CN1696302A - 一种生产普鲁兰多糖的发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产普鲁兰多糖的发酵方法。本发明方法为将液体种子接入发酵培养基中，发酵初始培养基，其水溶液组成为(wt％)：蔗糖或DE值为40－60的淀粉水解物3.0－5.0，精制氮源0.2－0.5，磷酸二氢钾0.2－1.0，硫酸铵0.1－0.5，硫酸镁0.1－1.0，发酵复加溶液20－50，pH值6.0－6.2，接种量为5％－10％，温度为29℃±1℃，通气量为0.5－1.0(V/V)，罐压为0.01－0.02MPa，发酵进行到16小时进行补加碳源，每隔8－12小时流加一次，流加5－7次碳源后，再继续发酵16－56小时。本发明通过精制氮源替代普通氮源来提高发酵得率，同时控制发酵时间生产不同平均分子量的普鲁兰多糖。
Description
技术领域
本发明涉及工业生物技术领域，更具体地说，是涉及一种生产普鲁兰多糖的新发酵方法。
背景技术
早在1936年就发现了普鲁兰多糖(pulullan)，后来用液体培养出芽短梗霉并分离出普鲁兰多糖。一直到六十年代，人们才开始对其进行发酵、提取和应用等方面的研究，1978年日本林原公司实现工业化生产普鲁兰多糖。普鲁兰是由出芽短梗霉(Aureobasidium pulullans)利用糖质化合物为基质进行好气发酵生产的胞外多糖，基本结构是由α-1，6-糖苷键连接的聚麦芽三糖，其分子量为几千到上百万。它无色、无味、无毒，在水中有极好的溶解性，有很好的粘接性能和成膜成纤维性能，制成的膜透气性很低，因此，在医药、食品、轻工、化工等许多领域有着广泛的应用前景。目前国内外用于普鲁兰生产的菌种均为出芽短梗霉，在以葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖、糖蜜、蔗糖、淀粉及淀粉水解物为碳源；酵母膏、玉米浆为有机氮源，进行发酵，发酵时间一般在120-156小时左右，产物得率20％上下，普鲁兰多糖平均分子量一般在2-20万之间。林原公司工业化生产的商品普鲁兰多糖平均分子量为20万。通常发酵产物分子量大时，得率较低，发酵时间较长。发酵产物分子量小时，得率较高，发酵时间短。但小分子量的产物，无论是粘连性、成膜性和成纤维性均差，其应用受到限制。
发明内容
本发明的目的在于通过精制氮源替代普通氮源来提高发酵得率，同时控制发酵时间生产不同平均分子量的普鲁兰多糖。以获得其粘连性、成膜性和成纤维性等性状不同的普鲁兰多糖，来解决生产和应用的问题。
本发明生产普鲁兰多糖的发酵方法，通过下述步骤予以实现，
a.准备种子培养基，其水溶液组成为(wt％)：蔗糖2.0-4.0，精制氮源0.2，磷酸二氢钾0.1-0.8，硫酸铵0.1-0.5，硫酸镁0.1-1.0，PH值6.0-6.2，121℃灭菌，25分钟；
b.取出芽短梗霉菌种接在上述种子培养基中，经一级种子、二级种子、种子罐逐步扩大培养后，作为液体种子；
c.准备发酵初始培养基，其水溶液组成为(wt％)：蔗糖或DE值为40-60的淀粉水解物3.0-5.0，精制氮源0.2-0.5，磷酸二氢钾0.2-1.0，硫酸铵0.1-0.5，硫酸镁0.1-1.0，发酵复加溶液20-50，PH值6.0-6.2，121℃灭菌，25分钟；
d.将上述液体种子接入所述发酵培养基中，接种量为5％-10％，发酵搅拌速度为200-300转/分钟，温度为29℃±1℃，通气量为0.5-1.0(V/V)，罐压为0.01-0.02Mpa；
