CN1594341A

CN1594341A - 人参皂苷次级苷compound K的脂肪酸酯类化合物及制备方法

Info

Publication number: CN1594341A
Application number: CN 200410010959
Authority: CN
Inventors: 郑毅男; 弓晓杰
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Yatai Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2004-06-28
Filing date: 2004-06-28
Publication date: 2005-03-16
Anticipated expiration: 2024-06-28
Also published as: CN1300160C

Abstract

本发明公开一种人参皂苷次级苷compound K的脂肪酸酯类化合物，包括2种衍生化合物：OM1和SM1，具有以下通式，其中，R为油酰或硬脂酰；它们均是compound K与脂肪酸形成的酯。同时提供了compound K与脂肪酸的合成方法，以该类化合物为活性成分的药物组合物，以及本发明化合物和药用组合物在制备抗癌药物中的应用。

Description

人参皂苷次级苷compound K的脂肪酸酯类化合物及制备方法

技术领域：

本发明涉及人参皂苷次级苷compound K的脂肪酸酯类化合物，并公开了该化合物的分子结构、合成方法和以该化合物为活性成分的药物组合物，属于中药有效成分半合成技术领域。

背景技术：

本发明所涉及的人参皂苷次级苷compound K(以下简称M1)是人参皂苷的肠内菌代谢产生物，M1具有很强的抗癌活性。M1在肝中与脂肪酸形成脂肪酸酯(EM1)，它比M1在肝中的积累时间要长。而且通过M1、EM1的药代动力学研究发现，M1脂肪酸酯化形成EM1提高了其体内抗肿瘤活性，并且降低了细胞毒性。因此，人参的抗癌活性源于口服人参后经肠内菌代谢形成的代谢物M1和肝内脂肪酸酯化形成的脂肪酸酯EM1，肠内菌代谢物M1可以直接发挥抗癌作用。

经检索未见上述人工合成产物的文献报道。

发明内容：

本发明提供一种具有药用价值的人参皂苷次级苷compound K的脂肪酸酯类化合物，包括2种衍生化合物：OM1和SM1。

本发明还提供了M1与脂肪酰氯的合成制备OM1及SM1的方法，适于工业化生产。

本发明进一步提供了以该化合物为活性成分的药物组合物，用于抗癌。

本发明用M1与脂肪酰氯合成的酯类化合物，经过药理活性筛选，对于多种癌症有效。

本发明所说的化合物具有下述结构通式：

本发明的制备方法包括以下步骤：

取M1 30-50g溶于1000-1500ml乙酸乙酯中，在搅拌条件下加入1000-1500ml水饱和碳酸氢钠，在冰水浴条件下加入油酸酰氯430～720g，室温下搅拌过夜；然后用分液漏斗将乙酸乙酯层和水层分离，并用乙酸乙酯反复萃取水层，将乙酸乙酯合并，离心，上清液用水反复冲洗，减压回收乙酸乙酯，干物质用甲醇溶解、过滤，甲醇液减压浓缩得干物质；

将所得物质经HPLC，C-18柱100％甲醇洗脱，分别得到20-(S)-原人参二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖-6-O-油酸酯(以下简称：OM1)；20-(S)-原人参二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖-6-O-硬脂酸酯(以下简称：SM1)。

