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CN1681505A - 用于治疗白血病的а ) N－{ 5－[ 4－( 4－甲基－哌嗪－1－基－甲基)－苯甲酰氨基]－2－甲基苯基}－4－( 3－吡啶基 ) －2－嘧啶－胺和b )组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的组合 - Google Patents

用于治疗白血病的а ) N－{ 5－[ 4－( 4－甲基－哌嗪－1－基－甲基)－苯甲酰氨基]－2－甲基苯基}－4－( 3－吡啶基 ) －2－嘧啶－胺和b )组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的组合 Download PDF

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CN1681505A CNA038217635A CN03821763A CN1681505A CN 1681505 A CN1681505 A CN 1681505A CN A038217635 A CNA038217635 A CN A038217635A CN 03821763 A CN03821763 A CN 03821763A CN 1681505 A CN1681505 A CN 1681505A
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S·格兰特
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Abstract

本发明涉及一种用于同时、独立或相继应用来治疗白血病，尤其是对N－{5－[4－(4－甲基－哌嗪－1－基－甲基)－苯甲酰氨基]－2－甲基苯基}－4－(3－吡啶基)－2－嘧啶有抗药性的白血病的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂和N－{5－[4－(4－甲基－哌嗪－1－基－甲基)－苯甲酰氨基]－2－甲基苯基}－4－(3－吡啶基)－2－嘧啶或其可药用的盐的组合。

Description

用于治疗白血病的a)N-{5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基-甲基)-苯甲酰氨基]-2-甲基 苯基}-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶-胺和b)组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的组合
本发明涉及一种组合，其包含用于同时、独立或相继应用，例如用于治疗白血病的(a)至少一种组蛋白脱乙酰基酶抑制剂和(b)N-{5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基-甲基)-苯甲酰氨基]-2-甲基苯基}-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶-胺(在下文被称为化合物I)或其可药用的盐，以及任选的至少一种可药用载体；一种对患有白血病的温血动物，尤其是人进行治疗的方法，其包括以治疗白血病的联合治疗有效量给该动物施用(a)至少一种组蛋白脱乙酰基酶抑制剂和(b)化合物I；包含该类组合的药物组合物；(a)和(b)的组合用于制备治疗白血病或延迟白血病进程的药物的应用；以及包含用于同时、独立或相继应用的联合制剂形式的(a)和(b)的该类组合的商业包装或产品。
慢性髓细胞性白血病(CML)代表一种同源的原始造血干细胞病症，其导致了成熟能力受损的祖细胞的逐渐累积。从病理生理学观点来看，CML的发展代表了Bcr/Abl致癌基因表达的后果，所说的基因编码了在95％患有该疾病的患者细胞中所发现的融合蛋白。该Bcr/Abl酪氨酸激酶的组成活化赋予了造血细胞生存优势，有助于白血病转化。除保护造血细胞不受某些有害环境刺激的影响(例如，生长因子丧失)外，该Bcr/Abl激酶的表达使得细胞对由细胞毒性药物诱导的细胞凋亡比较不敏感。目前在CML细胞中负责细胞凋亡抗性的Bcl/Abl的下游途径还不确定。但是，已经推断在这种现象中涉及多重信号/存活途径，其中包括NFk-B、Stat5、MEK/MAP激酶、Bcl-xL和Akt失调。
最近，已经通过引入化合物I——一种可以抑制Bcr/Abl、c-Kit、PDGF和其它激酶的口服有效的酪氨酸激酶抑制剂对CML的治疗产生了革命性影响。化合物I在体外干扰了Bcr/Abl-阳性白血病细胞中细胞的生长并诱导了细胞凋亡。将化合物I口服给药于CML患者在＞90％的患者中产生了显著的临床响应。但是，化合物I在开始对这种物质有反应的CML患者中出现抗药性以及在加速期CML或原始细胞危象的患者中观察到对化合物I的反应性差的结果促使人们进行寻找治疗这种疾病的另外的方法的研究。
对化合物I的抗药性的机理包括药物吸收减少、Bcr/Abl扩增和Bcr/Abl激酶结构域突变等等。解决这一问题的一种可能方法包括将化合物I与表现出抗白血病活性的其它物质组合。在这点上，已经描述了当将化合物I与常规的细胞毒性药物、三氧化二砷、格尔德霉素或肿瘤坏死因子细胞凋亡-诱导配体(TRAIL)联用时对Bcr/Abl+白血病细胞的活性增加。最近，已经对化合物I和药理学MEK1/2抑制剂，例如PD184351、U0126或细胞周期蛋白-依赖性激酶抑制剂flavopiridol在Bcr/Abl+细胞(包括那些由于Bcr/Abl蛋白表达增加而对化合物I具有抗药性的细胞)中的协同作用进行了描述。
组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDI)，包括曲古抑菌素A、丁酸钠、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、缩肽、MS-275和aphicidin等等，代表了一类可以通过促进组蛋白乙酰化从而使得染色质结构松弛来起作用的新型物质。染色质松弛和解螺旋使得可以表达不同的基因，包括在分化过程中所涉及的那些基因，例如p21CIP1。实际上，已经表明HDI，例如SAHA、丁酸钠可以在各种人白血病细胞系中诱导成熟。在一些情况中，HDI诱导了细胞凋亡而不是人白血病细胞的成熟，但是决定哪一个响应占优势的因素仍然不清楚。HDI还诱导了某些Bcr/Abl+白血病细胞，例如K562的成熟——一种与MAP激酶途径活化作用减弱有关的现象。
化合物I可以改变Bcr/Abl+细胞的分化响应并且令人吃惊地发现将化合物I与HDI相结合可能会促进成熟或者改变白血病细胞存活。为了对这一问题进行探求，对化合物I与临床相关的HDI，即，丁酸钠和SAHA之间的相互作用进行研究。在一些CML细胞系例如K562、LAMA 84中，将HDI与化合物I共同给药使得多重信号途径瓦解、诱导线粒体损伤和细胞凋亡显著加强。此外，这种药物组合在表现出Bcr/Abl表达增加的对化合物I有抗药性的Bcr/Abl+细胞中有效地诱导了细胞死亡。这些结果一起表明，将化合物I与临床相关的HDI相结合的策略确保了CML和相关恶性血液学肿瘤中需要考虑的事项。
组蛋白可逆的乙酰化是一种通过改变转录因子对DNA的可及性而起作用的基因表达的主要调节剂。在正常的细胞中，组蛋白脱乙酰基酶(HDA)和组蛋白乙酰转移酶一起控制组蛋白的乙酰化水平从而维持一种平衡。HAD的抑制导致了过乙酰化组蛋白的蓄积，从而产生了各种细胞响应。
已经对HDA抑制剂对癌细胞的治疗作用进行了研究。例如，已经报道了包括苯丁酸钠在内的丁酸以及其衍生物在体外在人结肠癌、白血病和成视网膜细胞瘤细胞系中诱导了细胞凋亡。但是，因为其易于被代谢的趋势并且体内半衰期很短，所以丁酸以及其衍生物不是有用的药理学物质。已经对其抗癌活性进行了广泛研究的其它HDA抑制剂有曲古抑菌素A和Trapoxin。曲古抑菌素A是一种杀真菌剂和抗生素，并且是一种可逆的哺乳动物HAD抑制剂。Trapoxin是一种环状四肽，其是一种不可逆的哺乳动物HAD抑制剂。虽然已经对曲古抑菌素和Trapoxin的抗癌活性进行了研究，但是这些化合物在体内的不稳定性使其不适于作为抗癌药。仍然需要适于治疗肿瘤，包括癌性肿瘤的高效和稳定的活性化合物。
现在已经令人吃惊地发现，在治疗白血病时，包含(a)至少一种组蛋白脱乙酰基酶抑制剂和(b)化合物I或其可药用的盐的组合的作用高于仅使用该组合伴侣中的任何一种类型所得到的作用，即高于仅使用这里所定义的组合伴侣(a)和(b)中的一种进行的单一疗法的作用。