e.在发酵进行到16小时进行补加碳源，每隔8-12小时流加一次，流加体积为发酵体积的2％，流加液为含有蔗糖或DE值为40-60的淀粉水解物30-50％、尿素或氨水0.5-1.0％的水溶液；
f.连续流加5-7次碳源后，再继续发酵16-56小时；
g.将上述发酵液得到的普鲁兰多糖溶液通过分子量3000-4000道尔顿的陶瓷膜进行膜分离，得到分子量3000-4000以上的普鲁兰多糖。
本发明精制氮源通过下述步骤得到：将玉米浆或酵母膏稀释5-10倍，调节PH值至6-7之间，80-90℃保持30-45分钟，然后冷却至常温，用管式离心机于12000-15000转/分钟下对上述物料离心，取离心液。在温度为30-50℃的条件下选用截留分子量3000-6000道尔顿的陶瓷膜进行膜分离，取分离液作为精制氮源进行发酵。
本发明最后的发酵液膜分离后分子量3000-4000以下的通过去离子、脱色后得到发酵复加溶液用于配制发酵初始培养基。
本发明与以往其他技术相比发酵时间明显缩短，发酵时间为80-120小时，提高了生产强度，产物得率也有较大提高，发酵结束产物得率在35％以上，产物平均分子量可根据发酵时间来选择，所获得的普鲁兰多糖平均分子量在20-60万道尔顿之间。更重要的是发酵液充分重复利用不但节省了原料投入总量，提高产物得率；而且解决了发酵液废水排放问题，避免了环境污染。
具体实施方式
实施例1
将玉米浆或酵母膏稀释5倍，调节PH值至6-7之间，80-90℃保持30分钟，然后冷却至常温，用管式离心机于12000转/分钟下对上述物料离心，取离心液。在温度为30℃的条件下选用截留分子量3000-6000道尔顿的陶瓷膜进行膜分离，取分离液作为精制氮源。
(1)取一环出芽短梗霉菌种接在装有100毫升种子培养基的500毫升三角瓶中。摇瓶种子培养基组成每升为(L)：蔗糖30g，精制氮源2g，磷酸二氢钾5g，硫酸铵2.5g，硫酸镁3g，PH值6.0，121℃灭菌，25分钟，摇瓶于30℃，转速为180转/分钟的摇床上培养36小时，作为一级种子液。
(2)取10毫升一级种子液接入装有100毫升种子培养基的500毫升三角瓶中。摇瓶种子培养基组成同(1)。121℃灭菌，25分钟，摇瓶于30℃，转速为180转/分钟的摇床上培养36小时，作为二级种子液。
(3)按7.5％的接种量将摇瓶种子接入50升发酵罐中。在50升发酵罐中加入32升种子培养基并接入二级种子液2.4升，其组成每升为(L)：蔗糖30g，精制氮源2g，磷酸二氢钾5g，硫酸铵2.5g，硫酸镁3g，PH值6.0，121℃灭菌，25分钟。于29℃±1℃，通气量0.7(V/V)，罐压0.01MPa，搅拌速度250转/分钟条件下发酵16小时。
(4)在500升发酵罐内加入320升发酵培养基，其组成每升为(L)：蔗糖30g，精致氮源3g，磷酸二氢钾5g，硫酸铵3g，硫酸镁4g，发酵复加溶液300mL，PH值6.1，121℃灭菌，25分钟。按10％接种量将32升种子罐培养好的种子接入，发酵搅拌速度为前8小时为200转/分钟，8-16小时为300转/分钟，16小时以后为250转/分钟，温度为29℃±1℃，通气量为前16小时0.5(V/V)，16小时以后为1.0(V/V)，罐压为0.02MPa条件下发酵。发酵到16小时开始每隔8小时流加6.4升的含有50％的蔗糖和1％的尿素水溶液，到发酵64小时时流加结束，继续发酵到80小时结束。由发酵液得到的普鲁兰多糖溶液通过分子量3000-4000道尔顿的陶瓷膜进行膜分离，产物得率36.6％，产物平均分子量20万道尔顿。
