CN205910200U - 降钙素原定量检测的化学发光微流控盘片 - Google Patents
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Abstract
本实用新型公开了一种降钙素原定量检测的化学发光微流控盘片，包括微流控盘片，所述的微流控盘片上安装有微流检测单元，所述的微流检测单元包括全血注入槽、全血分离信道、血球储存槽、血浆传送流道、混合/侦测槽、降钙素原单克隆抗体包被的磁微粒溶液注入槽、清洗液注入槽、内含磁铁的外部磁铁区域、废液槽、碱性磷酸酶标记的降钙素原单克隆抗体溶液注入槽、发光底物液注入槽。本实用新型能实现全血分离、血浆定量、培育混合、清洗的功能，能快速实现样品中PCT浓度的定量检测，具有检测灵敏度高，结果准确可靠，重复性好的特点。
Description
技术领域
本实用新型涉及一种降钙素原定量检测的化学发光微流控盘片，属于医学免疫体外诊断领域，能够在很短时间内实现对生物样品中降钙素原的定量检测，具有操作简单，灵敏度高，低成本的特点。
背景技术
降钙素原 (PCT) 是一种含 116 个氨基酸的无激素活性糖蛋白， 分子量约为13kDa，在生理情况下由甲状腺-C细胞产生，在健康人群的血清中几乎不能被检出。在细菌、真菌、寄生虫等感染性疾病并有全身或/和中枢神经系统性炎症反应时，病菌的内毒素可促使甲状腺-C细胞、肝脏巨噬细胞和单核细胞、肺和肠道组织的淋巴细胞以及神经内分泌细胞等甲状腺以外的组织大量产生 PCT，而导致其血清中的含量升高或持续性升高。新生儿的PCT 水平于出生后1~2天内和少数大型外科手术患者术后1～4天内的 PCT 可有轻度短暂升高，但均呈逐日下降趋势且于三天后即可达到成人正常值。为此 PCT 检查可为上述病情提供确切的鉴别诊断。
PCT 水平反映了全身细菌性炎症反应的活跃程度，并提示与被感染器官的大小和类型、细菌的种类、以及炎症程度和免疫反应状况相关。PCT 水平的升高虽可出现在严重休克、全身性炎症反应综合征和多器官功能紊乱综合征患者，如无细菌感染或细菌感染性病灶存在，其水平通常低于那些有细菌感染性病灶的患者。PCT 检测的临床价值是多方面的。对细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒血症性感染的病因诊断、抗生素的临床应用、病情和预后的评估均具有明显的应用价值，对自身免疫、过敏、病毒感染和无菌性炎症等具有明确的鉴别诊断价值。
目前，检测降钙素原的方法主要有放射免疫分析法、化学发光免疫分析法、胶体金比色法。放射免疫分析法检测耗时长，而且有放射性元素的污染使用受到限制；胶体金比色法具有快速简便、容易观察等特点，是一种快速的半定量使用方法；化学发光免疫分析法操作简便，特异性强，灵敏度高，检测时间短，目前得到广泛的应用。
磁微粒免疫检测技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作载体，以物理吸附、化学偶联等方法包被上具有特异性亲和力的的抗体或抗原等各种免疫活性物质，具有分离速度快、效率高、可重复性好、操作简单、不影响被分离细胞或其他生物材料的生物学性状和功能等特点，在外加磁场作用下可定向运动，使某些特殊成分得以分离、浓集或纯化。
微流控芯片作为一种新型的分析检测平台，具有高通量、集成化、便携式、易操作、低成本等优点，已经在众多领域中得到了广泛的应用，尤其是在免疫分析领域已崭露头角。
免疫磁珠的生物微流控芯片是将磁颗粒技术，免疫分析集成到微流控芯片上的一种分析使用方法，目前这种综合性的使用方法的主要难点表现为：1) 液体在芯片内部微流动的智能控制，目前常采用的方法是在芯片内部设置多个微泵和微阀，使得微流控体系变得更加复杂化；2) 反应体系的混合不充分，导致反应不充分；3) 集成化程度不高，导致非特异性背景高。
