CN1602359A

CN1602359A - 靶向性载体的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN1602359A
Application number: CNA028244990A
Authority: CN
Inventors: J·莫里森; G·张
Original assignee: COPYRAT Pty Ltd
Current assignee: COPYRAT Pty Ltd
Priority date: 2001-10-09
Filing date: 2002-10-08
Publication date: 2005-03-30
Also published as: EP1451330A1; IL161324A0; WO2003031629A1; JP2005504552A; US20050130147A1; CA2463453A1

Abstract

本发明涉及制备靶向性构建物的方法，该靶向性构建物用于制备基因打靶或同源重组的靶向性载体。本发明还涉及靶向性载体以及含该载体的经修饰的细胞、植物或动物(包括酵母)。本发明还提供用靶向性载体修饰的植物和动物。本文所用的基因打靶方法是基于转座子和重组介导的过程，该过程可以产生高通量的序列删除，适于半自动化地制备基因敲除载体。

Description

靶向性载体的制备方法及其应用

本发明涉及用于基因打靶或同源重组的靶向性载体中靶向性构建物的制备方法。本发明还涉及靶向性载体以及含该载体的经修饰的细胞、植物或动物(包括酵母)。本发明也涉及经靶向性载体改造的植物和动物。

发明背景

制备能表达目的基因和/或目的多肽的转化细胞和生物体通常通过将外源DNA整合到细胞和生物体内。但是，利用这种系统常常会有很多问题。其中一个主要的问题在于外源基因是随机整合到来源于多细胞生物体的细胞如哺乳动物细胞的基因组中。这就导致外源基因在不同转化细胞中的表达水平千差万别。而且，外源基因随机整合到基因组中会打断细胞或生物体成熟、分化和/或生存所必须的内源性基因。解决由随机整合导致的这一问题的一种方法是利用基因打靶技术。这种技术包括筛选细胞或生物体基因组DNA序列之间的同源重组事件以及将新的DNA序列插入到基因组中。该技术提供了一种系统改造细胞或生物体基因组的方法。

在检测和分离细胞如哺乳动物细胞和植物细胞时遇到一个有意义的问题，这就是虽然这些细胞可能会发生同源重组事件，但是这些细胞更容易发生非同源重组。

那些在体外不易增殖的细胞更不容易发生同源重组，因此上述的筛选和扫描方法即使不是完全不可能的，至少也是很难实现的。例如，有许多类型的细胞，包括许多干细胞，在体外是难以克隆化增殖的。如果同源重组的相对频率得以提高，那么那些不易进行特异性分离的各种细胞也易于进行打靶操作。

因此，急需一种能提供常规且高效同源重组的基因打靶系统，并且这种系统能提供足够高的同源重组频率，从而避免再需要进行特异性的筛选和扫描。

同源重组不仅可用于引入外源序列，还可用于删除或灭活基因内的序列。

“基因敲除”是指靶向性灭活细胞或生物体内的基因。该技术是用靶向性载体上的灭活基因通过同源重组替代染色体上的野生型基因(靶基因)。在基因敲除实验中遇到的一个普遍问题是整个载体更容易随机插入到动物的细胞内(非同源重组)而不是基因替换(同源重组)。常规的是用正/负筛选过程来计数选择随机插入事件。一般用单纯疱疹病毒的胸苷激酶(TK)基因作为阴性选择标记。虽然这个系统作为常规使用，但是该系统有许多缺点。首先，所构建的正/负选择载体有时很不稳定。第二，构建基因敲除载体要经过许多步，有时所需要的时间可能是数月而不是数周。第三，本文所描述的方法是一种半自动的构建靶向性载体的方法，现有的技术还无法构建这种载体。

因此，还需要一种构建基因打靶载体的系统，该系统能提供常规且高效的同源重组，并且这种系统能提供足够高的同源重组频率，从而避免再需要进行特异性的筛选和扫描。

本发明的目的在于提供一种快速高效构建稳定的基因打靶载体的方法，该载体可以改造细胞或生物体基因组上的任何预定区域，这种改造的细胞可以被筛选和富集。

发明概述

本发明的第一个方面涉及用于靶向性载体的靶向性构建物的制备方法，其中所述靶向性载体能修饰靶DNA序列，所述方法包括以下步骤：

在体外获得一个靶DNA序列的拷贝；

将含有转座子序列和DNA重组序列的DNA片段插入到靶DNA序列拷贝的一个位点上；

将含有转座子序列和DNA重组序列的另一DNA片段插入到靶DNA序列拷贝的另一个位点上；以及

诱导上述两个重组序列之间的重组事件以删除一部分靶DNA序列。

本文所描述的这种方法提供了一种靶向性构建物，该构建物可以插入到靶向性载体中以修饰能同源重组的细胞基因组内的靶DNA序列。这种转座子介导的过程特别适用于在靶DNA序列和细胞上进行删除。

本发明的另一方面提供了用于在靶DNA序列上进行删除的前靶向性构建物(pre-targeting construct)，所述构建物包含：

靶DNA序列的一个拷贝；

至少两个转座子单元，每个都含有一个重组序列；以及

将其中所述的转座子单元插入到靶DNA的拷贝内，从而在重组序列进行重组时删除部分靶DNA拷贝。

这种前靶向性构建物是靶向性构建物的前体，在诱导重组前就已经存在。这种构建物是转座子介导的基因删除过程的基础，并且是该过程的必须成分。利用转座子单元可以并且易于在同源重组时从靶DNA上或从靶DNA的拷贝上删除DNA序列。

本发明的另一方面涉及用本文所描述的方法制备的靶向性构建物。靶向性构建物来自于重组序列之间的重组过程，缺少一部分靶DNA拷贝的序列，但是却含有与靶DNA同源或基本同源的DNA序列。这种形式的靶向性构建物很容易被从其克隆载体上切下，然后插入到靶向性载体中用于通过同源重组修饰靶DNA序列。靶向性构建物可以从原始的克隆载体中分离出来，然后再插入和克隆到靶向性载体中。

本发明的另一个方面涉及双阳性(DP)载体，该载体用于修饰能同源重组的靶细胞基因组内的靶DNA序列。载体包含的第一部分DNA序列至少有一部分是与靶DNA序列的第一区的一部分基本同源。载体包含的第二部分DNA序列至少有一部分是与靶DNA序列的第二区的另一部分基本同源。载体的第三部分序列优选位于第一、第二部分DNA序列之间，编码阳性选择标记物，该标记物表达时能在载体转导的靶细胞内发挥功能。

第三部分DNA序列内还有另外一种DNA序列，该序列在位点特异性重组酶存在的情况下支持DNA的高效重组。比较适宜的序列是LoxP序列或FRT序列，它们分别受位点特异性重组酶如Cre或FLP的影响。

第四部分DNA序列也是一种在位点特异性重组酶存在的情况下支持DNA高效重组的序列，在靶细胞内有活性，其5’端是第一部分序列，3’端是第二部分DNA序列，基本不能与靶DNA序列同源重组。这个序列也是另外的LoxP序列或FRT序列，它们也分别受位点特异性重组酶如Cre或FLP的影响。

另外也可以将一些作为引物的DNA序列加到载体的5’端或3’端，其5’和3’分别是第一和第二部分序列。

上述含有两个同源区和一个阳性选择标记的DP载体可用于本发明的方法中以修饰靶DNA序列。在转化过程中，DP载体最可能随机整合到细胞的基因组中。在这种情况下，几乎所有的含有第一、第二、第三和第四部分DNA序列的DP载体都可以整合到基因组中。但是，有一部分DP载体是通过同源重组整合到基因组中的。当DP载体上第一部分DNA序列和第二部分DNA序列的同源部分与细胞内源性靶DNA的相应同源部分之间发生同源重组时，在特异性重组酶存在的情况下支持高效DNA重组的第四部分序列不掺入到基因组中。这是因为该序列位于内源性靶DNA序列同源区的外面。

因此，转化时至少形成两个细胞群，第一个细胞群中载体是随机整合的，通过在特异性重组酶存在的情况下支持高效DNA重组的第四部分序列可以被筛选出来。这是因为随机整合发生在线性DNA的末端。另外一群细胞所发生的基因打靶是通过同源重组形成的，这群细胞可以通过载体第三部分的阳性选择标记筛选。

如果第四部分DNA序列存在，重组酶如Cre的活化能灭活阳性选择标记，这是通过灭活LoxP序列两侧的载体序列而实现的。这个细胞群不含有阳性选择标记，因此在阳性筛选时无法存活。这种阳性筛选最后的结果是将含修饰靶DNA序列因而同源重组的转化细胞富集出来。

如果上述DP载体中含阳性选择标记的第三部分DNA序列位于编码多肽的基因的第一部分DNA序列和第二部分DNA序列之间(即真核生物的外显子内)，或者位于基因表达必须的调节序列之内，同源重组就能使细胞被筛选出来，因为含这种靶DNA序列的基因被修饰后就成为了无功能的基因。

但是，如果DP载体第三部分DNA序列中的阳性选择标记位于基因组的非翻译区(即位于真核基因的内含子内)，通过替代、插入和/或删除一个或多个核苷酸修饰靶序列(即外显子和/或调节序列)周围的序列就不会使靶基因的功能丧失。

本发明还涉及转化细胞，该细胞的基因组内至少有一个靶序列被修饰。

另外，本发明还涉及生物体，如非人的转基因动物和植物，该生物体含有的细胞基因组内的靶DNA序列被修饰。

本发明的其他方面见下面说明书、附图和权利要求的详细描述。

附图

图1显示的是小-Mu转座子的构建及其在删除序列时的应用。小-Mu转座子1可以构建成含双启动子(细菌的和真核生物的)(P/P)的，两个启动子之间用LoxP位点(开放三角)从氯霉素抗性基因(Cam^r)处分开，整个结构向转座子两侧分布。在这个转座子中，细菌启动子和真核启动子都能启动Cam^r基因的表达。小-Mu转座子-2结构如下：四环素抗性基因(含有细菌启动子的Tet^r)-LoxP序列-无启动子的β-geo基因，整个结构向转座子两侧分布。

小-Mu转座子的结构及其在删除序列时的应用。P/P，原核/真核双启动子；三角，LoxP序列；Cam^r，无启动子的氯霉素抗性基因；Tet^r，带天然细菌启动子的四环素抗性基因；β-geo，无启动子的新霉素抗性基因-LacZ融合基因；粗线，克隆的靶基因；细线，载体骨架。

图2显示的是在克隆动物基因时删除序列过程示意图。

图3显示的是DP载体的原理。A.双阳性载体的设计。三角代表能被重组酶Cre活化的LoxP位点。B.重组酶Cre表达后，发生基因打靶的细胞还对新霉素有抗性(第二阳性筛选)。C.随机插入的细胞变得对新霉素敏感，因为任意两个LoxP位点之间的删除都能灭活启动子或neo基因，甚至两者皆被灭活。D.用于构建DP载体系统的方法的实施例。

图4显示的是用两个阳性选择标记改造DP载体。三角代表LoxP位点。

图5显示的是携带小-Mu转座子-1的载体pCO10的构建过程。

图6显示的是小-Mu转座子1。

图7显示的是携带转座子Mu2-Neo的载体pCO20的构建过程。

图8显示的是携带转座子Mu2-HygEGFP的载体pCO25的构建过程。

图9显示的是携带转座子Mu2-β-neo的载体pCO43的构建过程。

图10显示的是一个24kb的XhoI片段，该片段含有大鼠HPRT基因的外显子3的一部分和外显子4-9，小-mu转座子1插在这个克隆片段中。

图11显示的是携带控制neo基因表达的启动子的DP载体。

图12显示的是DP载体的检测。

图13显示的是具有两个阳性选择标记的DP载体。

图14显示的是用这些靶向性构建物敲除大鼠HPRT基因。

图15显示的是具有floxed β-geo的载体的构建过程。

图16显示的是用Southern印迹法验证HPRT基因的敲除。

发明的详细描述

本发明的第一个方面涉及用于靶向性载体的靶向性构建物的制备方法，其中所述靶向性载体能修饰靶DNA序列，其中所述靶向性载体能修饰靶DNA序列，所述方法包括以下步骤：

在体外获得一个靶DNA序列的拷贝；

重组事件能将靶DNA的拷贝转化成靶向性构建物，该构建物含有与靶DNA的部分序列同源或基本同源的序列，但是也有一部分靶DNA序列从靶向性构建物中删除。两个转座子都含有重组序列，都可以被插入到靶基因拷贝的不同位置上。

通过两个转座子重组序列之间的重组能删除两个转座子之间的序列。优选将选择标记留在删除位点上以便于阳性筛选动物细胞。这在要删除各种所需的基因时特别有用，可以在克隆基因上得到高通量的删除。