实施例2
将玉米浆或酵母膏稀释8倍，调节PH值至6-7之间，80-90℃保持40分钟，然后冷却至常温，用管式离心机于13000转/分钟下对上述物料离心，取离心液。在温度为30-50℃的条件下选用截留分子量3000-6000道尔顿的陶瓷膜进行膜分离，取分离液作为精制氮源进行发酵。
(1)取一环出芽短梗霉菌种接在装有100毫升种子培养基的500毫升三角瓶中。摇瓶种子培养基组成每升为(L)：蔗糖20g，精制氮源2g，磷酸二氢钾1g，硫酸铵1g，硫酸镁1g，PH值6.0，121℃灭菌，25分钟，摇瓶于30℃，转速为180转/分钟的摇床上培养36小时，作为一级种子液。
(2)取10毫升一级种子液接入装有100毫升种子培养基的500毫升三角瓶中。摇瓶种子培养基组成同(1)。121℃灭菌，25分钟，摇瓶于30℃，转速为180转/分钟的摇床上培养36小时，作为二级种子液。
(3)按7.5％的接种量将摇瓶种子接入50升发酵罐中。在50升发酵罐中加入32升种子培养基并接入二级种子液2.4升，其组成每升为(L)：蔗糖30g，精制氮源2g，磷酸二氢钾5g，硫酸铵2.5g，硫酸镁3g，，PH值6.1，121℃灭菌，25分钟。于29℃±1℃，通气量0.7(V/V)，罐压0.01MPa，搅拌速度250转/分钟条件下发酵16小时。
(4)在500升发酵罐内加入320升发酵培养基，其组成每升为(L)：蔗糖30g，精致氮源2g，磷酸二氢钾2g，硫酸铵1g，硫酸镁1g，发酵复加溶液400mL，PH值6.0，121℃灭菌，25分钟.按10％接种量将32升种子罐培养好的种子接入，发酵搅拌速度为前8小时为200转/分钟，8-16小时为300转/分钟，16小时以后为250转/分钟，温度为29℃±1℃，通气量为前16小时0.5(V/V)，16小时以后为1.0(V/V)，罐压为0.02MPa条件下发酵。发酵到16小时开始每隔8小时流加6.4升的含有50％的蔗糖和1％的尿素水溶液，到发酵64小时时流加结束，继续发酵到104小时结束。由发酵液得到的普鲁兰多糖溶液通过分子量3000-4000道尔顿的陶瓷膜进行膜分离，产物得率37.8％，产物平均分子量35万道尔顿。
实施例3
将玉米浆或酵母膏稀释7倍，调节PH值至6-7之间，80-90℃保持45分钟，然后冷却至常温，用管式离心机于14000转/分钟下对上述物料离心，取离心液。在温度为50℃的条件下选用截留分子量3000-6000道尔顿的陶瓷膜进行膜分离，取分离液作为精制氮源进行发酵。
(1)取一环出芽短梗霉菌种接在装有100毫升种子培养基的500毫升三角瓶中。摇瓶种子培养基组成每升为(L)：蔗糖40g，精制氮源2g，磷酸二氢钾8g，硫酸铵5g，硫酸镁10g，PH值6.2，121℃灭菌，25分钟，摇瓶于30℃，转速为180转/分钟的摇床上培养36小时，作为一级种子液。
(2)取10毫升一级种子液接入装有100毫升种子培养基的500毫升三角瓶中。摇瓶种子培养基组成同(1)。121℃灭菌，25分钟，摇瓶于30℃，转速为180转/分钟的摇床上培养36小时，作为二级种子液。
(3)按7.5％的接种量将摇瓶种子接入50升发酵罐中。在50升发酵罐中加入32升种子培养基并接入二级种子液2.4升，其组成每升为(L)：蔗糖30g，精制氮源2g，磷酸二氢钾5g，硫酸铵2.5g，硫酸镁3g，，PH值6.0，121℃灭菌，25分钟。于29℃±1℃，通气量0.7(V/V)，罐压0.01MPa，搅拌速度250转/分钟条件下发酵16小时。