所得单体化合物用乙酸乙酯重结晶可得本发明的纯品。

上述化合物经光谱分析，分别具有如下理化特性：

SM1为无色透明油状物，溶于氯仿、甲醇。Liebermann-Burchard反应呈阳性；Molish反应呈阳性。

TOF-MS谱中，m/z[M+H]+为889.5，其分子量为888。

SM1的¹H NMR归属情况如下：¹H-NMR(500MHz，py-d₅)δ：5.33 1H，m，H-24)，5.14(1H，d，J＝7.5Hz，glc-H-1)，5.05(1H，d，J＝10.1Hz，glc-Ha-6)，4.65(1H，dd，J＝7.0，11.0Hz，glc-Hb-6)，4.19(2H，m，glc-H-3，glc-H-4)，3.98(3H，H-12αglc-H-2，glc-H-5)，3.40(1H，m，H-3α)，2.58(2H，m，H-1α，Hb-23)，2.41(1H，m，Hb-22)，2.32(1H，m，Hα-23)，2.01(2H，m，Hb-11，H-13α)，1.88(1H，m，Hb-2)，1.88(1H，m，Hb-2)，1.85(1H，m，Hb-16)，1.82(1H，m，Ha-22)，1.80(1Hm，Ha-2)，1.69(1H，m，Hb-1)，1.67(3H，s，Me-21)，1.64(3H，s，Me-26)，1.63(3H，s，Me-27)，1.58(1H，m，Hb-6)，1.55(1H，m，Ha-11)，1.52(1H，m，Hb-15)，1.51(1H，m，Hb-7)，1.45(1H，m，Ha-6)，1.42(1H，m，H-9)，1.39(1H，Ha-16)，1.31(1H，m，Ha-7)，1.20(3H，s，Me-28α)，1.03(1H，m，Ha-15)，1.03(3H，s，Me-29β)，0.98(3H，s，19β)，0.95(3H，s，Me-α)，0.89(1H，m，Ha-1)，0.87(3H，s，Me-1β)0.85(3H，t，J＝7.5Hz，脂肪酸末端Me)，0.79(1H，d，J＝11.0Hz，H-5)。¹³C-NMR(125MHz，py-d₅)δ：

其归属详见表1，它的碳归属与M1比较，在¹³C-NMR波谱上，葡萄糖残基的C₆信号由δ62.7向低场位移到δ64.5(Δ1.8)；在¹H-NMR波谱上，葡萄糖残基的-CH₂OH信号由δ4.44(1H，d，J＝11.0Hz，glc-Ha-6)和4.27(1H，m，glc-Hb-6)分别向低场位移到δ5.05(1H，d，J＝10.1Hz，glc-Ha-6)和4.65(1H，dd，J＝7.0，11.0Hz，glc-Hb-6)。而C3信号(δ77.9)和H-3α信号[δ3.40(1H，m)]完全一样。在HMBC谱，δ5.05(1H，d，J＝10.1Hz，glc-Ha-6)和4.65(1H，dd，J＝7.0，11.0Hz，glc-Hb-6)皆与脂肪酰基δ173.3(CO)有HMBC关系。因此，脂肪酸残基与葡萄糖残基的-CH₂OH成酯键结合。由于M1的分子量为622，硬脂酸(Stearic acid)的分子量为284(C₁₈H₃₆O₂)，两者的缩合产物分子量为888，此与所测分子量吻合。确定化合物6为M1的硬脂酸酯，确定名为：20-(S)-原人参二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖-6-O-硬脂酸酯。

OM1为无色透明油状物，溶于氯仿、甲醇。在TLC板上展开后喷雾10％H2SO4试剂呈现紫红色；Liebermann-Burchard反应呈阳性；Molish反应呈阳性。提示有三萜皂苷类化合物存在。

TOF-MS谱中，m/z[M+H]+为887.5可知其分子量为886。

¹³C-NMR(125MHz，py-d₅)δ：其归属详见表1，它的碳归属与M1比较，在¹³C-NMR波谱上，葡萄糖残基的C₆信号由δ62.7向低场位移到δ64.7(Δ2.0)；在¹H-NMR波谱上，葡萄糖残基的-CH₂OH信号由δ4.44(1H，d，J＝11.0Hz，glc-Ha-6)和4.27(1H，m，glc-Hb-6)分别向低场位移到δ5.02(1H，d，J＝11.0Hz，glc-Ha-6)和4.63(1H，d，J＝7.0，11.0Hz，glc-Hb-6)。而C3信号(δ78.0)和H-3α信号[δ3.39(1H，dd，J＝5.0，11.0Hz)]完全一致。因此，脂肪酸残基与葡萄糖残基的CH₂OH脱水缩合。由于M1的分子量为622，油酸的分子量为282(C₁₈H₃₄O₂)，两者的缩合产物分子量为860，此与所测分子量吻合。确定名为：20-(S)-原人参二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖-6-O-油酸酯。

