CN1543338B

CN1543338B - 壳多糖微粒及其医疗用途

Info

Publication number: CN1543338B
Application number: CN028160274A
Authority: CN
Inventors: 彼得·斯特朗
Original assignee: CMP Therapeutics Ltd
Current assignee: CMP Therapeutics Ltd
Priority date: 2001-08-16
Filing date: 2002-08-16
Publication date: 2010-06-16
Anticipated expiration: 2022-08-16
Also published as: PT1416916E; EP1416916A1; US7498038B2; DE60223037T2; CA2457027A1; ATE375786T1; US8551501B2; US20040234614A1; JP2005501845A; CA2457027C; EP1416916B1; US20090214666A1; AU2002324124B2; WO2003015744A1; CN1543338A; ES2295391T3; DE60223037D1

Abstract

本发明公开了壳多糖微粒成分及其在治疗疾病如变态反应、感染和癌中的用途。

Description

壳多糖微粒及其医疗用途

发明领域

本发明涉及壳多糖微粒及其医疗用途，尤其是涉及治疗变态反应、得益于细胞介导的免疫系统的上调的疾病和得益于天然杀伤细胞(NK)活性的上调和/或干扰素-γ(IFN-γ)的分泌的疾病。

背景技术

肺泡巨噬细胞是肺泡腔中数量最多的白细胞，对于肺的先天免疫系统很重要，可促进吞噬细胞的清除和分泌细胞因子，所述细胞因子可促进对吸入颗粒的有效细胞介导的免疫应答，所述颗粒包括微生物和病原体。在吞噬作用过程中产生的主要细胞因子是IL-12、TNF-α和IL-18。这些巨噬细胞因子随后通过NK细胞和Th1淋巴细胞诱导产生IFN-γ。IFN-γ与这些细胞因子协同作用，促进Th1细胞介导的免疫应答，并下调Th2细胞因子的产生，尤其是IL-4和IL-5的产生，IL-4和IL-5是变态反应的强介质。

Shibata等人(1-4)的研究已表明，1-10μm可被吞噬细胞吞噬的壳多糖颗粒的口服递送可导致小鼠脾细胞培养物内Th1细胞因子增加。这种效果对于颗粒有特异性，因为溶解的壳多糖不会导致Th1细胞因子的增加。这种效果也可以在涂以N-乙酰-D-葡糖胺的1μm聚苯乙烯微球体中重现，所述N-乙酰-D-葡糖胺是壳多糖的主要组分。在豚草变态反应的鼠模型中(1)还证明了，口服壳多糖可向下调节血清IgE和肺嗜酸粒细胞增多。

Shibata等人还已开发了变应性气道炎症的小鼠模型，对小鼠口服壳多糖制剂(Shibata 2000)。在免疫接种之前和之间，给豚草致敏的小鼠每日口服壳多糖后发现豚草特异性IgE水平显著降低了。在免疫接种14天后，采集细支气管肺泡灌洗(BAL)细胞，在用壳多糖治疗后观察到嗜酸粒细胞和淋巴细胞水平减少。在免疫接种14天后，在组织学上确定肺的炎症，在壳多糖治疗组内，支气管周围、血管周围和整个肺的炎症被抑制了。

当将壳多糖预防性地施用给小鼠时，所述小鼠随后施以豚草，IL-4、IL-5和IL-10的产量显著减少了且很低，但可检测到显著水平的IFN-γ。

当对C57BL6小鼠施以壳多糖时，壳多糖也具有预防效果，所述小鼠与BALB/c小鼠相比时，对细胞介导的免疫/Th1应答较高，但对变应性应答较低。

与那些仅用豚草刺激的小鼠相比，当同时用豚草和壳多糖治疗豚草致敏的小鼠时，其产生的IL-4、IL-5和IL-10水平显著降低了。

然而，尽管Shibata等人公开了壳多糖微粒的治疗变态反应的用途，但是该组合物作为补充物被口服，以在没有复发性细菌性感染的情况下活化巨噬细胞和预防性地增强免疫系统，所述复发性细菌性感染在工业化国家逐渐减少。

日本专利申请1997-0087986A(Unitika Limited)公开了脱乙酰壳多糖颗粒的用途，所述脱乙酰壳多糖为粉末、颗粒或纤维形式，以递送至鼻粘膜。壳多糖颗粒的有效粒径为20至250微米，被推荐用于治疗发炎部位的变应性症状如花粉症。

美国专利5,591,4419(医学研究所)涉及颗粒组合物的用途，用于提供保护，防止微生物感染和生物学冲突剂。组合物经静脉内递送，用于使得体内过氧化物水平短暂增加，以杀死微生物。

更普通地，现有的对于变态反应的治疗典型地涉及使用类固醇来抑制免疫系统。类固醇疗法有不希望的副作用。合成药物如类固醇的制造很昂贵，涉及复杂的工艺，其要求复杂的质量控制和GMP标准来满足Health and Safety Authorities的要求。鉴于这些因素，本领域在发现对于变态反应的有效疗法方面仍存在问题。

