接有将被缺失（删除）的区域（Sollazzo等，Gene，37：199-206，1985）。
为此，可使用磷酸三酯法合成具有下列序列的单股寡核苷酸：
51-CTTACATATGGACGAGCC-31
应使该寡核苷酸以其51端退火接到载体的ATG前面或包括ATG的区域（核苷酸1至10）内，并使其31端退火接到apoAⅠ基因的前8个核苷酸上，从而将存在于pLS66中的8个多余的核苷酸圈出（见图2）。按已述方法（Kunkel，Proc.Natl.Acad。Sci.USA，82：488-492，1985），使用大肠杆菌RL841作宿主制备pLS66的ssDNA。该细菌菌株是含有质粒pCⅠ857（M.Zabeau）之大肠杆菌RZ1032的衍生物，其可产生存在于pFCE4中之PL启动子的温度敏感性阻遏物。
使用这种方法，由该菌株所产生的ssDNA含有几个尿嘧啶残基以代替胸腺嘧啶，故可“在体外”起到正常功能模板作用，但在转移到野生型（Ung+）大肠杆菌71/18cⅠ857菌株（其为这些质粒的正常宿主）内之后则是无生物学活性的。
使0.1pMpLS66ssDNA与2pM激酶诱变的寡核苷酸（20倍过量的）在15mM Tris-Cl（PH8.5）和15mMMgCl2中于56℃退火30分钟。冷却至室温后加入延伸-连接混合物并于15℃反应过夜。延伸反应混合物（终浓度）：10mM Tris-Cl（PH8.5）;10mM MgCl2;0.5mM ATP;0.05mM dNTPs;5mM DTT;1单位DNA聚合酶（Klenow片段）和1.5单位T4DNA连接酶。
保温后用酚提取反应混合物，并用异丙醇和乙醇沉淀;转化71/18cⅠ1857反应潜能细胞并铺敷在选择培养基（LA）上。为了鉴定含有预期之缺失的克隆，选出150个菌落，使之生长在有序平板上并转移到硝酸纤维素滤膜上。于室温下，在6×SSC和10×Denhardt氏液中使用诱变的寡核苷酸作探针完成杂交。然后在6×SSC和0.1%SDS中于两不同温度下洗滤膜：首先于室温下洗，然后于50℃即理论上的熔点以下4℃洗，以检查杂交效率。对此可按下列公式计算：Tm＝4×GC+2×AT，其中GC和AT是寡核苷酸与诱变的模板所形成的配对数目（Norrander等，Gene，26：101-106，1983）。每次洗涤之后均使滤膜与X射线敏感的胶片接触曝光。经双脱氧链终止序列分析法进一步确定在严格温度下也产生阳性信号的待选突变菌落（图3B）。该方法的效率相当高，约为50%。将其中apoAⅠ基因已正确定位于读码框中的pFCE4+定名为pML11-20。
apoAⅠ变异型T6和MⅠ的构建
将pLS66和pML11-20用作构建两变异型apoAⅠ-T6和apoAⅠ-MⅠ的模板。我们决定使用这两个模板同时获得正确定位于读码框和一可易位BamHⅠ片段中的变异基因。
为此目的，用常规方法合成了两个单一寡核苷酸：
1.用于T6突变的51-CACCGCAGACTCCATGG-31;
2.用于MⅠ突变的51-GCGCCAGTGCTTGGC-31;
以数字1指示成熟apoAⅠ之第一个密码子的第一个核苷酸，寡核苷酸1应自残基8至24退火，在位置17上有一误配（G→C）。寡核苷酸2应自残基510至524退火，在位置517上有一误配（C→T）。
使用前述读码框定位中所用的同样方法完成诱变实验（图4A和B）。为得到双突变型，我们首先获得了T6突变，然后加进MⅠ突变。
所得质粒分别定名为：
pIL5-6＝两个BamHⅠ位点之间的apoAⅠ-T6;
pIL5-Ⅰ＝两个BamHⅠ位点之间的apoAⅠ-MⅠ;
pIL5-6Ⅰ＝两个BamHⅠ位点之间的apoAⅠ-T6/MⅠ;
pIL8-6＝读码框中的apoAⅠ-T6;
pIL8-Ⅰ＝读码框中的apoAⅠ-MⅠ;
pIL8-6Ⅰ＝读码框中的apoAⅠ-T6/MⅠ。
变异型apoAⅠ-RP5和IP1的构建