上述2个物质具有相似的生理活性，均属于本发明的保护范围。

表1化合物SM1和OM1的¹³C-NMR数据

Compound

C

SM1 OM1

1 39.2 39.3

2 28.1 28.1

3 77.9 77.9

4 39.3 39.4

5 56.1 56.2

6 18.5 18.6

7 34.9 35.0

8 39.9 39.9

9 50.1 50.2

10 37.1 37.2

11 30.8 30.7

12 69.9 70.1

13 49.3 49.3

14 51.3 51.3

15 30.5 30.7

16 26.5 26.5

17 51.2 51.5

18 16.1 16.2

19 15.8 15.9

20 83.2 83.2

21 22.7 22.3

22 35.9 36.0

23 22.8 23.1

24 125.8 125.8

25 130.7 130.8

26 25.6 25.7

27 17.6 17.7

28 28.5 28.6

29 16.1 16.2

30 17.2 17.3

1’ 97.8 98.1

2’ 74.8 75.0

3’ 79.0 79.2

4’ 71.4 71.5

5’ 77.8 78.2

6’ 64.5 64.7

1” 173.3 173.0

2” 34.2 33.8

3” 25.1 25.0

4” 30.8 29.9

5” 29.3 28.6

6” 29.4 29.8

7” 29.4 29.3

8” 29.8 40.9

9” 29.8 129.2

10” 29.8 130.1

11” 29.8 41.2

12” 29.8 31.0

13” 29.6 29.5

14” 30.5 30.3

15” 29.8 30.1

16” 31.9 32.1

17” 22.7 22.6

18” 14.1 14.2

经过药理学实验筛选，上述化合物具有抗癌生理活性。

本发明的药物组合物含有上述化合物为活性成分，以及含有一种或多种药学上可以接受的载体。

本发明的化合物和组合物可用于治疗癌症。

上文中的载体是指药学领域常规的药物载体，包括稀释剂、赋形剂，填充剂，黏合剂，崩解剂，吸收促进剂，表面活性剂，吸附载体。

本发明可以组合物的形式通过口服、直肠、静脉、肌肉或胃肠外给药方式施用于癌症治疗患者。按照药学领域的常规生产方法制备各种剂型如片剂、冲剂、胶囊、栓剂、喷雾剂、缓释剂和注射剂。也可以使其活性成分与一种或多种载体或药物混合，制成所需剂型。

本发明的药物组合物为1％-99.5％活性成分，优选5％-85％，最好为90％以上的本发明的化合物。

本发明的施药量可根据用药途径、患者年龄、体重、疾病类型和严重程度等变化，日剂量为0.1-10mg/kg。

人参皂苷次级苷compound K的脂肪酸酯类化合物OM1和SM1的合成、分离和结构鉴定，阐明了它们功能主治的物质基础，具有抗癌作用。

下述的药理实验证实了本发明化合物的抗癌药理活性。

实验例1 OM1的抗癌(黑色素瘤)作用

1实验材料与方法

1.1肝脏移植黑色素瘤

实验动物：ICR小鼠，♀♂各半，体重18～22g，12-16周龄，选取小鼠30只，随机分为3组，12小时黑白循环，随时供应食物和水。

方法：小鼠腹腔注射戊巴比妥(50mg/kg)麻醉，并肝内注射B16F-10肿瘤细胞(2×10⁵个细胞)作为对照；小鼠肝内注射B16F-10肿瘤细胞(2×10⁵个细胞)和M1(5mg/kg)；小鼠肝内注射B16F-10肿瘤细胞(2×10⁵个细胞)和OM1(5mg/kg)。10天后，宰杀小鼠摘除肝脏，称量癌肿瘤重量。结果：如图1-1所示，图中每个柱型代表6只鼠肿瘤重量的平均值(EM±SD)。#，p＜0.002与对照比较；^*p＜0.02与M1比较。

2数据的统计学处理

实验数据的统计采用t-检验法；结果以均数加减标准差( x±S)表示。

参照图1-1，M1与OM1对B16F-10黑色素瘤肝内移植后，肿瘤生长的作用。小鼠单独肝内注射B16F-10肿瘤细胞(对照)；小鼠肝内注射B16F-10肿瘤细胞和M1(5mg/kg)；小鼠肝内注射B16F-10肿瘤细胞和OM1(5mg/kg)。10天后，宰杀小鼠摘除肝脏，称量癌肿瘤重量。图中每个柱型代表6只鼠肿瘤重量的平均值(EM±SD)。#，p＜0.002与对照比较；^*p＜0.02与M1比较。

研究结果表明，M1形成脂肪酸酯以后，抗癌活性明显增强(见图1)。

实验例1-2 SM1的抗癌(黑色素瘤)作用

1实验材料与方法

1.1肝脏移植黑色素瘤

方法：小鼠腹腔注射戊巴比妥(50mg/kg)麻醉，并肝内注射B16F-10肿瘤细胞(2×10⁵个细胞)作为对照；小鼠肝内注射B16F-10肿瘤细胞(2×10⁵个细胞)和M1(5mg/kg)；小鼠肝内注射B16F-10肿瘤细胞(2×10⁵个细胞)和SM1(5mg/kg)。10天后，宰杀小鼠摘除肝脏，称量癌肿瘤重量。结果：如图1-2所示，图中每个柱型代表6只鼠肿瘤重量的平均值(EM±SD)。#，p＜0.002与对照比较；^*p＜0.02与M1比较。