绿脓假单胞菌，机会致病菌，是引起免疫减弱个体中危及生命的感染的主要原因，对依赖呼吸机支持的病人和许多其中肺功能降低及清除感染能力降低的疾病是主要危险因素。每年，超过两百万的病人因之死亡。关于与医院相关的感染的发生率的报告将绿脓假单胞菌归为三类最常见的致病菌之一(5)。绿脓假单胞菌也是在囊性纤维化病人中危及生命的慢性肺部感染的常见原因。最近的报告将绿脓假单胞菌列为最严重的耐受抗生素的细菌之一且是需要有效疫苗的细菌(6)。

肺炎链球菌是普遍存在的致病菌，可导致大部分的肺炎疾病(大叶性肺炎和支气管肺炎)，是幼童、老人和免疫系统受损的人的疾病和死亡的主要原因之一，所述免疫系统受损来自于疾病如AIDS、或免疫抑制疗法如骨髓移植。侵袭形式的链球菌感染，其中细菌散布于血液和其它器官，可导致非常严重的并发症。据估计，在美国每年肺炎球菌疾病引起3000例脑膜炎、50,000例菌血症、125,000个人住院和6,000,000例中耳炎。

对于耐受抗生素的肺炎链球菌菌株的出现的关注日益增加，并有大量关于新疗法和疫苗的研究。

发明概述

广义上说，本发明涉及壳多糖微粒(CMP)制剂的治疗疾病的用途，通过将微粒经鼻内递送到窦道和上呼吸道，例如使用鼻内喷剂或通过吸入来针对例如肺内的肺泡巨噬细胞而进行治疗。壳多糖微粒成分不同于那些现有技术中公开的许多物质，其粒径典型地小于10μm。

巨噬细胞在肺的先天免疫系统内具有重要控制功能，其能促进吞噬细胞清除颗粒，将吸入的变应原送至淋巴细胞，分泌细胞因子以促进对于吸入颗粒的有效的细胞介导免疫应答，所述吸入颗粒包括微生物和变应原物质。具体地，本发明公开了壳多糖微粒的鼻内递送对于减少大量指征炎症的参数尤其有效，从而提供了可替代类固醇治疗的疗法。

本文所公开的研究来自于下面的发现，即壳多糖微粒的鼻内递送对于由烟曲霉(Atu)和Dermatophagoides pteronyssinus(Der p)引起的变态反应的小鼠模型特别有效，它可降低外周血嗜酸粒细胞增多、血清总IgE、Afu-特异性IgGL、细胞因子IL-4、GM-CSF和气道反应过度(AHR)的水平，以及增加细胞因子IL-12、IFN-γ和TNF-α的水平。壳多糖微粒的鼻内预治疗可有效地阻止在感染病原体的小鼠内感染的进展，所述病原体为绿脓假单胞菌或肺炎链球菌。另外，已证明CMP可增强活化的人白细胞的TNF-α和IFN-γ应答。

因此，在第一方面，本发明提供了壳多糖微粒(CMP)制剂在制备用于治疗变态反应的药物中的用途，其中经鼻内或吸入来递送药物。

在一个可供选择的方面，本发明提供了治疗患有变态反应的病人的方法，该方法包括给病人施用治疗有效量的壳多糖微粒制剂，其中CMP制剂经鼻内或吸入来施用。

根据本发明，可治疗的变态反应的实施例包括季节性呼吸变态反应，通常称为枯草热；对空气变应原，包括屋内螨、真菌孢子、草花粉、树花粉或动物皮屑的变态反应；可通过减少血清IgE和嗜酸粒细胞增多治疗的变态反应；哮喘；湿疹和食物过敏；皮炎如特应性皮炎。

在另一方面，本发明提供了包括壳多糖微粒成分和变应原的组合物。这些组合物可用于治疗变态反应和变应性症状，如过敏性休克，这与传统的脱敏疗法相关。已证明，口服IL-12可抑制过敏性反应，因此施用变应原和CMP组合物可有助于缓和在脱敏疗法中出现的过敏反应，所述脱敏疗法用于形成对变应原的耐受性。变应原可容易地从食物中提取并是市售的，因为它们用于变态反应的诊断和治疗。本发明的这方面的一个具体应用是治疗食物过敏。常见食物变应原的实例包括牛奶、小麦、麸质、鸡蛋、坚果或贝类，本领域技术人员能用CMP组合物与这些食物配制以递送给病人。

在可供选择的方面，本发明提供了一个用于同时或按顺序施用给病人的试剂盒，所述试剂盒包括：

a)壳多糖微粒成分，和

b)变应原。

涉及变态反应治疗的另一个具体实施方案是对于马的治疗，尤其是纯种马，其具有患变态反应疾病如哮喘或复发性肺感染的倾向。

在另一个方面，本发明提供了壳多糖微粒(CMP)制剂在制备用于治疗疾病的药物的用途，所述疾病得益于细胞介导的免疫系统的上调，其中经鼻内或吸入来施用药物。

在可供选择的方面，本发明提供了治疗病人的方法，该病人患有得益于细胞介导的免疫系统的上调的疾病，所述方法包括给病人服用治疗有效量的壳多糖微粒制剂，其中CMP制剂经鼻内或吸入来施用。

