CN1586636A - 将水凝胶复合到多孔组织工程支架中的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种将水凝胶复合到多孔组织工程支架中的方法。该方法是是在溶胶状态下将水凝胶导入到多孔支架中，然后改变外部条件使溶胶凝胶化，获得复合水凝胶的多孔支架。根据需要，水凝胶溶胶中还可添加细胞生长与分化的细胞生长因子。本发明方法制得的支架同时具备多孔支架的良好的机械性能和水凝胶支架的优良的生物相容性能。本发明适用范围广，适用于多种结构和组成的多孔支架和水凝胶，以及多种细胞；制备工艺简单，重复性好，所制备的支架可以广泛地应用于组织工程领域。
Description
技术领域
本发明涉及将水凝胶复合到多孔组织工程支架中的方法。
背景技术
利用天然或者合成材料模拟细胞外基质，使其与细胞结合，进而促进和诱导细胞生长形成组织或器官，以达到修复或重建人体器官缺损的目的，已成为组织工程研究中广为认同的方法。细胞支架的制备及其与细胞间的结合，是组织工程需要解决的重要问题。
根据组织再生支架的形态结构，目前大量使用的支架分为两类：多孔支架和水凝胶支架。多孔支架由材料和材料间的间隙组成，在干态情况下，该间隙通常为空气；在细胞培养环境中，该间隙通常为培养基。目前，已发展了多种方法制备各种结构的多孔支架，如致孔剂法、热致相分离法、纤维编织法、乳液冻干法、微球堆积法、3维-印刷法等。多孔支架具有较好的机械强度和易调控的降解速率；容易宏观塑型，在组织再生期间也能够保持良好的宏观形状。但是这类支架也存在明显的缺点。在体外培养条件下，多数体细胞具有贴壁生长特性，但是细胞的贴壁生长与其体内状态下的被基质包围生长有明显的区别，细胞更容易去分化而失去生物学功能。细胞在孔壁上长时间生长分裂后，由于受到生长空间的限制而发生接触抑制，无法继续分裂，导致多孔支架上能够附着的细胞数较天然状态的组织要小，而且分布不平均。此外，由于多数合成材料的生物惰性，还必须对支架进行生物相容性的改进，增加了制备工艺的复杂性。水凝胶支架也是由材料与间隙构成，该材料通常为天然的或合成的亲水性高分子。聚合物材料形成纤细的凝胶网络，其间含有大量的水。但这些水不是自由的，因受周围水化高分子的束缚而处于高度结合的状态。因此，水凝胶类支架与细胞外基质具有类似的结构和性能，尤其是天然大分子水凝胶材料有着优良的生物相容性，能够为细胞的生长与分化提供更接近于体内的生长环境。同时，细胞分散在水凝胶中，具有更大的生长空间。这类支架同样存在明显的缺点，即机械强度普遍较差，宏观塑型困难，在组织再生期间也无法保持良好的宏观形状，因此不能有效控制再生器官的形状；同时，可操作性相对较差。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作过程简单、适用范围广的将水凝胶复合到多孔组织工程支架中的方法，以获得同时具有良好机械性能和细胞相容性的组织工程支架。
本发明的将水凝胶复合到多孔组织工程支架中的方法是在溶胶状态下将水凝胶导入到多孔支架中，然后改变外部条件使溶胶凝胶化，获得复合水凝胶的多孔支架。
本发明的将水凝胶复合到多孔组织工程支架中的方法，有三种技术解决方案。
方案一、将水凝胶复合到多孔组织工程支架中的方法，具体包括以下步骤：