2数据的统计学处理

小鼠单独肝内注射B16F-10肿瘤细胞(对照)；小鼠肝内注射B16F-10肿瘤细胞和M1(5mg/kg)；小鼠肝内注射B16F-10肿瘤细胞和SM1(5mg/kg)。10天后，宰杀小鼠摘除肝脏，称量癌肿瘤重量。图中每个柱型代表6只鼠肿瘤重量的平均值(EM±SD)。#，p＜0.002与对照比较；^*p＜0.01与M1比较。

研究结果表明，M1形成脂肪酸酯以后，抗癌活性明显增强(图1-2)。

实验例2-1 M1和OM1的静脉给药之后在肝脏中的滞留时间

实验材料与方法

实验动物：ICR小鼠，♀♂各半，体重18～22g，12-16周龄。

方法：，小鼠分别单独静脉注射M1或OM1(30mg/kg)。在给药后的指定时间宰杀小鼠，立即取出肝脏，用6ml生理盐水均质化，用40ml乙酸乙酯萃取2次，乙酸乙酯层减压浓缩至干。供HPLC分析。

结果：如图2-1所示。M1给药后不久选择性的进入肝脏，在10分钟内达到最高峰，并且迅速的从肝脏中清除；而OM1迅速在肝脏中积累，且OM1随着时间的推移逐渐减少，超过剂量25％的OM1可以在肝脏保留24小时。

实验例2-2 M1和SM1的静脉给药之后在肝脏中的滞留时间

实验材料与方法

实验动物：ICR小鼠，♀♂各半，体重18～22g，12-16周龄。方法：，小鼠分别单独静脉注射M1或SM1(30mg/kg)。在给药后的指定时间宰杀小鼠，立即取出肝脏，用6ml生理盐水均质化，用40ml乙酸乙酯萃取2次，乙酸乙酯层减压浓缩至干。供HPLC分析。

结果：如图2-2所示。M1给药后不久选择性的进入肝脏，在10分钟内达到最高峰，并且迅速的从肝脏中清除；而SM1迅速在肝脏中积累，且SM1随着时间的推移逐渐减少，超过剂量27％的SM1可以在肝脏保留24小时。

实验例3-1 OM1对小鼠脾内注射B16F-10细胞引起的肝转移的作用

实验动物：ICR小鼠，♀♂各半，体重18～22g，12-16周龄。

实验方法：小鼠腹腔注射戊巴比妥(50mg/kg)麻醉，小鼠脾内注射B16F-10细胞(2×10⁵个细胞/鼠)造成肝转移。在癌接种后的0，2，和4天静脉注射OM1(30mg/kg)。至接种第7日摘除具有早期癌变的脾。17日后宰杀小鼠计数肝脏中癌转移的数目。

实验结果：评价OM1抗癌转移作用，小鼠脾内注射B16F-10细胞，造成肝转移。三次连续静脉注射OM1(30mg/kg)，对小鼠体重没有明显影响。表明没有毒性反应。如图3-1A所示，OM1对脾癌肿瘤无抑制作用，但能明显抑制肝的转移(图3-1C)。另外OM1处理的小鼠脾的重量明显增加(图3-1A)。

在癌接种后的0，2，和4天静脉注射OM1(30mg/kg)。至接种7日摘除具有早期癌变的脾。17日后宰杀小鼠计数肝脏中癌转移的数目。图中每个柱型代表5只鼠的平均值(EM±SD)。^*，p＜0.02；#，p＜0.002与对照比较。A：实心柱肿瘤重量，空心柱表示无癌的脾重量(在第7天时)。B：在第7天时，肝脏中的癌群落数。C：肝脏转移的照片。

实验例3-2 SM1对小鼠脾内注射B16F-10细胞引起的肝转移的作用

实验动物：ICR小鼠，♀♂各半，体重18～22g，12-16周龄。

实验方法：小鼠腹腔注射戊巴比妥(50mg/kg)麻醉，小鼠脾内注射B16F-10细胞(2×10⁵个细胞/鼠)造成肝转移。在癌接种后的0，2，和4天静脉注射SM1(30mg/kg)。至接种第7日摘除具有早期癌变的脾。17日后宰杀小鼠计数肝脏中癌转移的数目。

实验结果：评价SM1抗癌转移作用，小鼠脾内注射B16F-10细胞，造成肝转移。三次连续静脉注射SM1(30mg/kg)，对小鼠体重没有明显影响。表明没有毒性反应。如图3-2A所示，SM1对脾癌肿瘤无抑制作用，但能明显抑制肝的转移(图3-2C)。另外SM1处理的小鼠脾的重量明显增加(图3-2A)。