因此，在本发明的这个方面，CMP组合物可用于增强个体的免疫系统。得益于细胞介导的免疫系统上调的疾病包括微生物感染的治疗，所述微生物感染包括细菌性感染、真菌性感染和病毒性感染，尤其是在易受损病人群体中，如老人、早产儿、婴儿、进行移植术的病人、免疫抑制的病人如化疗病人、有机会性感染危险的住院病人、使用呼吸机的病人、囊性纤维化病人和患有AIDS的病人。本发明具体可用于治疗耳、鼻、咽喉和肺感染。

细菌性感染的具体实施例包括治疗由微生物引起的感染，所述微生物包括例如绿脓假单胞菌、链球菌如肺炎链球菌、化脓链球菌、无乳链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷波杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、沙门菌、利斯特菌、分枝杆菌感染，其包括结核分枝杆菌、麻风杆菌分枝杆菌、寄生虫感染，包括利什曼原虫和血吸虫。

由微生物感染，典型地由肺炎链球菌引起的一种疾病为复发性耳感染如中耳炎。这些疾病发生于儿童和成人，目前使用抗生素治疗。使用本发明的壳多糖微粒组合物可有利于治疗这些疾病，减少对抗生素的需求。

本发明的制剂可用于治疗结核病，或者是治疗已有的感染，或者是防止易受损病人组被感染。

微生物感染的其它实例包括细菌性肺炎，如呼吸机相关的肺炎和囊性纤维化相关的感染。

真菌性感染的实例包括例如在免疫抑制病人中所发生的真菌感染，如侵袭性肺曲霉病和侵袭性肺念珠菌病、卡氏肺囊虫肺炎、球孢子菌感染和隐球菌感染。

根据本发明可治疗的病毒性疾病的实例包括肺病毒性感染如呼吸性合胞病毒性细支气管炎，尤其是在婴儿和老人中所发生的感染、或流感病毒、或鼻病毒。许多研究已证明，在AIDS的进展过程中，单核细胞不能分泌IL-2、IL-12和IFN-γ，使IL-4水平增加，这使得HIV病毒可以增殖。因此，利用CMP经鼻内或吸入的治疗可通过恢复IL-12和IFN-γ水平来阻止HIV感染的进展。

在另一个方面，本发明提供了壳多糖微粒(CMP)制剂在制备用于治疗疾病的药物用途，所述疾病可通过NK细胞活性的上调和/或免疫系统细胞分泌IFN-γ来治疗，其中经鼻内或吸入来递送药物。

在可供选择的方面，本发明提供了治疗病人的方法，所述病人患有可通过NK细胞活性的上调和/或免疫系统细胞分泌IFN-γ来治疗的疾病，所述方法包括给病人服用治疗有效量的壳多糖微粒制剂，其中CMP制剂经鼻内或吸入来施用。

在本发明的这一方面，可治疗的疾病的实例是癌症，尤其是肺癌、肺肿瘤、或鼻-咽肿瘤。

优选地，将上述药物施用于人。利用CMP进行鼻内治疗的优选病人群体包括那些患有季节性变应性鼻炎和窦炎、或慢性呼吸性变态反应如屋内螨变态反应的病人和正服用类固醇或抗组胺药的病人。其它病人群体包括正在治疗慢性肺疾病的住院病人，所述肺疾病包括感染和肺癌。

壳多糖是N-乙酰-D-葡糖胺的聚合物，具有类似于纤维素的结构。自然界中有大量的多糖，其包括角质，所述角质来自蟹、虾、龙虾、乌贼和昆虫的外骨骼，以及真菌。这些或其它来源的壳多糖的任何一种可适于制备用于本发明的CMP制剂。

优选地，壳多糖通过物理性方法成为颗粒而制得，所述物理性方法有例如超声处理或研磨，所得颗粒直径为小于50μm，更优选小于40μm，还更优选小于20μm，更优选小于10μm，最优选小于5μm。已发现由壳多糖微粒产生的效果具有尺寸依赖性，因此优选壳多糖微粒的平均直径小于10μm。壳多糖微粒的尺寸上限可通过不识别颗粒的巨噬细胞进行功能性限定。壳多糖微粒的尺寸下限不太重要，但优选颗粒的直径为至少1μm。尺寸下限可通过溶解的因而也不能被巨噬细胞识别的壳多糖微粒来进行功能性限定。本领域技术人员可容易地确定颗粒尺寸和尺寸分布，例如使用流式细胞仪或显微镜。可供选择地或附加地，壳多糖微粒可通过涂布载体颗粒来制备，例如由生物相容性材料如聚苯乙烯或胶乳与N-乙酰-D-葡糖胺、壳多糖或其片段形成具有上述尺寸的颗粒，这些成分包括在本文所用的术语“壳多糖微粒成分”的范围内。

应认识到，在组合物中，壳多糖微粒具有尺寸分布，典型地为正态分布，在微粒总体中不是所有的微粒都必须满足这些尺寸限制。然而，在形成CMP制剂的壳多糖微粒总体中，优选至少60％、更优选至少75％、更优选至少90％、更优选至少95％、最优选至少99％的壳多糖颗粒的粒径分布处于上述的限制范围之内。

在另一个方面，本发明提供了递送装置，该装置包括上述壳多糖微粒的储存器和适于设置在病人口或鼻内的递送孔，其中病人可将递送孔放在口或鼻内以施用壳多糖微粒。在一些实施方案中，递送装置可包括位于储存器和递送孔之间的阀门，以便操纵该阀门来控制壳多糖微粒的递送。通过吸入和/或推进剂，微粒可进入鼻内到达窦道和上呼吸道，或通过口到达肺泡巨噬细胞。装置的特别优选形式为包含CMP制剂和任选的载体的鼻用喷瓶，该喷瓶具有适于经鼻内递送的颈。

