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CN220450209U - 用于支持高密度细胞培养物的生物反应器 - Google Patents

用于支持高密度细胞培养物的生物反应器 Download PDF

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CN220450209U CN202320778397.1U CN202320778397U CN220450209U CN 220450209 U CN220450209 U CN 220450209U CN 202320778397 U CN202320778397 U CN 202320778397U CN 220450209 U CN220450209 U CN 220450209U
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Abstract

本实用新型提供了一种用于支持高密度细胞培养物的生物反应器。所述系统包括：第一贮存容器以及用于连续循环含细胞培养基的一个或多个第一泵；第二循环回路，所述第二循环回路包括无细胞培养基调节回路和第二贮存容器以及用于循环培养基的一个或多个第二泵；和控制器，所述控制器用于引导第一数量的第一培养基通过所述第一循环回路的循环和第二数量的第二培养基通过所述第二循环回路的循环。

Description

用于支持高密度细胞培养物的生物反应器
相关申请的交叉引用
本申请要求于2022年4月7日提交的美国专利申请No.63/328,382的优先权，因此其内容通过引用全部并入本文。
技术领域
本实用新型涉及一种用于支持高密度细胞培养物的生物反应器。更具体地，该生物反应器被设计用于高密度哺乳动物细胞培养，特别是初级免疫细胞的扩增和贮存。
背景技术
在生物反应器中，存在培养物中向哺乳动物细胞传递的溶解氧不足的问题，这一限制阻碍了支持高密度细胞培养物的能力。此外，快速饱和氧气所需的高速与细胞不可兼容，因为细胞会被剪应力破坏。
发明内容
本实用新型描述了一种用于支持高密度细胞培养物的系统，该系统包括第一循环回路和第二循环回路，该第一循环回路包括含细胞的回路和第一贮存容器以及用于连续循环含细胞的培养基的一个或多个泵，该第二循环回路为无细胞培养基调节回路和第二贮存容器以及用于循环培养基的一个或多个泵；和用于引导第一数量的培养基通过第一循环回路的循环和第二数量的培养基通过第二循环回路的循环的控制器。
在另一个实施方案中，该系统包括在第一循环回路和第二循环回路之间的细胞分离设备。
在该系统的另一个实施方案中，细胞分离设备被配置为使用离心力来连续地将细胞与培养基分离。
在该系统的另一个实施方案中，第二贮存容器可操作地连接至细胞分离设备，并且其中细胞分离设备被配置为将浓缩的细胞返回至第一贮存容器以完成第一循环回路。
在该系统的另一个实施方案中，细胞分离设备被配置为将分离出的无细胞培养基递送至第二贮存设备以重新调节培养基，并且其中经重新调节的培养基然后返回至第一贮存设备以完成第二循环回路。
在另一个实施方案中，其中第二贮存容器包括循环回路，该循环回路被配置为通过中空纤维人工肺的管腔(lumen，或称为内腔)侧递送无细胞培养基，并且其中该人工肺回路被配置为对该第二贮存容器中的无细胞培养基进行充氧。
在该系统的另一个实施方案中，该第二贮存容器包括用于连续测量pH、氧、葡萄糖、乳酸、氨及其组合中的至少一种的一个或多个传感器。
在另一个实施方案中，其中第一循环回路包括用于测量第一贮存容器内的培养基的pH、培养基的溶解氧或其组合的一个或多个探针，和/或该第一贮存容器被配置为连续监测与第一贮存容器内的培养基的体积相关的容器的重量。