实验例4-1 OM1处理的脾淋巴细胞对B16-F10细胞毒性作用

1实验方法：

1.1淋巴细胞的制备使肝脏或脾通过不锈钢筛网悬浮在红细胞溶解液[0.17 MNH₄Cl，0.01mM EDTA，0.1M Tris(pH 7.3)]中，100xg室温离心6′。细胞颗粒用全介质洗2次，肝脏培养的淋巴细胞和20μM 2-巯基乙醇加到全介质中。

1.2癌细胞毒性作用测定：癌细胞(1×10⁶/孔)同肝脏或脾淋巴细胞3×10⁶/孔)在全介质中培养，并且OM1(0.1-10μM)存在或不存在的条件下，5％ CO₂气中，37℃培养。3天以后，用胰蛋白酶收集粘连细胞并在显微镜下观察测定癌细胞数。另一组脾淋巴细胞(1×10⁶)事先用OM1(0-240μM)处理。2天以后，脾淋巴细胞被分成粘连细胞和非粘连细胞并且立即分别与B16-F10细胞(2×10⁴)培养。平行实验：癌细胞与OM1单独培养。1天以后，用胰蛋白酶收集粘连细胞并测定癌细胞数。淋巴细胞溶解癌细胞的能力应用下述公式计算：溶解力(％)＝(1-试验组/对照组)×100，其中试验组＝癌细胞同淋巴细胞在OM1存在或不存在的条件下，培养的癌细胞数；对照组＝没有淋巴细胞培养的癌细胞数。

2数据的统计学处理

3结果：如图4-1所示，癌细胞与预先用OM1处理的非粘连细胞培养，随着浓度的变化，癌细胞生长抑制率增加。而粘连细胞对癌细胞的生长没有抑制作用。M1也没有作用。这些结果表明OM1对癌细胞生长和转移的抑制作用，可能是与非粘连细胞对破坏的癌细胞状态的刺激和活化有关。

用OM1预处理2天的脾淋巴细胞分成两组：粘连细胞和非粘连细胞并且分别与B16-F10细胞培养。平行实验：癌细胞与OM1单独培养。1天以后，用胰蛋白酶获得粘连细胞并测定癌细胞数。每个点表示3个盘平均数(EM±SD)。□，粘连细胞；□，非粘连细胞；□，OM1单独。^*，p＜0.01；^**p＜0.02与对照比较。

实验例4-2 SM1处理的脾淋巴细胞对B16-F10细胞毒性作用

1实验方法：

1.1淋巴细胞的制备使肝脏或脾通过不锈钢筛网悬浮在红细胞溶解液[0.17MNH₄Cl，0.01mM EDTA，0.1M Tris(pH 7.3)]中，100xg室温离心6′。细胞颗粒用全介质洗2次，肝脏培养的淋巴细胞和20μM 2-巯基乙醇加到全介质中。

1.2癌细胞毒性作用测定：癌细胞(1×10⁶/孔)同肝脏或脾淋巴细胞3×10⁶/孔)在全介质中培养，并且SM1(0.1-10μM)存在或不存在的条件下，5％CO₂气中，37℃培养。3天以后，用胰蛋白酶收集粘连细胞并在显微镜下观察测定癌细胞数。另一组脾淋巴细胞(1×10⁶)事先用SM1(0-240μM)处理。2天以后，脾淋巴细胞被分成粘连细胞和非粘连细胞并且立即分别与B16-F10细胞(2×10⁴)培养。平行实验：癌细胞与SM1单独培养。1天以后，用胰蛋白酶收集粘连细胞并测定癌细胞数。淋巴细胞溶解癌细胞的能力应用下述公式计算：溶解力(％)＝(1-试验组/对照组)×100，其中试验组＝癌细胞同淋巴细胞在SM1存在或不存在的条件下，培养的癌细胞数；对照组＝没有淋巴细胞培养的癌细胞数。

2数据的统计学处理

3结果：如图4-2所示，癌细胞与预先用SM1处理的非粘连细胞培养，随着浓度的变化，癌细胞生长抑制率增加。而粘连细胞对癌细胞的生长没有抑制作用。M1也没有作用。这些结果表明SM1对癌细胞生长和转移的抑制作用，可能是与非粘连细胞对破坏的癌细胞状态的刺激和活化有关。