根据本说明书的描述和权利要求，单词“含有”可与其他的单词、组分、整体或步骤连用。

如本文所描述的，“靶DNA序列”是指细胞基因组内的一个预定区域，该区域是被本发明的靶向性载体修饰的靶位。靶DNA序列包括基因的各种结构组分(如编码多肽的DNA序列，其中包括真核生物的基因，内含子和外显子)、调节序列如增强子序列、启动子等，以及目的基因组上的其他区域。靶DNA序列也可以是经载体打靶后对宿主基因组功能无影响的序列。每个靶DNA序列上都有一个同源序列部分用于设计本发明的靶向性载体。

本文所用的术语“靶DNA序列的拷贝”包括同源拷贝、基本同源的拷贝以及靶DNA经修饰的拷贝。靶DNA的同源拷贝与靶DNA序列一致，当需要删除一部分目的靶DNA序列时特别有用。“基本同源的”拷贝是那些与靶DNA序列基本一致的拷贝，在严格的条件下也能杂交。“经修饰的”拷贝是那些“基本同源”的序列，但这些序列内含有一些需要被引入靶向性载体内进而进入细胞基因组内的改变和修饰。这些DNA序列可以变成经修饰的DNA序列用于靶向性载体中。经修饰的DNA序列中这些修饰或改变优选在重组序列的位点之外，这样经重组后这些修饰的序列还能保留在靶向性载体内。

靶DNA序列的拷贝可以是任何来源的，一般来说从商业的文库中获得。靶DNA序列通常是已知的序列或已知的基因。但是本发明并不限于已知的序列。部分DNA经鉴定后可用于修饰，这部分序列的拷贝可以通过提取、天然产生或合成方法制备，这些都包括在本发明的范围之内。基于本发明的目的，序列在体外经操作删除期望的部分。这些序列可以被克隆到任何载体内，或者克隆到能产生含靶DNA序列的稳定构建物的克隆载体中，从而使插入的DNA序列包含转座子和同源序列。构建物最好用商品化的任何构建物。但是，载体pNEB193也可以使用。其他的载体包括以pUC为基础构建的载体、以粘粒为基础构建的载体、以PAC/BAC或YAC为基础构建的载体。

因此，靶向性构建物的构建是为了插入到靶向性载体中。

本文所描述的方法能在体外有效删除靶DNA序列拷贝的一部分，这部分代表了动物靶基因上需要删除的序列。这种简便的方法明显简化了在靶细胞内删除基因序列的过程。它也大大简化了构建基因构建物的方法，构建基因构建物需要将DNA插入子如启动子序列、选择标记和同源靶序列准确地插入到靶载体中以确保准确的同源重组。

靶向性构建物至少含有两个分离的插入DNA序列，插入的DNA序列中包含转座子序列和DNA重组序列。

但是，也可以多点插入DNA序列以诱导重组，从而删除靶DNA序列拷贝的一部分。

转座子序列是一组不连续的DNA片段，该序列能插入到DNA分子的新位点上，该过程被称为转座。这种元件在原核细胞和真核细胞中都存在。在细菌中存在几组含不同转座子的这类元件，其中有些已经作了详细的研究，并被用于插入到真核基因和细菌基因中以产生插入突变。转座子也可作为移动性的标记用于克隆，或作为插入引物结合位点的工具用于测序。

不同转座子转座的机制和模式

一般来说，转座过程包括转座子编码的转座酶识别转座子的末端，然后转座子末端与靶位点序列之间发生重组。大多数转座酶基因的作用方式都是顺式的，催化转座子在含转座酶基因的同一个DNA分子上转座。体内的转座过程通常都需要辅助蛋白和DNA辅助因子，某些转座子具有转座抑制功能，能阻止同样的转座子转座到包含其自身的DNA分子上。

已经开发出许多体外转座子系统，其中只有两个组分是需要的，小-转座子和小-mu转座子，二者都含有抗生素抗性标记，抗性标记分布于各种转座子末端的两侧，纯化的转座酶能催化供体转座子向受体DNA分子上转座。在这个系统中，一般只需要转座酶就足够了，不需要辅助蛋白和DNA辅助因子。而且，没有转座抑制活性，多个转座子可以插入到同一个DNA分子上。

适宜的小-转座子可从如下一组中选择：Mu1-Cam、Mu2-Neo、Mu2-Hyg EGFP和MU2-β-geo。

插入的DNA序列还含有重组序列。本文所描述的重组序列对于删除部分靶DNA拷贝或重组序列两侧的任何序列都是十分重要的。这些序列能在位点特异性重组酶存在的情况下支持高效重组。

适宜的重组序列包括LoxP序列和反向重复序列(FRT)，二者分别受重组酶如Cre和FLP的影响。重组酶的整合酶家族(Gln，Hin，解离酶)也包括在本说明书中。其他酶催化的高效重组事件也可以有效介导该系统。

Cre-LoxP重组酶系统是最好的。但是，FLP-FRT系统也可以使用。LoxP是一个34bp的DNA片段，该片段能在重组酶Cre的介导下与另一个LoxP序列重组。重组事件使DNA分子环化，两个LoxP位点之间的DNA序列被删除。本系统的一个重要特征是两个LoxPP位点之间是在一个方向上重组，位点之间的序列被删除，只留下一个拷贝的LoxP。该系统在原核生物和更高级的生物体内都能发挥作用，因此本文所描述的方法可用于各种类型的细胞，其中包括酵母。

插入DNA序列的重组序列必须相匹配，只有这样才能重组。因此，如果一个DNA序列的重组序列是LoxP，则另一个DNA序列必须要包含LoxP序列，这样才能删除其两侧的DNA序列。

尽管是优选的，但转座子序列也可以包含能提供选择标记和启动子的其他序列。这些序列的存在意味着转座子能成功地插入到靶DNA序列中。任何选择标记都可以和转座子序列结合使用。

适宜的选择标记包括抗生素抗性标记，或酶标记如氯霉素、四环素或新霉素抗性标记及β-geo标记。

插入到靶DNA拷贝中的DNA序列可以被插入以确保转座子是在同样的方向上，从而保证重组序列也是在同一个方向上。

重组序列在插入序列内可以位于相对于转座子或附加的选择标记和启动子位置的任何空间顺序上，这些附加的选择标记和启动子是其两侧需要删除的靶位。重组序列优选置于在删除一部分靶DNA序列后能活化新标记序列的位置上。

除了理论上的限制，一个插入的DNA序列可以包含转座子序列，该转座子序列含有一个控制第一选择标记如Cam^r的启动子序列以及一个插入到启动子序列和选择标记序列之间的重组序列。另外一种插入DNA序列包含的转座子序列含有一个活动选择标记如Tet^r和一个插入到活动与非活动选择标记之间的重组序列。重组序列之间的重组能使第一选择标记被删除，非活动的选择标记活化，从而可以鉴定下一步的成功重组。

DNA序列可以通过转座过程和转座子编码的转座酶对DNA序列上转座子末端的识别而被插入到靶DNA的拷贝中。理想的是每个DNA序列被分别插入以便其相继整合到靶DNA拷贝中。通过选择标记可以鉴定整合是否成功。但是插入的DNA序列可能同时被插入。尽管这种情况不是理想的，但是这种方法还是适于将重组序列引入到靶DNA拷贝中，其两侧含有需要被删除的DNA序列部分。

转座子的整合是随机的。通过PCR扫描或用限制性酶切图谱的方法可以确定转座子整合的位点和方向。

优选通过将Cre导入到细胞内诱导重组序列之间的重组。

cre重组酶基因可以被表达，最好是以可调控的方式表达。Tet-on系统或ecdysine诱导系统可用于诱导cre的表达。这些系统需要将两个质粒整合到染色体上。在转基因和基因敲除实验中，整合到染色体上的质粒DNA会引起意外的副效应。为了解决这一问题，通过Cre重组酶的瞬时表达最适合删除LoxP位点两侧的DNA片段。优选腺病毒载体用于重组酶的瞬时表达。这些载体极少整合到染色体上，在正常细胞系内不会复制，因为它们是复制缺陷的病毒载体，只在能提供必须复制功能的特殊细胞系内增殖。而且，其转染效率比质粒表达载体高的多(腺病毒转染效率接近100％，而质粒表达载体只有20％)。腺病毒载体用于Cre基因的瞬时表达是最优选的。优选表达Cre重组酶的腺病毒AxCANCre(RIKEN，日本)。通过Western印迹法用抗-Cre抗体(Novagen)可确定Cre重组酶是否表达。

当使用其他的重组序列如PLP-FRT系统或重组酶的整合酶家族成员时，相应的重组酶可以同样的方式被诱导表达。

本发明的另外一个方面涉及用于在靶DNA序列上制造缺失的前靶向性构建物，所述的构建物包含：

一个拷贝的靶DNA序列；以及

至少两个转座子单元，每个转座子含有一个重组序列；以及

其中所述的转座子单元插入到靶DNA序列内，这样在重组序列发生重组时一部分靶DNA序列被删除。

这种前靶向性构建物是靶向性构建物的前体，在诱导重组前就已经存在。这个构建物是转座子介导的基因删除过程的基础，是这一过程所必须的。使用转座子单元能促使DNA序列在同源重组时从靶DNA上删除和/或从靶DNA拷贝上删除。

在一个优选实施方式中，转座子单元是小-mu转座子单元。小-mu转座子单元还含有选择标记和控制选择标记表达的所需启动子。转座子单元优选不相同的，这样在重组时不同的选择标记或基因被活化从而有利于重组子的筛选和靶向性载体的形成。

选择标记的选择如上所述。

本发明的另外一个方面涉及用上述方法制备的靶向性构建物。靶向性构建物通过重组序列之间的重组而形成，缺少一部分靶DNA拷贝，但是却含有与靶DNA同源或基本同源的DNA序列。这种形式的靶向性构建物很容易被从其克隆载体上切下，然后插入到靶向性载体中通过同源重组用于修饰靶DNA序列。靶向性构建物可以从原始的克隆载体中分离出来，然后再插入和克隆到靶向性载体中。

一种优选的靶向性构建物含有一个活动的选择标记，因此在经重组后形成，其中活动的选择标记来自于启动子和选择标记的结合，二者分别来源于插入的DNA序列。优选的活动选择标记位于与靶DNA同源或基本同源的DNA序列上。这种选择标记能帮助在克隆载体和细胞内进行阳性筛选，这些细胞内已经转导了含有靶向性构建物的靶向性载体。

这种转座子介导的方法被设计成能制造缺失的方法，并且基因一旦被克隆出来就能利用该方法提高载体的构建速度。因为转座子是随机插入到克隆载体上的，并且对于小-Mu转座子来说没有优选的序列，因此删除可以发生在任何期望的位置上，每个删除都不需要多余的克隆步骤。这有利于高通量地制造缺失，特别适合于半自动化地制备敲除载体。

如本文所描述，优选的靶向性载体是DP(双阳性)载体。

本发明的另一个方面涉及双阳性(DP)载体，该载体用于修饰细胞基因组内的靶DNA序列。所述DP载体含有：

能与所述靶DNA序列的第一区同源重组的第一同源载体DNA序列；

能使所述细胞呈现阳性筛选特征的阳性选择标记DNA序列；

在位点特异性重组酶存在的情况下支持高效DNA重组的第三部分序列，这部分序列包含在阳性选择标记内；

能与所述靶DNA序列的第二区同源重组的第二同源载体DNA序列；以及

能与第三部分序列发生位点特异性重组但基本不能与所述靶DNA序列同源重组的第四部分序列。

其中所述序列在所述DP载体上的空间分布顺序为：所述第一同源载体DNA序列，所述含第三部分序列的阳性选择标记DNA序列，所述第二同源载体DNA序列以及所述第四部分序列；

其中所述载体能通过所述第一同源载体DNA序列与所述靶序列的第一区之间的同源重组以及所述第二同源载体DNA序列与所述靶序列的第二区之间的同源重组修饰靶DNA序列。

双阳性筛选(DP)方法和载体或本发明的靶向性载体用于修饰能进行同源重组的细胞基因组内的靶DNA序列。

本发明DP载体的简要示意图见图3和图4的显示。另一种DP载体显示在图4中。DP载体至少含有4部分序列。第一和第二部分DNA序列中每个序列都有一部分序列是与靶DNA的第一区和第二区的相应部分基本同源的。

DP载体上的部分序列与靶DNA上的部分序列基本同源是保证DP载体能正确插入到基因组适当区域上所必须的。

本文所用的术语“同源的”或“基本同源的”DNA序列是指一个DNA序列与参照DNA序列一致或基本一致。两个序列是同源的意味着他们即使在最严格杂交条件下也能彼此杂交；并且最好没有序列多态性(即他们含有相同的限制性内切酶酶切位点)。