(4)在500升发酵罐内加入320升发酵培养基，其组成每升为(L)：蔗糖50g，精致氮源5g，磷酸二氢钾10g，硫酸铵5g，硫酸镁10g，发酵复加溶液500mL，PH值6.0，121℃灭菌，25分钟。按10％接种量将32升种子罐培养好的种子接入，发酵搅拌速度为前8小时为200转/分钟，8-16小时为300转/分钟，16小时以后为250转/分钟，温度为29℃±1℃，通气量为前16小时0.5(V/V)，16小时以后为1.0(V/V)，罐压为0.02MPa条件下发酵。发酵到16小时开始每隔12小时流加10升的含有33％的蔗糖和0.6％的尿素水溶液，到发酵76小时时流加结束，继续发酵到120小时结束。由发酵液得到的普鲁兰多糖溶液通过分子量3000-4000道尔顿的陶瓷膜进行膜分离，产物得率38.0％，产物平均分子量55万道尔顿。
实施例4
将玉米浆或酵母膏稀释9倍，调节PH值至6-7之间，80-90℃保持45分钟，然后冷却至常温，用管式离心机于15000转/分钟下对上述物料离心，取离心液。在温度为45℃的条件下选用截留分子量3000-6000道尔顿的陶瓷膜进行膜分离，取分离液作为精制氮源进行发酵。
(1)取一环出芽短梗霉菌种接在装有100毫升种子培养基的500毫升三角瓶中。摇瓶种子培养基组成每升为(L)：DE值为40-60的淀粉水解物30g，精制氮源2g，磷酸二氢钾5g，硫酸铵2.5g，硫酸镁3g，PH值6.0，121℃灭菌，25分钟，摇瓶于30℃，转速为180转/分钟的摇床上培养36小时，作为一级种子液。
(2)取10毫升一级种子液接入装有100毫升种子培养基的500毫升三角瓶中。摇瓶种子培养基组成同(1)。121℃灭菌，25分钟，摇瓶于30℃，转速为180转/分钟的摇床上培养36小时，作为二级种子液。
(3)按10％的接种量将摇瓶种子接入50升发酵罐中。在50升发酵罐中加入32升种子培养基并接入二级种子液3.2升，其组成每升为(L)：DE值为40-60的淀粉水解物30g，精制氮源2g，磷酸二氢钾5g，硫酸铵2.5g，硫酸镁3g，，PH值6.1，121℃灭菌，25分钟。于29℃±1℃，通气量0.7(V/V)，罐压0.01MPa，搅拌速度250转/分钟条件下发酵16小时。
(4)在500升发酵罐内加入320升发酵培养基，其组成每升为(L)：DE值为40-60的淀粉水解物30g，精致氮源3g，磷酸二氢钾5g，硫酸铵3g，硫酸镁4g，发酵复加溶液300mL，PH值6.0，121℃灭菌，25分钟。按8％接种量将25.6升种子罐培养好的种子接入，发酵搅拌速度为前8小时为200转/分钟，8-16小时为300转/分钟，16小时以后为250转/分钟，温度为29℃±1℃，通气量为前16小时0.5(V/V)，16小时以后为1.0(V/V)，罐压为0.02MPa条件下发酵。发酵到16小时开始每隔8小时流加6.4升的含有50％的DE值为40-60的淀粉水解物和1％的尿素水溶液，到发酵64小时时流加结束，继续发酵到80小时结束。由发酵液得到的普鲁兰多糖溶液通过分子量3000-4000道尔顿的陶瓷膜进行膜分离，产物得率35.8％，产物平均分子量23万道尔顿。
实施例5
将玉米浆或酵母膏稀释6倍，调节PH值至6-7之间，80-90℃保持35分钟，然后冷却至常温，用管式离心机于14000转/分钟下对上述物料离心，取离心液。在温度为50℃的条件下选用截留分子量3000-6000道尔顿的陶瓷膜进行膜分离，取分离液作为精制氮源进行发酵。