用SM1预处理2天的脾淋巴细胞分成两组：粘连细胞和非粘连细胞并且分别与B16-F10细胞培养。平行实验：癌细胞与SM1单独培养。1天以后，用胰蛋白酶获得粘连细胞并测定癌细胞数。每个点表示3个盘平均数(EM±SD)。□，粘连细胞；□，非粘连细胞；□，SM1单独。^*，p＜0.01；^**p＜0.02与对照比较。

4讨论

研究表明M1的脂肪酸酯明显增强了M1的抗癌活性。通过M1、OM1的药代动力学研究发现，M1脂肪酸酯化形成OM1提高了其体内抗肿瘤活性。在小鼠接种肝肿瘤细胞的同时给药M1或OM1，M1处理组抑制率为23％，但与对照组比较差异不明显；相同剂量的OM1处理明显抑制肿瘤生长，与对照组比较差异极显著，与M1处理组比较差异也显著。M1给药后不久选择性的进入肝脏，在10分钟内达到最高峰，并且迅速的从肝脏中排出；OM1迅速地在肝脏中积累，且OM1随着时间的推移逐渐减少，超过剂量25％的OM1(湿组织μg/g)可以在肝脏中存留24小时。据报导脂肪酸酯化后的阿糖胞苷治疗血液恶性肿瘤比阿糖胞苷本身更有效。因此，OM1抗肿瘤活性的增强可能与它在肝中的停留时间延长有关。

口服人参皂苷后，在肠内菌作用下代谢形成次级苷和苷元。小鼠口服Rb2，发现Rb2在胃液中只发生了轻微的氧化作用，不能被分解。将Rb1与大鼠胃肠的内容物一同培养，结果发现只有当Rb1与大肠的内容物共同培养时，Rb1才代谢成M1(又称Compound K)。这个现象在小鼠口服Rb1后同样观察得到。这个结果表明是肠内菌将Rb1代谢成M1(Compound K)。

当大鼠口服给药，人参皂苷和皂苷代谢物二者都有明显的抗转移作用；然而，静脉注射给药时，人参皂苷的肠内菌代谢物有明显抑制肿瘤转移的作用，但是人参皂苷本身却没有。因此，口服人参皂苷后不是皂苷而是它们的肠内菌代谢物在肠中被吸收并发挥作用。

OM1通过淋巴细胞，特别是非粘连的脾细胞调节促进肿瘤细胞的溶解，凋亡。OM1诱导宿主细胞免疫调节作用要比M1强烈的多。

因此，人参的抗癌活性源于口服人参后经肠内菌代谢形成的代谢物M1和肝内脂肪酸酯化形成的脂肪酸酯OM1，肠内菌代谢物M1具有抗癌作用；代谢物的脂肪酸酯OM1具有更强的抗癌活性。

实验例5硬脂酸酯SM1抗肿瘤活性的评价

5.1材料与方法

5.1.1材料

化学药品及供试样品：SM1由本实验合成，纯度97％。吐温购自上海华联制药有限公司，批号020803，环磷酰胺购自中国医药(集团)上海化学试剂公司，批号20001110。

实验动物：ICR小鼠，♀♂各半，体重18～22g，由吉林大学基础医学院实验动物中心提供。实验动物饲养在顶部为铁线栅栏的塑料笼子里，底部铺有锯末，12小时黑白循环，随时供应食物和水。

5.1.2方法

采用动物移植瘤模型，以生理盐水组、阳性药环磷酰胺组作对照，对SM1抗癌活性进行筛选评价，以具体操作如下：

A.SM1对小鼠肝癌腹水型(HepA)细胞生长的抑制作用：将小鼠腹腔内传代7天的瘤细胞(HepA)在无菌条件下取出，用生理盐水洗涤2次，用生理盐水稀释，记数每毫升中瘤细胞数，调整细胞浓度至1×107·ml-1，给受体小鼠作腹腔注射，每只小鼠右腋窝皮下接种0.2ml瘤液。小鼠成活率100％，对宿主的影响类似，个体间差异很小。选取小鼠30只，随机分为3组，(注射生理盐水组、阳性药环磷酰胺组、SM1给药组)，次日腹腔给药，阳性药环磷酰胺组小鼠给药剂量30mg/kg间日给药、SM1给药组小鼠给药剂量20mg/kg/day。连续10天，停药后24小时脱颈处死小鼠，剥离出肿瘤电子称称重，计算肿瘤抑制百分率。