1)4℃～120℃下将琼脂溶解于水中制备成水凝胶的溶胶，再与等体积的含细胞的培养基溶液混合，得到的溶胶重量体积浓度为0.5～5％；
2)将多孔支架进行灭菌处理，再用磷酸缓冲液预先润湿；
3)将溶胶滴加到多孔支架的表面，在重力和毛细作用下，将溶胶导入支架内部；或将支架浸入到水凝胶溶胶中，将水凝胶吸附到多孔支架内部；
4)将复合有溶胶的支架在15℃～40℃下放置至少10分钟，即得到负载了水凝胶的多孔支架。
通常为了提高这种复合支架的生物学性能，可在琼脂中混入明胶或/和细胞生长因子，明胶用量与琼脂用量的比例是1∶1～1∶100，细胞生长因子用量与琼脂用量的比例是1∶10,000～1∶1,000,000。所说的细胞生长因子可以是碱性促成纤维细胞生长因子、酸性促成纤维细胞生长因子、骨形成蛋白或转化因子β。
方案二、将水凝胶复合到多孔组织工程支架中的方法，具体包括以下步骤：
1)在4℃～120℃下将海藻酸钠溶解于水中制备成水凝胶的溶胶，再与等体积的含细胞的培养基溶液混合，得到的溶胶重量体积浓度为0.5～5％；
2)将多孔支架进行灭菌处理，再用磷酸缓冲液预先润湿；
3)将溶胶滴加到多孔支架的表面，在重力和毛细作用下，将溶胶导入支架内部；或将支架浸入到水凝胶溶胶中，将水凝胶吸附到多孔支架内部；
4)将复合有溶胶的支架置于0.1％～2％乳酸钙溶液中至少5分钟，即得到负载了水凝胶的多孔支架。
通常为了提高这种复合支架的生物学性能，可在海藻酸钠中混入明胶或/和细胞生长因子，明胶用量与海藻酸钠用量的比例是1∶1～1∶100，细胞生长因子用量与海藻酸钠用量的比例是1∶10,000～1∶1,000,000。所说的细胞生长因子可以是碱性促成纤维细胞生长因子、酸性促成纤维细胞生长因子、骨形成蛋白或转化因子β。
方案三、将水凝胶复合到多孔组织工程支架中的方法，具体包括以下步骤：
1)在4℃～120℃下将壳聚糖与1～5倍重量的磷酸甘油脂二钠盐混合物，或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，或聚异丙基丙烯酰胺溶解于水中制备成水凝胶的溶胶，再与等体积的含细胞的培养基溶液混合，得到溶胶的重量体积浓度为0.5～5％；
2)将多孔支架进行灭菌处理，再用磷酸缓冲液预先润湿；
3)将溶胶滴加到多孔支架的表面，在重力和毛细作用下，将溶胶导入支架内部；或将支架浸入到水凝胶溶胶中，将水凝胶吸附到多孔支架内部；
4)将复合有溶胶的支架置于30℃～40℃条件下至少5分钟，即得到负载了水凝胶的多孔支架。
本发明的上述三种技术解决方案中所说的多孔支架可以是聚合物类多孔支架，包括聚乳酸、胶原、乳酸-乙醇酸共聚物、聚己内酯、聚氨酯或聚苯乙烯支架，也可以是陶瓷类多孔支架，包括多孔羟基磷灰石、磷酸三钙或生物玻璃支架。
本发明的上述三种技术解决方案中所说的细胞包括但不限于软骨细胞、成骨细胞、肝细胞、成纤维细胞或平滑肌细胞。
本发明结合了多孔支架和水凝胶支架的优点，既保持了多孔支架的良好的机械性能、宏观塑型性能和宏观形状保持能力，又具有了水凝胶支架的良好的仿细胞外基质结构和生物相容性能。通过改变溶胶的组分，对于不同的细胞，可以有针对性的加入各种促细胞生长和分化因子，从而更进一步的改善支架的生物学性能，方法简单有效。本发明适用范围广，适用于多种结构和组成的多孔支架和水凝胶，以及多种细胞；制备工艺简单，重复性好，所制备的支架可以广泛地应用于组织工程领域。本发明为组织工程研究中细胞与支架的最佳结合提供一种切实可行的方法。通过本发明制备的多孔支架可以广泛地应用于皮肤、软骨、骨、肝脏、血管、气管、食管、肌腱、心脏瓣膜等多种组织或器官的重建和再生。