本实用新型还描述了一种用于支持密度>1×107细胞/毫升的细胞培养物的系统。所述系统包括：第一循环回路，所述第一循环回路包含具有细胞的培养基，并且所述第一循环回路包括第一贮存容器和用于连续循环所述具有细胞的培养基的一个或多个第一泵；第二循环回路，所述第二循环回路包括无细胞培养基调节回路，并包括第二贮存容器和用于循环培养基的一个或多个第二泵；控制器，所述控制器用于引导所述具有细胞的培养基通过所述第一循环回路的循环和所述无细胞培养基通过所述第二循环回路的循环；和细胞分离设备，所述细胞分离设备位于所述第一循环回路和所述第二循环回路之间，并且可操作地连接至所述第一贮存容器，用于将具有细胞的浓缩的培养基返回至所述第一贮存容器，并将所述无细胞培养基返回至所述第二贮存容器，在所述第二贮存容器中对所述无细胞培养基进行重新调节。
在另一个实施方案中，所述细胞分离设备被配置为使用离心力来连续地将细胞与培养基分离，同时反向淘析力将所述无细胞培养基抽出。
在另一个实施方案中，所述细胞分离设备可操作地连接至所述第一贮存容器，使得经重新调节的培养基返回至所述第一贮存容器。
在另一个实施方案中，所述第二循环回路还包括中空纤维人工肺，所述中空纤维人工肺包括在筒内的多个中空纤维和由筒壁和所述中空纤维限定的毛细管外空间，其中所述纤维包括由多孔壁限定的内腔，所述中空纤维能够在所述内腔内接纳所述无细胞培养基以接纳氧气。
在另一个实施方案中，所述系统还包括流体连接至所述第二贮存容器的透析设备，用于接收具有由所述细胞产生的废物的所述无细胞培养基，并从所述无细胞培养基中去除所述废物并返回去除了所述废物的所述无细胞培养基。
在另一个实施方案中，所述第二循环回路还包括第一传感器，所述第一传感器用于连续测量包含在所述第二贮存容器中的所述无细胞培养基中的pH、氧、葡萄糖、乳酸和/或氨。
在另一个实施方案中，来自所述第一传感器的数据用于控制所述第二贮存容器中的pH、氧含量和葡萄糖浓度。
在另一个实施方案中，所述系统还包括温度控制系统，所述温度控制系统将所述第一循环回路、所述第二循环回路和所述细胞分离设备保持在选定的温度设定点。
在另一个实施方案中，所述第一循环回路还包括一个或多个探针，所述一个或多个探针用于测量所述第一贮存容器内的所述具有细胞的培养基的pH、所述培养基的溶解氧或其组合。
在另一个实施方案中，所述系统还包括用于监测所述第一贮存容器的重量的重量监测设备。
附图说明
图1为根据本文中所描述的一个或多个实施方案的系统的实施方案的示意图。
在图1中，术语定义如下：FR＝流量计，CD＝红外细胞密度传感器，W＝重量，DO＝溶解氧。在图1的实施方案中，第一泵，泵1是灌注泵。泵速率将增加以将细胞培养回路53中的DO保持在设定点(泵1+4＝泵2)。泵2的速率＝泵3的速率+泵4的速率。
具体实施方式
该系统可以是具有主要部件的生物反应器，该主要部件包括两个贮存容器和两个分离的循环回路。这两个贮存容器包括无细胞贮存容器，用于调节培养基以调整代谢参数(例如，pH、葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和氨)和用于使用高速中空纤维充氧器进行氧饱和；和生物反应器容器，用于将哺乳动物细胞培养至高密度(即>107细胞/毫升)。无细胞容器具有循环回路，用于将氧饱和的和代谢调整的培养基连续地递送至生物反应器容器。生物反应器容器具有连续的细胞再循环回路，该连续的细胞再循环回路使用离心力将细胞与废弃培养基分离，将细胞返回至生物反应器，并且将来自生物反应器回路的废弃培养基返回至无细胞容器以重新调节。将来自无细胞回路的经重新调节的培养基返回至生物反应器容器，以替代从细胞再循环回路中去除的废弃培养基。
本文中所描述的生物反应器优于其他生物反应器，因为其解决了培养物中哺乳动物细胞的溶解氧转移速率不足的问题，该限制阻碍了支持高密度细胞培养物的能力。