经用BamHⅠ消化，由质粒pLS66、pILS-6、pIL5-Ⅰ和pIL5-6Ⅰ上切下含有apoAⅠ基因及其变异型T6及MⅠ的DNA片段并按前述方法在1%琼脂糖凝胶上电泳纯化。然后将片段连接到已用BamHⅠ酶切成线形的pUC8和pUC9（Vieira和Messing，Gene，19：259-268，1982）上。转化JM101反应潜能细胞后，用迅速分裂方法鉴定重组质粒并经用BamHⅠ切断分离物来进一步确证。经用HindⅢ及XhoⅠ切断来区别插入片段的两个相反定向。
用pUC8构建便可以使apoAⅠ基因处在了读码框内，从而序列前面直接连有蛋氨酸残基及来自细菌β半乳糖苷酶基因之α肽的前9个氨基酸。这便导致apoAⅠ分子的N末端上有-β半乳糖苷酶的10氨基酸延伸部分。
对所有含有正确定向之apoAⅠ基因的重组体pUC9衍生物，均须进一步操作以使apoAⅠ基因处于读码框内。首先在ATG翻译起始密码子与apoAⅠ基因之间用限制性内切酶HindⅢ及SalⅠ切断。用DNA聚合酶（Klenrw片段）填入经切断后所形成的粘性末端，然后用T4DNA连接酶连接。这样便导致pUC9的多个克隆位点处（apoAⅠ基因的前面）有10个核苷酸的缺失，从而再建正确的读码。
这些重组质粒被定名为：
a）pUC8系列
pIPⅠ＝有apoAⅠ-IPⅠ
pIPⅠ-6＝有apoAⅠ-IPⅠ/T6
pIPⅠ-Ⅰ＝有apoAⅠ-IPⅠ/MⅠ
pIPⅠ-6Ⅰ＝有apoAⅠ-IPⅠ/T6/MⅠ
b）pUC9系列
pRP5＝有apoAⅠ-RP5
pRP5-6＝有apoAⅠ-RP5/T6
pRP5-Ⅰ＝有apoAⅠ-RP5/MⅠ
pRP5-6Ⅰ＝有apoAⅠ-RP5/T6/MⅠ
可获得扩展了的变异型的理由在于，由于存在细菌β半乳糖苷酶的N末端-天然出现于质粒中调节结构部分之后的序列，从而提高了表达水平。
在大肠杆菌中的表达
1）将所有重组体pFCE4衍生物转化到携带质粒pCⅠ856的细菌宿主CAG629中（已在“读码框定位”一节中述及）。
用LA将32℃生长过夜的培养物稀释到1∶10，并在振荡培养瓶内生长直到OD650为0.5-0.6，然后将温度改变为42℃，继续培养1～2小时。保温后在冰上将细胞冷却10分钟并经离心得到细胞沉淀饼。按“ELISA”一节中所述方法处理细胞沉淀饼以破碎细胞。以16，000rpm将细胞提取物于4℃离心30分钟并将上清加到“材料与方法”中所述的亲合柱上。充分洗涤后用1M乙酸洗脱滞留的蛋白质，用免疫印迹分析法（图5）和“ELISA”法检测洗脱部分，初步结果表明使用pML11-20时，平均每升培养物约得到0.2mg    apoAⅠ。
用携带突变apoAⅠ-T6、apoAⅠ-MⅠ和apoAⅠ-T6/MⅠ的所有其他构建物则得到相似的结果。
2）在细菌宿主MC1061中转化所有重组的pUC8/9衍生物。
以1∶100的比例用LA稀释于37℃生长过夜的培养物，并在加入1mM    IPTG之前使之在振荡培养瓶中生长1小时，然后继续保温4-6小时。保温时间过后将细胞在冰上冷却10分钟并离心得到细胞沉淀饼。从这一步骤以后，各步提取均与所述对PFCE4衍生物的提取方法相同。用免疫印迹分析法（图6）和“ELISA”法检测含有pIPⅠ和pRP5的细胞粗提物;初步结果为每升培养物得到平均约10mgapoAⅠ。
用携带与apoAⅠ-RP5及apoAⅠ-IP1结合的apoAⅠ-T6、apoAⅠ-MⅠ和apoAⅠ-T6/MⅠ等突变的所有其他构建物亦获得了相似的结果。
实施例2