附图说明
图1是软骨细胞在海藻酸钠凝胶复合聚乳酸支架中的分布情况；
图2是软骨细胞在琼脂凝胶复合聚乳酸支架中的分布情况；
图3是软骨细胞在琼脂和明胶凝胶复合聚乳酸支架中的分布情况；
图4是软骨细胞在碱性成纤维细胞生长因子和琼脂凝胶复合聚乳酸支架中的分布情况；
图5是成骨细胞在酸性成纤维细胞生长因子和海藻酸钠凝胶复合胶原支架中的分布情况；
图6a是100微米聚乳酸多孔支架(黑色部分)填充海藻酸钠水凝胶(白色部分)的激光共聚焦显微镜照片；
图6b是300微米聚乳酸多孔支架(黑色部分)填充海藻酸钠水凝胶(白色部分)的激光共聚焦显微镜照片；
图7a是胶原多孔支架的激光共聚焦显微镜照片(罗丹明染色)；
图7b是分布在胶原多孔支架中的海藻酸钠的激光共聚焦显微镜照片(荧光素钠染色)；
图7c是图6a和图6b的复合图。
具体实施方式
以下实例进一步说明本发明，但这些实例并不用来限制本发明。
实施例1 聚乳酸多孔支架导入含软骨细胞的海藻酸钠水凝胶
配置重量体积浓度为2％的海藻酸钠溶胶，放入高压釜中120℃高温灭菌30分钟，冷却至室温后，将海藻酸钠与软骨细胞悬液混合，使最终海藻酸钠的浓度为1％。将平均孔径为300微米，厚度为2-4毫米的聚乳酸支架薄片，置于75％乙醇溶液中浸泡，通过抽真空的办法，将支架中的空气除去，使乙醇溶液完全浸润支架。在乙醇溶液中浸泡一天后，将支架放入pH为7.4的磷酸盐缓冲液中浸泡1天，期间换液3次，以完全置换出支架中的乙醇。将溶胶和细胞混合物滴加在处理后的聚乳酸支架表面。在重力和毛细作用下，溶胶进入支架内部。然后将支架置于0.5％的乳酸钙溶液中15分钟，通过钙离子的交联使海藻酸钠凝胶化。最后，将复合支架置于5％CO2、37℃恒温的培养箱中孵育7天，测试细胞的存活与细胞外基质分泌情况，并与未导入海藻酸钠水凝胶的空白聚乳酸支架相对比，见表1。支架中细胞的形态和分布情况见图1。可见软骨细胞能够均匀分布在复合有海藻酸钠水凝胶的聚乳酸支架中，细胞的活性更高。
表1聚乳酸多孔支架中导入海藻酸钠水凝胶对软骨细胞性能的影响
| 支架 | MTT活性 | 羟脯氨酸(mg/g) | GAG(mg/g) |
| 空白聚乳酸支架 | 100 | 6.22 | 11.47 |
| 海藻酸钠复合聚乳酸支架 | 146.9 | 6.60 | 11.11 |
MTT指的是(3-(4，5-二甲基噻唑)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(噻唑蓝)，测量的细胞活性以空白聚乳酸支架为100进行归一化处理。GAG代表硫酸软骨素。羟脯氨酸与GAG的单位为每克支架中细胞分泌的毫克数。
实施例2聚乳酸多孔支架导入含软骨细胞的琼脂水凝胶