本文所用的术语“基本同源”用于DNA时意味着该DNA分子至少有约97-99％的核苷酸与参照DNA分子一致，优选至少约99.5-99.9％的核苷酸与参照DNA分子一致，在某些情况下甚至100％一致。两个序列是基本同源的意味着他们即使在最严格杂交条件下也能彼此杂交；并且最好没有RFLPs或序列多态性(从统计学意义上说，特定长度的序列中至少约有97-99％的序列是一致的)。

基因打靶技术是一种先进的选择性改造细胞基因组的技术。利用该技术可以位点特异性的精确方式定位和改造特定的DNA序列。

各种类型的DNA序列都可以被靶向性地改造，其中包括调节区、编码区以及两个基因之间的区域。

调节区的例子包括：启动子区、增强子区、终止子区和内含子。通过修饰这些调节区可以改变基因表达的时相和水平。编码区也可以被改造以改变、增强或消除抗原或抗体的特异性、酶的活性、食物蛋白的组成、蛋白质对灭活的敏感性、蛋白的分泌特性以及蛋白质在细胞内的分布等。内含子和外显子以及基因内的区域适宜作为修饰的靶位。当该技术与重组酶结合时可用于染色体工程(Ramirez-SolisR，Liu P，Bradley A(1995).小鼠的染色体工程改造(Chromsome Engineering inMice.Nature 378：720-4.)，可以实现染色体间或染色体内的大片段基因重排。

DNA序列的修饰包括几种类型，如插入、删除、替代或上述几种修饰的组合。一种特殊类型的修饰是通过核苷酸序列的位点特异性整合阻断基因的表达从而灭活基因。利用这种技术靶向性地“敲除”一个基因会避免利用反义RNA阻断基因产物的功能表达时所出现的问题。例如，一种用于本发明的阻断靶基因的方法是将一个选择标记插入到靶DNA中，通过靶DNA与靶DNA之间的同源重组来将选择标记插入到靶基因的编码区内。

编码阳性选择标记的DNA序列也包含在DP载体中。本说明书中所用的优选选择标记包括而不限于抗性基因(如新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因等)、荧光或生物发光标记(如绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)等)或其他任何能将携带插入DNA的细胞与未携带插入DNA的细胞区别开来的标记。

编码阳性选择标记的DNA序列最好位于第一部分DNA序列和第二部分DNA序列之间。标记基因在靶向性构建物中的位置依赖于基因打靶的目的。例如，如果要阻断靶基因的表达，则选择标记要克隆到靶DNA的相应编码序列内。另外，如果要表达改变的靶基因产物，如氨基酸发生替代的蛋白质，则编码序列要被修饰成编码替代物的序列，选择标记应放在编码区之外，比如靠近内含子的位置。

如果选择标记基因依赖自己本身的启动子，并且选择标记基因所来源的物种与所要导入的物种差别很大(如原核标记基因用于转导哺乳动物细胞)，那么优选用已知的能在受体细胞内发挥功能的启动子替代原来的启动子。许多转录起始区可用于上述目的，其中包括金属硫蛋白启动子、胸苷激酶启动子、β-肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、SV40启动子和巨细胞病毒启动子。一个被广泛应用的例子是pSV2-neo质粒，该质粒含有SV40早期启动子控制下的细菌来源的新霉素磷酸转移酶基因，导入该质粒后可使哺乳动物细胞对G418(一种新霉素类的抗生素)有抗性。

DP载体内标记基因的一个特征是有一个在位点特异性重组酶存在的情况下支持高效重组的第三序列存在于阳性标记基因的编码序列内。适宜的序列包括LoxP和反向重复序列(FRT)，二者分别受重组酶如Cre和FLP的影响。

重组酶的整合酶家族(Gln，Hin，解离酶)也包括在本说明书中。其他酶催化的高效重组事件也可以有效介导该系统。

Loxp序列是一个34bp的DNA片段，其两侧的序列可以被删除。没有Cre蛋白的存在它不能介导重组。

FRT序列是FLP的靶位，在重组酶FLP存在的情况下其两侧的DNA序列也能被删除。

在位点特异性重组酶存在的情况下支持高效DNA重组的第三部分序列插入时最好不要阻断阳性选择标记基因的表达，当细胞内的启动子序列活化时标记基因才表达。该序列优选插入到启动子和选择标记基因的编码区之间。但是，其他的方法也可以使用，如利用蓝/白斑筛选策略时β-半乳糖苷酶的基因被打断。

如果编码选择标记的DNA序列所表达的表型能赋予表达该DNA序列的细胞阳性筛选特征，则该阳性标记在转化细胞内是有“功能的”。因此，“阳性筛选”包含用DP载体转染的转化细胞，利用适当的筛选药物可以杀死或筛选掉那些不含整合的阳性选择标记的细胞。

本文所用的其他阳性选择标记包括编码膜结合多肽的DNA序列。这种多肽是本领域技术人员所熟知的，该多肽含有一个分泌序列，一个胞外区、一个跨膜区和一个胞内区。当阳性选择标记表达时，这种多肽插入到靶细胞膜上。通过荧光活化细胞分离器(FACS)用胞外区特异性的荧光标记抗体筛选表达膜结合多肽的细胞。阴性筛选之前或之后都可以用FACS筛选。

DP载体内的第四部分序列在位点特异性重组酶存在的情况下支持高效的DNA重组，直接介导与第三部分序列的位点特异性重组，但是基本不能与靶DNA序列发生同源重组。因此，如果第三部分序列是一个LoxP序列，那么第四序列最好也是一个Loxp序列，这样才能删除其两侧的序列。

同样，如果第三部分序列是一个FRT序列，那么第四序列最好也是一个FRT序列，这样才能删除其两侧的序列。重组酶分别是Cre和FLP。其他能产生同样效应的重组酶也包括在本申请的范围之内。

本发明的一个关键特征是，在位点特异性重组酶(如Cre)的作用下，两个LoxP位点之间发生重组，结果导致阳性选择标记功能的丧失。因此，同源重组的细胞基因组必须发生改变才能表达可诱导形式的Cre(或其他的重组酶如FLP)。

在另一个优选实施方式中，第四部分DNA序列还含有另外一个短序列，该序列可以作为PCR引物位点或作为阳性选择标记基因内的另外一个重组位点。这个序列可以加到第一部分DNA序列的末端，也可以加到第二部分DNA序列的末端。

但是，阳性选择标记也可以被构建成独立表达的(即包含在靶DNA的内含子中时)，或构建成经同源重组后被置于靶DNA序列的调节序列控制之下的。

然而，DP载体内各种DNA序列的排列并不需要每个DNA序列转录和翻译时都位于DP载体的一条链上。因此，第一部分DNA序列和第二部分DNA序列的5’到3’方向可以与靶DNA序列的第一区和第二区的5’到3’方向一致。

当如此排列时，DP载体被称为“置换DP载体”。一旦发生同源重组，置换DP载体就用DP载体第一部分DNA序列和第二部分DNA序列的同源区域之间的DNA序列替换靶DNA同源区域之间的基因组DNA序列。序列置换载体是实现本发明所优选的。另外，DP载体上第一部分序列和第二部分序列的同源区域可以彼此互换，这样DNA序列1的同源区域的5’端与靶DNA序列的第一区同源区域的3’端相对，而DP载体上DNA序列2的同源区域的3’端与靶DNA序列的第二区同源区域的5’端相对。这种方向的颠倒使载体成为“插入DP载体”。当插入DP载体同源插入到靶DNA序列中时，整个DP载体就插入到靶DNA序列中，但不会替换靶DNA的同源序列部分。

这样所修饰的靶DNA至少含有两个拷贝的靶DNA同源区，这种区域是DP载体所含有的。

同样，阳性选择标记序列、第三和第四DNA序列也可以彼此发生转录性颠倒，或与靶DNA序列的方向颠倒。但是这种情况只是在第三DNA序列中的阳性选择标记基因独立地被适当的调节序列控制时才发生。例如，当使用无启动子的阳性选择标记作为第三序列时，选择标记被置于内源性调节序列的控制之下，这种载体就需要阳性选择标记基因的方向与转录子的方向和内源性调节区的方向一致(5’到3’，正确的阅读框架)。

DP筛选需要第四部分DNA序列基本不能与靶DNA序列发生同源重组。

本发明的另外一个方面涉及包含在载体中的另外一个选择标记。这个附加的选择标记两侧优选重组酶控制下的位点特异性重组序列，如上面所描述的LoxP和FRT。这类DP载体中的选择标记可以是相同的也可以是不同的。当他们不相同时，就需要两种不同的药物来筛选含这类标记物的细胞，可以用选择标记特异的药物先后或同时筛选细胞。位于DP载体5’末端和3’末端的两个选择标记更容易筛选掉随机整合DP载体的靶细胞。这是因为随机整合有时会导致DP载体的重排，这样在随机整合前会使选择标记的全部或部分被删除。如果发生这种情况，随机整合DP载体的细胞不能被筛出来。但是，DP载体上存在第二个选择标记实质上增大了两个选择标记至少有一个随机整合的可能性。

本发明优选含有第二个选择标记的载体，该标记两侧为LoxP位点，这样就可以去掉在DP筛选过程中Cre不发挥功能的细胞。这个标记可以是上面所描述的任何标记，但是优选单纯疱疹病毒胸苷激酶和荧光蛋白等。可诱导的Cre可能在经过一段时间后活化，并且使大多数的细胞发生同源重组。但细胞类型不同差异很大。选择标记的筛选有时在Cre被诱导后开始，这时就会排除那些Cre不能有效发挥功能的细胞。

在本发明的这一方面还有一个优选的实施方式，其中的DP载体至少含有两个选择标记，一个选择标记是无启动子的，另一个标记处于启动子的控制之下。适宜的无启动子标记是潮霉素抗性标记基因(Hyg^r)。

在依赖Cre重组酶在100％或接近100％细胞内表达的系统中，发生随机整合事件的所有细胞都变得对第一选择标记敏感，因此在第二轮筛选时被杀死，没有细胞没有100％的有效率。筛选过程会产生带随机整合的背景。因此为了减少随机整合的发生，本发明提供了一种DP载体，所述载体至少含有2个阳性选择标记(图4)。

这种载体与上面所描述的DP载体一样，只是在第一选择标记基因之后还含有另外一个LoxP位点和一个无启动子的选择标记抗性基因。这个无启动子的标记基因是不表达的，因为第一标记基因作为“填塞序列”位于启动子和无启动子的标记基因之间。这种载体转染的细胞用第一标记抗性基因筛选。靶向性事件发生后，腺病毒-Cre表达的Cre重组酶会将第一选择标记基因删除，无启动子的基因表达，从而使细胞具有了不同的抗性。在两个外部LoxP位点存在的随机整合事件中，Cre重组酶的表达会删除启动子或无启动子的基因(或者删除二者)。因此，通过无启动子标记的第二轮筛选，存活的细胞只有那些发生基因打靶的细胞。这里Cre重组酶是否高效表达并不是一个问题，因为没有LoxP的重组无启动子的基因就不会表达。这种修饰代表了一种超级基因打靶载体，该载体会产生较低水平的非打靶细胞。

DP载体的第四部分DNA序列与靶DNA之间基本上是非同源的，这样第四部分DNA序列接头处及其附近的序列同源性出现了中断。因此，当载体通过细胞内的同源重组机制整合到基因组时，第四部分DNA序列不会转移到靶DNA上。在同源重组及重组酶活化期间第四部分DNA序列是不整合的，这就是本发明DP方法的基础。

本文所述的“修饰的DNA序列”是指一个包含在第一部分DNA序列、第二部分DNA序列和/或阳性选择标记DNA序列内的DNA序列，当DP载体同源插入到基因组的靶区域时，该序列编码靶DNA序列上的一个或多个核苷酸的替代、插入和/或缺失。当DP载体只含有编码阳性选择标记的DNA序列插入子时，这种DNA序列有时也被称为“第一修饰DNA序列”。如果除了编码选择标记的DNA序列以外，DP载体还含有编码一个或多个替代、插入和/或缺失核苷酸的序列时，编码这种修饰的序列部分有时也被称为“第二修饰DNA序列”。第二修饰DNA序列可以含有完整的第一部分DNA序列和/或第二部分DNA序列，在某些情况下所含有的序列也可以比完整的第一部分DNA序列和/或第二部分DNA序列少。后一种情况一般发生在异源基因插入到DP载体时，这时的载体设计成将异源基因置于内源性的调节序列控制之下。在这种情况下，第一部分DNA序列可以含有整个内源性调节序列或只含有内源性调节序列的一部分，修饰DNA序列含有第一部分DNA序列的一段(在某些情况下也可以是第二部分DNA序列的一段)，这段序列编码异源DNA序列。所包含的第二部分DNA序列的同源部分能使DP载体具有靶向性。另外一方面，完整的第一或第二部分DNA序列可以含有第二修饰DNA序列，例如当这两个序列的一个或两个编码矫正靶DNA序列缺损的序列时。