在一些实施例中，生物反应器可以支持超过约1000万细胞/毫升的细胞密度。在一个实施例中，生物反应器可以支持约1亿/毫升的细胞密度。在一些实施方案中，这些细胞密度可以在高达8升的体积下被支持，在一个实施方案中，可以在10升或更高的体积下被支持。
本实用新型的一个方面涉及一种用于支持密度>1×107细胞/毫升的高密度细胞培养物的系统。该系统具有第一循环回路和第二循环回路，该第一循环回路为含细胞的回路，并且包括第一贮存容器和用于连续循环含细胞培养基的一个或多个泵，该第二循环回路为无细胞培养基调节回路，并且包括第二贮存容器和用于循环培养基的一个或多个泵。提供控制器，该控制器用于引导第一数量的培养基通过第一循环回路的循环和第二数量的培养基通过第二循环回路的循环。
在第一循环回路和第二循环回路之间的是细胞分离设备。该细胞分离设备优选地使用离心力来连续地将细胞与培养基分离。浓缩的细胞返回至第一贮存容器，同时反向淘析力抽出无细胞培养基并递送至第二贮存容器。
第一贮存容器可操作地连接至细胞分离设备。该细胞分离设备将浓缩的细胞返回至第一贮存容器以完成第一循环回路。
细胞分离设备将分离出的无细胞培养基递送至第二贮存容器，在该第二贮存容器中对培养基进行重新调节。然后，将经重新调节的培养基返回至第一贮存设备以完成第二循环回路。
第二贮存容器包括循环回路，该循环回路通过中空纤维人工肺的管腔侧递送无细胞培养基。通过使培养基从第二容器以高速度循环通过中空纤维人工肺，将包括氧气、空气、二氧化碳和氮气的受控气体混合物递送至中空纤维人工肺的管腔侧，溶解氧浓度可以在短时间段内达到饱和。以这种方式，人工肺回路提供了对第二贮存容器中的无细胞培养基的充氧和培养基pH的校正。此外，可控速率的泵用于将葡萄糖和/或谷氨酰胺和新鲜的培养基递送至第二贮存容器，同时对附加的泵进行编程，以便以保持第二容器中的恒定体积的方式从第二贮存容器中去除废弃培养基。可以添加附加回路以将无细胞培养基从第二容器循环至透析中空纤维设备的管腔侧，从而去除乳酸和氨废弃产物。将废弃培养基从透析设备的毛细管外侧去除。
第二贮存容器包含用于连续测量pH、氧、葡萄糖、乳酸和氨的传感器。来自这些传感器的信息用于编程连接至第二贮存容器的泵和气流，以保持编程的设定点。
第一循环回路包括用于测量第一贮存容器内的培养基的pH、培养基的溶解氧或其组合的一个或多个探针。此外，第一贮存容器悬挂在系统上以持续监测重量，该重量与容器内培养基的体积相关。
温度控制系统将第一贮存容器、第一循环回路、第二贮存容器、细胞分离设备和第二循环回路保持在受控的温度设定点，优选地37℃+/-3℃。
本实用新型的另一方面涉及一种用于支持高密度细胞培养物的方法，该方法包括：在第一贮存容器中浓缩哺乳动物细胞群，通过在第一循环回路中从经浓缩的哺乳动物细胞群中去除无细胞培养基来分离经浓缩的群；将大量的无细胞培养基递送至第二循环回路；在第二回路中的第二贮存容器中调节大量的无细胞培养基；在第二回路中从大量的无细胞培养基中去除废弃产物；和将经调节的大量的无细胞培养基返回至第一循环回路。
在该方法的另一个实施方案中，第二贮存容器中的调节包括通过人工肺中空纤维筒设备在高速的再循环回路中对无细胞培养基进行再充氧。
在该方法的另一个实施方案中，调节还包括调整一种或多种代谢参数，该一种或多种代谢参数包括pH、葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、氨或其组合。
在该方法的另一个实施方案中，将细胞在第一容器中从废培养基中分离是连续工艺，并且还包括在连续或半间歇工艺中的一种中使用离心力从细胞中去除无细胞培养基的部分。
在该方法的另一个实施方案中，将经调节的培养基从第二贮存容器返回至第一贮存容器，以替代在离心设备中从细胞中去除的废弃培养基的体积。
在该方法的另一个实施方案中，通过调整细胞在离心机中的保留时间、离心机的速度(rpm)、反向淘析泵的速率中的一种或多种和调整细胞的再循环速率以保持第一贮存容器中的培养基的预定水平，在第一循环回路和第二循环回路之间的离心机设备中分离细胞。