配置重量体积浓度为2％的琼脂溶胶，放入高压釜中120℃高温灭菌30分钟，冷却至45℃左右后，将琼脂溶胶与软骨细胞悬液混合，使最终琼脂的浓度为1％。将平均孔径为300微米，厚度为2-4毫米的聚乳酸支架薄片，置于75％乙醇溶液中浸泡，通过抽真空的办法，将支架中的空气除去，使乙醇溶液完全浸润支架。在乙醇溶液中浸泡一天后，将支架放入pH为7.4的磷酸盐缓冲液中浸泡1天，期间换液3次，以完全置换出支架中的乙醇。将溶胶与细胞的混合物滴加在处理后的聚乳酸支架表面。在重力和毛细作用下，溶胶进入支架内部。然后将支架在25℃下放置15分钟使琼脂凝胶化。最后，将复合支架置于5％CO2、37℃恒温的培养箱中孵育7天，测试细胞的存活与细胞外基质分泌情况，并与未导入琼脂水凝胶的空白聚乳酸支架相对比，见表2。支架中细胞的形态和分布情况见图2。可见软骨细胞能够均匀分布在复合有琼脂水凝胶的聚乳酸支架中，细胞的活性更高，羟脯氨酸和GAG的分泌量更大。
表2聚乳酸多孔支架中导入琼脂水凝胶对软骨细胞性能的影响
| 支架 | MTT活性 | 羟脯氨酸(mg/g) | GAG(mg/g) |
| 空白聚乳酸支架 | 100 | 6.22 | 11.47 |
| 琼脂复合聚乳酸支架 | 201.5 | 9.79 | 67.25 |
实施例3聚乳酸多孔支架导入含软骨细胞的琼脂和明胶水凝胶
配置重量体积浓度各为2％的琼脂、明胶混合溶胶，放入高压釜中120℃高温灭菌30分钟，冷却至45℃左右后，将琼脂溶胶、明胶溶胶与软骨细胞悬液混合，使得最终琼脂和明胶的浓度各为1％。将平均孔径为300微米，厚度为2-4毫米的聚乳酸支架薄片，置于75％乙醇溶液中浸泡，通过抽真空的办法，将支架中的空气除去，使乙醇溶液完全浸润支架。在乙醇溶液中浸泡一天后，将支架放入pH为7.4的磷酸盐缓冲液中浸泡1天，期间换液3次，以完全置换出支架中的乙醇。将溶胶与细胞的混合物滴加在处理后的聚乳酸支架表面。在重力和毛细作用下，溶胶进入支架内部。然后将支架在25℃下放置15分钟使琼脂凝胶化。最后，将复合支架置于5％CO2、37℃恒温的培养箱中孵育7天，测试细胞的存活与细胞外基质分泌情况，并与未导入琼脂水凝胶的空白聚乳酸支架和单纯导入琼脂的聚乳酸支架相对比，见表3。支架中细胞的形态和分布情况见图3。可见软骨细胞能够均匀分布在复合有琼脂和明胶水凝胶的聚乳酸支架中，细胞的活性更高，羟脯氨酸和GAG的分泌量更大。
表3聚乳酸多孔支架中导入琼脂和明胶水凝胶对软骨细胞性能的影响
| 支架 | MTT活性 | 羟脯氨酸(mg/g) | GAG(mg/g) |
| 空白聚乳酸支架 | 100 | 6.22 | 11.47 |
| 琼脂复合聚乳酸支架 | 201.5 | 9.79 | 67.25 |
| 琼脂和明胶复合聚乳酸支架 | 264.5 | -- | 77.62 |
由于明胶分子含有大量的羟脯氨酸，因而添加明胶后无法区分羟脯氨酸是细胞分泌的还是明胶中的。
实施例4聚乳酸多孔支架导入含软骨细胞和碱性促成纤维细胞生长因子的琼脂水凝胶