使用载体pRIT2T（Pharmacia，Sweden）-其中一携带apoAⅠ基因的949bp片段被插入到该载体的SmaⅠ位点-构建其他变异型。由该质粒表达的蛋白质包含541个氨基酸。由N末端起，有λ噬菌体之CRO蛋白的前11个氨基酸，之后是葡萄球菌蛋白A序列的248个氨基酸（由残基23至270），由于与大肠杆菌β半乳糖苷酶的后17个氨基酸邻接而出现的5个异常氨基酸（Pro-Gly-Asp-Ser-Thr）以及含有蛋白水解酶肠激酶之识别序列的17个氨基酸（Gly-Asp-Pro-Glu-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Ser-Arg-Gly-Ser-Met），其直接连在成熟人apoAⅠ（定名为CPA-AⅠ）或其变异型apoAⅠ-T6、apoAⅠ-MⅠ、apoAⅠ-T6/MⅠ之序列的前面。这些嵌合蛋白很稳定并可溶于含水溶液中。
已研究了CPA-AⅠ与培养的大鼠肝细胞及小鼠巨噬细胞的相互作用。125Ⅰ标记的CPA-AⅠ与培养的细胞于4℃保温，结果表明杂交蛋白结合于细胞表面具有相似于HDL的结合参数。杂交蛋白于37℃被细胞摄入并显示出是被内在化了的。当与脂质结合形成HDL颗粒时，这一行为相似于天然apoAⅠ的行动。
材料与方法
材料
通过不连续KBr梯度由人血浆中制备HDL（1.09＜d＜1.21g/ml）。将HDL对PBS、1mMEDTA广泛透析，以除去KBr并储存于4℃。按照Klausner等人的方法（J.Biol.Chem.258，4715-4724，1983）用铁饱和人转铁蛋白（Sigma，A7638）。Pharmacia公司生产的金黄色葡萄球菌蛋白A。Gibco公司生产的含酚红的Hanks氏平衡盐溶液。
细胞及细胞培养物
由Deschatrette和Weiss建立并定性的一种大鼠肝癌细胞系，即Fao细胞（Biochemie56，1603-1611，1974），以单层培养在Conn氏改良的、添加有5%胎牛血清（FCS）、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM谷氨酰胺和10mM    HEPES缓冲液（PH7.4）的Ham氏F12培养基（Seromed）中。J774细胞-一种小鼠巨噬细胞系（Ralph等，J.Immunology114，898-905，1975）以旋转悬浮培养方式及下述浓度被保存在含有4.5%FCS、青霉素、链霉素、谷氨酰胺和HEPES缓冲液（PH7.4）的D-MEM培养基中。
细菌菌株和质粒
所用细菌宿主为大肠杆菌菌株HB101（Boyer和Roulland-Dussoix，J.Mol.Biol.41：459-472，1969）和RR1M15（Langley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，72，1254-1257，1975）。所用质粒是pNF2690（Nilsson等，Atti    Convegno    congiunto    A.G.I.-S.I.B.B.M.，195-196，1985）和购自Pharmacia公司（Sweden）的pRIT2T。
DNA构建
限制性内切酶、Klenow DNA聚合酶及T4DNA连接酶购自Boehringer Mannheim公司并按制造商提供的说明书使用。大肠杆菌的转化是按Morrison的方法（Mettods Enzymol.68：326-331，1979）完成的。
杂交基因的表达
杂交基因在λ噬菌体PR启动子控制下，基本上是依照Zabeau和Stanley（EMBO J.1，1217-1224，1982）所述方法表达的。使细菌于30℃生长到OD600＝0.9。加入于54℃预加热的等体积培养液使培养物温度迅速上升至42℃。收获细胞前于42℃将培养物保温90分钟。按Zabeau和Stanley所述方法（1982）将整个细胞溶胞产物加于凝胶上。
杂交蛋白的纯化