本发明的另一个优选实施方式涉及含靶向性构建物的DP载体，其中靶向性构建物是通过转座子介导的方法制备的，该方法包括如下步骤：

在体外获得一个靶DNA序列的拷贝；

将含有转座子序列和DNA重组序列的另一DNA片段插入到靶DNA序列拷贝的另一个位点上；

经过上述重组步骤后，还要回收和分离靶向性构建物以便将其插入到DP载体中。可以通过从克隆载体中分离构建物的任何方法回收该构建物。通过限制性酶切方法消化构建物并将其插入到DP载体内。

在一个更优选的实施方式中，靶向性构建物含有：

能使所述细胞呈现阳性筛选特征的阳性选择标记DNA序列；

本文所用的术语“修饰的靶DNA序列”是指被DP载体修饰的靶细胞基因组上的一个DNA序列。与转化靶细胞来源的细胞相比，第一转化靶细胞内经修饰的DNA序列含有一个或多个替代、插入和/或缺失的核苷酸。在某些情况下，修饰的靶DNA序列是指“第一和/或第二修饰靶DNA序列”。当含第一或第二修饰序列的DP载体同源整合到靶DNA序列中时，这些修饰序列与转化靶细胞内所发现的DNA序列一致。

被称为“第一转化靶细胞”的“转化靶细胞”有时也指那些基因组内有DP载体同源整合的靶细胞。另一方面，“转化细胞”是指那些基因组内有DP载体随机非同源整合的细胞。“转化靶细胞”通常都有包含在修饰靶DNA序列内的阳性选择标记。当基因组修饰的目的是打断特定基因的表达时，阳性选择标记一般包含在外显子内，这样就可以有效地打断内源性靶基因的转录和/或翻译。但是，当基因组修饰的目的是插入外源基因或矫正内源基因缺损时，第一转化靶细胞内的修饰靶DNA序列就另外附加了外源性的DNA序列或正常内源性基因(即非缺损基因)相应的内源性DNA序列。

“第二转化靶细胞”是指第一转化靶细胞的基因组以预先确定的方式经修饰改造后得到的转化靶细胞。例如，第一转化靶细胞基因组内所含有的阳性选择标记通过同源重组被删除后就成为第二转化靶细胞。后面有这种基因组改造方法的详细描述。

本文所用的术语“异源DNA”是指与靶DNA序列不一致的DNA序列。异源DNA与靶DNA的不同在于一个或多个核苷酸的替代、插入和/或缺失。因此，可以将内源性的基因序列插入到DP载体中，通过DP载体的转导使其插入到同一生物体基因组的不同调节区中。这样所得到的修饰DNA序列就是异源DNA序列。异源DNA序列也包括经修饰后的内源性序列，这些经修饰的内源性序列可以矫正基因缺损或改变内源性基因编码的氨基酸序列。异源DNA序列也包括与内源性序列不相关的外源序列，如来源于不同物种的序列。这种“外源DNA序列”包括那些编码外源多肽的序列或外源调节序列。例如，能被导入到鼠或牛ES细胞内进行组织特异性表达(如在乳腺分泌细胞中)的外源DNA序列，其中包括人血因子如t-PA、凝血因子VIII、血清白蛋白等。编码阳性选择标记的DNA序列也是异源DNA序列的例子。

本发明的另外一个方面涉及富集转化细胞的方法，该转化细胞的基因组靶DNA序列经过修饰，该方法包括：

(a)用DP选择载体转染能介导同源重组的细胞，所述载体包含：

能使所述细胞呈现阳性筛选特征的阳性选择标记DNA序列；

(b)筛选转化细胞，其中所述DP选择载体已经通过同源重组整合到所述靶DNA序列中，所述同源重组是在重组酶存在的情况下依次选择含有阳性选择标记的转化细胞；以及

(c)分析经筛选步骤后存活的转化细胞的DNA以鉴定含有修饰的细胞。

对所期望的同源重组事件的选择取决于靶向性事件和随机插入事件之间的区别。在靶向性事件中，重组发生在靶DNA序列与第一和第二部分DNA序列之间，结果载体一端的LoxP位点或FRT位点被删除。因此，在Cre(或其他的重组酶如FLP)存在的情况下，重组事件不会发生，阳性选择标记依然是完整的和有功能的。因而表达标记DNA的细胞经阳性筛选后依然能够存活。

另外，在随机整合的事件中，载体的一个或两个末端都保持完整(一般来说)，留下两个或三个插入到细胞基因组中的有功能的LoxP位点或FRT。细胞内可诱导的Cre(或其他的重组酶如FLP)活化可以使阳性选择标记变成无功能的。这样在阳性筛选条件下能存活的细胞经筛选后可能死亡或被排除。

在某些环境中，重组事件发生的效率不高，这样就会导致非同源重组事件被排除的效率相对较低。

在这些情况下，通过PCR反应利用引物序列就能检测这些发生几率相对较低的事件。因此，到DP筛选过程的后期细胞依然能在Cre存在的条件下存活，并且允许重组以较低的频率发生，利用引物序列和第一或第二部分DNA序列特异性的引物通过PCR反应可以检测这些重组事件。

DP载体用于DP方法中筛选含阳性选择标记的转化靶细胞。这种阳性筛选过程可以大量富集那些同源重组的转化靶细胞。本文所用的术语“大量富集”是指相对于同源转化子与非同源转化子之比来说转化靶细胞至少要富集两倍，较好的是富集10倍，更好的是富集1000倍，最好的是富集10000倍，即转化靶细胞对转化细胞的比率。在某些情况下，同源重组发生的几率对随机整合的几率是1∶1000，在某些情况下可能低到1∶10000。通过本发明的DP载体和方法进行大量富集通常能得到含转化靶细胞约为1％的细胞群，较好的是约含20％，最好的是约占95％，转化靶细胞内有DP载体的同源整合。这种大量富集的转化靶细胞群可用于下一步的基因操作、细胞培养实验、或制备转基因生物如转基因动物或植物。

在一个优选实施方式中，DP载体含有靶向性构建物，该构建物是通过本文所描述的方法制备的。

本发明的另外一个方面涉及用本文所描述的方法制备的转化细胞。

细胞可以是任何的原核或真核细胞，这些细胞能被DP载体转染，其中的靶DNA能被修饰。

本发明还有一个方面涉及诱导细胞基因组修饰的方法，所述方法包括：

能介导与DP选择载体进行同源重组的转化细胞，所述载体含有：

能使所述细胞呈现阳性筛选特征的阳性选择标记DNA序列；

在一个优选实施方式中，DP选择载体含有靶向性构建物，该构建物是通过本文所描述的转座子介导的方法制备的。

修饰包括基因的删除或基因序列的替代。修饰也可以是对靶DNA序列预先确定的修饰。

在许多情况下，需要通过将阳性选择标记插入到想要被打断或修饰的基因的外显子中来打断基因。例如，可以通本方法突变原癌基因来制备转基因动物。这种含选择性灭活原癌基因的转基因动物可用于分析这种基因在肿瘤发生中的作用，以及在某些情况下可用于分析其在正常发育中的作用。

基因灭活方法的另一潜在用途是分析细胞表面蛋白性受体的分布。例如，用适当的DP载体将细胞系或生物体内假定的病毒受体的表达阻断，然后用病毒感染就可以确定这个受体在病毒感染中是否起作用。另外，适当的DP载体可用于制备转基因动物模型以研究特异性的基因缺损。许多基因缺陷的特征就是特异性的基因不能表达有功能的基因产物，如α、β地中海贫血，血友病，戈谢病，影响α-1-抗胰蛋白酶、ADA、PNP产生的遗传疾病，苯丙酮尿症，家族性高胆固醇血症以及视网膜母细胞瘤。与这些疾病相关的一个或两个等位基因被打断或者编码特异性基因缺陷的DNA被修饰的转基因动物可作为治疗的模型。如果转基因动物出生后还能存活，则实验性治疗可从出生后开始。但是，如果基因缺陷影响到动物在胎儿期的存活，则可用F0或F1代的转基因动物通过体内技术进行基因治疗。

上述通过同源整合打断基因X的方式利用了阳性选择标记，该基因表达所需要的一个或多个调节序列是缺乏的。因此在构建DP载体时需要将基因X的部分而不是全部调节序列置于编码阳性选择标记的结构基因片段的5’端，也就是编码部分基因X启动子的同源序列。这种构建方式使阳性选择标记在靶细胞内不发挥功能，除非其同源整合到基因X的启动子区。如果发生这样的整合，基因X被打断，通过靶基因启动子控制下的阳性选择标记的表达可使发生整合的细胞被筛选出来。利用这种方法的唯一限制在于该方法需要靶基因在所用的细胞中是活动的。否则选择标记不会表达，从而也无法赋予细胞阳性筛选特征。

在许多情况下，不希望打断内源性基因，例如在某些基因治疗中。在这种情况下，DP载体的阳性选择标记应置于非翻译序列内，如靶DNA的内含子或5’、3，非翻译区。阳性选择标记位于第一和第二部分序列之间。第四部分DNA序列位于同源区之外。当DP载体通过同源重组整合到靶DNA上时，阳性选择标记就插入到靶基因的内含子中。这样的构建可以使阳性选择标记的表达和翻译独立于靶基因。

因此，它含有功能独立的启动子、翻译起始序列、翻译终止序列，在某些情况下还含有多聚腺苷酸序列和/或一个或多个增强子序列，每个序列在DP载体转染的细胞内都有功能。这种方式中通过同源重组整合DP载体的细胞可以用阳性选择标记筛选出来而不打断内源基因。当然，当标记处于外显子内时，同样的调节序列也可用于控制阳性选择标记的表达。显然其他可用的调节序列也是本领域技术人员所熟知的。在每一种情况下，调节序列都应正确排列，如果需要还要将其与要表达的特定DNA序列一起置于正确的阅读框架内。不同来源的调节序列，即增强子和启动子可以结合使用来调节基因的表达。

当然，利用本发明的DP载体和方法还可以对细胞基因组的靶DNA序列进行多种修饰。例如，控制原癌基因表达的内源性调节序列可以用调节序列如能在生物体的特定类型细胞内调节特定基因表达即组织特异性表达的启动子和/或增强子来代替。通过这种方式，原癌基因在特定类型细胞内如在转基因动物内的表达可以被控制，从而可以确定正常情况下不表达原癌基因的细胞内癌基因表达的效应。另外，已知的病毒癌基因插入到靶基因组的特异性位点上就能使病毒癌基因产生组织特异性的表达。

如本文所描述的，本发明的DP筛选方法和载体用于修饰靶细胞基因组上的靶DNA序列，这些靶细胞是能同源重组的。因此，可以用能同源重组的任何类型的细胞实现本发明。这种靶细胞的例子包括脊椎动物如哺乳动物象人、牛、绵羊、鼠、猿，其他真核生物如丝状真菌，以及更高级的多细胞生物如植物来源的细胞。本发明还可以用较低等的生物如能同源重组的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌来实现，但是这种低等的生物不是优选的，因为他们通常无法证明是有意义的非同源重组，即随机整合。相应的也不需要筛选非同源转化子。

如果最终目的是制备非人转基因动物，则胚胎干细胞(ES细胞)和神经干细胞是优选的靶细胞。ES细胞可以从经体外培养后预先植入的胚胎中获得。利用电穿孔方法、显微注射方法以及其他方法可以将DP载体有效地导入到ES细胞中，优选电穿孔方法。这种转化的ES细胞进而可以和非人动物的胚囊结合。ES细胞发育成胚胎，从发育成的嵌合动物中可以获得种系。在本发明中，DP载体可以定向地插入到ES细胞基因组的特定位置，然后用标准技术制备嵌合的转基因动物。

如果最终目的是矫正生物如人的基因缺陷，就要根据特定的病因及其表现来确定细胞类型。例如，造血干细胞是矫正从干细胞分化出来的细胞内基因缺陷的优选细胞类型，如红细胞和白细胞。因此，红细胞内珠蛋白链合成的基因缺陷如镰刀形红细胞、β地中海贫血等可以用从病人体内分离出来的造血干细胞通过本发明的DP载体和方法加以矫正。例如，如果靶DNA是造血干细胞内的镰刀形β珠蛋白基因，DP载体的靶位是这个基因，那么所得到的转化造血干细胞经分化后就可以表达正常的β珠蛋白基因。基因缺陷被矫正后，将造血干细胞再输入到患者的骨髓或循环中就可以分化成含正常血红蛋白的红细胞亚群。另外，可以通过放疗和/或化疗将患者体内的造血干细胞破坏，然后再输入经改造的造血干细胞，也可以矫正这种基因缺陷。