本发明涉及一种用于同时、独立或相继应用的组合，如一种联合制剂或药物的固定组合，所说的组合包含协同有效量的(a)至少一种组蛋白脱乙酰基酶抑制剂和(b)化合物I或其可药用的盐、以及任选的至少一种可药用的载体，其中活性成分在各种情况中以游离形式或可药用盐的形式存在。
在第一个实施方案中，本发明涉及一种对患有白血病的温血动物进行治疗的方法，其包括给所说的动物以对抗白血病的联合治疗有效量施用(a)至少一种组蛋白脱乙酰基酶抑制剂和(b)化合物I。
这里所用的术语“白血病”非限制性地包括慢性髓细胞性白血病(CML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)，尤其是费城-染色体阳性的急性淋巴细胞白血病(Ph+ALL)。用这里所公开的方法治疗的白血病的变型优选地是CML以及对化合物I有抗药性的白血病、对化合物I有抗药性的Bcr/Abl+白血病。
这里所用的术语“对化合物I有抗药性的白血病”尤其定义的是其中化合物I或其可药用盐表现出治疗作用降低的白血病，其非限制性地包括由于Bcr/Abl基因扩增、Bcr/Abl蛋白表达增加和Abl激酶结构域突变而对化合物I的治疗表现出抗药性的白血病。
这里所用的术语“治疗”包括给需要该类治疗的温血动物，优选人施用该组合伴侣以治愈疾病或取得疾病消退作用或延迟疾病进程的作用。
这里所用的术语“进程的延迟”指的是疾病的进程至少被该治疗减慢或阻碍并且与未进行治疗或进行单一治疗的患者相比患者在存活率方面有所改善。
组合伴侣(a)化合物I是式I的N-{5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基-甲基)-苯甲酰氨基]-2-甲基苯基}-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶-胺
Figure A0382176300071
(I)，在本发明中，化合物I优选地是以其单甲磺酸盐的形式被应用的。可以如WO 99/03854所述的那样来制备化合物I并将其给药，尤其是可以如WO 99/03854的实施例4和6所述的那样来制备N-{5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基-甲基)-苯甲酰氨基]-2-甲基苯基}-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶-胺的单甲磺酸盐。化合物I可以以由GLIVECTM或GLEEVECTM的商标市售的形式来进行给药。术语“化合物I”包括其所有可药用的盐并且还可以以水合物的形式进行应用或者包括结晶形式，例如α和β结晶形式，如于2000年5月10日公开的EP 998 473中所述的形式。
这里所用的术语“组蛋白脱乙酰基酶抑制剂”非限制性地包括丁酸钠、MS-275(以前称为MS-27-275)、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、aphacidin、缩肽、FK228(以前称为FR901228)、曲古抑菌素A和以NOVARTIS AG的名义提交的国际专利申请WO 01/38322(优先权日：1999年11月23日)和WO 02/22577(优先权日2000年9月1日)中所公开的化合物，所说的专利申请在这里被引入作为参考。特别是游离形式或可药用盐形式的式II的化合物II(优选地是其乳酸盐形式)
Figure A0382176300081
和
游离形式或其可药用盐形式的式III的化合物III。
在于2002年3月21日公开的以NOVARTIS AG的名义提交的国际专利申请WO 02/22577的实施例P2中具体公开了化合物II。
在于2002年3月21日公开的以NOVARTIS AG的名义提交的国际专利申请WO 02/22577的实施例200中具体公开了化合物III。化合物III是其游离形式或可药用盐的形式。
可以从标准摘要“默克索引(The Merck Index)”的现行版本或从数据库，例如国际专利(例如IMS国际公布)中得到由代码、属名或商品名所确定的活性物质的结构。其相应内容在这里被引入作为参考。
本发明涉及一种组合，如一种联合制剂或药物组合物，其包含用于同时、独立或相继应用的(a)化合物I或其可药用的盐，尤其是其单甲磺酸盐形式，和(b)至少一种选自丁酸钠、MS-275(之前被称为MS-27-275)、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、aphacidin、缩肽、FK228(之前被称为FR901228)、曲古抑菌素A、化合物II和化合物III的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，其中活性成分在各种情况中以游离形式或可药用盐的形式存在，并且该组合任选地包含至少一种可药用的载体。
本发明涉及一种组合，如一种联合制剂或药物组合物，其包含用于同时、独立或相继应用的(a)化合物I或其可药用的盐，尤其是其单甲磺酸盐的形式，和(b)至少一种选自丁酸钠、MS-275(之前被称为MS-27-275)、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、aphacidin、缩肽、FK228(之前被称为FR901 228)、化合物II和化合物III的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，其中活性成分在各种情况中以游离形式或其可药用盐的形式存在，并且该组合任选地包含至少一种可药用的载体。
当在本发明的组合中所用的组合伴侣以市售的单一药物进行应用时，如果在这里没有另外提及，则其给药剂量和给药方式可以根据各市售药物包装说明书上所提供的信息来进行以产生这里所述的有益作用。
以上所列举专利的终产品、药物制剂和权利要求的主题在这里被引入作为参考。同样包括其中所公开的相应立体异构体以及相应晶体变型，例如溶剂化物和多晶型。如果没有特别提及，则在这里所公开的组合中用作活性成分的化合物可以分别如所列举的文件中所述的那样来进行制备和给药。
应当清楚的是，涉及组合伴侣(a)和(b)时还意味着包括可药用的盐。如果这些组合伴侣(a)和(b)具有，例如，至少一个碱性中心，其可以形成酸加成盐。如果需要的话，还可以形成具有另外存在的碱性中心的相应的酸加成盐。该具有酸性基团(例如COOH)的组合伴侣(a)和(b)还可以与碱形成盐。该组合伴侣(a)或(b)或其可药用的盐还可以以水合物的形式使用或者包括用于结晶的其它溶剂。
这里所用的术语“联合制剂”尤其定义的是“成套的药盒(kit-of-parts)”，它的意思是指例如，上面所定义的组合伴侣(a)和(b)可以独立地给药或者可以通过使用具有不同量组合伴侣(a)和(b)的不同固定组合来进行给药，即，可以同时给药或在不同的时间点进行给药。成套药盒的各部分可例如同时施用或按时间顺序交错施用，也就是说在不同时间点以相同或不同的时间间隔施用成套药盒的任何部分。特别优选所选择的时间间隔可以使各部分的联合应用对所治疗疾病的效果大于仅使用该组合伴侣(a)和(b)中的任何一种所获得的效果。在联合制剂中用于进行给药的组合伴侣(a)与组合伴侣(b)的总量的比例可以进行变化，例如，为了符合所治疗的患者亚人群的需要或单个患者的需要(这些患者由于年龄、性别、体重等的不同而具有不同的需要)而进行变化。优选至少可以获得一种有益效果，例如组合伴侣(a)和(b)的作用相互增强，特别是具有协同作用，例如高于相加的作用、额外增加的有利作用、较少的副作用、增强效力的作用，即以组合伴侣(a)和(b)中一种或两种的非有效剂量获得联合治疗效果，并且十分优选组合伴侣(a)和(b)具有强的协同作用。
在本发明的一个实施方案中，用一种包含作为组合伴侣的(a)化合物I和(b)选自丁酸钠、MS-275(之前被称为MS-27-275)、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、aphacidin、缩肽、FK228(之前被称为FR901228)、曲古抑菌素A、SAHA、化合物II和化合物III的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的组合对白血病、特别是对化合物I有抗药性的白血病进行治疗。该组蛋白脱乙酰基酶抑制剂优选地选自丁酸钠、SAHA、化合物II和化合物III。