实用新型内容
本实用新型目的在于提供了一种降钙素原定量检测的化学发光微流控盘片；本实用新型能实现全血分离 (样本前处理)、血浆定量、培育混合、清洗的功能，能快速实现样品中 PCT 浓度的定量检测，具有检测灵敏度高，结果准确可靠，重复性好的特点。
为了达到上述目的，本实用新型的技术方案是：
一种降钙素原定量检测的化学发光微流控盘片，包括微流控盘片，所述的微流控盘片上安装有微流检测单元，所述的微流检测单元包括全血注入槽，所述的全血注入槽通过全血分离信道与血球储存槽相连，所述血球储存槽与血浆传送流道连通；所述的血浆传送流道与混合/侦测槽顶部相连；所述的混合/侦测槽顶部通过管路与降钙素原单克隆抗体包被的磁微粒溶液注入槽连通；所述的混合/侦测槽顶部还通过管路与清洗液注入槽连通；所述的混合/侦测槽一侧安装有内含磁铁的外部磁铁区域；所述的混合/侦测槽底部通过管路与废液槽连通，且所述的混合/侦测槽底部与废液槽之间的管路上安装有阀门；所述的降钙素原单克隆抗体包被的磁微粒溶液注入槽顶部通过管路与碱性磷酸酶标记的降钙素原单克隆抗体溶液注入槽的底部连通；所述的清洗液注入槽顶部通过管路与发光底物液注入槽的底部连通。
所述的微流控盘片上安装6个以上且为6的倍数的微流检测单元。
所述的微流控盘片上优选安装12个微流检测单元。
本实用新型的有益效果是：本实用新型能实现全血分离 (样本前处理)、血浆定量、培育混合、清洗的功能，能快速实现样品中 PCT 浓度的定量检测，具有检测灵敏度高，结果准确可靠，重复性好的特点。
附图说明
图1是本实用新型一种降钙素原定量检测的化学发光微流控盘片的结构示意图；
图2是图1中微流控盘片上单个微流检测单元的放大示意图。
具体实施方式
实施例1：降钙素原的定量检测
本实施例的一种降钙素原定量检测的化学发光微流控盘片，如图1、2所示，包括微流控盘片13，所述的微流控盘片13上安装有12个微流检测单元，所述的每个微流检测单元包括全血注入槽1，所述的全血注入槽1通过全血分离信道2与血球储存槽3相连，所述血球储存槽3与血浆传送流道4连通；所述的血浆传送流道4与混合/侦测槽7顶部相连；所述的混合/侦测槽7顶部通过管路与降钙素原单克隆抗体包被的磁微粒溶液注入槽9连通；所述的混合/侦测槽7顶部还通过管路与清洗液注入槽10连通；所述的混合/侦测槽7一侧安装有内含磁铁的外部磁铁区域8；所述的混合/侦测槽7底部通过管路与废液槽6连通，且所述的混合/侦测槽7底部与废液槽6之间的管路上安装有阀门5；所述的降钙素原单克隆抗体包被的磁微粒溶液注入槽9顶部通过管路与碱性磷酸酶标记的降钙素原单克隆抗体溶液注入槽11的底部连通；所述的清洗液注入槽10顶部通过管路与发光底物液注入槽12的底部连通。
1. 降钙素原溶液配制
1）降钙素原系列校准品的制备：用胎牛血清将降钙素原纯品（海肽生物科技（上海）有限公司）稀释为系列校准品，其校准品浓度范围为 0～50 ng/mL。
2）降钙素原单克隆抗体包被的磁微粒溶液的制备：
将降钙素原单克隆抗体（海肽生物科技（上海）有限公司）置于透析袋中，在PBS缓冲液中过夜透析；用PBS缓冲液配制BNHS溶液，每mg抗体中加入15μL BNHS（生物素-N-羟基琥珀亚胺酯（上海励瑞生物科技有限公司）溶液，混合均匀，室温反应30min；将标记好的抗体置于透析袋中，在PBS缓冲液中过夜透析。将2.0 μm 的链霉亲和素磁微粒（广州达于成贸易有限公司）加磁场，静置5min，倒出上清液，用PBS缓冲液清洗3次，并用该缓冲液进行悬浮；倒出上清液；每mL磁微粒悬浮液中加入1mg标记好的抗体，混合均匀，室温反应20min；用含有5%的牛血清白蛋白的Tris-HCl缓冲液清洗3次；用含有0.5%牛血清白蛋白和0.02%Proclin300（防腐剂，上海励瑞生物科技有限公司）的PBS缓冲液重悬，得到降钙素原单克隆抗体包被的磁微粒溶液。