其他类型的干细胞也可用于矫正这些干细胞来源的细胞内的特异性基因缺陷，其中包括上皮、肝、肌肉、内皮、间质、神经以及骨干细胞。

另外，治疗某些特定疾病时也可以通过修饰细胞基因组的方式，这种方式并不矫正基因缺陷，而是补充缺损基因的产物。例如，内皮细胞可以作为人类基因治疗的优选靶位来治疗那些循环系统缺乏正常细胞因子的疾病。通过对狗和猪动物模型的研究发现，分离出来的原代细胞在培养基中用DNA转化，然后再将动脉移植物中的转化细胞移植到宿主体内，这些细胞就能表达目的基因。因为内皮细胞是移植物的一部分，因此转化细胞可以将产生的蛋白质分泌到循环系统中，作为治疗循环因子缺乏疾病的药物。这种疾病的例子有胰岛素缺乏性糖尿病、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症以及血友病。

上皮细胞用于治疗因子VIII引起的血友病时有其特殊优势。这些细胞天然地就产生von Willebrand因子(vWF)，实验证明活性因子VIII的产生有赖于vWF的自身合成。

人类的其他免疫系统和/或循环系统疾病也可进行基因治疗。利用现有的技术可以很容易地获得靶组织-骨髓，从中可以分离出干细胞在体外培养。腺苷脱氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)突变引起的免疫缺陷疾病特别适于本发明。不仅这两个酶的基因已被克隆出来，而且经DP载体矫正的细胞相对于其突变株来说也有选择优势。因此，可能并不需要将受体病人的骨髓去除。

能用DP筛选方法治疗的遗传疾病应具有下列特点：第一，应有DNA序列，最好是已经克隆出了正常的基因；第二，必须有合适的与组织相关的干细胞或其他细胞。

如上所述，通过将阳性选择标记置于特定细胞系基因组的非翻译区内可以矫正基因缺陷，如与两侧的片段一起放置在靠近缺陷基因位点附近来矫正基因缺陷。这种方法中，阳性选择标记是置于自身的调节序列控制之下，其自身的表达不会干扰靶基因的表达。对于人的基因治疗来说，只希望将那些矫正特定基因缺陷所必须的DNA序列导入到细胞内。因此，尽管可能是不需要的，但是也希望在通过同源重组矫正了基因缺陷后将残留的阳性选择标记去除。

本发明的DP载体和方法也可用于改造植物细胞进而改造整个植物的基因组。现在已经报道了多种转基因植物，其中包括草本二倍体植物、木本二倍体植物和单倍体植物。现在已经开发出了多种不同的转基因技术用于制备这种转基因植物和转化的植物细胞。一种技术利用根瘤土壤杆菌作为基因转移系统，Rogers等，(1986)，Methods Enzymol.，118，627-640。一种比较相似的转化是利用发根土壤杆菌。这些系统中的每个系统都有Ti或Ri植物转化载体，该载体含有一个边界区来确定要插入到植物基因组中的DNA序列。以前已经用这些系统将外源DNA随机整合到植物基因组中。在本发明中，将一个适当的DP载体插入到植物转化载体的边界序列之间，这些边界序列用于确定通过土壤杆菌转化载体转移到植物细胞中的DNA序列。

本发明的DP载体最好是通过与以前用于将基因导入植物原生质体的方法类似的方法直接转移到植物原生质体中。另外，包裹在脂质体内的DP载体也可以融合到植物原生质体中，或者通过核内微注射的方式直接插入到植物原生质体中。微注射是转导原生质体的优选方法。DP载体也可以微注射到花序分生组织中。总之，可以用包被DP载体的高速微注射器转化组织外植体，该方法与插入转基因的方法类似。这种转化的外植体可从新生长成各种植物。

一旦利用上述的任何一种方法将DP载体插入到植物细胞内，DP载体就会靶向性地同源重组到植物基因组的适当位点上。根据转染方法的不同，转化的原生质体组织培养物或植物细胞可以通过阳性或阴性筛选。在某些情况下，适宜组织培养的细胞可以从转化的植物如F0代或其子代中分离。

本发明的DP载体和方法可以预先确定的方式精确地修饰植物基因组。因此，通过基因改造可以赋予特定的植物物种组织特异性的耐受特性，包括对除草剂、昆虫和疾病的耐受，如可以使植物的叶子和皮具有抗昆虫特性。另外，可以通过替代适当的调节元件来改变植物内各种组分的表达水平，如可以改变种子内脂肪酸和/或油脂的含量、植物内淀粉的含量以及除去导致食物出现异味的组分。另外，可以将异源基因导入到植物中并使其在特定的调节序列控制下表达以产生各种烃类物质，如蜡类和制备橡胶用的烃类。

比如，已知小麦和玉米内各种储存蛋白的氨基酸组分缺乏赖氨酸和色氨酸，这也可以被改造。可以通过DP载体的设计，改变这类蛋白特定密码子以使其编码赖氨酸和/或色氨酸，这样就可以增加这类谷物的营养价值。

另外还可以修饰各种阳性和阴性调节元件的表达水平，这些调节元件控制着各种细胞和生物体内特定蛋白质的表达。因此，可以使用适当的启动子增强特定蛋白质或阴性调节元件控制下的蛋白质的表达，以此来达到降低阴性调节元件表达水平的目的。另外，也可以通过增强阳性调节元件的表达水平来增强其所调节的蛋白的表达水平，或降低其表达水平以减少细胞或生物体内其所调节的蛋白的表达量。

本发明DP载体的基本元件已经都作了描述。但是，具体选择哪一个DNA序列要根据所用的细胞类型、所要修饰的靶DNA序列以及所希望的修饰类型而定。

DP载体优选线性双链DNA分子，但是环状闭合的DP载体也可以使用。线性载体是优选的，因为线性载体同源整合到靶DNA序列内的频率更高(Thomas等，(1986)，Cell，44，49)。

一般来说，DP载体的长度在2.5kb(2500bp)到1000kb之间。其长度的下限取决于两个标准，第一个是DP载体的第一部分序列和第二部分序列与靶位点之间同源所需要的最短长度，最短大约为500bp(DNA序列1加上DNA序列2)。第二个标准是第三部分序列内功能基因的长度。最后还需要一小段序列添加靶向性重组位点(即LoxP位点，长度为34bp)。基于实际操作的考虑，每个序列最短的限制是约1000bp。这是因为编码已知的阳性选择标记和阴性选择标记的DNA序列最小也要1.0-1.5kb长。

DP载体长度的上限取决于操作DNA片段所用的技术。如果用细菌质粒作为繁殖这些片段的载体，实际的上限约为25kb；如果以粘粒作为繁殖载体，则上限约为50kb；如果以YAC(酵母人工染色体)为繁殖载体，则上限可以达到2000kb(CEPH BYACs可以达到这个长度)。

DP载体第一和第二部分DNA序列内的部分DNA序列与靶DNA序列的第一区和第二区内的部分序列是基本同源的。载体和靶序列之间同源的程度影响两个序列之间同源重组的频率。序列100％同源是最好的，但是较低的序列同源性也可以实现本发明。例如，序列同源性低到约80％时也可以使用。序列同源性的实际下限定义为当同源性低于此数值时DP载体就无法同源重组到基因组中。虽然100％同源的序列只要25bp的长度就可以发生同源重组(Ayares等，(1986)，Genetics，83，5199-5203)，但是最好是更长一点的，比如较好的是500bp的，更好的是5000bp的，最好的是25000bp的。这些数字决定了第一部分序列和第二部分序列长度的下限。DP载体的同源区最好与靶DNA序列100％同源，因为非同源比例的增加就意味着基因同源重组的频率相应下降。如果DP载体的同源部分与靶DNA的相应区域确实存在非同源序列，那么非同源序列最好不要分布于整个同源区，而只是位于同源区的不连续部分。DP载体临近第四部分序列的同源区域最好是与靶DNA上的相应区域100％同源的，这样可以保证DP载体上的同源序列与非同源序列之间保持最大的不连续性。当第一部分DNA序列和第二部分DNA序列的同源区所占的绝对量增加时，同源重组发生的几率增高。

如上面所描述的，第四部分DNA序列应该与靶DNA序列的非同源性足够高才能阻止第四部分DNA序列与靶DNA序列发生同源重组。不过一般来说这不是一个问题，因为所选择的阴性选择标记与靶DNA序列基本同源的可能性不大。在任何情况下，第四部分序列与靶DNA序列之间的同源性不应该超过约50％，最好是不超过约30％。

利用标准杂交技术可以初步分析第四部分DNA序列与靶DNA序列之间的非同源性是否足够。例如，用放射性同位素或其他检测标记物标记特定的阴性筛选引物，然后作为探针用Southern印迹法分析靶细胞基因组DNA。在中等严格杂交条件下，如3XSSC，杂交温度约为55℃，如果检测到很低的信号或根本检测不到信号，则说明第四部分序列在DP载体中是有功能的，可用于该细胞类型中的同源重组。但是，即使检测到了信号，也不必然说明特定的第四部分序列不能用于DP载体以转导该基因组。这是因为这部分序列也可能会与基因组上的靶DNA序列不近似的区域杂交。

严格杂交条件也可用于确定一个物种的基因是否可以靶向性插入到另一个物种的相关基因中。例如，初级的基因治疗实验需要用人的基因组序列代替鼠细胞内相关的基因组序列。利用高度严格杂交条件如0.1×SSC，约68℃，进行杂交，在此条件下的信号强度与DP载体第一部分DNA序列和第二部分DNA序列的同源部分的同源性成相关关系。

这种实验可以作为常规来分析各种已知同源性不同的基因组序列。杂交信号的强度与该序列发生重组的几率成相关关系。

本发明的另外一个方面涉及转基因植物或动物的方法，这种转基因植物或动物基因组内的靶DNA序列被修饰，所述方法包括：

用DP载体转化一群胚胎干细胞；

筛选含所述DP载体的细胞来确定具有所述基因组的细胞，分析从筛选中存活下来的细胞的DNA以确定是否发生了修饰；

将细胞移植到胚胎中；

从胚胎繁殖植物或动物；

其中DP载体含有：

能使所述细胞呈现阳性筛选特征的阳性选择标记DNA序列；

DP载体最好包含通过上述转座子介导的方法制备的靶向性构建物。

胚胎干细胞可以来源于任何动物或植物，可以通本领域技术人员熟知的任何方法分离和制备。上面所描述的DP载体是优选的。

本发明的另一个方面涉及用上述方法制备的转基因动物或植物。

通过所附的实施例和附图可以更加完整地描述本发明。但应该理解下面的描述仅仅是以举例的方式说明，并不意味着以任何方式对本发明的一般性作出限制。

实施例

实施例1：利用转座子介导的方法进行序列删除

为了在克隆的基因上删除序列，可以利用以前描述的方法构建两个小-Mu转座子(Haapa等，1999 Nucleic Acid Res.27：2777-2784)。图1显示的是适宜的转座子的构建及其在删除序列中的应用。其中所用的β-geo只是作为一个例子，其他的标记也同样适合。使用小-Mu转座子也仅仅是为了举例说明，其他的转座子也同样可以使用。

小-Mu转座子1的构建过程如下：从Clontech的载体如pEGFP-N1中扩增出原核/真核双启动子(P/P)，将转座子末端插入到其5’端，LoxP位点插入到其3’端。从载体如pACYC184中扩增出氯霉素抗性基因(CAAM^r)，将转座子末端插入到其3’端。前一个PCR产物与后一个PCR产物的5’端连接起来，然后克隆到pUC19的多接头上。在这个转座子中，细菌的启动子可以启动CAM^r基因的表达。

小-Mu转座子2的构建过程如下：从质粒如pBR322中扩增出四环素抗性基因(Tet^r)，将转座子末端插入到其5’端，LoxP位点插入到其3’端。从载体如pβAclβgeo中扩增出无启动子的β-geo基因，将转座子末端插入到其3’端。前一个PCR产物与后一个PCR产物的5’端连接起来，然后克隆到pUC19的多接头上。在这个转座子中，Tet^r基因可在大肠杆菌中表达，β-geo基因以其现在的形式是不表达的。

这个技术的用法在图2中有简要描述。

靶基因可以克隆到pNEB193中，将两个转座子以正确的方向插入到希望的位点上。小-Mu转座子1可以通体外转座作用插入到克隆的基因内，用转座混合物转化大肠杆菌并通过CAM^r筛选。转座子插入片段在物理图谱上位于所选择的第一个删除点上(其方向见图1所示)。小-Mu转座子2插入到克隆载体内，用Tet^r筛选大肠杆菌。转座子插入片段在物理图谱上位于所选择的第二个删除点上(其方向见图1所示)。