除了壳多糖微粒之外，CMP制剂还可以包括一种或多种药用可接受的赋形剂、载体、推进剂、缓冲剂、稳定剂、等渗剂、防腐剂或抗氧化剂、或本领域技术人员已知的其它物质。这些物质应是无毒的，且不应干扰活性成分的效能。

防腐剂通常包括在药物组合物中以阻止微生物生长，延长组合物的贮藏期限，并允许多用途包装。防腐剂的实例包括苯酚、间甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸及其酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯化benzalconium、氯化benzethonium。防腐剂的用量典型地为约0.1％至1.0％(w/v)。

优选地，以“预防有效量”或“治疗有效量”将药物组合物施用至个体(视情况而定，尽管预防可看作治疗)，这足够对个体产生有益效果，例如减轻变态反应或其它疾病，或在可接受的一段时间内进行预防。通常，这将产生有益于个体的有用治疗活性。化合物的实际给药量和给药速率和时间段取决于待治疗疾病的性质和严重性。治疗处方如剂量等的确定，属于普通医疗工作者和其它医生的职责，其典型地考虑了待治疗的疾病、个别病人的状况、递送部位、给药方法和医师已知的其它因素。上述技术和方案的实例可参见Remington′sPharmaceutical Sciences，16th edition，Osol，A.(ed)，1980和Remington′sPharmaceutical Sciences，19th edition，Mack Publishing Company，1995。组合物的给药剂量按每千克体重计优选为约0.01至100mg活性化合物，更优选为约0.5至10mg。举例来说，可使用鼻用递送瓶来递送4-8剂量的约0.25ml 5mg/ml CMP颗粒的溶液，达到上述目的。

现在参照附图举例但非限制性地描述本发明的实施方案。

附图和表的概述

图1显示了对于Afu激发的小鼠的治疗结果，其使用17μg CMP使外周血嗜酸粒细胞增多显著下降(p＜0.05)。

图2显示了对于Der p和Afu激发的小鼠的治疗结果，每日使用4剂量的25μg CMP使外周血嗜酸粒细胞增多显著下降(p＜0.05)。

图3显示了，每天使用17μgCMP治疗后，Afu激发的小鼠的血清总IgE的减少(p＜0.0005)。

图4显示了在每日用5剂量的17μg CMP治疗和在一周后重新激发后，Afu激发的小鼠的血清总IgE的减少(p＜0.0005)。

图5显示了对于Der-p激发的小鼠的治疗结果，每日用5剂量的25μg CMP治疗，使血清总IgE显著下降(p＜0.005)。

图6显示Afu特异性IgG1减少(p＜0.01)。

图7显示了在每日用5剂量的17μg CMP治疗之后和在一周后重新用变应原激发后，Afu特异性IgG1减少(p＜0.001)。

图8显示了在用Afu抗原重新激发的小鼠中，在用CMP治疗后，气道反应过度减少(p＜0.01)。

图9显示在Afu抗原重新激发的小鼠中，在经过4天的CMP治疗后，AHR减少(p＜0.01)。

图10显示了在Der p抗原激发的小鼠中，在用CMP治疗后，AHR减少，其对应于乙酰甲胆碱的浓度增加。

图11显示了在抗原激发(Der-CMP(0)，p＜0.01)和4天后重新激发(Der-CMP(4)，p＜0.01)后，分别用25μg CMP治疗3天后，AHR减少。

图12显示了在Der p抗原激发的小鼠中，在用不同剂量的CMP治疗4天后，AHR的减少，对应于乙酰甲胆碱的暴露。

图13显示了，在用CMP治疗Afu致敏的小鼠后，其发炎和阻塞程度不同的肺切片。

图14显示了用CMP或参照物(PBS)预处理的小鼠存活率，其对应于绿脓假单胞菌感染。

图15显示了从感染的鼠肺中清除肺炎链球菌所需的时间。

图16显示了在感染小鼠的血液中出现肺炎链球菌所需的时间。

图17显示了由CMP所导致的TNFα的产率的增加，TNFα由LPS激活的CD14单核细胞产生。

图18显示了由CMP所导致的TNFα的产率的增加，TNFα通过LPS激活的CD14/CD16的前炎症单核细胞产生。

图19显示了由CMP所导致的IFNγ产量增加，所述IFNγ来自于PMA/离子霉素刺激的人T淋巴细胞。

表1a说明了在小鼠的脾细胞内细胞因子IL-12、IFN-γ和TNF-α的增加，其对应于使用CMP的治疗，所述小鼠被Der p和Afu变应原激发。

表1b说明了在被Der p激发的小鼠的脾细胞内细胞因子GM-CSF的增加，对应于使用CMP的治疗。

表1c说明了细胞因子IL-4的荧光几何平均数的下降，对应于使用CMP的治疗。

发明详述

材料和方法

经鼻内递送的壳多糖微粒代表一种新方法，刺激细胞介导的免疫性和促进在发炎组织内的抗炎应答。本发明的优点主要在于上呼吸道的巨噬细胞或肺泡巨噬细胞可直接成为具有适当尺寸的壳多糖微粒的靶，所述壳多糖微粒分别用鼻内喷剂和吸入法来递送。