依照Marston等人（Biotechnology2，800-804，1984）的方法纯化杂交蛋白。将细菌沉淀饼重新悬浮于3倍体积（W/V）缓冲液A（50mM    Tris/Hcl（PH8.0）、50mM    NaCl、1mM    EDTA）中并于冰上超声处理5×20秒钟。离心（在Sorvall    SS34转子，4℃，10，000rpm、10分钟）后，将细胞沉淀物重新悬浮于9倍体积（W/V）含0.5%Triton    X-100、10mM    EDTA的缓冲液A中并于室温下放置5分钟。按上述方法离心悬液并将沉淀饼重新悬浮于9倍体积（W/V）含8M尿素的缓冲液A中，然后于室温下保温1小时。
将尿素悬液加于9倍体积（V/V）含50mM磷酸钾缓冲液（PH10.7）、50mM NaCl、1mM EDTA的溶液内并于室温下搅拌30分钟，同时加入KOH以使PH保持在10.7。然后中和悬液并于4℃对缓冲液A透析。按上述方法离心经过透析的悬液;此时在清澈的上清中的杂交蛋白已相当纯，这一步骤中所得杂交蛋白的平均产率为每升细菌培养物50-60mg。进一步的纯化是在IgG-Sepharose 6FF柱（Pharmacia）上经亲合层析达到的。样品上柱后用含有0.05%Tween20的PBS、PBS和5mM AcoNH4（PH5）洗，并用1M AcOH/AcONH4（PH2.8）洗脱。然后将纯化的蛋白质对缓冲液A透析。
使用Biogel    1.5A凝胶过滤柱进行校准
在50mM Tris/HCl（PH8.0）、50mM NaCl、1mM EDTA中平衡由BioRad公司生产的Biogel1.5A柱（40cm×1cm）。以3ml/小时的流速洗脱样品并收集之（每管250μl）。用葡聚糖兰（dextran blue，2，000KD）、甲状腺球蛋白（699KD）、转铁蛋白（440KD）、HDL（285KD）和醛缩酶（158KD）校准层析柱。使用1.25μg〔125Ⅰ〕-CPA-AⅠ或800μg未标记的CPA-AⅠ测定杂交蛋白的Mr。
蛋白质的碘化处理
使用Iodo-Gen试剂（Pierce Chemical公司）碘化蛋白质。碘化反应混合物含有100μg Iodo-Gen、1mg蛋白（在200μl PBS中）和lmCi无载体Na〔125Ⅰ〕（16.5mCi/μg）（AmershamInternational公司）。于4℃作用10分钟后，在10ml Sephadex G50柱上从蛋白中分离出游离碘。用PBS（0.2%BSA）由柱上洗脱HDL、转铁蛋白和IgG，并用50mM Tris/HCl（PH8.0）、0.15M NaCl、1mM EDTA、0.2%BSA洗脱杂交蛋白。杂交蛋白、IgG和转铁蛋白未经透析即可使用。必须使HDL对PBS、0.5mM EDTA充分透析，直到少于5%的标记物可溶于10%（W/V）三氯乙酸中。用氯仿/甲醇进行脂类提取后，测知有不到5%的标记物与脂类相联结。所得比活性为200-400cpm/ng蛋白质。
结合试验
对悬浮细胞的结合试验于4℃进行两小时。为得到Fao细胞的悬液，于37℃将单层细胞在PBS、1mM EDTA中保温30分钟。然后通过将悬液以1000g×5分钟（4℃）离心沉淀细胞并重新悬浮于3ml Hanks氏液/BSA中的方法，将这些细胞或生长有J774巨噬细胞的悬液洗三次。每份结合试验混合物含有1×106细胞（在1ml Hanks/BSA中）及所指出量的〔125Ⅰ〕-apoAⅠ-Ⅰ-PA或〔125Ⅰ〕-HDL。于4℃作用2小时后，用Hanks氏液/BSA将细胞洗四次，移入Eppendorf管内并用r计数仪计数放射活性。为进行比较实验，将10μg碘化的配体各用10-800μg未标记的HDL、CPA-AⅠ、蛋白A或转铁蛋白与之竟争，其中每种竟争物均在加入碘化配体之前30分钟于4℃加到细胞内。
HDL和CPA-AⅠ的配体吸印（Ligand    blot）