配置重量体积浓度为2％的琼脂溶胶，放入高压釜中120℃高温灭菌30分钟，冷却至45℃左右后，将琼脂溶胶和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)与软骨细胞悬液混合，使最终琼脂的浓度为1％，bFGF浓度为100μg/mL。将平均孔径为300微米，厚度为2-4毫米的聚乳酸支架薄片，置于75％乙醇溶液中浸泡，通过抽真空的办法，将支架中的空气除去，使乙醇溶液完全浸润支架。在乙醇溶液中浸泡一天后，将支架放入pH为7.4的磷酸盐缓冲液中浸泡1天，期间换液3次，以完全置换出支架中的乙醇。将溶胶与细胞的混合物滴加在处理后的聚乳酸支架表面。在重力和毛细作用下，溶胶进入支架内部。然后将支架在25℃下放置15分钟使琼脂凝胶化。最后，将复合支架置于5％CO2、37℃恒温的培养箱中孵育7天，测试细胞的存活与细胞外基质分泌情况，并与空白聚乳酸支架和单纯导入琼脂水凝胶的聚乳酸支架相对比，见表4。支架中细胞的形态和分布情况见图4。可见软骨细胞能够均匀分布在复合有琼脂水凝胶的聚乳酸支架中，细胞的活性有非常显著的提高，羟脯氨酸和GAG的分泌量与单纯琼脂填充无显著区别。
表4 聚乳酸多孔支架中导入bFGF和琼脂水凝胶对软骨细胞性能的影响
| 支架 | MTT活性 | 羟脯氨酸(mg/g) | GAG(mg/g) |
| 空白聚乳酸支架 | 100 | 6.22 | 11.47 |
| 琼脂复合聚乳酸支架 | 201.5 | 9.79 | 67.25 |
| 琼脂和bFGF复合聚乳酸支架 | 370.1 | 9.53 | 55.90 |
实施例5胶原多孔支架导入含成骨细胞和酸性促成纤维细胞生长因子的琼脂水凝胶
配置重量体积浓度为2％的海藻酸钠溶胶，放入高压釜中120℃高温灭菌30分钟，冷却至室温后，将海藻酸钠和酸性促成纤维细胞生长因子混合(aFGF)与成骨细胞悬液混合，使最终海藻酸钠的浓度为1％，aFGF浓度为30μg/mL。将平均孔径约为100微米，孔隙率为99.9％，厚约2毫米的胶原薄片支架，置于三蒸水中浸泡，使支架溶涨。之后将支架浸入溶胶与细胞的混合液中震荡半小时，使海藻酸钠和软骨细胞进入胶原支架内部。然后将支架置于0.1％的乳酸钙溶液中10分钟，通过钙离子的交联使海藻酸钠凝胶化。最后，将复合支架置于5％CO2、37℃恒温的培养箱中孵育7天，支架中细胞的形态和分布情况见图5。
实施例6聚乳酸多孔支架导入海藻酸钠水凝胶
在室温下预先配置重量体积浓度为1％，2％的海藻酸钠溶胶。将平均孔径为300微米，厚度为2-4毫米的聚乳酸支架薄片，置于75％乙醇溶液中浸泡，通过抽真空的办法，将支架中的空气除去，使乙醇溶液完全浸润支架。在乙醇溶液中浸泡一天后，将支架放入pH为7.4的磷酸盐缓冲液中浸泡1天，期间换液3次，以完全置换出支架中的乙醇。将海藻酸钠溶胶滴加在处理后的聚乳酸支架表面。在重力和毛细作用下，溶胶进入支架内部。然后将支架置于0.5％的乳酸钙溶液中60分钟，通过钙离子的交联使海藻酸钠凝胶化。支架表面用三蒸水清洗后，干燥称重。利用下列公式计算导入率：
导入率＝实际支架增重/理论计算支架增重
结果发现在海藻酸钠水凝胶浓度分别为1％和2％时，导入率分别为92％和94％。
实施例7聚乳酸多孔支架导入琼脂水凝胶
在室温下预先配置重量体积浓度为1％，2％的琼脂溶胶。将平均孔径为300微米，厚度为2-4毫米的聚乳酸支架薄片，置于75％乙醇溶液中浸泡，通过抽真空的办法，将支架中的空气除去，使乙醇溶液完全浸润支架。在乙醇溶液中浸泡一天后，将支架放入pH为7.4的磷酸盐缓冲液中浸泡1天，期间换液3次，以完全置换出支架中的乙醇。将浓度为1％或2％的琼脂溶胶滴加在处理后的聚乳酸支架表面。在重力和毛细作用下，溶胶进入支架内部。然后将支架在10℃下放置60分钟使琼脂凝胶化。导入水凝胶的支架表面用三蒸水清洗后，干燥称重，计算导入率。结果发现在琼脂水凝胶浓度分别为1％和2％时，导入率分别为100％和83％。