已在小鼠体内建立了两种变态反应模型，它们是致病性肺感染模型和细菌性感染模型。另外，已开发了利用人单核细胞或淋巴细胞的体外检验，以验证本发明的效能。

在变态反应模型中测量的参数为血清IgE和IgG1、外周血嗜酸粒细胞增多和AHR，它们在Afu和Der p变应原的小鼠变态反应模型中都显著升高了，在用CMP经鼻内治疗后都显著降低。在Der p的小鼠变态反应模型中减少的细胞因子IL-12、IFN-γ和TNF-α的水平在用CMP经鼻内治疗后都增加了，而GM-CSF和IL-4的水平减少了。所提出的作用模式是，CMP与鼻粘膜和肺泡内的巨噬细胞的甘露糖受体结合，这刺激巨噬细胞和树状细胞产生IL-12、IFN-α和IL-18，并逆转了变应原激发产生的IL-12的抑制，将其水平恢复到在无变应性的小鼠中所观测的水平。这导致NK细胞和Th1淋巴细胞产生IFN-γ。GM-CSF和IL-4的减少说明从Th2到Th1的免疫应答调变。实际上，所有这些细胞因子，尤其是IFN-γ，促进了T淋巴细胞群体从Th2向Th1转变。GM-CSF是Th2细胞因子，其促进了嗜酸粒细胞的分化、活化和生存。所观察到的血清IgE和嗜酸粒细胞增多的减少达到顶点，这是变态反应的主要因素。

在致病性肺感染的小鼠模型中，在10天后测量用CMP预处理的小鼠的存活率，对应于绿脓假单胞菌感染。与没有用CMP预处理的小鼠相比，用CMP预处理的小鼠具有显著提高的存活率。

在细菌性感染的小鼠模型中，在24小时内，测量从感染小鼠的肺内清除绿脓假单胞菌所需的时间。与PBS预处理的小鼠相比，用CMP预处理的小鼠的肺内具有明显(p＜0.001)低的细菌集落形成单位(cfu)。在48小时内，测量在血液中绿脓假单胞菌出现所需的时间，在24小时(p＜0.005)和48小时，用CMP预处理的小鼠中的血液菌血症明显比用PBS预处理的小鼠低。

在人单核细胞中测量应答LPS刺激的TNF-α的产量，在人T淋巴细胞中测量应答PMA/离子霉素刺激的IFN-γ水平。在这两个检验中，CMP的添加增强了细胞因子产量。在人细胞中所观测到的这个效果符合下面的概念，即CMP原单核细胞和巨噬细胞通过与甘露糖受体或其它糖类受体结合，然后发生CMP的噬菌作用。微生物制品如脂多糖(LPS)的活化可增强这些单核细胞的响应，这是由吞噬细胞衍生的细胞因子如IL-12调节的效果。CMP也可以促进Th1淋巴细胞的活性，这符合下面的概念，即CMP促进了Th1细胞介导的免疫应答。

壳多糖微粒(CMP)悬浮液的制备

通过超声处理10mg/ml不含内毒素的PBS的悬浮液，以最大功率处理20分钟，每5分钟用冰冷却，从纯化的壳多糖(Sigma-Aldrich，Poole，UK)制得壳多糖微粒。以1000xg将浆液离心分离10分钟，除去大的颗粒，在4000xg下离心分离来收集微粒，再用PBS洗涤三次，除去所有溶解的壳多糖。上清液包含均匀的小颗粒悬浮物，这通过光学显微镜并使用具有50μm角尺的血球计来判断，尺寸上相当于1μm胶乳球体(Polysciences，Inc.，Warrington，Pennsylvania，USA)。直径小于5μm的颗粒用Celltac血液分析器(Haematology Analyser)(Nihon Kohden，Inc.)来确定数量。我们发现，在制剂所包含的微粒中，99.9％的微粒直径小于5μm，其浓度量级为10¹¹/ml。通过Limulus Amebocyte LysateAssay(BioWhittaker Co.)测量内毒素，其浓度为小于1EU/ml。

变态反应的小鼠模型

变应原提取物

在合成培养基(M199，Sigma Chemicals)中培养烟曲霉菌(Afu)，在37℃静置培养一周。Arrunda等人证明了，Asp f1(一种主要的变应原)的表达在一周后达到最大，并倾向于在较长培育时间后减少(7)。通过加入0.1％硫柳汞经12小时可杀死1周培养物。通过玻璃绵和最后通过0.45μm膜来过滤培养物，以除去所有的颗粒和可能的芽孢，然后用三种不同的缓冲液对水进行透析。冻干透析液，得到棕色粉末。

对应于Asp f1，在18kDa处出现一个主带。对应于Asp f2(37KDa)的带也很明显。18kDa的带为N末端序列，其序列为ATWTCINQQLNP，对应于Asp f1的N末端序列。

ELLSA也已验证了，1周培养物的过滤物(1wcf)可被Afu变应性病人的人血清识别，所述人血清来自国家生物标准和控制研究所(National Institute of Biological Standards and Control)。