(1)取一环出芽短梗霉菌种接在装有100毫升种子培养基的500毫升三角瓶中。摇瓶种子培养基组成每升为(L)：DE值为40-60的淀粉水解物30g，精制氮源2g，磷酸二氢钾5g，硫酸铵2.5g，硫酸镁3g，PH值6.0，121℃灭菌，25分钟，摇瓶于30℃，转速为180转/分钟的摇床上培养36小时，作为一级种子液。
(2)取10毫升一级种子液接入装有100毫升种子培养基的500毫升三角瓶中。摇瓶种子培养基组成同(1)。121℃灭菌，25分钟，摇瓶于30℃，转速为180转/分钟的摇床上培养36小时，作为二级种子液。
(3)按10％的接种量将摇瓶种子接入50升发酵罐中。在50升发酵罐中加入32升种子培养基并接入二级种子液3.2升，其组成每升为(L)：DE值为40-60的淀粉水解物30g，精制氮源2g，磷酸二氢钾5g，硫酸铵2.5g，硫酸镁3g，，PH值6.0，121℃灭菌，25分钟。于29℃±1℃，通气量0.7(V/V)，罐压0.01MPa，搅拌速度250转/分钟条件下发酵16小时。
(4)在500升发酵罐内加入320升发酵培养基，其组成每升为(L)：DE值为40-60的淀粉水解物30g，精致氮源3g，磷酸二氢钾5g，硫酸铵3g，硫酸镁4g，发酵复加溶液400mL，PH值6.2，121℃灭菌，25分钟。按5％接种量将16升种子罐培养好的种子接入，发酵搅拌速度为前8小时为200转/分钟，8-16小时为300转/分钟，16小时以后为250转/分钟，温度为29℃±1℃，通气量为前16小时0.5(V/V)，16小时以后为1.0(V/V)，罐压为0.02MPa条件下发酵。发酵到16小时开始每隔8小时流加6.4升的含有50％的DE值为40-60的淀粉水解物和1％的尿素水溶液，到发酵64小时流加结束，继续发酵到104小时结束。由发酵液得到的普鲁兰多糖溶液通过分子量3000-4000道尔顿的陶瓷膜进行膜分离，产物得率36.2％，产物平均分子量38万道尔顿。
实施例6
将玉米浆或酵母膏稀释10倍，调节PH值至6-7之间，80-90℃保持40分钟，然后冷却至常温，用管式离心机于13000转/分钟下对上述物料离心，取离心液。在温度为30-50℃的条件下选用截留分子量3000-6000道尔顿的陶瓷膜进行膜分离，取分离液作为精制氮源进行发酵。
(1)取一环出芽短梗霉菌种接在装有100毫升种子培养基的500毫升三角瓶中。摇瓶种子培养基(L)：DE值为40-60的淀粉水解物30g，精制氮源2g，磷酸二氢钾5g，硫酸铵2.5g，硫酸镁3g，，PH值6.2，121℃灭菌，25分钟，摇瓶于30℃，转速为180转/分钟的摇床上培养36小时，作为一级种子液。
(2)取10毫升一级种子液接入装有100毫升种子培养基的500毫升三角瓶中。摇瓶种子培养基组成同(1)。121℃灭菌，25分钟，摇瓶于30℃，转速为180转/分钟的摇床上培养36小时，作为二级种子液。
(3)按10％的接种量将摇瓶种子接入50升发酵罐中。在50升发酵罐中加入32升种子培养基并接入二级种子液3.2升，其组成每升为(L)：DE值为40-60的淀粉水解物30g，精制氮源2g，磷酸二氢钾5g，硫酸铵2.5g，硫酸镁3g，，PH值6.2，121℃灭菌，25分钟。于29℃±1℃，通气量0.7(V/V)，罐压0.01MPa，搅拌速度250转/分钟条件下发酵16小时。