B.SM1对小鼠胃癌(MFC)细胞生长的抑制作用：将小鼠腹腔内传代7天的瘤细胞(MFC)在无菌条件下取出，用生理盐水洗涤2次，用生理盐水稀释，记数每毫升中瘤细胞数，调整细胞浓度至1×107·ml-1，给受体小鼠作腹腔注射，每只小鼠右腋窝皮下接种0.2ml瘤液。小鼠成活率100％，对宿主的影响类似，个体间差异很小。选取小鼠30只，随机分为3组，(注射生理盐水组、阳性药环磷酰胺组、SM1给药组)，次日腹腔给药，阳性药环磷酰胺组小鼠给药剂量30mg/kg间日给药、SM1给药组小鼠给药剂量20mg/kg/day。连续10天，停药后24小时脱颈处死小鼠，剥离出肿瘤电子称称重，计算肿瘤抑制百分率。

5.1.3数据的统计分析

肿瘤抑制率(％)＝(1-T/C)×100％

T：实验组平均瘤重 C：对照组平均瘤重

5.1.4结果

A.SM1对小鼠肝癌(HepA)细胞生长的抑制作用

SM1给药组瘤重明显低于生理盐水处理的对照组，与对照组比较差异极显著(p＜0.001)，说明SM1显著抑制了小鼠体内肝癌细胞的生长，SM1给药组与阳性药环磷酰胺组比较作用不及环磷酰胺，SM1给药组肿瘤抑制率为51.66％，阳性药环磷酰胺组肿瘤抑制率为71.15％。结果见表1，图1，图3。

表5-1不同处理对小鼠肿瘤细胞(HepA)的影响

Group N Tumor weight(g) Inhibitory rate(％)

Control 10 2.97±0.54 ——

CTX 30mg/kg 10 0.86±0.35*** 71.15

SM1 20mg/kg 10 1.44±0.57*** 51.66

***P＜0.001 as compared with control group

5.2讨论

药理学中药抗肿瘤作用的实验方法中规定，当中药的瘤重抑制率＞30％，并经统计学处理有显著差异的，就可评定此药有抗癌疗效。SM1对小鼠肝肿瘤(HepA)、胃肿瘤(MFC)的抑制效果大大优于中药抗肿瘤的评定标准，可以确定SM1有明显的抗肿瘤效果。此外，SM1给药小鼠药理学观察，无死亡，无不良反应，生理特征、体重与对照组比较没有明显变化，初步断定SM1无毒副作用。由此可见，SM1结构清楚、效果显著、安全稳定，经进一步药理、临床实验，创新研发出一类抗癌新药前景光明。

在评价SM1的抗肿瘤活性时，引入了环磷酰胺作阳性对照。环磷酰胺是化学抗肿瘤药物，主要是干扰DNA、RNA的功能，抑制DNA的合成，有极显著的抗肿瘤效果，但其副作用非常强烈。SM1的抗肿瘤效果虽不如环磷酰胺，但它的抗癌作用是通过抗转移、抑制新血管形成、增强免疫调节来实现的，没有毒副作用。SM1的开发新药可以达到低毒高效、安全可靠的效果。

在SM1的药理实验中，配制SM1的给药溶液时，SM1加入吐温溶解很好，但加入生理盐水后，溶解不好并有少量结晶析出，间接影响SM1的抗癌效果。因此，制剂、给药途径及方法有待于深入研究。这一领域的突破有利于SM1抗癌活性的表达。

最新的人参皂苷药代动力学研究表明：M1的脂肪酸酯是由肠内菌的代谢产物M1在肝脏中脂肪酸酯化，形成的一系列脂肪酸(包括硬脂酸、油酸、棕榈酸或软脂酸)的M1单酯混合物。M1的酯化过程代表一个解毒过程，就象胆固醇的酯化预防了胆固醇过量摄取产生细胞毒一样。此外，M1的酯化延迟了M1在肝脏的排泄，加强了对宿主细胞的免疫调节。因此，M1酯化成EM1，降低了细胞毒性，提高了抗癌活性。研究发现陆生高等动物的体脂中的脂肪酸主要为硬脂酸、软脂酸和油酸，人肝脏中的三萜酯80％是硬脂酸酯、20％是软脂酸酯。