标准化Dermatophagoicles pteronyssinus(Der p)提取物(Greer Labs，Lenoir，North Carolina，USA)，其包含10000变态反应单位(AU)/ml，被稀释到无菌的不含内毒素的PBS中。

敏化作用

用变应原提取物(68AU Der p；200μg Afu)与明矾的100μl无菌PBS溶液的混合物经过每周4次i.p.注射而使C57BL/6雌性小鼠致敏。

变应原激发和用CMP治疗

致敏小鼠用异氟烷麻醉，然后用50变态反应单位的Der p提取物或10μg Afu变应原提取物的PBS溶液经鼻内激发，然后在1-2小时后加入鼻内剂量的PBS或CMP、或颗粒参照物(PC)的1μm聚苯乙烯小球的50μl溶液。在不同的实验中显示了，经鼻内所施用的大约50％的FITC标记的微球可在30分钟后从肺内恢复。

外周血嗜酸粒细胞

从小鼠(n＝4-8/组)的尾部静脉采集血液以评估嗜酸粒细胞。通过自动细胞计数装置来测定总白细胞数，通过May-Grunwald-Giemsa染色的血涂片的区别计数来测定嗜酸粒细胞的比例。结果表示为10⁶个细胞/ml。

血清IgE和Afu特异性IgG1

通过夹层ELISA(BD PharMingen，Cowley，UK)，在来自1∶20的最大稀释的连续稀释血液中测量总血清IgE，得到数值，该数值根据小鼠IgE的标准曲线为线性。结果表示为μg/μl。通过ELISA使用涂有变应原提取物的96孔板来测量抗原特异性IgG1。使用HRP标记的抗鼠IgG1检测抗体。结果表示为相对吸光度单位(OD450)。

细胞内细胞因子染色

在治疗后，小鼠用CO₂窒息而无痛苦死亡，取出它们的脾，在PBS内均化。过滤匀浆，用氯化铵细胞溶解剂(BD Pharmingen，Cowley，UK)溶解红细胞，并用4％(v/v)低聚甲醛固定20分钟。用PBS洗涤细胞，该PBS补充有3％热的失活小牛胎儿血清和0.1％(w/v)叠氮化钠(FSB)，在10％DMSO(v/v)的FSB溶液中重新悬浮，在-80℃保存。用Cytoperm洗涤缓冲剂(CPB，BD Biosciences，Cowley，UK)在4℃将细胞渗透处理15分钟，在4℃培育30分钟用CPB阻滞等分试样的10⁶个细胞，CPB补充以1％(v/v)大鼠IgG。用1μg PE-共轭的抗小鼠细胞因子单克隆抗体(BD Biosciences，Cowley，UK)给细胞内细胞因子染色，所述抗体在4℃培育60分钟。用CPB洗涤细胞，然后用FSB洗涤，并重新悬浮于500μl FSB。使用FACScan流式细胞仪(Beckton Dickinson，MountainView，California，USA)，利用CellQuest软件来进行流式细胞计数。采集20000个细胞的数据。在所有情况下脾细胞的平均FSC为100。门控染色细胞(FSC＞100，FL2＞100)，深度染色成计算PE(PE＞1000)的这些细胞的比例。结果表示为在消除未染色细胞背景荧光后深度染色细胞的百分数，所述未染色细胞用大鼠IgG(％PE＞1000)培育。对于IL-4，在消除背景的情况下，测定染色细胞的几何平均荧光(GMF)。

肺组织学

在治疗后，立即将各治疗组的2-4个小鼠的肺固定于10％中性缓冲福尔马林中，进行独立分析。将肺包埋于石蜡中、切片，并用苏木精和伊红(H&E)染色。对载玻片进行支气管周围发炎的评估，评分等级为0-4，分别对应于正常到严重的分数(9)。

整个躯体的体积描记法

在这项研究中，使用无限制的整个躯体的体积描记法(8)利用四室系统(Buxco，Sharon，Connecticut，USA)来测量AHR。首先将小鼠用鼻内抗原激发，使其在2小时内恢复，然后放入小室内，对其呼吸监测10分钟。当适应后，对它们的基线应答测量5分钟。然后将小鼠置于烟雾状PBS下，时间为1分钟，然后逐渐增加乙酰甲胆碱(5、10、20、30、40mg/ml PBS)的剂量。每次记录5分钟应答，每次之间有短暂的间隔，以使其返回基线。使用增强的呼气停顿(Penh)的测量来定量确定响应。每组包含4至8个小鼠。对于各组中的小鼠，当平均百分比增长至超过基线值时，测量Penh。在用乙酰甲胆碱激发后，将结果表示为Penh的平均增长百分比。为了确定治疗是否产生长期效果，在治疗结束4天后，将Der p实验小鼠单独用变应原提取物经鼻内重新激发。

统计

结果为4-8个小鼠/组的结果平均值，误差范围为±SEM。通过Student的双侧t-检验，确定显著性。当p＜0.05时，接受显著性。

致病性肺感染的小鼠模型

用CMP进行预处理和致病性激发

用开他敏/甲苯噻嗪麻醉NMRI雌性小鼠，每天用250μg/μl CMP治疗，连续三天，或用20μl PBS治疗，作为参照。在开始时，用开他敏/甲苯噻嗪麻醉小鼠，用2×10⁶绿脓假单胞菌经鼻内激发。在10天后测量动物存活率。