将筛选克隆转化表达Cre重组酶的大肠杆菌EAK133株。两个LoxP位点之间的序列被删除，即Cam^r基因和Tet^r基因以及两个转座子之间的一部分靶基因序列。这些细胞可以用Kan^r筛选，在X-Gal存在的情况下呈蓝色，因为小-Mu转座子1上的启动子转而启动geo基因的表达。通过限制性酶切或PCR方法检测Cam^r基因和Tet^r基因是否丢失从而可以判断是否发生了删除。

从载体上切下基因构建子然后克隆到如实施例2所述方法构建的DP载体的两个多接头之间，替代neo^r表达盒。pNEB193上的8-bp的剪切片段可用于此目的，因为该片段与DP载体上的片段一致。这一步骤可以很容易地实现，方法是通过噬菌体λ上的重组位点(att)去除载体之间的基因插入片段，这一重组过程是有克隆酶混合物催化的。这种载体转换系统可用于将pNEB193改变成供体载体以克隆动物的靶基因。同样，DP载体也可以在删除供体载体上的序列后转变成目的载体以亚克隆基因。

尽管体外的转座子系统已经开始使用，但体内的转座子系统还需进一步的改造，因为体内的转座过程是通过细菌的交配完成的。

该系统需要下列组分：1)质粒在载体上的转移起点(oriT)；2)能提供小转座子、转座酶和转移功能的大肠杆菌细胞株，以便含oriT的质粒共转移。首先用含靶基因的载体转化大肠杆菌细胞株，该细胞株与受体株交配后用转座子携带的抗生素抗性标记筛选。该系统已被改造成能通过Tn5插入突变细菌基因的系统(Zhang等，1993 FEMS Microbiol.Lett，108：303-310)。经过两项改造后该系统也可用于本发明。第一，制备反式作用的突变转座酶；第二，两种不同的转座子以消除转座耐受现象。

实施例2：利用DP载体系统进行基因修饰

根据本文所描述的方法和方式，可以用本领域所熟知的任何方法装配DP基因敲除载体。同样，可诱导Cre(或FLP)系统的装配及与该系统相配套的表达此可诱导重组酶的细胞系的制备都是熟悉本领域的人所熟知的(该方法的详细描述通常是由Bujard提供的，见网页http：//www.zmbh.uni-heidelberg.de/bujard/homepage.html)。

对所期望的同源重组事件的筛选是基于靶向性事件和随机事件的区别。靶向性事件中重组发生在靶DNA序列与第一部分DNA序列和第二部分DNA序列之间(图3A；NB三角代表LoxP位点)，结果导致载体两个末端之一的LoxP位点被删除。这样表达标记DNA的细胞经阳性筛选后还能存活。重组酶的诱导及随后的第二轮阳性筛选对靶向性事件没有影响。

而在随机事件中(图3B)，载体的两个末端或其中之一依然保持完整(一般来说如此)，插入到细胞基因组中的两个或三个LoxP位点还保留着。细胞内可诱导重组酶的活化会使选择标记失去功能(这种情况下启动子被删除)，因此经过阳性筛选后细胞就会死亡，被从筛选过程中去除。

在某些环境中，重组事件的效率不高，因此导致对非同源重组事件的排除率相对较低。在这些情况下，通过PCR反应利用引物序列就能检测这些发生几率相对较低的事件。因此，到DP筛选过程的后期细胞依然能在Cre存在的条件下存活，并且允许重组以较低的频率发生，利用LoxP位点最左侧或最右侧引物序列特异性的引物(图3A)和第一或第二部分DNA序列特异性的引物通过PCR反应可以检测这些重组事件。

实施例3：DP载体的构建及靶基因的插入

双阳性选择载体(DP)如图3所显示。实际上，通常是整个载体通过非同源重组形式(随机整合)整合到染色体中，这是该DP载体的基础。这里所用的neo^r标记仅仅是作为一个例子来说明，其他的标记也同样可以使用，其中包括β-geo、超霉素抗性基因、零霉素(zeomycin)、HPRT基因以及GFP。同样，其他的重组系统如FLP/FRT也可用于代替Cre/LoxP。

最终的含靶基因的构建物元件组成顺序如下：引物结合序列-LoxP位点-靶基因的短臂-启动neo^r的启动子-另外一个LoxP位点-neo^r基因-靶基因的长臂-第三个LoxP位点-另外一个引物结合位点(图3D)。在这个载体中，neo^r基因和其启动子之间可以被一个LoxP位点隔开。大家都知道被一个拷贝的LoxP位点隔开启动子和基因不会影响该基因的表达。载体转染以后，被转染的细胞无论发生靶向性事件还是随机事件都对新霉素有抗性(第一阳性筛选)。但是，Cre重组酶表达以后(在pTet-on系统的控制之下，Clontech)，发生靶向性事件的细胞(图3B)还对新霉素有抗性(第二阳性筛选)，但是发生随机事件的细胞(图3C)变得对新霉素敏感，这是因为任意两个LoxP位点之间的序列被删除，从而去除了启动子或neo^r结构基因，或者二者皆被去除。

一般来说所用的DP载体是从pNEB193开始构建的((New England Biolabs)，这个载体是pUC19的衍生物，其多接头上只有一个三8-bp剪切子位点。DP载体的构建过程如下(图3D)。利用一个退火的寡核苷酸序列可以将一个LoxP序列克隆到多接头左侧的EcoR1和Kpn1位点之间，并引入一个Not1位点。同样，利用一个退火的寡核苷酸序列可以将另一个LoxP序列克隆到多接头右侧的Pst1和HindIII位点之间，并引入一个Fse1位点。在转染动物细胞前，用8-bp剪切子的Not1和Fse1限制性酶切位点将载体线性化。通过PCR反应从pCI-noe(Promega)中扩增出neo^r基因(无启动子的)，然后插入到多接头中间的BamH1和Pac1位点之间。最后，从pCL-neo中扩增出CMV增强子/启动子(插入到LoxP位点的3’端)并克隆到neo^r基因的5’端。其他可用的启动子包括PGK的启动子和β珠蛋白的启动子。另外，细胞特异性的启动子也可以使用，只要其能在特异性的细胞系内表达，如雄性精细胞内的精蛋白启动子。每一步都在寡核苷酸中插入了适宜的限制性酶切位点。

在如此构建的新型载体中，可以有两个来源于pNEB193的多接头，二者被neo^r表达盒分开。第一个连接子覆盖8-bp剪切子Asc1的Kpn1和BamH1之间的区域，而另一个连接子覆盖8-bp剪切子(Pac1和Pme1)的Pac1和Pme1之间的区域这两个多接头分别用于克隆靶基因的短臂和长臂。

在本发明的两个系统中，Cre表达的时相对于在动物细胞内的第二轮筛选都是十分重要的(消除发生非同源重组事件的细胞对新霉素的抗性)。可以通过两种途径控制Cre的表达。在转基因和基因敲除实验中，质粒DNA整合进入染色体会产生意外的效应。为了克服这一问题，一般用瞬时表达Cre重组酶来删除LoxP位点两侧的DNA片段。特别是用腺病毒载体表达的Cre酶(Kanegae等，1995；Kaartinen和Nagy，2001)。这些载体很少整合到染色体中，在正常的细胞系内无法复制，因为它们是复制缺陷型的，只能在那些提供复制功能的特定细胞系内复制。而且，其转染效率也比质粒表达载体高的多(腺病毒载体接近100％，而质粒表达载体只有20％)。可以利用任何方法表达Cre，其中包括蛋白质或cDNA的转染，蛋白质或cDNA的微注射。

实施例4：具有两个阳性选择标记的双阳性选择载体的构建

这种载体与图3A所示的DP载体类似，只是前者的neo^r基因后有另外一个LoxP位点和一个无启动子的潮霉素抗性基因(Hyg^r)。这种载体转染的大鼠细胞可用新霉素筛选。发生靶向性事件后，腺病毒载体表达的Cre重组酶会将neo^r基因删除，从而使Hyg^r基因表达，细胞具有了潮霉素抗性。在随机整合事件中，两个外测的LoxP位点还存在，Cre重组酶的表达会使启动子或Hyg^r基因删除，或者二者皆被删除，这样细胞对潮霉素是敏感的。这种DP载体的构建方法如图3D所示，是将一个LoxP-Hyg^r片段插入到neo^r基因后的Pac1位点上。载体显示在图4中

实施例5：用转座子介导的方法制造缺失

a)寡核苷酸引物

扩增用于构建各种转座子的DNA片段的PCR反应所用的引物如下：

Mu1-1：

CTGGGTACCAGATCTGAAGCGGCGCACGAAAAACGCGAAAGCGTTTCACGATAAATGCGAAAACATTCAAATATGTATCCGCTC(SEQ ID NO：1)

Mu1-2：

CTGCCCGGGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCCTGTCTCTTGATCGATCTTTGC(SEQ ID NO：2)

Mu1-3：

CTGGTCGACGCTAAGGAAGCTAAAATGGAG(SEQ ID NO：3)

Mu1-4：

CTGAAGCTTAGATCTGAAGCGGCGCACGAAAAACGCGAAAGCGTTTCACGATAAATGCGAAAACGTCAATTATTACCTCCACG(SEQ ID NO：4)

Mu2-1：

CTGGGTACCAGATCTGAAGCGGCGCACGAAAAACGCGAAAGCGTTTCACGATAAATGCGAAAACTTCTCATGTTTGACAGCTTATC(SEQ ID NO：5)

Mu2-2：

CTGCTCGAGCCGCAAGAATTGATTGGCTCC(SEQ ID NO：6)

Mu2-Neo-1：

CTGCTCGAGATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATAGGAGCCGCCACCATGATTGAACAAGATGGATTGC(SEQ ID NO：7)

Mu2-Neo-2

CTGTCTAGATCTGAAGCGGCGCACGAAAAACGCGAAAGCGTTTCACGATAAATGCGAAAACACACAAAAAACCAACACACAG(SEQ ID NO：8)

Mu2-HygGFP-1：

CTGCTCGAGATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATAGGAGCCGCCACCATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCG(SEQ ID NO：9)

Mu2-HygGFP-2：

CTGAGATCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG(SEQ ID NO：1 0)

Mu2-geo-1：

CTGCTCGAGATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATAGGAGCCGCCACCATGGAAGATCCCGTCGTTTTACACAGTCG(SEQ ID NO：11)

GeoSacBg1Xba：

CTGTCTAGAGAGAGATCTTCTGAGCTCGTTATCGCTATGAC(SEQ IDNO：12)

SacGeo：

CTGGAGCTCCTGCACTGGATGGTG(SEQ ID NO：13)

Mu2-geo-2：

CTGAGATCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGG(SEQ ID NO：14)

Mu2-polyA1：

CTGGGATCCGAGCAGACATGATAAGATAC(SEQ ID NO：15)

Mu2-polyA-2：

CTGTCTAGATCTGAAGCGGCGCACGAAAAACGCGAAAGCGTTTCACGATAAATGCGAAAACTTACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGC(SEQ ID NO：16)

Mu1CamEndOutward：CGTGGAGGTAATAATTGACG(SEQ ID NO：17)

HPRTexon4F：CTTGCACTCACTAGGCAAGC(SEQ ID NO：18)

HPRTexon5F：GGACCCTTCTGAGTTCTAATAAGC(SEQ ID NO：19)

HPRTexon6F：CCACTGCTTGCTTAGAACCAG(SEQ ID NO：20)

HPRTexon7-9F：GTTGCATTTCAGTGTGGGTG(SEQ ID NO：21)

b)PCR.