包含(a)化合物I或其可药用的盐，尤其是其单甲磺酸盐的形式，和(b)选自丁酸钠、MS-275(之前被称为MS-27-275)、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、aphacidin、缩肽、FK228(之前被称为FR901228)、曲古抑菌素A，优选选自SAHA、丁酸钠、化合物II和化合物III的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(其中在各种情况中活性成分以游离形式或可药用盐的形式存在)、以及任选的至少一种可药用的载体的组合在下文中将被称为本发明的组合。
包含(a)化合物I或其可药用的盐，尤其是其单甲磺酸盐形式，和(b)选自丁酸钠、MS-275(之前被称为MS-27-275)、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、aphacidin、缩肽、FK228(之前被称为FR901228)，优选选自SAHA、丁酸钠、化合物II和化合物III的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(其中在各种情况中活性成分以游离形式或可药用盐的形式存在)、以及任选的至少一种可药用的载体的组合在下文将被称为本发明的组合。
本发明的组合抑制了白血病例如CML、对化合物I有抗药性的白血病的发展。在本发明的一个实施方案中，用本发明的组合进行治疗的增殖性疾病是白血病，尤其是Bcr/Abl+白血病并且优选对化合物I有抗药性的白血病。
更令人吃惊的是，经实验发现，与仅使用本发明组合中所用药学活性成分中的一种的单一治疗相比，本发明组合的体内给药不仅产生了更有益的作用，尤其是协同作用，例如抗增生作用，例如就延迟增殖性疾病进程或改变肿瘤体积而言的作用，而且还产生了令人吃惊的有益作用，例如副作用较少和死亡率以及发病率降低。本发明的组合特别适用于治疗难以用称为抗癌剂的化疗剂进行治疗的增殖性疾病或难以用化合物I进行治疗的增殖性疾病。
一种另外的益处是本发明的组合可以使用更低的活性成分剂量，例如，该剂量不仅常常更低，而且使用的频率也更低，或者可以用于减少副作用如例如可以减少单独使用该组合伴侣中的一种时所观察到的腹泻或恶心的发生率。其与被治疗患者的要求和需要相一致。
通过所确定的试验模型可以证实，本发明的组合产生了上文所描述的有益作用。相关领域的普通技术人员完全能选择相关的试验模型来证明该类有益作用。例如可以用临床研究或基本如下文所述的试验方法来证明本发明组合的药理学活性。
适宜的临床研究特别是用患有晚期疾病的癌症患者进行的随机、双盲、安慰剂对照的平行研究。该类研究特别适用于将使用活性成分进行的单一治疗和使用本发明的组合进行的治疗的作用进行比较，并且特别适于证明本发明的组合的活性成分的协同作用。该类研究中的主要终点可以是对疼痛得分、止痛剂应用、行为状态、生命质量得分或到疾病发展的时间的影响。通过规律的时间周期，例如每隔4、6或8周对肿瘤进行评估是一种确定本发明的组合的作用的适宜方法。
本发明的一个目的是提供一种包含治疗增殖性疾病联合有效量的本发明组合的药物组合物。在这种组合物中，组合伴侣(a)和(b)可以可以以一种联合的单位剂型的形式或以两个独立的单位剂型的形式一起给药、一个接一个的给药或者独立给药。该单位剂型还可以是一种固定组合。
本发明的药物组合物可以用本身已知的方法来进行制备并且适于肠内给药如口服或直肠给药、或胃肠外给药于包括人在内的哺乳动物(温血动物)，其可仅包含治疗有效量的至少一种药理学活性的组合伴侣或可以还包含一种或多种可药用的载体，尤其是适于肠内或胃肠外给药的载体。在本发明的一个实施方案中，可以将一种或多种活性成分静脉内给药。
例如，该新型药物组合物可包含约10％至约100％，优选约20％至约60％所说的活性成分。用于进行肠内或胃肠外给药的联合治疗的药物制剂是，例如，单位剂型如糖衣片、片剂、胶囊或栓剂，并且还可以是安瓿剂。如果没有特定提及，则其可以用本身已知的方法来进行制备，例如可以通过常规混合、制粒、包糖衣、溶解或冷冻干燥方法来进行制备。应当意识到在各剂型的各剂量中所包含的组合伴侣的单位含量本身不一定构成有效量，这是因为可以通过使用多个剂量单位来达到所必需的有效量。
本发明组合的各组合伴侣的治疗有效量特别是可以同时或以任何次序相继给药，并且所说的组分可以独立给药或以固定组合的形式进行给药。例如，本发明延迟增殖性疾病的进程或对增殖性疾病进行治疗的方法可以包括(i)施用游离或可药用盐形式的第一种组合伴侣和(ii)施用游离或可药用盐形式的第二种组合伴侣，(i)和(ii)可以同时进行或以任何次序相继进行，其是以联合治疗有效量，优选以协同有效量，例如以与这里所述的量相一致的日剂量进行的。在治疗过程中，本发明组合的各组合伴侣可以以分割或单一组合形式在不同的时间点独立给药或同时给药。此外，术语给药还包括使用在体内可以转化成该类组合伴侣的组合伴侣的前体药物。因此，本发明应被理解为包含所有该类同时或交替治疗方案并且术语“给药”也具有相应解释。
本发明的组合中所用各组合伴侣的有效剂量可以根据所用的特定化合物或药物组合物、给药方式、被治疗的病症、被治疗病症的严重程度而变化。因此，可以根据包括给药途径和患者的肾和肝功能在内的各种因素来对本发明组合的剂量方案进行选择。普通的医师、临床医师或兽医可以容易地决定和给出用于预防、反转或抑制疾病进程所需单个活性成分的有效量。获得位于可产生效力而不会产生毒性范围内的活性成分浓度的最佳精度需要一种以靶部位对活性成分利用度的动力学为基础的方案。这需要考虑活性成分的分布、平衡和消除。
119.5mg化合物I单甲磺酸盐相当于100mg作为活性物质的化合物I(游离碱)。根据种属、年龄、个体情况、给药方式以及所讨论的临床现象，将例如相当于约50至1000mg的每日剂量、例如50至800mg的活性物质，优选50至600mg，例如50至400mg的有效量的化合物I给药于约70kg体重的温血动物。对于患有白血病的成人患者而言，推荐每天400mg的起始剂量。对于被评估为用400mg每天治疗后响应不足的患者而言，可以考虑安全地增加剂量并且只要其可以从治疗受益并且不存在限制治疗的毒性，患者就可以继续进行治疗。
本发明还涉及一种给患有白血病的人类个体施用本发明的组合的方法，其中将药学有效量的化合物I或其可药用的盐在超过3个月的时期内每天给药于所说的人类个体。本发明尤其涉及其中被给药活性物质的日剂量为50至800mg，尤其是50至600mg，例如50至400mg的该类方法。
当本发明的组合中所用的组合伴侣以市售单一药物的形式进行应用时，如果没有特别提及，则可以根据各市售药物包装传单上所提供的信息来进行给药以产生这里所述的有益作用。
本发明的组合可以是联合制剂或药物组合物。
此外，本发明还涉及一种对患有白血病的温血动物进行治疗的方法，其包括以对增殖性疾病联合治疗有效量给所说的动物施用本发明的组合并且其中所说的组合伴侣还可以以其可药用盐的形式存在。在本发明的一个实施方案中，在该类方法中将本发明的组合与止泻剂一起给药。此外，该治疗还可以包含手术、放疗、冷疗法和免疫疗法。
本发明还涉及一种抑制患有白血病的温血动物形成转移瘤的方法，其包括给该患者施用药学有效量的本发明的组合，所说的有效量可以联合对所说的白血病进行有效治疗，并且其中所说的化合物还可以以其可药用盐的形式存在。
本发明涉及本发明的组合用于治疗白血病，例如对化合物I有抗药性的白血病的应用以及用于制备治疗白血病的药物的应用。
此外，本发明还涉及化合物I或其可药用的盐相结合用于制备治疗白血病的药物的应用。
此外，本发明还提供了一种包含作为活性成分的本发明的组合以及说明用于同时、单独或相继用其来治疗白血病，例如CML、对化合物I有抗药性的白血病的说明的商品化包装。
本发明优选地涉及一种对患有增殖性疾病，优选Bcr/Abl+人髓细胞性白血病的温血动物进行治疗的方法，其包括给所说的动物施用包含对所说的增殖性疾病联合治疗有效量的(a)化合物I，尤其是其单甲磺酸盐形式，和(b)选自SAHA、丁酸钠、化合物II和化合物III的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的组合，其中所说的化合物可以以其可药用盐的形式存在。
本发明优选地涉及包含(a)化合物I或其可药用的盐，尤其是其单甲磺酸盐的形式，和(b)选自SAHA、丁酸钠、如本文中所述的化合物II和化合物III的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的组合用于制备治疗增殖性疾病、优选Bcr/Abl+人髓细胞性白血病、最优选对化合物I有抗药性的Bcr/Abl+人髓细胞性白血病的药物的应用。
实施例1：
材料和方法