用PBS洗J774细胞（2×108个）两次并在10mM Tris/HCl（pH7.4）、0.1mM EDTA中制成匀浆。以2000g离心10分钟以制备去核后上清（PNS）。用1%（V/V）Triton X-114（Bordier，J.Biol.Chem.256，1604-1607，1981）提取PNS。将去污剂相与等体积含二硫苏糖醇的样品缓冲液混合，加热至沸，然后用碘乙酰胺使之烷基化。以每泳道约1mg蛋白将其加到5-15%SDS聚丙烯酰胺凝胶上。将凑胶吸印到硝酸纤维素薄膜上并经Ponceau S染色以显现电泳带。将硝酸纤维素条在含有10%（W/V）低脂乳粉的Hanks氏液中浸渍6小时。使配体〔125Ⅰ〕-CPA-AⅠ或〔125Ⅰ〕-HDL以12.5μg/ml在Hanks氏液/乳液中结合16小时。用Hanks氏液/乳液将硝酸纤维素条洗4次并用抗人HDL、抗CPA-AⅠ或抗蛋白A（1/50血清稀释）兔抗血清检测配体，洗涤，并于抗兔IgG过氧化物酶存在下保温，结果表明具有二氨基联苯胺反应（Burnette，Anal。Biochem.112，195-203，1981）。然后使干燥后的印迹对X射线胶片曝光。
分析方法
按Frank和Trosin所述的（H.Tschesce（editor）：Modern    Methods    in    Protein    Chemistry，Walter    de    Gruyter    &    Co.，Berlin，287-302，1985）用依据Lottspeich（Hoppe    Seylers    Z.Physiol.Cem.361，1829-1834，1980）设计的气一液相微量序列分析仪，经自动Edman降解法测定氨基末端序列。依据Tadros等人（Eur.J.Biochem.138，209-212，1983）的方法，使用羧肽酶ε，A和/或B测定杂交蛋白的羧基末端序列。为进行氨基酸分析，按Tadros等人（Eur.J.Biochem.127，315-318，1982）的方法水解蛋白质，并使用自动氨基酸分析仪（Durrum    D-500）测定氨基酸组成。未检测色氨酸和半胱氨基。
为进行显微镜观察，用2%磷钨酸对HDL和CPA-AⅠ的样品作负性染色。依照Bradford的方法（Anal.Biochem。72，248-254，1976）测定蛋白质浓度。
结果
携带编码杂交蛋白CPA-AⅠ之基因的质粒pLM8的构建
载体pRIT2T是pRIT2的衍生物（Nilsson等，1985），它是为了在大肠杆菌内完成细胞内杂交蛋白的温度诱导的表达而设计的。该构建物含有处于λPR启动子控制下的葡萄球菌蛋白A的IgG结合区域。多克隆位点有利于外来基因在蛋白A的31端插入。蛋白A转录终止序列被直接插入到多克隆位点的下游。质粒pLM3含有在读码框中与人apoAⅠ的成熟基因融合的大肠杆菌lacZ基因（Monaco等，1985）。
按图7中所述的路线构建携带有PA与apoAⅠ之间融合的质粒pLM8。由pLM3分离侧接有限制性位点EcoRⅠ及ClaⅠ的949bp片段并用Klenow DNA聚合酶填充两突出端。将该片段连接到用SmaⅠ切成线形的pRIT2T上。所得质粒PLM8携带一编码含541个氨基酸之融合蛋白的开放读码，其由51端上蛋白A的基因及31端上成熟的人apoAⅠ基因所组成，由其编码的融合蛋白可根据对蛋白水解作用特异的序列分离开。
杂交蛋白的表达、分离和纯化
在pNF2690-一个编码温度敏感性Cl857λ阻遏物突变型的相容性质粒的存在下，携带pLM8的大肠杆菌细胞能够大量地表达杂交蛋白。当生长于42℃时，被诱导的CPA-AⅠ的量约为总量的20%。杂交蛋白的表现Mr，如所预计的，经SDS-PAGE法测定为62KD。所提供的标准提取方法（超声处理、冻融、溶菌酶-Triton    X-100处理）都是不成功的。已采纳了一种变性方法，包括将经过超声处理的细菌加入8M尿素中保温，之后加一种碱性缓冲液保温。经中和并透析而复性后，离心悬液，得到含纯度大于90%之融合蛋白的清澈的上清液。进一步的纯化是通过在IgG    Sepharose柱上进行亲合层析而达到的。