在该方法的另一个实施方案中，该方法包括从第二贮存容器中提取无细胞培养基的样品；分析葡萄糖、谷氨酰胺、氨、乳酸或渗透压中的一种或多种；和响应于分析，通过调整培养基、葡萄糖或谷氨酰胺递送泵或废物去除泵的一个或多个参数来调整葡萄糖、谷氨酰胺、氨、乳酸或渗透压中的一种或多种。
在还另一种方法中，本实用新型包括组合式间歇补料和灌注培养方法，该方法包括进行第一间歇补料工艺用于对第一浓度的细胞进行接种，允许细胞生长至第一体积，并通过添加经调节的培养基将细胞浓度调整回至第一浓度，并在集成容器中重复间歇补料工艺，直至达到第一选定体积；接合第一循环回路和第二循环回路以灌注集成容器中的细胞，并增加第一选定体积内的细胞密度；通过集成容器中的取样口从循环回路中取出的样品来监测细胞数量和细胞活性；和添加来自第二循环回路的经调节的培养基以保持恒定体积。
在组合式间歇补料和灌注培养方法的方法的另一个实施方案中，其中灌注包括：启动灌注循环，包括将细胞从集成容器移动至旋转容器，产生离心力并将无细胞培养基与细胞分离；将较重的细胞返回至集成容器；和将无细胞培养基递送至第二循环回路中的第二贮存容器以调节无细胞培养基。
在组合式间歇补料和灌注培养方法的方法的另一个实施方案中，使用中空纤维筒接合作为第二贮存容器的一部分的透析回路，以从无细胞培养基中去除乳酸和其他代谢废物。
在组合式间歇补料和灌注培养方法的方法的另一个实施方案中，该方法还包括连续监测无细胞培养基的氧水平，如果氧水平降至预选设定点以下，则增加经调节的培养基的递送速率，同时按比例地增加从第一循环回路中去除细胞和去除废物的速率。
在组合式间歇补料和灌注培养方法的方法的另一个实施方案中，还包括使用比例-积分-微分控制器(PID)控制回路调整第二容器中的pH，以降低人工肺中的CO2浓度，并用空气或N2气体替代CO2；和当CO2水平达到零时，将新鲜的无细胞培养基或缓冲液添加至第二贮存容器，以提高无细胞培养基的pH。
本实用新型的另一方面涉及一种用于支持高密度细胞培养物的方法。细胞在培养物中通常达到约1×106/ml的密度，在那里它们变得氧气受限而不能进一步扩增。此外，细胞只能在1×106/ml的密度下保持几天，因为随着时间的推移，它们会消耗所有可用的营养物并产生有毒的废弃产物。氧浓度是由于气体进入液体的氧转移速率而引起的，当细胞密度达到约1×106细胞/毫升时，细胞的吸氧速率超过氧气进入液相的氧转移速率。
活化T细胞的吸氧速率为约100毫摩尔/1010细胞/天或0.1摩尔/1010细胞/天。在4×10-5摩尔O2/毫升下，为10-5摩尔/106细胞/毫升/天。因此，在4天内消耗完所有的O2(假设在时间零点下全饱和的培养基)。如果细胞密度增加至1×107细胞/毫升，则为10-4摩尔/107细胞/毫升/天，在0.4天(9.6小时)内消耗完所有的O2。如果细胞密度增加至1×108细胞/毫升，则为10-3摩尔/108细胞/毫升/天，在0.04天(0.96小时)内消耗完所有的O2。为了在1×106/毫升下向4L细胞供应足够的氧气，需要4升/4天＝1升/天或42毫升/小时的灌注速率。在107/毫升下＝4升/0.4天、10升/天或420毫升/小时。在108/毫升下＝0.4升/0.04天、100升/天或4200毫升/小时或70毫升/分钟。
因此，在生物反应器中，容器中必须有均匀的氧气。为了在108/ml的密度下消耗的速率供应氧气，需要以每小时约100倍的速率交换反应器的全部体积。
为了克服这种限制，具有高速人工肺的第二容器保持氧饱和培养基源，以递送至含细胞的第一容器。快速饱和氧气所需的高速度与细胞不相容。高速循环中的任何细胞都会被剪应力破坏。这种具有细胞的第一容器和不具有细胞的第二容器的分离通过提供现成的氧饱和培养基源以递送至具有细胞的第一容器而解决了该问题。