细菌性感染的小鼠模型

肺炎链球菌制备

从National Collection of Type Cultures，London，UK(NCTC 7466)得到2号血清型肺炎链球菌，D39菌株。鉴定出肺炎双球菌，然后通过革兰氏染色、过氧化氢酶试验、在血琼脂板上的溶血、奥普托欣(乙基氢化叩卜林)敏化进行感染。通过荚膜肿胀反应来确定荚膜多糖血清类型。对于体内感染实验的应用，培养肺炎球菌，并使其通过如上所述小鼠(10)，随后在-70℃储存。当需要时，在室温下溶解悬浮液，通过离心分离法采集细菌，然后在无菌PBS中重新悬浮。

小鼠的感染

远系交配的雌性MF1小鼠，9周大，体重30-35g(Harlan Olac，Bichester，UK)，用2.5％(体积比)氟烷(AstraZeneca，Macclesfield，UK)与氧气(1.5-2升/分钟)轻微麻醉。将包含1×10⁶cfu肺炎链球菌的50μlPBS应用于小鼠的鼻孔。在感染后通过在血琼脂板涂铺来确定接种物。在感染后的每小时间隔中，将预选的小鼠组用5％(体积比)氟烷深度麻醉，然后用心脏穿刺术采集血液。在这一步骤后，用断颈法立即杀死老鼠。取出肺，置于10ml无菌蒸馏水中，称重，在Stomacher-Lab混合器(Seward Medical，London，UK)中均质化。如前所述，测定在匀浆和血液中的活体数目(10)。通过荚膜肿胀反应来确定2类多糖荚膜的存在。这些小鼠没有可测量水平的2类抗体、3类抗体、抗肺炎球菌溶血素的抗体。

治疗策略

在第1、2、3天，给小鼠施以250μg CMP的50μl无菌PBS溶液，经鼻内给药至麻醉的小鼠。在第3天，用肺炎链球菌经鼻内感染小鼠，以1小时间隔杀死小鼠。

人白细胞的细胞因子生成

服用CMP对人单核细胞的作用

从三个健康供体得到血液，加入10U/ml肝素，作为抗凝血剂。用10μg/ml布雷菲德菌素A(BFA)、来自细胞的蛋白质分泌物抑制剂和衍生自明尼苏达沙门氏菌的5ng/ml LPS，加入或不加入0.1μg/mlCMP，培育0.6ml等分溶液。在37℃培育6小时。培育结束后，用氯化铵缓冲液溶解红细胞，在FACS染色的缓冲液中重新悬浮。在用皂苷渗透细胞后，用荧光标记的抗体给细胞表面标记物CD14和CD16染色。在9倍的过量重组人TNF-α存在的情况下，进行细胞内细胞因子的染色，证明TNF-α染色的特异性。在对染色细胞进行FACS分析后，控制CD14或CD14/CD16群体，在去除各种供体的背景染色后，所得结果为TNF-α染色的荧光强度平均值(MFI)。

CMP给药对于人淋巴细胞的作用

在37℃，在有或没有0.1μg/ml CMP存在的情况下，用BFA和5ng/ml PMA以及0.25μM离子霉素培养来自两个供体的血液等分试样，培养时间为6小时。通过细胞内细胞因子染色，对T细胞的表面标记物CD2和IFN-γ染色。

结果

实施例1

用CMP对感染Afu的动物的血液嗜酸粒细胞增多进行治疗的效果示于图1。试验组接受4天的治疗，在第5天进行测量。样本量为4-5只小鼠/组。误差范围为±SEM。结果说明，用CMP治疗导致血液嗜酸粒细胞增多水平降至约0.3×10⁶/ml，相比之下，用PBS治疗的试验动物的血液嗜酸粒细胞增多水平为约0.7×10⁶/ml。

实施例2

用CMP对感染Der p和Afu的动物的外周血嗜酸粒细胞增多进行治疗的效果示于图2。试验组每日用Afu或Der p提取物经鼻内感染，然后用4个每日剂量的25μg CMP经鼻内治疗。PBS表示用PBS治疗的未致敏小鼠。Der-PC表示用胶乳小球的颗粒参照物治疗的致敏小鼠。样本量为4-8只小鼠/组。误差范围为±SEM。在Der p模型中，外周血嗜酸粒细胞增多减少了36％，在Afu模型中，外周血嗜酸粒细胞增多减少了58％。

实施例3

图3表示用CMP对感染Afu的小鼠的血清IgE水平的治疗结果的比较。试验组接受5天的治疗，3天后对采集的血液进行测量。样本量为4-5只小鼠/组。误差范围为±SEM。结果说明，在用CMP(Afu-壳多糖)经鼻内治疗3天后，血清IgE水平小于5μg/ml IgE，相比之下，用PBS(Afu-PBS)治疗的致敏小鼠的血清IgE水平为24μg/ml IgE。PBS表示用PBS治疗的未致敏小鼠。