3）碱性磷酸酶标记的降钙素原单克隆抗体溶液的制备：用PB缓冲液配制Sulfo-SMCC溶液，每mg碱性磷酸酶中加入0.1mL Sulfo-SMCC（4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐，上海励瑞生物科技有限公司）溶液，混合均匀，室温反应30min，在PB缓冲液中透析；用PB缓冲液配制2-亚氨基硫羟烷盐酸盐溶液，每mg抗体中加入0.1mL 2-亚氨基硫羟烷盐酸盐溶液，混合均匀，室温反应30min，在p PB缓冲液中透析；将上述透析后的碱性磷酸酶和抗体混合均匀，室温反应120min；通过蛋白纯化系统（AKTApurifier100）收集蛋白，加入50%的甘油，得到碱性磷酸酶标记的降钙素原抗体溶液。
4）碱性磷酸酶催化的化学发光底物液的制备：向Tris-HCl缓冲液中加入2-氨基-2-甲基-1-丙醇、AMPPD（1，2-二氧环已烷衍生物，广州达于成贸易有限公司）和发光增强剂（AP底物增强剂，上海励瑞生物科技有限公司）。
5）清洗液的制备：向Tris-HCl缓冲液中加入0.02%的吐温20和15%的氯化钠。
2. 本实施例的一种降钙素原定量检测的化学发光微流控盘片的使用方法，包括如下步骤：
1）标准曲线的制作：取 30 μL PCT系列标准品 (浓度为0ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL) 加入本实施例中的微流控盘片的降钙素原单克隆抗体包被的磁微粒溶液注入槽9，将微流控盘片13置于配套检测仪器中。每个样本分别重复测定五次。配套仪器根据 RLU 和 PCT 浓度间的比例关系，自动拟合计算出 PCT 浓度，取五次测定平均值，绘制标准曲线。
2）将微流控盘片13放入配套仪器中，开启自动加样装置，可将全血 150 μL 、降钙素原单克隆抗体包被的磁微粒溶液 30 μL、碱性磷酸酶标记的降钙素原单克隆抗体溶液20 μL 注入至全血注入槽1、降钙素原单克隆抗体包被的磁微粒溶液注入槽9、碱性磷酸酶标记的降钙素原单克隆抗体溶液注入槽 11中。
3）以 4,500 RPM (加速度a=1,500 RPM/s) 操控盘片旋转 50 秒，能在全血分离信道2分离血浆及血球，并将降钙素原单克隆抗体包被的磁微粒溶液及碱性磷酸酶标记的降钙素原单克隆抗体溶液传送至混合/侦测槽7，降钙素原单克隆抗体包被的磁微粒溶液可藉外部磁铁区域8中的磁铁的吸引保留于混合/侦测槽7中(可避免被冲刷至废液槽)。
4）以 1,500 RPM (加速度a=500 RPM/s) 操控盘片旋转 20 秒，能将血浆经由血浆传送流道4传送至混合/侦测槽7，血球则被保留于血球储存槽3。
5）以 1,300 RPM (加速度a=2,500 RPM/s) 操控盘片旋转 40 秒，藉由外部磁铁区域8中的磁铁操控，可操纵降钙素原单克隆抗体包被的磁微粒于混合/侦测槽7内移动，进而达到良好的混合/培育效果。
6）将清洗液 60 μL注入至清洗液注入槽10内，以 3,600 RPM (加速度a=3,600RPM/s) 操控微流控盘片13旋转 22 秒，可将清洗液传送至混合/侦测槽7，清洗液可置换混合/侦测槽7内的液体，此液体会被传送至废液槽6，降钙素原单克隆抗体包被的磁微粒可藉由外部磁铁区域8中的磁铁的吸引保留于混合/侦测槽内7。