杂交蛋白的定性
使用在羊体内产生的特异性apoAⅠ抗体，通过识别过程进一步鉴定杂交蛋白。蛋白A不能识别羊抗体。
前8个氨基酸的氨基末端序列和后3个氨基酸的羧基末端序列是与apoAⅠ和蛋白A的已知序列一致的。另外，氨基酸组成分析的结果也与预期的组成一致。
为确定杂交蛋白在细胞表面上结合的量（见下述），必须测定其固有的Mr。这可使用Biogel1.5A柱经凝胶过滤来完成。由柱洗脱物的峰值部分给出Mr为316KD，其相当于单体Mr（62KD）的5倍。杂交蛋白洗脱的宽分布图表明还存在有其他多聚体以及出现于外水体积中的小量集聚的物质。将316KD这一平均值作为所有实验的固有Mr。此与在同一柱上用作标准物的HDL的Mr（285KD）差不多。碘化的杂交蛋白的洗脱曲线相似于未标记的杂交蛋白的洗脱曲线。
在负性染色后，用电子显微镜检查HDL和杂交蛋白颗粒。显微照相显示出直径范围为9-12nm的均质颗粒群。杂交蛋白颗粒稍大于HDL，此进一步确实了凝胶过滤分析的结果。
杂交蛋白和HDL之生物学活性的比较
将由大肠杆菌中提纯的杂交蛋白和由人血浆中提纯的HDL平行地用于研究它们与细胞表面受体相结合的能力。研究了几个细胞类型：小鼠巨噬细胞（J774）和大鼠肝细胞（Fao）细胞系。有证据表明，这两个细胞类型具有不同的HDL。胆固醇交换发生在巨噬细胞中，而降解作用发生在肝细胞中。
4℃时结合的数据
碘化的配体于4℃时可在细胞上结合2小时。30分钟时结合的量即已达到了平台。用500μg未标记的配体进行竟争，以估计非特异结合的量，然后从总结合曲线减去这个值，即得到特异性结合的值。按Scatchard分析法（Scatchard，Ann.N.Y.Acad.Sci.51，660-672，1949），使用特异性结合值来计算亲合力。对HDL和杂交蛋白两者来说，结合是特异的并且是高亲合力的。就与J774或Fao细胞的高亲合力结合来说，HDL的Kd为2.8-3.0×10-8M，而杂交蛋白的Kd为3.5-4.9×10-9M。下列表2中显示了这些结果。另外，还有一种没有完全被带HDL及杂交蛋白的未标记配体竟争的低亲合力组分。
两种细胞类型中高亲合力结合组分给出99-155ng/1×106细胞的最大结合：此代表了每个细胞1.9-3.6×105个结合位点。每个细胞结合位点的数目及结合亲合力对HDL和杂交蛋白两者来说是十分相似的。这提示有一单一受体被卷入其中，而且单单apoAⅠ组分即能解释对HDL的受体介导的结合。
竟争研究
有关apoAⅠ的特异结合的其他证据得自于竟争研究。HDL和杂交蛋白两者彼此有效地竟争结合于J774和Fao细胞。在达到非特异性组成之前，竟争一直是有效的。蛋白A不能竟争对杂交蛋白或HDL的结合。作为一个独立的对照，竟争研究中使用了转铁蛋白。虽然转铁蛋白是通过转铁蛋白受体结合于细胞表面上的，但它不能竟争与HDL或杂交蛋白的结合。
蛋白A和IgG结合活性
因为杂交蛋白也含有蛋白A，所以检测蛋白A本身是否能与细胞结合是很重要的。将蛋白A碘化至相似的比活性并分析其与J774及Fao细胞的结合。既使蛋白A的浓度很高时（100μg/ml），也没有检测出特异性结合。与细胞相关的放射活性的量小于杂交蛋白的非特异性结合的量。
因为J774细胞表达IgG的Fc受体，所以在进行这些使用杂交蛋白的实验时，必须特别小心。从而，〔125Ⅰ〕-兔IgG以高亲合力（Kd＝1×10-8M）结合于细胞表面Fc受体上。当存在兔IgG时结合〔125Ⅰ〕CPA-AⅠ，所结合的杂交蛋白的量增加2.7倍。反之，当存在杂交蛋白时结合〔125Ⅰ〕-兔IgG，则结合量亦增加（1.6倍）。由此可见，IgG和CPA-AⅠ之间的复合物能够与Fc受体或HDL受体结合。为了只研究HDL受体，所有结合实验都是在没有IgG的培养基内进行的。在添加了BSA的Hanks氏缓冲液（特别是没有IgG的）中将细胞洗3次，以除去存在于培养基中的IgG。