实施例8聚乳酸多孔支架导入壳聚糖水凝胶
将200mg壳聚糖(去乙酰度为91％)溶于9ml 0.1M盐酸溶液中。将560mg磷酸甘油脂二钠溶于1ml去离子水中，溶液逐滴加入壳聚糖溶液中，形成均相的溶液。将平均孔径为300微米，厚度为2-4毫米的聚乳酸支架薄片，置于75％乙醇溶液中浸泡，通过抽真空的办法，将支架中的空气除去，使乙醇溶液完全浸润支架。在乙醇溶液中浸泡一天后，将支架放入pH为7.4的磷酸盐缓冲液中浸泡1天，期间换液3次，以完全置换出支架中的乙醇。将处理过的支架浸泡到壳聚糖水凝胶中，20分钟后在37℃处理5分钟，使壳聚糖凝胶化。导入水凝胶的支架表面用三蒸水清洗后，干燥称重，测得导入率为84.6％。
实施9聚乳酸多孔支架孔径对水凝胶导入率的影响
在室温下预先配置重量体积浓度为2％的海藻酸钠溶胶。将平均孔径为300微米和100微米，厚度为2-4毫米的聚乳酸支架薄片，置于75％乙醇溶液中浸泡，通过抽真空的办法，将支架中的空气除去，使乙醇溶液完全浸润支架。在乙醇溶液中浸泡一天后，将支架放入pH为7.4的磷酸盐缓冲液中浸泡1天，期间换液3次，以完全置换出支架中的乙醇。将海藻酸钠溶胶与荧光素钠混合，使最终海藻酸钠的浓度为1％，荧光素钠的浓度为0.01％，并滴加在处理后的聚乳酸支架表面。在重力和毛细作用下，溶胶进入支架内部。然后将支架置于2％的乳酸钙溶液中5分钟，通过钙离子的交联使海藻酸钠凝胶化。采用激光共聚焦显微镜观察水凝胶在其中的分布情况，见图6a、图6b。支架表面用三蒸水清洗后，干燥称重。结果发现在聚乳酸多孔支架的孔径为100微米和300微米时，导入率分别为82％和92％。说明大孔径有利于水凝胶的导入。
实施例10胶原多孔支架导入海藻酸钠水凝胶
将平均孔径约为100微米，孔隙率均为99.9％，厚约2毫米的罗丹明标记胶原薄片支架，置于三蒸水中浸泡，使支架溶涨。再将支架浸入溶有0.01％荧光素钠的浓度为1％或2％的海藻酸钠溶胶中震荡半小时，使海藻酸钠溶胶进入胶原支架内部。然后将支架置于0.1％的乳酸钙溶液中50分钟，通过钙离子的交联使海藻酸钠凝胶化。采用激光共聚焦显微镜观察，见图7a、图7b、图7c。支架表面用三蒸水清洗后，干燥称重。结果发现在海藻酸钠水凝胶浓度分别为1％和2％时，导入率分别为100％和84％。
Claims (10)
1.将水凝胶复合到多孔组织工程支架中的方法，该方法包括以下步骤：
1)4℃～120℃下将琼脂溶解于水中制备成水凝胶的溶胶，再与等体积的含细胞的培养基溶液混合，得到的溶胶重量体积浓度为0.5～5％；
2)将多孔支架进行灭菌处理，再用磷酸缓冲液预先润湿；
3)将溶胶滴加到多孔支架的表面，在重力和毛细作用下，将溶胶导入支架内部；或将支架浸入到水凝胶溶胶中，将水凝胶吸附到多孔支架内部；
4)将复合有溶胶的支架在15℃～40℃下放置至少10分钟，即得到负载了水凝胶的多孔支架。
2.根据权利要求1所述的将水凝胶复合到多孔组织工程支架中的方法，其特征是在步骤1)中，在琼脂中混入明胶或/和细胞生长因子，明胶用量与琼脂用量的比例是1∶1～1∶100，细胞生长因子用量与琼脂用量的比例是1∶10,000～1∶1,000,000。