细胞：K562、HL60、Jurkat和U937人白血病细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD。LAMA 84细胞购自德国微生物和细胞培养物保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)(Braunschweig，Germany)。将所有的细胞在补加了丙酮酸钠、MEM必需维生素、L-谷氨酸盐、青霉素、链霉素和10％热灭活FCS(Hyclone，Logan，UT)的RPMI 1640中进行培养。将其维持在37℃，5％CO2，完全潮湿的培养器中，每周传代两次，并且当在对数期生长(细胞密度≤4×105细胞/ml)时制备用于试验方法的物质。
多重耐药的K562R细胞按照文献中的描述(Yanovich等人，Cancer Res1989，49：4499-4503)通过在逐渐增加的阿霉素浓度下传代培养而由亲本母系获得。在所有的试验操作之前将其在不存在阿霉素的情况下进行培养。此外，通过将LAM 84细胞在逐渐升高的化合物I浓度下进行培养来产生被称为LAMA 84-R的对化合物I有抗药性的LAMA 84细胞。将这些细胞在所选择的压力下维持在包含0.5μM化合物I的培养基中。化合物I对于LAMA-S-571和LAMA-R-571的I.C.50值分别为0.3和1.8μM。对于涉及LAMA 84-R系的研究而言，将细胞洗去药物并在实验前48小时将其重新混悬于不含药物的培养基中。
试剂：将化合物I在无菌DMSO(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)中制备成的10mM储备液形式。丁酸钠和SAHA由Calbiochem，San Diego，CA提供；BOC-fmk和IETD-fmk购自Enzyme Products，Ltd.，Livermore，CA，并且在使用前在无菌DMSO中对其进行配制。
实验形式：将对数生长期的细胞放到无菌的塑料T-烧瓶(Corning，Corning，NY)中，向其中加入所指定的药物并将该烧瓶放回到培养器中放置一定时间。在培养结束时，将细胞转移到无菌离心管中，通过在室温下在400xg下离心10分钟来使其成团，并且如下所述进行制备以用于分析。
细胞凋亡的评估：按照文献中的描述(Yu等人，Nat.Rev.Cancer1：294-202)，在与药物进行接触后，将细胞离心制备物用Wright-Giemsa染色并通过光学显微镜观察来对细胞凋亡(即，细胞皱缩、核聚集、形成凋落小体等等)的程度进行评估。对于这些研究而言，通过在各种情况中一式三份地对≥500个细胞进行评估来测定细胞凋亡细胞的百分比。为了确认形态学分析的结果，使用膜联蛋白V/PI染色。细胞死亡的膜联蛋白V/PI(BDPharMingen，San Diego，CA)分析是根据制造商的指导来进行的。在涉及TNF和TNF可溶性受体的研究中，将两种化合物相联合并在使用前将其在室温下维持30分钟。对于这些实验而言，每一种情况收获1-2×105个细胞。用Becton-Dickinson FACScan细胞荧光计(Mansfield，MA)来进行分析。为了确认该形态学结果，使用TUNEL染色法。对于TUNEL染色法而言，获得细胞离心制备物并将其用4％甲醛固定。将载玻片用醋酸/乙醇(1∶2)进行处理，用包含1×末端转移酶反应缓冲液(0.25个单位/μl末端转移酶，2.5mM CoCl2，和2pmol荧光素-12-dUTP；Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)的末端转移酶反应混合物来染色，并用荧光显微镜来进行目测检验。
MMP(ΔΨm)的测定：用DiOC6[36]来对MMP进行监测。对于各种情况而言，将4×105个细胞在37℃下在1ml 40nM DiOC6(Calbiochem)中培养15分钟，随后，用分别具有488和525nM的激发和发射装置的Becton DickinsonFACScan细胞荧光计对其进行分析。通过使细胞与5μM氨基甲酰基氰化物间-氯苯腙——一种消除MMP的解偶联剂(Sigma Chemical Co.；15分钟，37℃)进行接触来进行证明ΔΨm的损失的对照实验。
S-100级分的制备和细胞色素C释放的评估：在按照文献中的描述(Yu等人，2001，BBRC 286：1011-18)进行药物处理后通过在4℃下在600xg下离心10分钟并用PBS进行洗涤来收获U937细胞。通过在100μl包含75mM NaCl，8mM Na2HPO4，1mM NaH2PO4，1mM EDTA和350μg/ml洋地黄皂甙的细胞溶解缓冲液中培养3分钟来使细胞(4×106)溶解。将该溶解产物在12,000xg下离心5分钟，收集上清液并将其加入到等体积的2xLAEMMLI缓冲液中。用15％SDS-PAGE对该蛋白样品进行定量和分离。
免疫印迹分析：免疫印迹按照文献中的描述(Yu等人，Nat.Rev.Cancer1：294-202)来进行。简单地说，在药物处理后，通过离心使细胞沉积，然后立即将其溶解于Laemmli缓冲液[1X＝30mM Tris-碱(pH 6.8)，2％SDS，2.88mM Best wishes，β-巯基乙醇，和10％甘油]中，并将其进行简短的声处理。用Coomassie蛋白分析试剂(Pierce，Rockford，IL)对匀浆定量。将等量的蛋白(20μg)煮沸10分钟，用SDS-PAGE(5％堆叠剂(stacker)和10％解析)分离，并电转染至硝酸纤维素膜。在将其在22℃下在TBS-T(0.05％)和5％牛奶中阻断1小时后，将这些印迹在22℃下在具有适宜稀释度一级抗体的新鲜阻断溶液中培养4小时。抗体的来源如下：Bcl-xL，兔多克隆，Santa Cruz Biotechnology；XIAP，兔多克隆，R&D Systems，Minneapolis，MN；Mcl-1，小鼠单克隆Pharmingen，San Diego，CA；细胞周期蛋白D1，小鼠单克隆；p21，小鼠单克隆，Pharmingen；ERK 1/2，兔多克隆，细胞信号技术，Beverly，MA；磷酸-ERK 1/2(thr202/tyr204)，兔多克隆，细胞信号技术；JNK，兔多克隆，Santa Cruz Biotechnology；磷酸-JNK，小鼠单克隆，Santa Cruz Biotechnology；磷酸-p38 MAPK，兔多克隆，细胞信号技术；磷酸-p70S6K(421/424)，兔多克隆，细胞信号技术；磷-STAT5，细胞信号技术；pRB，小鼠单克隆，Pharmingen；次-磷酸-RB，小鼠单克隆，PharMingen；半胱天冬酶3，小鼠单克隆，Transduction Laboratories，Lexington，KY；PARP(C-2-10)，小鼠单克隆，BioMol ResearchLaboratories，Plymouth，MA；细胞色素c，小鼠单克隆，Santa CruzBiotechnology；AIF，小鼠单克隆，Santa Cruz Biotechnology；Smac，兔多克隆，Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY；半胱天冬酶8，兔多克隆，Pharmingen；和α-微管蛋白，Calbiochem。将这些印迹在TBS-T中洗涤3×15分钟，然后将其用1∶2000稀释度的辣根过氧化物酶-轭合的二级抗体(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)在22℃下培养1小时。将这些印迹再在TBS-T中洗涤3×15分钟，然后通过增强的化学荧光(Pierce，Rockford，IL)来显影。
分化研究
K562细胞红细胞系统的成熟分析按照文献中的描述(Yang等人，J.Biol.Chem.2001，276：25742-52)通过监测血红蛋白的产生来进行。
克隆存活：用文献中描述的克隆试验(Yu等人，Mol.Pharmacol.2001，60：143-54)来测定药物处理对白血病细胞克隆存活的作用。
瞬间转染：在人巨细胞病毒(CMV)即刻-早期(immediate-early)启动子(pEGFP-C2)的转录控制下编码增强的绿荧光蛋白的质粒和HA-标记的活化MEK1(在pUSEEamp中的S218D/S222D)分别得自ClontechLaboratories(Palo Alto，CA)和Upstate Biotechnology(Lake Placid，NY)。包含该MEK1 cDNA的1285-bp片断是通过Apa I和部分EcoR I消化获得的并且被框内(in-frame)插入到pEGFP-C2的(C-末端)多克隆位点中。对位于该融合构建体内的整个MEK1 cDNA定序并确定读码框。将Log期的K562细胞在电穿孔低渗缓冲液(Eppendorf)中用BTX electromanipulator600进行转染。对于各种情况而言使用20μgDNA和2.0×107个细胞。在培养12小时后，20％至30％的细胞表现出绿色荧光。用Cytomation MoFLO细胞分离器通过荧光-活化细胞分类(FACS)将整个细胞群体中最亮的10％至20％的细胞分离出来。然后使该细胞与指定的药物进行接触，并且如上所述对细胞凋亡的形态学迹象进行检查。