利用GeneAmp PCR系统2700(Applied Biosystem)进行PCR反应。反应体系为50μl，其中含有模板DNA(10-100ng)、每种dNTP 200μM、每种引物20pmol、Tag DNA多聚酶1.25U，溶于含MgCl₂(Fischer Biotech)的1×PCR缓冲液中。反应进行30个循环，反应条件如下：94℃变性30秒；55℃引物退火30秒；72℃引物延伸150秒。在第一个循环中变性时间延长到150秒，最后一个循环中引物延伸事件延长到570秒。

c)DNA的克隆

通过在引物的5’端加上限制性酶切位点使克隆出来的PCR引物具有这些酶切位点的方法效率并不高(Jung等，Nucleic Acids Res.18：6156，1990)，因此PCR得到的产物首先通过平端连接克隆到载体中(Zhang等，Biochem.Biophys.Res.Commun.242：390-395，1998)。为此需要用Klelow片段处理PCR产物，去除3’末端多聚酶添加的脱氧腺苷酸，方法见Obermaier-Kusser等人(Biochem.Biophys.Res.Commun.169：1007-1015，1990)的描述。然后用凝胶纯化试剂盒(Qiagen)纯化所得到的产物，并将其克隆到用平端限制性内切酶消化的质粒载体中(Zhang等，FEBS Lett.297：34-38，1992)。如果需要的话测定插入片段的序列组成，然后用适当的限制性内切酶和连接酶将其亚克隆到适宜载体中。

d)体外转座

用BglII消化细菌载体，从中切下转座子并用凝胶纯化。体外转座反应体系为20μl，其中含有20ng小-Mu转座子(BglII片段)，400ng靶质粒DNA和0.22μg的MuA转座酶，溶于1×转座缓冲液中。反应在37℃进行1小时，然后在75℃孵育10分钟以灭活转座酶。反应混合物转化大肠杆菌DH5α，或者用电穿孔方法转化大肠杆菌DH10β，转化的细菌用适当的抗生素抗性标记筛选。

1.小-Mu转座子1的构建

用PCR方法从Clontech的载体如pEGFP-N1中扩增出原核/真核双启动子(P/P)，所用的引物为Mu1-1和Mu1-2，将Mu转座子末端插入到其5’端，LoxP位点插入到其3’端。将Kpn1位点和BglII位点引入到其5’端，Sma1位点引入到其3’端。将此产物克隆到pUC9的Sma1位点得到pCO6。用PCR方法从载体pACYC184中扩增出氯霉素抗性基因(Cam^r)，所用的引物为Mu1-3和Mu1-4，将Mu转座子末端插入到其3’端。将hincII位点引入到其5’端，BglII位点和HindIII位点引入到其3’端。将此产物克隆到pUC7的HinII位点之间得到pCO7。用HincII和HindIII消化pCO7将Cam^r插入片段切下，然后克隆到pUC19的HincII和HindIII之间得到pCO9。用KpnI和SmaI消化pCO6将P/P插入片段切下，然后克隆到pCO9的KpnI和HincII之间。这样就完成了小-Mu转座子1的构建，其中含有双启动子P/P和CAM^r，二者之间被一个LoxP序列隔开，整个基因构建物的两侧是转座子末端。携带这种转座子的载体被命名为pCO10(图5)。用BglII消化这个载体可以将转座子切下。

2.小-Mu转座子1的检测

在体外检测小-Mu转座子1(Mu1-Cam)的转座能力，以pUC7为靶DNA，用氯霉素筛选。青霉素平板上长出50个氯霉素抗性克隆，其中13个(26％)对青霉素敏感，说明转座子已经插入到Amp^r基因中并将其灭活了。考虑到Amp^r基因在pUC7上的比例(30％)，说明Mu1在这个质粒上的插入是随机的。这可以用限制性内切酶消化来进一步证明。挑选3个青霉素抗性克隆和3个青霉素敏感克隆分离其质粒DNA。用SspI消化该DNA，这个酶会在pUC7上切一次，在转座子上切两侧。可以观察到不同的电泳图谱(图6)，说明转座子插入到pUC7上的随机性。在图6中，条带1-3显示的是转座子插入到Amp^r中的pUC7，条带4-6显示的是转座子插入到Amp^r之外的pUC7。

3.小-Mu转座子2的构建

总共构建了三种不同版本的小-Mu转座子2。三种版本的5’端是一样的，都是转座子末端和细菌四环素抗性基因(Tet^r)。其构建过程如下：用PCR方法从pBR322中扩增出四环素抗性基因(Tet^r)，所用的引物为Mu2-1和Mu2-2，将KpnI-BglII-转座子末端引入到其5’端，XhoI引入到其3’端。将此产物克隆到pNEB193的HincII位点得到pCO19。三种不同版本的小-Mu转座子2的构建过程分别如下：

a)Mu2-neo。这个转座子含有新霉素抗性基因(neo^r)，位于Tet^r基因的下游。用PCR方法从pCI-neo(Promega)中扩增出neo^r基因，所用的引物为Mu2-Neo-1和Mu2-Neo-2，将XhoI-LoxP引入到其5’端，转座子末端-BglII-XbaI引入到其3’端。将此产物克隆到pNEB193的HincII位点上，这样插入子上的XhoI位点朝向载体的KpnI位点，形成载体pCO18。用KpnI和XhoI消化pCO19，将切下的片段插入到pCO18的KpnI和XhoI之间。携带转座子Mu2-Neo的载体被命名为pCO20(图7)。

b)Mu2-HygEGFP。这个转座子含有潮霉素抗性基因-EGFP融合基因(HygEGFP)，位于Tet^r基因的下游。从pHygEGFP(Clontech)中扩增出HygEGFP的编码区，所用的引物为Mu2-HygEGFP-1和Mu2-HygEGFP-2，将XhoI-LoxP引入到其5’端，BglII引入到其3’端。将此产物克隆到pNEB193的HincII位点得到pCO15。从同一个质粒中扩增出含SV40多聚A信号的序列，所用的引物为Mu2-polyA-1和Mu2-polyA-2，将BamHI引入到其5’端，转座子末端-BglII-XbaI引入到其3’端。将此产物也克隆到pNEB193的HincII位点得到pCO16。用BamHI和XbaI将多聚A片段从载体上切下然后克隆到pCO15的BglII和XbaI位点上得到pCO21。含有多聚A的HygEGFP基因用XhoI和XbaI切下来，然后克隆到pCO19的XhoI和Xbal位点之间携带转座子Mu2-HygEGFP的载体被命名为pCO25(图8)。

c)Mu-2-β-geo。这个转座子含有β-半乳糖苷酶-新霉素抗性融合基因(β-geo)，位于Tet^r基因的下游。由于β-geo基因的编码区有4kb，以现有的PCR条件无法扩增出来，因此分为两个片段来扩增，然后利用基因中间的SacI位点将其连接起来。该基因的5’部分从pHβAclβgeo(E.Stanley，Pers.Comuun.)中扩增，所用的引物为Mu2-geo-1和GeoSacBglXba，将XhoI-LoxP引入到其5’端，BglII-XbaI位点引入到天然SacI位点后的3’端。将此产物通过平端连接克隆到pNEB193的HincII位点(得到pCO22)，然后再用PacI和PmeI将其克隆到pCO4(这个载体不含有SacI位点，见下)中(形成pCO40)。β-geo基因的3’部分用引物SacGeo和Mu2-geo-2扩增，其5’端为天然的SacI位点，将BglII位点引入到其3’端。将此产物克隆到pUC7的HincII位点得到pCO13。含多聚A信号的BglII片段从pCO16中被切下后克隆到pCO13的BglII位点上得到pCO41。用SacI和BglII切下geo2：多聚A部分，然后克隆到pCO40的SacI和BglII位点上得到pCO42。这个构建物再用XhoI和XbaI消化然后克隆到pCO19的XhoI和XbaI位点上。这个携带转座子Mu-β-geo的载体被命名为pCO43(图9)。

实施例6：转座子介导的大鼠HPRT基因突变

从PAC克隆中扩增出一个含大鼠HPRT基因外显子3的一部分和外显子4-9的24kb片段(见图10)，然后克隆到pNEB193的SalI位点上，形成pCO28。这个克隆作为小-Mu转座子1转座的靶位，用氯霉素筛选。用寡核苷酸Mu1CamEndOutward和四个引物中的一个作为PCR的引物，该寡核苷酸位于小-Mu转座子1的末端朝向3’端，这四个引物分别为HPRTexon4F，HPRTexon5F，HPRTexon6F，HPRTexon7-9F。取49个Cam^r克隆进行筛选，其中只有1-3号克隆扩增出了PCR产物，每个产物的大小都在1kb以内，即2-6％。在27kb质粒(包括载体)的一个方向上转座子插入到1kb区域内的可能性预计为2％。考虑到筛选的克隆数量较少，因此所得到的百分率是可以接受的。图10中的三角代表了转座子插入的大概位置，箭头代表了Cam^r基因的转录方向。这是所希望的转座子插入方向，小-Mu2-Neo转座也是类似的。

实施例7：DP载体的构建和靶基因的插入

a)寡核苷酸：

Oligo1：

AATTGCGGCCGCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATGGTAC(SEQ ID NO：22)

Oligo2：

CATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGCGGCCGC(SEQ ID NO：23)

Oligo3：

GATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATGGCCGGCC(SEQ ID NO：24)

Oligo4：

AGCTGGCCGGCCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATC TGCA(SEQ ID NO：25)

OligoNeo1：CTGGGATCCGCCGCCACCATGATTGAACAAGATGGATTGC(SEQ ID NO：26)

OligoNeo2：CTGTTAATTAACACACAAAAAACCAACACACAG(SEQ ID NO：27)

OligoCMVProm1：CTGGGATCCTCAATATTGGCCATTAGCC(SEQ ID NO：28)

OligoCMVProm2：

CTGAGATCTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGATCTGACGGTTCACTAAACG

(SEQ ID NO：29)

OligoPGKProm1：CTGGGATCCTACCGGGTAGGGGAGGCG(SEQ ID NO：30)

OligoPGKProm2：CTGAGATCTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGTCGAAAGGCCCGGAGATGAG(SEQ ID NO：31)

b)PCR和克隆

PCR的方法与上面实施例5所描述的方法基本一致，只是作了如下的修改。当需要将两个寡核苷酸解链和克隆时，每种引物加50pmol，混合后终体积为10μl，在95℃变性5分钟。变性后使样品在PCR仪内缓慢冷却到室温。用两个酶消化载体，得到不同的末端，然后将变性的寡核苷酸克隆到载体中。

1.DP载体的构建

构建了两个不同版本的DP载体，一个含有CMV启动子，另一个含有PGK启动子，二者都启动Neo的表达。将oligo1和oligo2退火变性后克隆到pNEB193的EcoRI和KpnI位点上，得到pCO3。这一插入引入了一个NotI位点和一个LoxP序列，但同时破坏了EcoRI位点。将oligo3和oligo4退火变性后克隆到pCO3的PstI和HindIII位点上，得到pCO4。这一插入引入了一个FseI位点和一个LoxP序列，但同时破坏了HindIII位点。利用引物OligoNeo1和OligoNeo2从pCI-neo中扩增出新霉素抗性基因(neo^r)然后克隆到pUC7的HincII位点上，形成pCO2。然后用BamHI和PacI将neo基因切下并克隆到pCO4的BamHI和PacI位点上，得到pCO5。利用引物OligoCMVProm1和OligoCMVProm2从pCI-neo中扩增出CMV启动子，然后克隆到pUC7的HincII位点上，形成pCO1。同样，利用引物OligoPGKProm1和OligoPGKProm2从pKO Scrambler NTKY-1906中扩增出PGK启动子，然后克隆到pUC7的HincII位点上，形成pCO12。用BamHI和BglII分别将这两个启动子从其载体上切下，然后克隆到pCO5的BamHI位点上，分别得到两个版本的DP载体。含有CMV启动子的DP载体被命名为pCO8，含有PGK启动子的DP载体被命名为pCO14(图11)。

2.在大肠杆菌中测试DP载体

将领个DP载体，pCO8和pCO14转化到能表达Cre重组酶的大肠杆菌细胞株中。提取质粒DNA，用NotI消化使其线性化。在图12中，条带1和2是pCO8，而条带3和4是pCO14。根据质粒(2.7kb)的大小进行判断，新霉素抗性基因和启动子都被删除了。这说明这些载体中LoxP位点两侧的序列可以通过重组被有效删除。

实施例8：含有两个阳性选择标记的双阳性选择载体的构建

a)寡核苷酸引物：

PvulLoxHyg：

CTGCGATCGATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATGCCGCCACCATGAAAAAGCCTG(SEQ ID NO：32)

HygPacl：CTGTTAATTAAGATCTATAGATCATGAGTGG(SEQ ID NO：33)

b)PCR和克隆

操作方法与实施例5和6所描述的一样。

1.DP载体的构建

利用引物PvulLoxHyg和HygPacl从PGKHyg中扩增出潮霉素抗性基因(Hyg^r)，将PvuI位点和一个LoxP序列引入其5’端，PacI位点引入其3’端。将PCR产物克隆到pNEB193的HincII位点上，得到pCO17。先用PacI完全消化，再用PvuI部分消化(因为基因内部有一个PvuI位点)，将Hyg^r基因切下，然后克隆到两个版本的DP载体(pCO8和pCO14)的PacI位点上，分别得到pCO26(CMV启动子)和pCO27(PGK启动子)。

实施例9：大鼠HPRT基因敲除载体的构建

a)寡核苷酸引物：

HPRTexon7-9F：GTTGCATTTCAGTGTGGGTG(SEQ ID NO：34)

HPRTexon7-9R：AGGCTGCCTACAGGCTCATA(SEQ ID NO：35)