HDL受体的特性
在检测HDL、杂交蛋白和转铁蛋白之前，于4℃用胰蛋白酶处理J774细胞。胰蛋白酶处理没有降低HDL或杂交蛋白结合量。但对〔125Ⅰ〕-转铁蛋白的结合降低到对照组的38%。与转铁蛋白受体比较，HDL受体有相对高的胰蛋白酶抗性。
为鉴定参予结合HDL和杂交蛋白的受体而进行了一次配体印迹试验。于还原条件下，对来由J774细胞的PNS的Triton    X-114提取物作SDS-聚丙烯凝胶电泳分离并转移到硝酸纤维素滤膜上。〔125Ⅰ〕-HDL和〔125Ⅰ〕-CPA-AⅠ各自结合于大约110KD的带上。这条带是通过观察滤膜的放射自显影图象上显现的〔125Ⅰ〕标记的配体而直接鉴定的，或者使用兔抗HDL抗血清进行抗体检测并用羊抗兔IgG过氧化物酶显现而间接鉴定的。对于HDL，因在硝酸纤维素上有碘化标记物的高本底，使得放射自显影图象上特异带的检测不够分明。
实施例3
人apoAⅠ是作为前体蛋白，即267个氨基酸的Prepro    apoAⅠ（前apoAⅠ原）合成的。在分泌期间18氨基酸长的前导肽被裂解，而留下代表了ProapoAⅠ（apoAⅠ原）的蛋白原。因此ProapoAⅠ包含了6个氨基酸的N末端延伸部分（Arg-His-Phe-Trp-Gln-Gln），之后是成熟蛋白质。
为了表达ProapoAⅠ，按照图8所示的程序以合成方法重新构建apoAⅠ基因的51端。合成了编码proapoAⅠ之前15个氨基酸（其包括6个氨基酸的前体肽）的NdeⅠ-BamHⅠ寡核苷酸。此合成的DNA包括一直接接在BamHⅠ位点前面的NcoⅠ位点。将携带来自质粒pDR720（Pharmacia，Sweden;Russel和Bennet，Gene20，231，1982）之trp启动子的EcoRⅠ-SalⅠ片段连接到编码λcⅡShine-Dalgarno序列的合成的SalⅠ-NdeⅠ片段上，以得到图中所示的EcoRⅠ-NdeⅠ107bp片段。将该DNA小片段连接到编码proapoAⅠ51序列的片段上并再克隆到被测定了序列的M13mp8（Messing等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，3642，1977）中。
为了表达重组的proapoAⅠ，按图9中所示的程序构建一表达载体。由重组的M13mp8上切下一包含表达信号（其后接有proapoAⅠ基因的51末端）的EcoRI-NcoⅠ片段（见图8），并连接到下列两个片段上：
a）用EcoRⅠ-BamHⅠ切断的质粒pDS20（Duester等，Cell.30，855，1982）的大片段;
b）得自pML11-20（其含有apoAⅠ序列的其余部分）的NcoⅠ-BamHⅠ片段。
所得质粒pFC33能够在大肠杆菌B菌株（Delbruck，1946，Bacterial    viruses    or    becteriophages，Biol.Rev.21：30-40）中于trp启动子控制下表达proapoAⅠ蛋白，或更具体地说是表达Met-proapoAⅠ。为了诱导，使细胞在含有氨苄青霉素的LB培养基中生长过夜。第二天用没有色氨酸的M9培养基稀释细胞并于37℃保温6小时，然后收获之。
图10显示了proapoAⅠ的凝胶电泳和免疫印迹分析结果。离心沉淀得到细菌培养物的等分部分并与标准的人类样品平行地重新悬浮于凝胶电泳缓冲液中。加热至沸后，将样品加在12.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。然后按实施例1中所述的方法在硝酸纤维素滤膜上进行吸印试验。
Figure 87107991_IMG1
表2：〔125Ⅰ〕-HDL和〔125Ⅰ〕-CPA-AI同Fao或J744