统计分析：用双侧学生t检验来测定实验条件之间差异的显著性。按照文献中的描述(Yu等人，2002，Cancer Res.62：188-189)用中间剂量作用(Median Dose Effect)分析(Chou和Talalay，1984，Adv.Enz.Regul.22：27-55)与可以通过商业途径获得的软件程序(Calcysyn；Biosoft；Ferguson，MO)一起来对协同作用和结抗作用进行分析。
结果
为了对化合物I和SAHA在K562细胞中的相互作用进行描述，进行剂量响应研究。浓度高达300nM的化合物I与细胞接触24小时几乎不诱导细胞凋亡，而2.0μM SAHA单独给药也具有最小的毒性。但是，当细胞与和100nM化合物I联用的SAHA接触时，观察到细胞凋亡明显增加(即，～20％)，并且对于浓度为250nM的化合物I而言，绝大多数细胞(即，～75％)发生细胞凋亡(表1A)。
化合物I(nM)     SAHA(μM)
 0  2
 0  0.6±0.3  3.2±1.1
 100  1.1±0.5  20.4±3.2
 150  1.3±0.6  34.5±3.8
 200  1.6±0.6  44.6±4.1
 250  2.8±1.2  65.3±4.3
 300  6.3±2.1  71.2±4.8
表1A：将K562细胞与和指定浓度的化合物I联用的2.0μM SAHA接触，然后按照“方法”部分的描述通过Wright Giemsa-染色样品的形态学分析来对细胞凋亡进行监测。
同样，当细胞与和浓度增加的SAHA联用的250nM化合物I接触24小时后，在1.0μM SAHA时注意到细胞凋亡急剧增加，并且在1.5μM的SAHA浓度下，大多数细胞发生细胞凋亡(表1B)。
 SAHA(μM)        化合物I(nM)
 0  250nM
 0  0.6±0.2  2.7±1.2
 1  0.8±0.4  21.4±3.2
 1.5  1.6±0.7  52.3±4.3
 2.0  2.7±0.7  64.5±4.5
 2.5  14.5±1.3  68.9±4.7
 3.0  28.4±3.2  77.8±5.1
表1B.将细胞与和指定浓度SAHA联用的250nM化合物I接触24小时，然后如上所述对细胞凋亡进行评估。对于A和B而言，这些值表示三次独立实验的均值±S.D.。
在一定的化合物I和SAHA浓度范围内诱导细胞凋亡的中等剂量作用分析产生了低于1.0的联合指数(CI)值，其与协同相互作用相一致(表1C)。
SAHA(mM) 化合物I(nM) 联合指数(CI) 作用分数
 1.0  125  0.787  0.184
 1.5  187.5  0.762  0.406
 2.0  250  0.792  0.623
 2.5  312.5  0.834  0.727
 3.0  375  0.794  0.893
表1C.将K562细胞与固定比例(10∶1)的各种浓度的SAHA和化合物I接触24小时，然后用中等剂量作用分析测定在作用分数(FA)方面对细胞凋亡的联合指数(CI)值进行测定。CI值＜1.0相当于协同相互作用。两种另外的研究产生了相似的结果。
如TUNEL-染色细胞的显微照片(未表示出来)所示的，与K562细胞与不含药物的培养基；SAHA 2.0μM(24小时)；化合物I250nM接触(24小时)相比，K562细胞与250nM化合物I+2.0μM SAHA接触24小时时细胞凋亡显著增加。
进行K562细胞与250nM化合物I±2.0μM SAHA接触的时间过程研究。虽然将这些物质各自独立给药在48小时最低程度地诱导了细胞凋亡，但联合治疗使得细胞凋亡增加，在最初12小时内就观察到这种增加，其在24小时时达到几乎最大水平。在联合治疗后48小时，90％以上的细胞发生细胞凋亡(表2A)。
小时  对照  SAHA  化合物I  SAHA+化合物I
 0  0.6±0.2  0.6±0.2  0.6±0.2  0.6±0.3
 6  0.6±0.3  0.9±0.2  1.1±0.5  6.7±0.8
 12  0.6±0.2  1.7±0.5  2.1±0.8  13.7±2.1
 18  0.6±0.2  2.3±0.8  3.3±1.0  35.4±3.8
 24  0.6±0.3  3.5±1.1  3.5±1.2  65.5±4.8
 48  0.6±0.3  14.8±2.1  21.8±3.4  86.3±5.9
表2A：将K562细胞与2.0μM SAHA±250nM化合物I接触所标明的时间，其后如“方法”部分所述测定发生细胞凋亡细胞的百分比。
当监测线粒体膜电位降低(ΔΨΘm)时观察到相似的结果，但是化合物I本身在这一点上在接触48小时后的毒性略微更高(表2B)。
小时  对照  SAHA  化合物I  SAHA+化合物I
 0  5.3±1.8  5.4±1.6  5.7±1.8  5.6±1.7
 6  5.8±1.7  8.1±1.9  8.8±1.9  16.5±2.1
 12  6.1±1.8  10.4±2.1  11.2±2.1  24.6±3.4
 18  5.2±1.6  12.3±2.8  11.9±2.3  45.8±3.8
 24  6.4±1.8  16.4±2.9  17.8±3.4  65.8±4.5
 48  5.9±1.7  20.5±2.8  41.3±4.3  87.2±5.8
表2B：将K562细胞与2.0μM SAHA±250nM化合物I接触所示的时间间隔，然后按照“方法”部分的描述对表现出线粒体膜电位降低(ΔΨm)的细胞百分比进行测定。
这些结果一起表明使用化合物I和HDI SAHA进行的联合治疗使得较早地诱导了Bcr/Abl+K562细胞中的线粒体损伤和细胞凋亡。
为了测定用化合物I和HDI联合处理的K562细胞中的细胞凋亡增强是否与白血病细胞自我更新能力的降低有关，进行克隆试验。尽管与250nM化合物I或2.0μM SAHA单独接触24小时时大大减少了克隆发生(即至对照值的～25％)，但联合治疗对集落形成产生了高于2-log的降低(表2C)。
克隆存活(％对照)
SAHA  21.8±3.6
化合物I  22.4±4.5
SAHA+化合物I  0.42±0.2
表2C：将细胞用2.0μM SAHA±250nM化合物I处理24小时，将药物洗涤掉，并按照“方法”部分的描述将其涂布到软琼脂上。在12天培养结束时，对集落评分并将存活表示为相对于未进行处理的对照而言的百分比。
因为已经证实化合物I和HDI如丁酸盐都可以诱导Bcr/Abl+细胞中的成熟，所以试图测定是否与该类物质的联合接触将导致K562细胞分化增加。为此，对用SAHA±化合物I进行处理的K562细胞中的血红蛋白(Hgb)生产进行监测。使K562细胞与2.0μM SAHA±250nM化合物I接触所标明的时间，然后按照“方法”部分的描述对细胞内的Hgb水平进行定量来对细胞分化进行监测。在各种情况中，这些值表示三次独立实验的均值±S.D.。在接触24小时后，用SAHA处理的细胞在Hgb生成方面表现出显著(即～50％)增加，而化合物I在这方面的作用较差。但是，同时用两种物质进行了处理的细胞并没有表现出Hgb水平增加。在48小时后，用SAHA-和化合物I-处理的细胞在Hgb生产方面都表现出显著增加。但是，在与两种物质同时进行接触的细胞(这时其发生大量细胞凋亡)中的Hgb水平比对照低(数据未表示出来)。这些结果表明用化合物I和SAHA对Bcr/Abl+K562细胞进行共同处理不会促进分化，而是表明在这些条件下发生的广泛的细胞凋亡反而阻止了这种过程。