7）将发光底物液 40 μL注入至发光底物液注入槽12内，以 2,700 RPM (加速度a=1,150 RPM/s) 操控盘片旋转 16 秒，可将发光底物传送至混合/侦测槽7，发光底物可置换混合/侦测槽7内的液体，此液体会被传送至废液槽，降钙素原单克隆抗体包被的磁微粒可藉由外部磁铁区域8中的磁铁的吸引保留于混合/侦测槽7内。最终，已反应的液体会在混合/侦测槽7进行检测，根据相对发光强度 (RLU) 与降钙素原抗原浓度间的比例关系，检测系统可自动换算，可快速报告测试结果，从而实现降钙素原的定量检测。
8）结果表明：采用本实用新型所述方法检测灵敏度为0.05 ng/mL，检测范围为0.05～100ng/mL，批间变异系数小于10%，批内变异系数小于10%。
本实施例能实现全血分离 (样本前处理)、血浆定量、培育混合、清洗的功能，能快速实现样品中 PCT 浓度的定量检测，具有检测灵敏度高，结果准确可靠，重复性好的特点。
实施例2：磁微粒颗粒尺寸筛选
磁性微球的粒径小，比表面积大，表面含有活性基团，故偶联容量大，但磁性微球尺寸过小不利于磁铁收集，尺寸过大在盘片中不利于混合反应，故进行磁微粒尺寸筛选。
其他的实验条件参见实施例1，磁微粒颗粒的尺寸按照以下方案进行。
选择颗粒尺寸分别为 0.1 μm、0.5 μm、1.0 μm、1.5 μm、2.0 μm、3.0 μm、5.0 μm磁颗粒标记降钙素原单克隆抗体抗体。检测时采用磁性大小经过优选的永久磁铁，固定磁铁高度。
实验结果如下 ：
磁微粒粒径尺寸从 0.1 μm、0.5 μm、1.0 μm、1.5 μm、2.0 μm、3.0 μm 依次增强，3.0 μm 干扰加大，5.0 μm 开始减小，信号值最低，综合各因素 2.0 μm 信号最强，干扰最小。
结果分析 ：磁微粒尺寸较小时，比表面积较大，表面所负载的生物分子量大，同时能够很好地分散在溶液中，但要保证磁性微球充分被收集所需的磁场强度大。在本实施例中由于磁珠所受的磁场力不能保证其充分被收集，导致部分有效磁珠在清洗过程中流失，从而导致最终检测信号值不高。当磁颗粒粒径较大时，比表面积小，表面生物分子的标记率相对较低，相同条件下，磁性粒子所受磁场力大，分散的磁珠能够得到充分的收集，但其由于极易发生沉降，导致生物分子间反应不充分，从而减弱发光信号。综合考虑，粒径为 1.0μm 至 3.0 μm 磁性微球效果较好，因此本实用新型的实施例中 2.0 μm 的磁性微球效果最好。
Claims (3)
1.一种降钙素原定量检测的化学发光微流控盘片，其特征在于：包括微流控盘片（13），所述的微流控盘片（13）上安装有微流检测单元，所述的微流检测单元包括全血注入槽(1)，所述的全血注入槽(1)通过全血分离信道(2)与血球储存槽(3)相连，所述血球储存槽(3)与血浆传送流道(4)连通；所述的血浆传送流道(4)与混合/侦测槽(7)顶部相连；所述的混合/侦测槽(7)顶部通过管路与降钙素原单克隆抗体包被的磁微粒溶液注入槽(9)连通；所述的混合/侦测槽(7)顶部还通过管路与清洗液注入槽(10)连通；所述的混合/侦测槽 (7)一侧安装有内含磁铁的外部磁铁区域(8)；所述的混合/侦测槽(7)底部通过管路与废液槽(6)连通，且所述的混合/侦测槽(7)底部与废液槽(6)之间的管路上安装有阀门（5）；所述的降钙素原单克隆抗体包被的磁微粒溶液注入槽(9)顶部通过管路与碱性磷酸酶标记的降钙素原单克隆抗体溶液注入槽(11)的底部连通；所述的清洗液注入槽 (10)顶部通过管路与发光底物液注入槽(12)的底部连通。
2.如权利要求1所述的一种降钙素原定量检测的化学发光微流控盘片，其特征在于：所述的微流控盘片（13）上安装6个以上且为6的倍数的微流检测单元。
3.如权利要求2所述的一种降钙素原定量检测的化学发光微流控盘片，其特征在于：所述的微流控盘片（13）上安装12个微流检测单元。
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