为了验证DP载体，用大鼠的HPRT基因作为敲除的靶位。利用引物HPRTexon7-9F和HPRTexon7-9R从PAC克隆中扩增出HPRT的短臂，然后将其插入到pUC7的HincII位点上，得到pCO30。插入片段用BamHI切下然后克隆到两个DP载体pCO14和pCO27的BamHI位点上，分别得到pCO33和pCO34。为了比较这些载体与传统的阳性/阴性选择载体的基因打靶效率，将HPRT基因的短臂也克隆到pKO Scrambler NTKY-1906的BamHI位点上，形成pCO32。所选择的长臂是一个8.8kb的XhoI片段，包含内含子1-外显子3。这个片段是从PAC克隆上扩增的，然后分别插入到pCO33的SalI位点(形成pCO38)、pCO34的SalI位点(形成pCO39)和pCO32的XhoI位点(形成pCO44)。这三个靶向性构建物都在图14中用示意图进行了说明(图未按比例来画)。

实施例10：含floxedβ-geo的载体的构建

a)引物：

Kpn-geo-1：

CTGGGTACCGCCGCCACCATGGAAGATCCCGTCGTTTTACAACGTCG(SEQ ID NO：36)

GeoSacBglXba：

CTGTCTAGAGAGAGATCTTCTGAGCTCGTTATCGCTATGAC(SEQ ID NO：37)

Kpn-PGK-1：CTGGGTACCACCGGGTAGGGGAGGCG(SEQ ID NO：38)

MuEndEcoSwaPGK-2：CTGGGTACCGTCGAAAGGCCCGGAGATGAG(SEQ ID NO：39)

Mu2-polyA1：CTGGGATCCGAGCAGACATGATAAGATAC(SEQ ID NO：40)

polyA-R：CTGAGATCTGGTACCTTACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGC(SEQ ID NO：41)

为了检测LoxP重组在哺乳动物细胞内的效应，构建了一个含β-geo的载体，β-geo两侧是LoxP位点。将载体整合到大鼠细胞的基因组内，然后转染瞬时表达Cre重组酶的腺病毒载体。通过X-Gal染色来测定丢失β-geo基因的细胞所占的百分数，这个百分数就可以代表Cre介导的LoxP重组的效率。

1.靶向性载体的构建

构建方法与实施例5所描述的小-Mu-β-geo构建方法一样。β-geo基因分为两个片段来扩增，然后利用基因中间的SacI位点将其连接起来。用引物Kpn-geo-1和GeoSacBglXba扩增该基因的5’部分，将KpnI引入到其5’端，BglII-XbaI位点引入到天然SacI位点后的3’端。将此产物通过平端连接克隆到pNEB193的HincII位点(得到pCO45)，然后再用KpnI和XbaI将其克隆到pCO4(这个载体的LoxP两侧有多接头)中(形成pCO46)。用引物Kpn-PGK-1和MuEndEcoSwaPGK-2扩增出PGK启动子，在启动子的每个末端都引入一个KpnI位点，然后利用平端连接将此PCR产物插入到pNEB193的HincII位点上形成pCO47。插入片段用KpnI切下后克隆到pCO46的KpnI位点上形成pCO48。用引物Mu-polyA-1和polyA-R从pHygEGFP中扩增出含多聚A信号的序列，在其5’短引入BamHI位点，在其3’端引入KpnI-BglII位点。将该产物克隆到pNEB193的HincII位点上得到pCO49。将此多聚A插入片段用BamHI和BglII切下并克隆到pCO13的BglII位点上得到pCO50。用SacI和BglII消化pCO50将geo2：多聚A部分切下，然后克隆到pCO48的SacI-BglII位点上，得到pCO51(图15)。

实施例11：Southern方法验证HPRT敲除的设计方案

a)引物：

HPRTSouthern1 GTACTCTGTAGTCCAGGCTG(SEQ ID NO：42)

HPRTSouthern2 CAAGTCTTTCAGTCCTGCAG(SEQ ID NO：43)

HPRTSouthern3 GAATAGTCTAAAGCGCTCAG(SEQ ID NO：44)

HPRTSouthern4 GCTAAGAGAAAGCCATGTTCTC(SEQ ID NO：45)

根据上述三个HPRT靶向性载体的结构，设计一种Southern杂交方法来验证HPRT基因是否被敲除。这个方法显示在图16中(该图并没有按照比例来强调长臂和短臂的排列)。

用引物HPRTSouthern1和HPRTSouthern2扩增出一个404bp的HPRT基因片段(左侧的黑色正方形代表该片段的位置)，然后将其克隆到pUC7的BamHI位点上，得到pCO51。

如果用其作为探针，可以与野生型基因组的一个3kb的SphI片段杂交。对于PD-Neo、PD-Neo-Hyg和pKO产生的基因敲除来说，杂交片段的大小分别为2.4kb、3.8kb和2kb。

用引物HPRTSouthern3和HPRTSouthern4扩增出一个414bp的HPRT基因片段(右侧的黑色正方形代表该片段的位置)，然后将其克隆到pUC7的BamHI位点上，得到pCO52。

如果用其作为探针，可以与野生型基因组的一个5.5kb的PstI片段杂交。对于PD-Neo、PD-Neo-Hyg和pKO产生的基因敲除来说，杂交片段的大小分别为2.7kb、2.2kb和2.5kb。

总之，应该理解的是只要不脱离本文所描述的本发明的精神，可以对本发明作出各种修改和/或改变。

Claims

1.一种用于靶向性载体的靶向性构建物的制备方法，其特征在于，所述靶向性载体能修饰靶DNA序列，所述方法包括以下步骤：

在体外获得一个靶DNA序列的拷贝；

将含有转座子序列和DNA重组序列的DNA序列插入到靶DNA序列拷贝的一个位点上；

将含有转座子序列和DNA重组序列的另一DNA序列插入到靶DNA序列拷贝的另一个位点上；以及

诱导所述重组序列之间的重组事件以删除一部分靶DNA序列的拷贝。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述插入的DNA序列包含一个小转座子。

3.如权利要求2所述的方法，其中，所述转座子选自Mu1-Cam、Mu2-Neo、Mu2-Hyg EGFP和Mu2-β-geo。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述重组序列选自受重组酶影响的LoxP和反向重复序列(FRT)。

5.如权利要求4所述的方法，其中，所述重组酶选自Cre、FLP或重组酶的整合酶家族。

6.如权利要求5所述的方法，其中，所述重组酶的整合酶家族选自Gln、Hin或解离酶。

7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述重组事件是由Cre-LoxP重组酶系统介导的。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述转座子序列包含选择标记和启动子序列。

9.如权利要求8所述的方法，其中，所述选择标记选自抗生素抗性标记或酶标记。

10.如权利要求9所述的方法，其中，所述抗生素抗性标记选自氯霉素、四环素或新霉素抗性基因。

11.如权利要求9所述的方法，其中，所述酶标记是β-geo标记。

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，所述含有转座子的DNA序列被依次插入靶DNA。

13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中，所述重组事件是由Tet-on系统或ecdysine诱导系统诱导完成的。

14.一种用于在靶DNA序列上制造缺失的前靶向性构建物，所述构建物包含：

靶DNA序列的一个拷贝；和

至少两个转座子单元，每个都含有一个重组序列；且

其中所述转座子单元被插入并定位在靶DNA拷贝内，从而在重组序列进行重组时删除部分靶DNA拷贝。

15.如权利要求14所述的前靶向性构建物，其中，所述转座子单元是小-mu转座子单元。

16.如权利要求14或15所述的前靶向性构建物，其中，所述转座子单元选自Mu1-Cam、Mu2-Neo、Mu2-Hyg EGFP和Mu2-β-geo。

17.如权利要求14-16中任一项所述的前靶向性构建物，其中，所述重组序列选自受重组酶影响的LoxP和反向重复序列(FRT)。

18.如权利要求17所述的前靶向性构建物，其中，所述重组酶选自Cre、FLP或重组酶的整合酶家族，其中包括Gln、Hin或解离酶。

19.如权利要求18所述的前靶向性构建物，其中，所述整合酶家族选自Gln、Hin或解离酶。

20.如权利要求14-19中任一项所述的前靶向性构建物，其中，所述重组事件是由Cre-LoxP重组酶系统介导的。

21.如权利要求14-20中任一项所述的前靶向性构建物，其中，所述转座子单元包含选择标记。

22.如权利要求21所述的前靶向性构建物，其中，所述选择标记选自抗生素抗性标记或酶标记。

23.如权利要求22所述的前靶向性构建物，其中，所述抗生素抗性标记选自氯霉素、四环素、新霉素抗性基因或β-geo标记。

24.一种按照权利要求1-13中任一项所述方法制备的靶向性构建物。

25.一种用于修饰细胞基因组内靶DNA序列的双阳性(DP)载体，所述DP载体包含：

能使所述细胞呈现阳性筛选特征的阳性选择标记DNA序列；

26.如权利要求25所述DP的载体，其中，所述第一和第二同源载体DNA序列含有部分DNA，该部分与靶DNA的第一区和第二区的相应部分基本同源。

27.如权利要求25或26所述DP的载体，其中，所述第一和第二同源载体DNA序列在严格杂交条件下与靶DNA的第一区和第二区杂交。

28.如权利要求25-27中任一项所述的DP载体，其中，所述第一和第二同源载体DNA序列没有序列多态性。

29.如权利要求25-28中任一项所述的DP载体，其中，所述阳性筛选标记选自抗性基因、荧光标记或生物发光标记。

30.如权利要求25-29中任一项所述的DP载体，其中，所述阳性选择标记位于第一部分DNA序列和第二部分DNA序列之间。

31.如权利要求25-30中任一项所述的DP载体，其中，所述第三部分序列选自受重组酶影响的LoxP或反向重复序列(FRT)。

32.如权利要求31所述DP的载体，其中，所述重组酶选自Cre、FLP或重组酶的整合酶家族，其中包括Gln、Hin或解离酶。

33.如权利要求32所述DP的载体，其中，所述重组酶的整合酶家族选自Gln、Hin或解离酶。

34.如权利要求25-33中任一项所述的DP载体，其中，当启动子序列在细胞内活化时第三部分序列的插入不会打断阳性选择标记基因的表达。

35.如权利要求34所述DP的载体，其中，所述第三部分序列插入到启动子和选择标记基因的编码区之间。

36.如如权利要求25-35中任一项所述的DP载体，其中，所述第四部分序列是重组序列。

37.如权利要求36所述DP的载体，其中，当第三部分序列分别是LoxP或FRT时，重组序列选自LoxP或FRT。

38.如权利要求36或37所述DP的载体，其中，所述第四部分序列还含有一个作为PCR引物位点或备选重组位点的DNA区域。

39.如权利要求25-38中任一项所述的DP载体，该载体还含有一个选择标记，该标记与所述阳性选择标记相同或不同。

40.如权利要求39所述DP的载体，其中，所述选择标记两侧还有位点特异性重组序列，该序列受重组酶的影响。

41.如权利要求40所述DP的载体，其中，所述重组序列是LoxP或FRT。

42.如权利要求39所述DP载体，该载体包含至少两个选择标记，其中一个标记是无启动子的标记，另一个标记受启动子影响。

43.如权利要求42所述DP的载体，其中，所述无启动子的标记是潮霉素抗性标记(Hygr)。

44.一种含有权利要求24所述靶向性构建物的载体。

45.一种富集转化细胞的方法，所述细胞基因组内的靶DNA序列被修饰，该方法包括：

能使所述细胞呈现阳性筛选特征的阳性选择标记DNA序列；

46.如权利要求45所述的方法，其中，对转化细胞的筛选由Cre-LoxP重组酶系统介导。

47.一种用权利要求45或46所述方法制备的转化细胞。

48.一种在细胞基因组中诱导修饰的方法，其特征在于，所述方法包括：

用DP选择载体转染能介导同源重组的细胞，所述载体包含：

能使所述细胞呈现阳性筛选特征的阳性选择标记DNA序列；

49.如权利要求48所述的方法，其中，所述阳性选择标记位于要被打断或修饰的基因的外显子内。

50.如权利要求48或49所述的方法，其中，所述细胞选自脊椎动物、丝状真菌和植物来源的细胞，脊椎动物包括哺乳动物。

51.如权利要求50所述的方法，其中，所述细胞是哺乳动物细胞。

52.如权利要求51所述的方法，其中，所述细胞选自胚胎、神经、上皮、肝、肺、肌肉、内皮、间质或骨的干细胞。

53.如权利要求48-51中任一项所述的方法，其中，所述DP载体通过电穿孔或微注射转染。

54.一种制造转基因植物或动物的方法，所述转基因植物或动物的基因组内的靶DNA序列被修饰，所述方法包括：

用DP载体转化一群胚胎干细胞；

通过筛选含所述DP载体的细胞来确定具有所述基因组的细胞，并分析在筛选中存活下来的细胞的DNA以确定是否发生了修饰；

将细胞移植到胚胎中；

从胚胎繁殖植物或动物；

其中所述DP载体包含：

能使所述细胞呈现阳性筛选特征的阳性选择标记DNA序列；

55.一种用权利要求54所述方法制备的动物。

56.一种用权利要求54所述方法制备的植物。