该方法包括用诸如葡萄糖和谷氨酰胺的能量源重新调节第二容器中的培养基，并去除诸如乳酸和氨的废物，以解决随着时间的推移营养物的耗尽和废弃产物的积累的问题。该方法减少了在高密度培养物中支持细胞所需的总培养基量。
细胞分离设备将含细胞的培养基递送至离心力场中，该离心力场设计为允许高密度细胞连续地流过第一循环回路而无需造粒。在离心力的相反方向上的反淘析力(诸如由泵提供的反淘析力)，首先将无细胞培养基拉到出口。这个泵会产生比离心力稍大的力。出口处的检测器设备(诸如光子光散射检测器)将检测到流到出口的任何细胞。当检测到细胞时，反向淘析泵稍微减慢，允许细胞返回至第一循环回路。这种加速和减慢淘析泵的工艺将使第一循环回路中的细胞连续再循环，并去除无细胞培养基以用于第二循环回路。
第二容器中的调节包括通过人工肺中空纤维筒设备在高速再循环回路中对无细胞培养基进行再充氧。调节还包括调整选自包括pH、葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、氨及其组合的组的一种或多种代谢参数。
在第一容器中将哺乳动物细胞与废培养基分离是连续的工艺，并且该方法包括在连续或半间歇工艺中使用离心力从哺乳动物细胞中去除无细胞培养基的部分。
将经调节的培养基从第二贮存容器返回至第一贮存容器，以替代在离心设备中从细胞中去除的废弃培养基的体积。
该方法还包括通过调整细胞在离心机中的保留时间、离心机的rpm、反向淘析泵的速率中的一种或多种和调整细胞的再循环速率以保持第一贮存容器中的培养基的预定水平，在第一循环回路和第二循环回路之间的离心机设备中分离哺乳动物细胞。从分离设备去除的相同量的无细胞废弃培养基作为经重新调节的培养基返回至第一容器。
在一个或多个实施方案中，该方法包括从第二贮存容器中提取无细胞培养基的样品；分析葡萄糖、谷氨酰胺、氨、乳酸和渗透压中的一种或多种；和响应于分析，通过调整培养基、葡萄糖和谷氨酰胺递送泵和废物去除泵的一个或多个参数来调整葡萄糖、谷氨酰胺、氨、乳酸和渗透压中的一种或多种。
本实用新型的另一方面涉及一种组合式间歇补料和灌注培养方法。该方法包括进行第一间歇补料工艺以对浓度为5×105细胞/毫升的细胞进行接种，并允许细胞在例如1L的第一体积中生长至约1×106细胞/毫升。随后通过添加附加的1L经调节的培养基将细胞浓度调整回至5×105ml。该间歇补料工艺持续，直至达到所期望的体积。一旦第一容器中达到期望的体积，接合第一循环回路和第二循环回路以灌注第一容器中的细胞，并增加所达到的最终体积内的细胞密度。
使用在线细胞密度检测器r来监测第一容器中的细胞浓度和通过经第一容器中的取样口从循环回路中取出的样品来监测细胞活性；添加来自第二循环回路的经调节的培养基，以平衡在第二循环回路中去除的无细胞废培养基，从而保持恒定的体积。
灌注步骤包括启动灌注循环，包括将细胞从集成容器移动至旋转容器，该旋转容器产生离心力并将无细胞培养基与细胞分离；将较重的细胞返回至第一容器中；将无细胞培养基递送至第二循环回路中的第二贮存容器以调节无细胞培养基。
该方法还可以包括使用中空纤维筒接合作为第二容器的一部分的透析回路，以从无细胞培养基中去除乳酸和其他代谢废物。
连续监测无细胞培养基的饱和氧水平以进行调整，例如，如果氧水平降至预定的设定点以下，则增加经调节的培养基的递送速率，同时按比例地增加从第一循环回路中去除细胞和去除废物的速率以调整饱和氧水平。
第二容器中的pH可以使用比例-积分-微分控制器(PID)控制回路调整至设定点，这降低了人工肺回路中的CO2浓度，并用空气或N2气体替代。当CO2水平达到零时，将新鲜的无细胞培养基添加至第二贮存容器或缓冲液可以提高无细胞培养基的pH。
培养基调节回路(MCL)