然后，在线粒体损伤、半胱天冬酶活化和细胞凋亡调控蛋白表达方面对将K562细胞与SAHA和化合物I联合接触24小时的作用进行监测。使K562细胞与2.0μM SAHA±250nM化合物I接触24小时，其后，用Western分析对AIF、Smac/DIABLO和细胞色素C向S-100细胞溶质部分中的释放进行评估，并对整个细胞提取物在裂解下来的半胱天冬酶9、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-8、PARP和Bcr/Abl的表达方面进行分析。各泳道包含25μg蛋白；将这些印迹剥离下来并对微管蛋白进行再探察以确保等量填充和转移。两项另外的研究产生了相当的结果。化合物I(250nM)或SAHA(2.0μM)各自的作用最小，而细胞与这些物质的联合接触使得释放进入到细胞溶质的S-100细胞级分中的细胞色素c、AIF，和Smac/DIABLO显著增加。这些活动伴随着半胱天冬酶-9裂解和半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-8以及PARP降解的显著增加。有趣地是，虽然单独治疗具有很小的作用，但是与化合物I和SAHA的联合接触使得Bcr/Abl蛋白水平显著下降(数据未表示出)。因此，用亚毒性浓度的化合物I与HDISAHA一起对Bcr/Abl+细胞进行的处理使得细胞凋亡前线粒体蛋白的释放、半胱天冬酶级联的活化、和Bcr/Abl的表达降低显著增加。
然后在对K562细胞中各种信号传导、细胞周期和细胞凋亡调节蛋白的作用方面来对SAHA和化合物I之间的相互作用进行检测。有趣地是，仅与SAHA接触(16小时)使得Raf的表达明显降低，而化合物I几乎没有作用。使K562细胞与2.0μM SAHA±250nM化合物I接触16小时，其后，用Western分析来对Raf、磷-MEK1/2和-ERK1/2、总ERK1/2、磷-70S6K(ERK-磷酰化部位；421/424)；磷酸-JNK、磷-p38 MAPK、磷-STAT5、磷酸-Akt(423)和总Akt的表达进行评估。如上所述的那样对K562细胞进行处理，并且对Bcl-xL、Mcl-1和XIAP的表达进行监测。在如上所述那样用化合物I±SAHA进行处理后用Western分析对p21CIP1、次-磷酰化pRb、总pRb和细胞周期蛋白D1的表达进行检测。CF＝裂解碎片。各泳道包含25μg蛋白；将这些印迹剥离下来并对微管蛋白再探测以确保等量填充和转移。两项另外的研究产生了相当的结果(数据未表示出)。化合物I和SAHA的共同给药使得Raf表达进一步减少。在磷酸-MEK1/2和磷酸-ERK1/2的水平中观察到几乎平行的改变。用化合物I和SAHA进行的联合治疗还显著降低了ERK-结合部位(421/424)上p70S6K的磷酸化作用，并且显著减少了磷酸-SATA5(Bcr/Abl的靶点)的表达。在总Akt表达方面没有注意到显著变化，但是在同时与SAHA和化合物I都进行接触的细胞中观察到磷酰化的(活化的)Akt适度下降。此外，虽然化合物I和SAHA各自都不能改变磷酸-JNK的表达，但是联合治疗使得JNK活化十分剧烈的增加。在用SAHA处理的细胞中观察到p38 MAPK的磷酸化作用略微增加，但在加入化合物I时这一点不会发生变化。用化合物I和SAHA进行的联合治疗不会改变抗细胞凋亡蛋白Bcl-xL或XIAP的表达。总之，如之前所报道的那样，仅用化合物I处理诱导了抗细胞凋亡蛋白Mcl-1表达的轻微降低，而加入SAHA(其本身发挥极小的作用)使得Mcl-1表达进一步减少(数据未表示出)。
然后在一些细胞周期调节蛋白的表达方面对SAHA和化合物I之间的相互作用进行检查。与在Bcr/Abl-白血病细胞中注意到的作用相似，用SAHA进行的处理产生了很强的p21CIP1诱导作用。出乎意料地是，与化合物I一起进行接触大大减少了SAHA对p21CIP1的诱导。尽管存在这种作用，细胞与SAHA和化合物I联合进行接触使得次-磷酰化pRb的表达适度增加，同时伴有总和次-磷酰化蛋白的裂解。最后，用化合物I和SAHA一起进行处理的K562细胞表现出明显的细胞周期蛋白D1水平降低，一种以前被与诱导细胞凋亡联系起来的现象。这些结果一起表明K562细胞与化合物I和SAHA进行的共接触扰乱了多重信号的表达、细胞周期和细胞凋亡调节蛋白(包括Raf的下调)，使MEK1/2、ERK1/2和p70S6K活性减弱、JNK显著活化、Bcr/Abl、Mcl-1、p21CIP1和细胞周期蛋白D1的表达降低，以及pRb的脱磷酸化/裂解(数据未表示出来)。
为了对半胱天冬酶在这些情况中的作用进行评估，将K562细胞在存在或不存在全-半胱天冬酶抑制剂BOC-fmk或半胱天冬酶8抑制剂IETD-fmk的情况下用化合物+SAHA处理20小时(表3)。
细胞凋亡(％)
 对照  0.6±0.2
 SAHA+化合物I  50.1±3.9
 BOC+SAHA+化合物I  9.8±2.4
 IETD+SAHA+化合物I  41.5±3.2
表3：将K562细胞与2.0μM SAHA+250nM化合物I在存在或不存在25μM BOC-fmk或IETD-fmk的情况下处理24小时，其后如上所述那样对细胞凋亡进行监测。这些值表示三次独立试验的均值±S.D.。
将细胞用SAHA+化合物I±BOC-fmk进行处理，其后如上所述那样对细胞色素c或Smac/DIABLO向S-100细胞溶质部分的释放进行评估(未表示出)。将细胞用SAHA+化合物I±BOC-fmk进行处理，其中用Western分析来对原半胱天冬酶(procaspase)-3、Bcr/Abl、pRb、次磷酰化pRb、Raf-1、Mcl-1、p21CIP1和细胞周期蛋白D1的表达进行评估。各泳道包含25μg蛋白；将这些印迹剥离下来并对微管蛋白再探测以确保等量填充和转移。两项另外的研究产生了相当的结果(数据未表示出来)。BOC-fmk显著抑制了细胞凋亡，而IETD-fmk的作用最小，表明对于在这些细胞中化合物I/SAHA-介导的致死性的外部途径而言具有相对较小的作用。但是，虽然BOC-fmk在阻断细胞色素c向与化合物I+SAHA接触的细胞的胞质溶胶中的释放方面无效，但是其大大阻断了Smac/DIABLO释放，表明后者代表了一种继发的、半胱天冬酶-依赖性事件。如所预期的那样，BOC-fmk减少了原半胱天冬酶-3以及总和次-磷酰化pRb的裂解。其还部分逆转了化合物I/SAHA-处理细胞中Bcr/Abl表达的下调，表明了这种现象有依赖半胱天冬酶的成分。相反，BOC-fmk对Raf、Mcl-1、p21CIP1或细胞周期蛋白D1的下调几乎没有影响，表明这些事件大多不依赖于半胱天冬酶活化。在独立的研究中，BOC-fmk的共同给药对SAHA单独给药的作用没有影响(数据未表示出来)。
为了测定化合物I和SAHA之间的协同作用是否将延续至包括其它Bcr/Abl+细胞，用LAMA 84细胞进行了平行研究(表4)。
％膜联蛋白V/PI
对照  08.2±1.8
SAHA 1mM  15.2±2.4
化合物I 200nM  13.4±2.3
SAHA+化合物I  70.8±4.8
表4：将LAMA 84细胞与200nM化合物I±1.0μM SAHA接触24小时，其后如“方法”部分所述用流式细胞计测定膜联蛋白V/PI+细胞的百分比(用带有上下限的数字(gated figures)表示)。两项另外的研究产生了相当的结果。
LAMA 84细胞与1.0μM SAHA或200nM化合物I单独接触24小时对细胞死亡只发挥了微弱的作用。但是，当将这些物质联用时，极大多数细胞(即，70％)发生细胞凋亡，这一点可以通过膜联蛋白阳性反映出来。相反，当将SAHA与一些Bcr/Abl-白血病细胞系(包括U937、HL-62、NB4、和Jurkat)相结合时没有协同作用的迹象(表5)。
                    细胞凋亡的细胞的％
细胞系 对照  SAHA 化合物I 化合物I+SAHA
 K562  0.6±0.3  6.6±3.8  8.3±3.2  74.3±5.3
 U937  0.8±0.4  5.4±1.9  0.9±08  6.2±3.0
 Jurkat  0.8±0.4  6.3±3.2  1.1±0.6  7.3±2.0
 NB4  1.2±0.5  5.6±2.3  1.8±1.3  8.2±2.4
 HL60  2.1±0.6  6.4±1.9  3.1±1.3  11.5±3.5
表5：将Bcr/Ab1+K562细胞和一些Bcr/Abl-白血病细胞系，包括U937单核细胞白血病、Jurkat成淋巴细胞白血病和NB4以及HL-60前髓细胞白血病细胞与SAHA±化合物I接触24小时，其后，如“方法”部分所述通过检查Wright Giemsa-染色的细胞离心涂片器载玻片来测定细胞凋亡细胞的百分比。各细胞系的浓度如下：K562：SAHA 2.5μM；化合物I 250nM；U937：SAHA 1.5μM；化合物I 250nM；Jurkat：SAHA 0.75μM；化合物I250nM；NB4：SAHA 1.5μM；化合物I 250nM；HL-60：SAHA 1.0μM；化合物I 250nM。在各种情况中，这些值表示三次独立试验的均值±S.D.。
这些结果表明SAHA和化合物I之间的协同相互作用仅限于表达Bcr/Abl蛋白的人白血病细胞。