附图说明：

图1-1：M1与OM1对B16F-10黑色素瘤肝内移植后，肿瘤生长的作用。

图1-2 M1与SM1对B16F-10黑色素瘤肝内移植后，肿瘤生长的作用。

图2-1：M1与OM1静脉给药之后在肝脏中的滞留时间。

图2-2：M1与SM1静脉给药之后在肝脏中的滞留时间。

图3-1A、B、C：OM1对小鼠脾内注射B16F-10细胞引起的肝转移的作用。

图3-2 A、B、C：SM1对小鼠脾内注射B16F-10细胞引起的肝转移的作用。

图4-1：OM1处理的脾淋巴细胞对B16-F10细胞毒性作用。

图4-2 SM1处理的脾淋巴细胞对B16-F10细胞毒性作用。

图5-1：SM1对肝癌肿瘤的抑制作用。

图5-2：OM1对肝癌肿瘤的抑制作用。

具体实施方式：

实施例1

取M1 30g溶于1000ml乙酸乙酯中，在搅拌条件下加入1000ml水饱和碳酸氢钠，在冰水浴条件下加入油酸酰氯720g，室温下搅拌过夜。然后用分液漏斗将乙酸乙酯层和水层分离，并用乙酸乙酯反复萃取水层，将乙酸乙酯合并，离心(3000rpm)，上清液用水反复冲洗，乙酸乙酯在低温下(20-30℃)条件下减压回收，残渣用甲醇溶解、过滤，甲醇液减压浓缩得干物质。

实施例2

取M140g溶于1200ml乙酸乙酯中，在搅拌条件下加入1000ml水饱和碳酸氢钠，在冰水浴条件下加入油酸酰氯700g，室温下搅拌过夜。然后用分液漏斗将乙酸乙酯层和水层分离，并用乙酸乙酯反复萃取水层，将乙酸乙酯合并，离心(3000rpm)，上清液用水反复冲洗，乙酸乙酯在低温下20℃)条件下减压回收，残渣用甲醇溶解、过滤，甲醇液减压浓缩得干物质。

实施例3

取M1 50g溶于1500ml乙酸乙酯中，在搅拌条件下加入1500ml水饱和碳酸氢钠，在冰水浴条件下加入油酸酰氯720g，室温下搅拌过夜。然后用分液漏斗将乙酸乙酯层和水层分离，并用乙酸乙酯反复萃取水层，将乙酸乙酯合并，离心(3000rpm)，上清液用水反复冲洗，乙酸乙酯在30℃条件下减压回收，残渣用甲醇溶解、过滤，甲醇液减压浓缩得干物质。

实施例4

将实施例1、2、3所得物质经HPLC，C-18柱100％甲醇洗脱，分别得到SM1(20-(S)-原人参二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖-6-O-油酸酯8g、10g、12g。

实施例5

将实施例1、2、3所得物质经HPLC，C-18柱100％甲醇洗脱，得到OM1[20-(S)-原人参二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖-6-O-硬脂酸酯]4g、6g、8g。

实施例6

抗癌片剂的制备

取实施例4或实施例5制备的化合物10g，加入赋形剂药用环糊精30g，混合均匀，造粒压片，制得片剂，每片含M1的脂肪酸酯10mg。

实施例4

抗癌胶囊的制备

取实施例4或实施例5制备的化合物10g，加入赋形剂药用环糊精10g，混合均匀，造粒，装入胶囊，每粒含M1的脂肪酸酯10mg。

实施例5

抗癌注射剂的制备

取实施例4或实施例5制备的化合物10g，加入药用丙二醇200ml，注射用水800ml，溶解，膜过滤；膜过滤(0.2μm)，分装，每瓶2ml，含M1的脂肪酸酯20mg。所有操作均应在无菌条件下进行。

Claims

1一种具有药用价值的人参皂苷次级苷compound K的脂肪酸酯类化合物，具有以下结构通式：

其中，R为油酰或硬脂酰。

2、权利要求1化合物的制备方法，包括以下步骤：

1)取M1 30-50g溶于1000-1500ml乙酸乙酯中，在搅拌条件下加入1000-1500ml水饱和碳酸氢钠，在冰水浴条件下加入油酸酰氯430～720g，室温下搅拌过夜；然后用分液漏斗将乙酸乙酯层和水层分离，并用乙酸乙酯反复萃取水层，将乙酸乙酯合并，离心，上清液用水反复冲洗，减压回收乙酸乙酯，干物质用甲醇溶解、过滤，甲醇液减压浓缩得干物质；

2)将所得物质经HPLC，C-18柱甲醇洗脱，分别得到20-(S)-原人参二醇-20-O-B-D-吡喃葡萄糖-6-O-油酸酯；20-(S)-原人参二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖-6-O-硬脂酸酯。

3、根据权利要求1中任意一项的化合物在制备抗癌作用的药物中的应用。

4、用于制备抗癌的药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1化合物和药学上可接受的载体。