培养基调节回路(MCL)20将废物返回子回路22连接至无细胞容器24和生物反应器容器26。无细胞容器24可以包括1-15升搅拌的生物反应器或柔性袋。无细胞容器24可以控制在大约37℃。MCL 20还包括对溶解的O2和pH的连续监测，以及其他探针，这些探针可以与无菌留置探针或外部设备一起来监测代谢变化。MCL 20可以包括用于无菌去除培养基28的取样口30，用于离线测量葡萄糖、乳酸、NH4和渗透压以及其他代谢参数。也可以存在用于压力均衡的无菌的0.2至0.45微米空气过滤器。MCL 20还可以包括连续可调速率的高速充氧回路30，其从无细胞容器24中去除培养基，并使培养基循环通过中空纤维充氧器34的管腔，并将经充氧的培养基返回至无细胞容器24。将气体递送通过充氧器筒34的毛细管外空间。将筒34加热以防止冷凝。质量流量控制器(MFC)36控制气体的递送。在优选的实施方案中，有4个MFC，各一个用于空气38、CO2 40、O2 42和N2 44。
对于无细胞容器24中的培养基的调节，可控速率的泵可以递送营养物并去除废弃产物。在优选的实施方案中，四个可控速率的泵用于废物收集46、葡萄糖递送48、谷氨酰胺递送50和培养基递送52。在一个实施方案中，可以使用通过透析筒58的附加高速回路，以便保留细胞因子、血清和生长因子，同时选择性地去除诸如乳酸和氨的代谢废物。
细胞培养回路(CCL)
细胞培养回路53包含连续离心机设备56，并将生物反应器容器26连接至其上。离心机设备56使细胞浓缩并去除无细胞培养基。在一个实施方案中，将无细胞培养基递送至培养基调节回路20，该培养基调节回路20使用人工肺34对培养基进行再充氧，并使用人工肾透析设备58去除废物。葡萄糖、谷氨酰胺、氨、乳酸和渗透压的外部取样和分析通过连接至培养基、葡萄糖和谷氨酰胺递送泵和废物去除泵的算法来控制。可以使用4气体质量转移系统来控制pH和氧水平。
将培养基从MCL 20递送至生物反应器26，该递送可以由可调速率泵60控制。用于pH62和溶解氧(DO)64的无菌留置探针在生物反应器26内部。将内容物控制在可调整的温度下。生物反应器26包括用于空气压力均衡或移动至离心机56的受控阀口、用于离线测量细胞计数和活性、表型分析的无菌取样口75和用于无菌添加微珠的口74。连续离心机设备56连续地将细胞与培养基分离，将细胞返回至生物反应器26，并将废弃培养基返回至无细胞容器。将培养基递送至细胞培养回路53至生物反应器，并从与离心力方向相反的口返回至培养基调节回路20。
生物反应器26可以是1升或更大的发酵罐或透气袋，并且在一个实施方案中，生物反应器可以是8升的球形生物反应器。将含细胞的培养基从生物反应器中连续地去除，并使其通过受控的离心力场56，该离心力场56被设计为保持细胞连续循环出生物反应器26并回至生物反应器26。调整离心力场56，以便将无细胞的培养基与含细胞的培养基分离。将无细胞培养基70返回至无细胞容器24以使用泵72进行重新调节，该泵72提供与离心机56的离心力矢量相反的力。
工艺控制回路的讨论
在一个实施方案中，使用组合式间歇补料和灌注培养方法。使用无菌注射口将大约5000万个细胞转移至生物反应器26容器。将来自集成容器或培养基调节回路(MCL)20的无细胞容器24的新鲜的经充氧的培养基转移至生物反应器26，以将细胞浓度调整至大约0.5×106细胞/毫升。体积可以由数字重量传感器监测。在一些实施方案中，单克隆抗体包覆的微珠或其他生长因子通过生物反应器中的无菌口74注射。
每天通过从无菌取样口75取出的样品来监测细胞数量和活性。允许细胞不受干扰地培育3天或直至细胞密度达到1×106细胞/毫升。
当细胞密度达到1×106细胞/毫升时，通过泵60将来自无细胞容器24的附加的经调节的培养基添加至生物反应器26，以将细胞密度稀释至0.5×106细胞/毫升。每天重复该补料间歇工艺，直至生物反应器中的总体积达到预定(选定)水平。在优选的实施方案中，该水平为8升。
在另一个实施方案中，每3天通过无菌口74添加CD3/CD28包覆的微珠，以保持1:1的珠:细胞比。