(4)在500升发酵罐内加入320升发酵培养基，其组成每升为(L)：DE值为40-60的淀粉水解物30g，精致氮源3g，磷酸二氢钾5g，硫酸铵3g，硫酸镁4g，发酵复加溶液500mL，PH值6.0，121℃灭菌，25分钟。按10％接种量将32升种子罐培养好的种子接入，发酵搅拌速度为前8小时为200转/分钟，8-16小时为300转/分钟，16小时以后为250转/分钟，温度为29℃±1℃，通气量为前16小时0.5(V/V)，16小时以后为1.0(V/V)，罐压为0.02MPa条件下发酵。发酵到16小时开始每隔12小时流加10升的含有3300g的DE值为40-60的淀粉水解物和60g的尿素水溶液，到发酵76小时时流加结束，继续发酵到120小时结束。由发酵液得到的普鲁兰多糖溶液通过分子量3000-4000道尔顿的陶瓷膜进行膜分离，产物得率37.1％，产物平均分子量58万道尔顿。
Claims (3)
1.一种生产普鲁兰多糖的发酵方法，其特征是，包括下述步骤：
(1)准备种子培养基，其水溶液组成为(wt％)：蔗糖2.0-4.0，精制氮源0.2，磷酸二氢钾0.1-0.8，硫酸铵0.1-0.5，硫酸镁0.1-1.0，PH值6.0-6.2，于121℃灭菌25分钟；
(2)出芽短梗霉菌种接在上述种子培养基中，经一级种子、二级种子、种子罐逐步扩大培养后，作为液体种子；
(3)准备发酵初始培养基，其水溶液组成为(wt％)：蔗糖或DE值为40-60的淀粉水解物3.0-5.0，精制氮源0.2-0.5，磷酸二氢钾0.2-1.0，硫酸铵0.1-0.5，硫酸镁0.1-1.0，发酵复加溶液20-50，PH值6.0-6.2；
(4)上述液体种子接入所述发酵培养基中，接种量为5％-10％，发酵搅拌速度为200-300转/分钟，温度为29℃±1℃，通气量为0.5-1.0(V/V)，罐压为0.01-0.02Mpa；
(5)发酵进行到16小时进行补加碳源，每隔8-12小时流加一次，流加体积为发酵体积的2％，流加液为含有蔗糖或DE值为40-60的淀粉水解物30-50％、尿素或氨水0.5-1.0％的水溶液；
(6)续流加5-7次碳源后，再继续发酵16-56小时；
(7)上述发酵液得到的普鲁兰多糖溶液通过分子量3000-4000道尔顿的陶瓷膜进行膜分离，得到分子量3000-4000以上的普鲁兰多糖。
2.根据权利要求1所述的一种生产普鲁兰多糖的发酵方法，其特征是，所述精制氮源通过下述步骤得到：将玉米浆或酵母膏稀释5-10倍，调节PH值至6-7之间，80-90℃保持30-45分钟，然后冷却至常温，用管式离心机于12000-15000转/分钟下对上述物料离心，取离心液。在温度为30-50℃的条件下选用截留分子量3000-6000道尔顿的陶瓷膜进行膜分离，取分离液作为精制氮源进行发酵。
3.根据权利要求1所述的一种生产普鲁兰多糖的发酵方法，其特征是，所述步骤(7)中膜分离后分子量3000-4000以下的通过去离子、脱色后得到发酵复加溶液用于配制发酵初始培养基。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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2005
- 2005-05-13 CN CN 200510013501 patent/CN1696302A/zh active Pending
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