Western分析表明LAMA 84细胞与化合物I+SAHA进行的联合接触使得细胞色素c的细胞溶质释放显著增加，并且导致半胱天冬酶-9、-3、和-8的相应活化(数据未表示出来)。在K562细胞中得到了相一致的结果，用化合物I和SAHA联合处理的LAMA 84细胞产生了Raf、p21CIP1、细胞周期蛋白D1、Mcl-1、磷酸-STAT5的下调、增强的次-磷酸化作用和pRb裂解，并且JNK磷酸化作用显著增加(数据未表示出来)。
然后，试图确定该类相互作用是否可以延展至包括除SAHA外的其它HDI。将LAMA 84细胞与200nM化合物I±1.0μM SAHA接触24小时，其后，用Western分析来对释放到细胞溶质S-100部分中的细胞色素c，或在总细胞提取物中裂解的原半胱天冬酶-9、裂解的原半胱天冬酶-3、或原半胱天冬酶-8的表达进行监测(数据未表示出来)。CF＝裂解碎片。将LAMA细胞如上那样进行处理，其后对总细胞提取物的Raf1、磷酸-JNK、p21CIP1、细胞周期蛋白D1、Mcl-1和磷酸-STAT5表达进行监测。各泳道包含25μg蛋白；将这些印迹剥离下来并对微管蛋白再探测以确保等量填充和转移。两项另外的研究产生了等值的结果(数据未表示出来)。
为此，将K562和LAMA 84细胞与所示浓度的化合物I在存在或不存在丁酸钠(SB；1或2mM)的情况下接触24小时，其后，对细胞凋亡的程度进行评估，按照“方法”部分的描述通过检查细胞离心涂片器载玻片来测定细胞凋亡细胞的百分比。这些值表示三个独立试验的均值±S.D.(表6)，化合物I与SB的联合给药使得两种细胞系中的细胞凋亡显著增加。
                 化合物I+SB细胞凋亡的细胞％
对照 SB 化合物I  SB+化合物I
 K562  0.6±0.3  5.1±2.2  10.3±3.6  61.2±6.2
 LAMA 84  1.8±0.5  6.4±2.8  9.3±3.8  55.1±5.4
与用SAHA获得的结果相似，致死率增加与细胞色素c向细胞溶胶中的释放增加、原半胱天冬酶-3和一9的活化、Raf、p21CIP1、Mcl-1、细胞周期蛋白D1的下调、以及JNK的显著活化有关(数据未表示出来)。
将化合物I与MEK1/2抑制剂或与细胞周期蛋白-依赖性激酶抑制剂flavopiridol一起给药产生了表现出Bcr/Abl表达增加的对化合物I有抗药性的K562细胞的致死率增加。因此，涉及化合物I/HDI方案的平行研究是用K562R细胞(得自具有多重抗药性的细胞系)以及对化合物I有抗药性的LAMA 84细胞(LANA 84-R)(其是通过将细胞在浓度逐渐升高的化合物I中进行培养来产生的)进行的(表7)。
                化合物I+SAHA细胞凋亡的细胞％
对照 SAHA 化合物I  SAHA+化合物I
 K562R  0.9±0.4  6.8±3.5  17.6±4.5  65.3±5.2
 LAMA 84R  2.2±0.9  10.3±3.4  14.8±4.7  66.2±6.1
表7：将对化合物I有抗药性的K562细胞(K562R)和对化合物I有抗药性的LAMA 84细胞(LAMA 84R)与所示浓度的化合物I和SAHA接触24小时，其后，按照“方法”部分的描述通过检查Wright Giemsa-染色的细胞离心涂片器载玻片来测定细胞凋亡细胞百分比。插入物包含耐药和敏感细胞中蛋白印迹试验Bcr/Abl蛋白水平(同微管蛋白对照一起)。各泳道包含25μg蛋白。这些值表示三次独立实验的均值±S.D.。
LAMA 84-R细胞表现出比其敏感对应物的I.C.50值约高10倍的化合物II.C.50值(例如，2.1对0.22μM；数据未表示出)。在插入物中表示的是证明各细胞系Bcr/Abl蛋白水平增加的蛋白印迹。可以看出，将化合物I(1.0或1.25μM)(其在任何一种细胞系中仅产生中等的致死率)与最低毒性浓度的SAHA(即，1.0或2.0μM)共同给药48小时在大多数K562R和LAMA84-R细胞中(例如～66％)中诱导了细胞死亡。将敏感K562和LAMA 84细胞与这些化合物I浓度接触48小时在基本100％的细胞中诱导了细胞死亡(数据未表示出来)。当将细胞与化合物I和SB一起进行接触时得到了基本相同的结果(数据未表示出来)。该类结果表明将化合物I与HDI联合给药可以有效增加对化合物I有抗药性的Bcr/Abl+细胞中的细胞死亡，至少可以有效增加表现出Bcr/Abl蛋白表达增加的细胞中的细胞死亡。
最后，为了对Raf/MEK/MAP激酶轴失调对化合物I和HDI在Bcr/Abl+细胞中的协同相互作用的功能性影响进行评估，将K562细胞用仅表达GFP的载体或组成活性的MEK1/2/GFP融合蛋白瞬时转染(表8)。
 GFP  GFP/MEK
对照  12.1±1.8  11.5±1.9
SAHA  22.5±2.6  19.8±2.1
化合物I  23.8±2.8  14.7±2.2
化合物I+SAHA  68.2±4.6  38.4±3.1
表8：按照“方法”部分的描述用Cytomation MoFLO细胞分离器将表达GFP的纯化群体(例如，＞95％)分离出来。未转染的K562细胞表现出91％的生存力和0.01％的GFP表达；仅用GFP转染的K562细胞；筛选的细胞表现出95％的生存力和95％的GFP表达；用GFP/组成活性MEK1/2融合cDNA转染的K562细胞；筛选的细胞表现出95％的生存力和96％的GFP-表达。将筛选出来的仅用GFP或GFP/组成活性MEK1/2融合cDNA转染的细胞在不含药物的培养基中培养5小时，然后将其与2.0μM SAHA±250nM化合物I接触24小时，其后，按照“方法”部分的描述通过对Wright Giemsa-染色的细胞离心涂片器制剂进行检查来对细胞凋亡进行监测。这些值表示两次独立测定的均值±S.D.。*＝显著低于仅用GFP转染的细胞的值；P＜0.05；**＝P＜0.01。在这一时期结束后，如上所述那样对细胞凋亡程度进行监测。用组成活性MEK1/2转染的细胞对化合物I介导的致死率的抵抗性适度但是显著高于仅使用GFP转染的对照的致死率(P＜0.05)，其与早期证明药理学MEK1/2抑制剂增强化合物I-诱导的细胞凋亡的报道相一致。此外，用突变MEK1/2瞬时转染的细胞十分显著地保护了细胞不受SAHA/化合物I方案的致死率影响(P＜0.01)。这些结果表明与化合物I和HDI一起进行接触的K562细胞中的Raf/MEK/MAP激酶级联失调在致死率增加中起着显著的功能作用。
本研究的结果表明将Bcr/Abl激酶抑制剂化合物I与临床相关的HDI共同给药使得Bcr/Abl+人白血病细胞中的线粒体损害和细胞凋亡显著增加。已知在人白血病细胞中，HDI(据推测是通过促进染色质松弛)使得可以进行在分化过程中所涉及的转录基因活化。就这一点而言，HDI如SB已经显示出诱导Bcr/Abl+细胞系如K562中红细胞系统的成熟。最近，已经将注意力集中到HDI、特别是更新一代化合物诱导人白血病细胞中细胞凋亡而不是成熟程序的能力上。一直没有完全阐明决定HDI究竟诱导细胞死亡还是诱导细胞分化的因素，但是已经表明反应性氧类型的产生可能在这种过程中起着一定的作用。在任何情况下，K562细胞都对HDI-介导的细胞死亡相对不敏感，这可能是由于其对Bcr/Abl激酶以及其下游细胞保护靶点的组成活化所产生的对细胞凋亡的抗性所致。对将HDI和化合物I共同给药使得这些Bcr/Abl细胞中细胞凋亡阈值显著降低的结果有一些可能的解释。例如，化合物I可以通过干扰一种或多种Bcr/Abl下游细胞保护靶点的抗细胞凋亡作用增强HDI触发细胞死亡级联的能力。相反，与由化合物I所诱发的情况一起，由HDI诱导的各种信号传导和细胞周期调节途径中的紊乱可产生线粒体损伤和细胞凋亡的放大。另外的可能是，当与HDI联合时，已经报道可以诱导Bcr/Abl+细胞成熟的化合物I引发了产生细胞凋亡而不是分化的冲突信号。在这一方面，很好地证明了白血病细胞成熟失调代表了有效的细胞凋亡刺激的发现。因为这些机理不是相互排他的，所以不排除其中一种以上机理有助于细胞死亡显著增加的可能性。