当体积达到预定(选定)量时，启动灌注循环。细胞通过泵从生物反应器26移动至产生离心力的旋转容器中。较重的细胞和珠将在力矢量的方向上积累，并返回至生物反应器容器。产生与离心力矢量相反的力的泵将去除无细胞培养基并将培养基返回至无细胞容器。相反矢量力的泵将振荡，以便在去除任何细胞之前去除最大量的培养基并释放。这可以通过关闭排气阀并接合泵以将新鲜的经调节的培养基从集成容器转移至袋中来实现。打开袋和离心机之间的阀门允许细胞/珠流入离心机。离心力将保留细胞和珠，培养基可以被去除并返回至集成容器中进行调节。
离心机中的保留时间和培养基去除速率可以通过切换阀门和调整回流泵上的流速来调整。细胞的再循环速率将增加，以将生物反应器中的氧设定点保持在100％饱和度附近。
随着生物反应器中细胞密度的增加，乳酸将积累，从而使pH降低。
为了将pH保持在设定点(通常在6.8至7.4之间)，递送至中空纤维充氧器的气体混合物用PID控制回路进行调整，使得随着pH下降，CO2的百分比降低。在工艺开始时，CO2通常设定为5％，并随着pH的下降而降低。
当pH控制器要求CO2水平低于0％时，接合废物泵以从无细胞容器中去除培养基，并泵入新鲜培养基以替代被去除的培养基。在一个实施方案中，使用6000道尔顿截止的中空纤维筒接合透析回路，以去除乳酸，而不是去除和替代完整的培养基。
经重新调节的培养基从无细胞容器递送至生物反应器的速率将随着生物反应器中饱和氧水平的变化而按对数地增加。使用生物反应器中的无菌探针连续监测饱和氧水平。当水平降至设定点(通常>95％)以下时，经充氧的培养基的递送速率会增加。同时，从生物反应器到离心力设备的细胞去除速率和废物去除速率按比例地增加。
集成室具有高速回路，该高速回路通过中空纤维充氧器的管腔侧泵送培养基。速度越高，单位时间内可以溶解的氧气越多。由于培养基调节回路(MCL)是无细胞的，因此不存在限制泵速度的剪切问题。增加搅拌速率还可以增加氧气转移的速率。此外，可以调整气体混合物以增加O2百分比。
随着细胞生长，细胞产生乳酸，该乳酸降低了培养基的pH。中空纤维充氧器的壳侧的初始气体混合物在空气中为5％的CO2。当pH下降至设定点(例如6.9)时，CO2的百分比降低并用氮气和氧气混合物替代，因此空气流速和O2百分比是恒定的。最终，CO2水平将达到0。在零CO2时，添加新的培养基以稀释乳酸并提高pH。葡萄糖和谷氨酰胺使用来自无菌口的样品离线测量。建立设定点，以便添加葡萄糖和谷氨酰胺，并通过可控泵去除废物，以保持设定点水平。如果离线渗透压达到设定点，则葡萄糖和谷氨酰胺添加泵被超驰，并添加新鲜培养基。
尽管已参考优选的实施方案对本实用新型进行了描述，但本领域技术人员将认识到，在不脱离本实用新型的精神和范围的情况下，可以对形式和细节进行改变。

Claims (18)

1.一种用于支持高密度细胞培养物的生物反应器，其特征在于，所述生物反应器包括：
第一循环回路，所述第一循环回路包括含细胞回路和第一贮存容器以及用于连续循环含细胞培养基的一个或多个第一泵；
第二循环回路，所述第二循环回路包括无细胞培养基调节回路和第二贮存容器以及用于循环培养基的一个或多个第二泵；和
控制器，所述控制器用于引导第一数量的第一培养基通过所述第一循环回路的循环和第二数量的第二培养基通过所述第二循环回路的循环。
2.根据权利要求1所述的生物反应器，其特征在于，所述生物反应器还包括在所述第一循环回路和所述第二循环回路之间的细胞分离设备。
3.根据权利要求2所述的生物反应器，其特征在于，所述细胞分离设备被配置为使用离心力来连续地将细胞与培养基分离。
4.根据权利要求2所述的生物反应器，其特征在于，所述第二贮存容器可操作地连接至所述细胞分离设备，并且其中所述细胞分离设备被配置为通过所述第一循环回路将浓缩的细胞返回至所述第一贮存容器。