细胞的结合
Mr    结合
Fao    μg/ml    M    高亲合力位点数/细胞
HDL 285，000 8.6 3.0×10-8362，000
CPA-AI 316，000 11.0 3.5×10-8248，000
J774
HDL 285，000 8.0 2.8×10-8190，000
CPA-AI 316，000 15.5 4.9×10-8277，000
勘误表
Figure 87107991_IMG2
勘误表
Figure 87107991_IMG3

Claims (18)

1、能够在已转化的宿主内表达蛋白质的表达载体，所说的蛋白质能够使用抗人apoAI抗血清以ELISA法检测，并且具有下列式(1)的结构通式
Met-X-Y  (1)
其中X是键、包括得自β半乳糖苷酶N末端氨基酸残基之序列或包括蛋白A的一个或多个IgG结合区域之序列的载体肽序列、或人apoAI的前导序列；且y代表人apoAI或其遗传变异型的序列。
2、根据权利要求1的表达载体，其中所说的蛋白质是Met-apoAⅠ、Met-apoAⅠ-T6、Met-apoAⅠ-MⅠ或Met-apoAⅠ-T6/MⅠ。
3、根据权利要求2的表达载体，其得自于质粒pFCE4+。
4、根据权利要求3的表达载体，其为质粒pML11-20、pIL8-6、pIL8-Ⅰ或pIL8-6Ⅰ。
5、根据权利要求1的表达载体，其中载体肽序列包括一得自β半乳糖苷酶的多至前15个N末端氨基酸残基的序列。
6、根据权利要求5的表达载体，其中载体肽包括序列Thr-Met-Ile-Thr-Pro-Ser-Phe-Asp-Gly-Ser-Met或Thr-Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Met。
7、根据权利要求6的表达载体，其得自于质粒pUC8或pUC9。
8、根据权利要求7的表达载体，其为质粒pIPI、pIPI-6、pIPI-Ⅰ、pIPI-6Ⅰ、pRP5、pRP5-6、pRP5-Ⅰ或pRP5-6Ⅰ。
9、根据权利要求1的表达载体，其中载体肽包括葡萄球菌蛋白A或其残基23至270。
10、根据权利要求1的表达载体，其中载体肽序列包括蛋白A的一个或多个IgG结合区域，所说的结合区域是通过蛋白水解酶的识别序列与人apoAⅠ或其遗传变异型相融合的。
11、根据权利要求10的表达载体，其中载体肽是由（λ噬菌体之CRO蛋白的前11个氨基酸）-（葡萄球菌蛋白A的248个氨基酸（残基23至270））-（Pro-Gly-Asp-Ser-Thr）-（β半乳糖苷酶的后17个氨基酸）-（含有蛋白水解酶肠激酶之识别序列的17个氨基酸即Gly-Asp-Pro-Glu-Phe-Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ser-Ser-Arg-Gly-Ser-Met）所组成的。
12、根据权利要求1的表达载体，其中载体肽序列包括蛋白A的一个或多个IgG结合区域，而且它是自质粒pLM3衍生得到的。
13、根据权利要求12的表达载体，其为质粒pLM8。
14、根据权利要求1的表达载体，其中人apoAⅠ的前导序列是与人apoAⅠ或其遗传变异型的序列融合的，并且是由质粒pDS20衍生得到的。
15、根据权利要求14的表达载体，其为质粒pFC33。
16、已用上述权利要求之任一项中所限定的表达载体转化的宿主，并从而能够在其中表达如权利要求1中所限定的式（1）的蛋白质。
17、根据权利要求16的宿主，其中宿主是大肠杆菌的菌株。
18、生产能够使用抗人apoAⅠ抗血清以ELISA法检测的蛋白质的方法，该方法包括培养如权利要求16或17中限定的已经转化的宿主并回收如此得到的所说的蛋白质。
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