3.根据权利要求2所述的将水凝胶复合到多孔组织工程支架中的方法，其特征是所说的细胞生长因子是碱性促成纤维细胞生长因子、酸性促成纤维细胞生长因子、骨形成蛋白或转化因子β。
4.根据权利要求1所述的将水凝胶复合到多孔组织工程支架中的方法，其特征是所说的多孔支架为聚合物类多孔支架，包括聚乳酸、胶原、乳酸-乙醇酸共聚物、聚己内酯、聚氨酯或聚苯乙烯支架，或为陶瓷类多孔支架，包括多孔羟基磷灰石、磷酸三钙或生物玻璃支架；所说的细胞为软骨细胞、成骨细胞、肝细胞、成纤维细胞或平滑肌细胞。
5.将水凝胶复合到多孔组织工程支架中的方法，该方法包括以下步骤：
1)在4℃～120℃下将海藻酸钠溶解于水中制备成水凝胶的溶胶，再与等体积的含细胞的培养基溶液混合，得到的溶胶重量体积浓度为0.5～5％；
2)将多孔支架进行灭菌处理，再用磷酸缓冲液预先润湿；
3)将溶胶滴加到多孔支架的表面，在重力和毛细作用下，将溶胶导入支架内部；或将支架浸入到水凝胶溶胶中，将水凝胶吸附到多孔支架内部；
4)将复合有溶胶的支架置于0.1％～2％乳酸钙溶液中至少5分钟，即得到负载了水凝胶的多孔支架。
6.根据权利要求5所述的将水凝胶复合到多孔组织工程支架中的方法，其特征是在步骤1)中，在海藻酸钠中混入明胶或/和细胞生长因子，明胶用量与海藻酸钠用量的比例是1∶1～1∶100，细胞生长因子用量与海藻酸钠用量的比例是1∶10,000～1∶1,000,000。
7.根据权利要求6所述的将水凝胶复合到多孔组织工程支架中的方法，其特征是所述的细胞生长因子是碱性促成纤维细胞生长因子、酸性促成纤维细胞生长因子、骨形成蛋白或转化因子β。
8.根据权利要求5所述的将水凝胶复合到多孔组织工程支架中的方法，其特征是所说的多孔支架为聚合物类多孔支架，包括聚乳酸、胶原、乳酸-乙醇酸共聚物、聚己内酯、聚氨酯或聚苯乙烯支架，或为陶瓷类多孔支架，包括多孔羟基磷灰石、磷酸三钙或生物玻璃支架；所说的细胞为软骨细胞、成骨细胞、肝细胞、成纤维细胞或平滑肌细胞。
9.将水凝胶复合到多孔组织工程支架中的方法，该方法包括以下步骤：
1)在4℃～120℃下将壳聚糖与1～5倍重量的磷酸甘油脂二钠盐混合物，或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，或聚异丙基丙烯酰胺溶解于水中制备成水凝胶的溶胶，再与等体积的含细胞的培养基溶液混合，得到溶胶的重量体积浓度为0.5～5％；
2)将多孔支架进行灭菌处理，再用磷酸缓冲液预先润湿；
3)将溶胶滴加到多孔支架的表面，在重力和毛细作用下，将溶胶导入支架内部；或将支架浸入到水凝胶溶胶中，将水凝胶吸附到多孔支架内部；
4)将复合有溶胶的支架置于30℃～40℃条件下至少5分钟，即得到负载了水凝胶的多孔支架。
10.根据权利要求9所述的将水凝胶复合到多孔组织工程支架中的方法，其特征是所说的多孔支架为聚合物类多孔支架，包括聚乳酸、胶原、乳酸-乙醇酸共聚物、聚己内酯、聚氨酯或聚苯乙烯支架，或为陶瓷类多孔支架，包括多孔羟基磷灰石、磷酸三钙或生物玻璃支架；所说的细胞为软骨细胞、成骨细胞、肝细胞、成纤维细胞或平滑肌细胞。
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