5.根据权利要求2所述的生物反应器，其特征在于，所述细胞分离设备被配置为将分离出的无细胞培养基递送至所述第二贮存容器以重新调节所述培养基以产生经重新调节的培养基，并且其中所述经重新调节的培养基通过所述第二循环回路返回至所述第一贮存容器。
6.根据权利要求1所述的生物反应器，其特征在于，所述第二贮存容器包括人工肺循环回路，所述人工肺循环回路被配置为通过中空纤维人工肺的管腔侧递送无细胞培养基，并且其中所述人工肺循环回路被配置为对所述无细胞培养基进行充氧。
7.根据权利要求1所述的生物反应器，其特征在于，所述第二贮存容器包括用于连续测量pH、氧、葡萄糖、乳酸、氨或其组合中的至少一种的一个或多个传感器。
8.根据权利要求1所述的生物反应器，其特征在于，所述第一循环回路包括用于测量所述第一贮存容器内的培养基的pH、所述培养基的溶解氧或其组合的一个或多个探针，和/或其中所述第一贮存容器被配置为连续监测与所述第一贮存容器内的培养基的体积相关的所述第一贮存容器的重量。
9.一种用于支持密度>1×107细胞/毫升的细胞培养物的生物反应器，其特征在于，所述生物反应器包括：
第一循环回路，所述第一循环回路包含具有细胞的培养基，并且所述第一循环回路包括第一贮存容器和用于连续循环所述具有细胞的培养基的一个或多个第一泵；
第二循环回路，所述第二循环回路包括无细胞培养基调节回路，并包括第二贮存容器和用于循环培养基的一个或多个第二泵；
控制器，所述控制器用于引导所述具有细胞的培养基通过所述第一循环回路的循环和所述无细胞培养基通过所述第二循环回路的循环；和
细胞分离设备，所述细胞分离设备位于所述第一循环回路和所述第二循环回路之间，并且可操作地连接至所述第一贮存容器，用于将具有细胞的浓缩的培养基返回至所述第一贮存容器，并将所述无细胞培养基返回至所述第二贮存容器，在所述第二贮存容器中对所述无细胞培养基进行重新调节。
10.根据权利要求9所述的生物反应器，其特征在于，所述细胞分离设备被配置为使用离心力来连续地将细胞与培养基分离，同时反向淘析力将所述无细胞培养基抽出。
11.根据权利要求9或10所述的生物反应器，其特征在于，所述细胞分离设备可操作地连接至所述第一贮存容器，使得经重新调节的培养基返回至所述第一贮存容器。
12.根据权利要求9所述的生物反应器，其特征在于，所述第二循环回路还包括中空纤维人工肺，所述中空纤维人工肺包括在筒内的多个中空纤维和由筒壁和所述中空纤维限定的毛细管外空间，其中所述纤维包括由多孔壁限定的内腔，所述中空纤维能够在所述内腔内接纳所述无细胞培养基以接纳氧气。
13.根据权利要求9所述的生物反应器，其特征在于，所述生物反应器还包括流体连接至所述第二贮存容器的透析设备，用于接收具有由所述细胞产生的废物的所述无细胞培养基，并从所述无细胞培养基中去除所述废物并返回去除了所述废物的所述无细胞培养基。
14.根据权利要求9所述的生物反应器，其特征在于，所述第二循环回路还包括第一传感器，所述第一传感器用于连续测量包含在所述第二贮存容器中的所述无细胞培养基中的pH、氧、葡萄糖、乳酸和/或氨。
15.根据权利要求14所述的生物反应器，其特征在于，来自所述第一传感器的数据用于控制所述第二贮存容器中的pH、氧含量和葡萄糖浓度。
16.根据权利要求9所述的生物反应器，其特征在于，所述生物反应器还包括温度控制系统，所述温度控制系统将所述第一循环回路、所述第二循环回路和所述细胞分离设备保持在选定的温度设定点。
17.根据权利要求9所述的生物反应器，其特征在于，所述第一循环回路还包括一个或多个探针，所述一个或多个探针用于测量所述第一贮存容器内的所述具有细胞的培养基的pH、所述培养基的溶解氧或其组合。
18.根据权利要求9或10所述的生物反应器，其特征在于，所述生物反应器还包括用于监测所述第一贮存容器的重量的重量监测设备。
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