一系列证据支持了HDI对Bcr/Abl+细胞中Raf/MEK/MAP激酶级联的干预有助于化合物I/HDI方案中显著诱导的细胞凋亡的想法。之前的研究已经暗示了Bcr/Abl+细胞中HDI-介导的分化-诱导中MEK/MAP激酶的紊乱，尽管已经报道了该类紊乱性质上的差异。例如，Rivero早些时候报道了与丁酸钠接触的K562细胞中ERK的活化，而Witt等人描述了在丁酸盐诱导的K562细胞的分化和ERK的抑制之间的相关性。这些完全不同的结果可以反映亚系-特异性差异或者，在与丁酸盐接触后出现一种ERK活化/下调的双目暂时模式。在这一方面，还已经表明阻挠ERK活化的化合物I至少在早期促进了K562细胞成熟。与这些结果相一致，我们还观察到在化合物I处理的K562细胞中ERK活化的早期抑制，但是，其后，较晚些时候其返回活性的基础水平或高于该水平。化合物I处理的K562细胞中MEK/ERK活化的抑制(即，被药理学MEK1/2抑制剂抑制)表示对线粒体损害和细胞凋亡十分有效的刺激[25]。但是，目前，有关在Bcr/Abl+细胞中在上游部位(例如在Raf水平上)中断MEK/MAP激酶途径的影响的信息几乎没有。就我们目前所知，之前一直没有描述过Bcr/Abl+细胞中由HDI引起的Raf下调。这些结果可以与下面的概念相容：a)Raf/MEK/EREK轴的下调改变了经HDI处理的细胞的活化程序，从而促进了细胞凋亡；或b)该Raf/MEK/ERK细胞保护途径的瓦解降低了HDI-介导细胞死亡的阈值。我们最近观察到，药理学MEK1/2/ERK阻断(例如，用诸如U0126之类的物质)使得在与HDI接触的K562细胞中的细胞凋亡显著加强(C.Yu和S.Grant，未公开的数据)，这支持了后一种可能性。
化合物I和HDI的联合治疗还使得应激-相关的激酶JNK的活化显著增加。虽然存在例外，但是应激相关的激酶如JNK和p38 MAPK的活化通常有利于细胞死亡，而MEK/MAP激酶的活化则发挥了细胞保护作用。实际上，已经表明JNK和MAP激酶级联的净输出在决定存活/细胞死亡方面起着关键性的作用。因此推测，在与化合物I和HDI联合接触的Bcr/Abl+细胞中由MEK/MAP激酶向JNK信号传导的显著转移有助于细胞凋亡的显著加强。
除MEK1/2/ERK途径瓦解外，CDKI p21CIP1失调也在Bcr/Abl+细胞中化合物I和HDI之间的协同相互作用中起作用。例如，已经表明干扰p21CIP1诱导(例如，在表达反义构建体的细胞中或在与CDK抑制剂flavopiridol接触的细胞中)促进了用一些分化诱导剂处理后白血病细胞的凋亡，所说的分化剂包括PMA、苔藓抑素1和最近的包括丁酸盐和SAHA在内的HDI。这种现象的基础在一定程度上是未知的，但是其可能涉及p21CIP1与半胱天冬酶-3结合和对其抑制的能力。所观察到的HDI对组蛋白的乙酰化特定活化了p21CIP1启动子，而p21CIP1被HDI有规律地诱导、特别是在正在成熟的白血病细胞中被诱导的结果表明这种CDKI表达增加在HDI-介导的成熟中起着重要作用。虽然并不清楚化合物阻断HDI-处理的细胞中的p21CIP1诱导的机理，但是其可能是由于Raf/MEK/ERK轴的瓦解(已知其操纵p21CIP1的上游)。或者，施用化合物I、特别是当将化合物I与HDI联用时可能干扰Akt途径——一种在p21CIP1调节中也被涉及的Bcr/Abl的下游目标。仍需要明确Raf/MEK/ERK的与HDI-有关的下调和化合物I-介导的p21CIP1诱导干扰(如果有的话)对HDI和化合物I在Bcr/Abl+细胞中的协同相互作用中的相对贡献。
HDI在对化合物I有抗药性的K562细胞和LAMA 84细胞中对化合物I的致死率的加强作用与我们之前在涉及药理学MEK1/2抑制剂或最近的CDK抑制剂flavopiridol的联合方案中所观察到的结果相似或更高。对化合物I的抗药性可能是由于多种因素造成的，包括细胞吸收减少、bcr/abl扩增和Bcr/Abl蛋白表达增加、药动学因素、以及Bcr/Abl激酶结构域中的突变。由于仍然还不清楚的原因，Bcr/Abl表达增加是所培养的细胞系(包括在我们实验室所分离出来的细胞系)的抗药性的最普通的机理[25，26]。但是，在得自已经在体内对化合物I形成抗药性的CML患者的细胞中，观察到Bcr/Abl表达增加的频率比观察到该Bcr/Abl激酶结构域突变的频率低。其中，最广泛报道了Bcr/Abl激酶接触部位(例如，T315和Y253)的突变。此外，Corbin等人最近用定位诱变来确定降低化合物I的抑制作用并且可能是临床相关的Bcr/Abl激酶结构域的其它突变。化合物I/HDI方案在其它有抗药性的K562或LAMA 84细胞中诱导细胞凋亡的能力表明这种策略绕开了Bcr/Abl表达增加的作用，或者通过操纵Bcr/Abl下游或者独立操纵Bcr/Abl的途径起作用。虽然该类策略可能在表现出Bcr/Abl上调的细胞中有效，但是仍然需要确定其是否在表达使得对化合物I有抗药性的Bcr/Abl突变的细胞中有效。在这一方面，可能涉及化合物I/HDI方案触发Bcr/Abl下调的能力，因为该激酶结构域中单个氨基酸取代可能不太可能阻止该类过程。
通过诱导组蛋白乙酰化和解螺旋，HDI促进了在成熟过程中所涉及的基因的表达。所以，一直对用HDI来增强其它物质诱导分化的能力的应用，特别是在白血病中的应用感兴趣。例如，最近已经报道了HDI如丁酸盐克服白血病细胞对全反式视黄酸(ATRA)的抗药性的能力。因为化合物I能诱导Bcr/Abl+细胞中的分化(虽然程度有限)，所以存在HDI共同给药可能增强这种过程的可能性。但是，这里所提供的数据表明化合物I和HDI之间的协同作用主要反映在诱导细胞凋亡而不是诱导成熟方面。由于最近在人临床试验中引入了一些新型的HDI，所以将该类物质与化合物I联合用于治疗患有CML和相关病症的患者的概念是可行的。因此，正在进行进一步的努力来对这种策略进行进一步探究。
实施例2：实施例3：含有4-[(4-甲基-1-哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-[[4-(3- 吡啶基)-2-嘧啶基]氨基[苯基]苯甲酰胺甲磺酸盐(β-晶型)的胶囊
制备具有下面组成的包含119.5mg作为活性物质的标题中所命名的化合物(化合物I单甲磺酸盐)(相当于100mg化合物I(游离碱))的胶囊：
组成：     盐I              119.5mg
           Avicel           200mg
           PVPPXL           15mg
           Aerosil          2mg
           硬脂酸镁         1.5mg
                            338mg
该胶囊是通过将这些组分混合并将该混合物填充到1号硬明胶胶囊中来进行制备的。

Claims (10)

1.一种用于同时、独立或相继应用的组合，其包含(a)式I的N-{5-[4-(4-甲基-哌嗪-1-基-甲基)-苯甲酰氨基]-2-甲基苯基}-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶或其可药用的盐
和(b)至少一种游离形式或其可药用盐形式的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂以及任选的至少一种可药用的载体。
2.如权利要求1所述的组合，其中(b)选自丁酸钠、MS-275、SAHA、aphacidin、缩肽、FK 228、曲古抑菌素A、式II的化合物或其可药用的盐
和式III的化合物或其可药用的盐，
以及任选的至少一种可药用的载体。
3.如权利要求2所述的组合，其中(b)选自丁酸钠、SAHA、式II的化合物和式III的化合物。
4.如权利要求1至3中任意一项所述的组合在治疗白血病中的应用。
5.如权利要求1至3中任意一项所述的组合用于制备治疗白血病的药物的应用。
6.如权利要求4或5中任意一项所述的组合应用，其中的白血病是对化合物I有抗药性的白血病。
7.一种对患有白血病的温血动物进行治疗的方法，其包括以对所说白血病的联合治疗有效量给所说的动物施用如权利要求1至3中任意一项所述的组合并且其中所说的化合物还可以以其可药用盐的形式存在。
8.一种包含对白血病联合治疗有效量的如权利要求1至3中任意一项所述的药物组合以及至少一种可药用载体的药物组合物。
9.一种包含如权利要求1至3中任意一项所述的组合以及说明其用于同时、独立或相继应用以治疗白血病的说明的商品化包装。
10.如权利要求7所述的方法、如权利要求8所述的药物组合物和如权利要求10所述的商品化包装，其中所说的白血病是对化合物I有抗药性的白血病。
CNA038217635A 2002-09-13 2003-09-10 用于治疗白血病的а ) N－{ 5－[ 4－( 4－甲基－哌嗪－1－基－甲基)－苯甲酰氨基]－2－甲基苯基}－4－( 3－吡啶基 ) －2－嘧啶－胺和b )组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的组合 Pending CN1681505A (zh)

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