实施例4

图4表示用CMP治疗感染Afu的小鼠的血清IgE水平的效果。试验组每日用Afu提取物经鼻内感染，然后5个每日剂量的17μgCMP(A-CMP1)经鼻内治疗，或者在1小时后用PBS(A-PBS1)经鼻内治疗。在下一周，单独用3个日剂量的变应原提取物经鼻内重新感染小鼠，重新测量血液IgE水平(A-PBS2、A-CMP2)。样本量为4-8只小鼠/组。误差范围为±SEM。结果说明，血清IgE显著降低(p＜0.0005)，在一周后用变应原重新感染，仍能保持(p＜0.0005)。

实施例5

图4显示了用CMP治疗感染Derp的小鼠的血清IgE水平的效果。试验组每日用Der p提取物经鼻内感染，然后用5个每日剂量的PBS(DerPBS)、25μg CMP(DerCMP)或25μg胶乳小球的颗粒参照物(DerPC)经鼻内治疗。PBS表示在1小时后用PBS治疗的未致敏小鼠。样本量为4-8只小鼠/组。误差范围为±SEM。在治疗的4天后测得，用5个每日剂量的25μg CMP治疗使总血清IgE显著下降(p＜0.005)。

实施例6

图6显示了用CMP或PBS治疗感染Afu的小鼠的血清IgG1水平的效果比较。试验组每日用PBS或25μg CMP经鼻内感染和处理5天，3天后对采集的血液进行测量。样本量为4-5只小鼠/组。误差范围为±SEM。用Afu变应原提取物经鼻内感染，然后用CMP经鼻内治疗的致敏动物(Afu-CMP)显示，其血清IgG1水平的下降量为用PBS治疗的致敏动物(Afu-PBS)的四倍。PBS表示用PBS治疗的未致敏小鼠。

实施例7

图7显示了用CMP治疗感染Afu的小鼠的Afu特异性血清IgG1水平的效果。试验组每日用Afu提取物经鼻内感染，然后用5个每日剂量的17μg CMP(A-CMP)或1小时后用PBS(A-PBS)经鼻内治疗。在下一周，单独用3个每日剂量的变应原提取物经鼻内重新感染小鼠，重新测量血液IgG1水平(A-PBS2、A-CMP2)。样本量为4-8只小鼠/组。误差范围为±SEM。结果表明，Afu特异性IgG1的显著降低(p＜0.01)，在一周后用变应原重新感染后其仍能保持(p＜0.01)。

实施例8

图8显示了变应原重新感染对于感染Afu的小鼠的AHR的作用。试验组用Afu变应原经鼻内感染，然后用PBS(Afu-PBS)或20μgCMP(Afu-CMP)经鼻内每日治疗，重复4天。小鼠重新单独感染变应原，测量AHR，以应答用30mg/ml的雾状乙酰甲胆碱产生的刺激。PBS表示用PBS治疗的未致敏小鼠。样本量为4-8只小鼠/组。误差范围为±SEM。结果表明，用CMP治疗的动物的AHR显著降低了(p＜0.01)。这些小鼠显示，当感染乙酰甲胆碱后，对于参照小鼠，其Penh仅增加了110％，相比之下，PBS治疗的小鼠增加了240％。

实施例9

图9显示了相应于20mg/ml雾状乙酰甲胆碱激发，感染Afu的小鼠的气道反应过度。试验组用4个每日剂量的PBS或25μg CMP经鼻内给药。样本量为4-8只小鼠/组。误差范围为±SEM。在CMP治疗的组内观察到AHR的显著降低(p＜0.01)。用胶乳小球的颗粒对照物进行的治疗(A-PC)没有减少AHR。

实施例10

图10显示了用Der p感染的治疗组对于雾状乙酰甲胆碱的剂量反应。治疗组首先用Der p提取物进行鼻内感染，然后用PBS(Der-PBS)或25μg CMP经鼻内治疗，重复4天。在感染/治疗过程结束的4天后，用Der p重新感染小鼠。相应于不同剂量的雾状乙酰甲胆碱，测量AHR。PBS表示用PBS治疗的未致敏小鼠。样本量为4-8只小鼠/组。误差范围为±SEM。结果表明，对于所有测试的乙酰甲胆碱浓度，AHR都降低了。

实施例11

图11显示了，相应于雾状乙酰甲胆碱，用Der p感染的小鼠的AHR。治疗组用25μg CMP经鼻内治疗3天，在此之前用变应原感染(Der p(0))，在用变应原感染后，再用4个每日剂量的2μg CMP治疗结束的4天后，重新单独用变应原感染(4))。PBS表示用PBS治疗的未致敏小鼠。结果表示为Penh增加，在治疗的第四天(Der-CMP(0)，p＜0.001)及在治疗四天后重新感染后(Der-CMP(4)，p＜0.001)，AHR显著降低。

实施例12

图12显示了用CMP治疗的Der p(H＝Der p)致敏小鼠的AHR。试验组用四种不同剂量的CMP(5-40μg)治疗4天。在第4天，用Der p感染小鼠，1至2小时后用CMP治疗，或用来自于25μg/ml的悬浮液(Psn)的CMP上清液治疗，其不含任何CMP，作为参照治疗。在与100mg/ml的雾状乙酰甲胆碱接触1.5分钟后，测量AHR。P表示用未致敏小鼠。结果表明，所有剂量的CMP具有相等的效能，说明在这个模型中，等于先前试验中所使用剂量五分之一的剂量可用于防止变应性应答。

实施例13

图13显示了用苏木精和伊红染色的肺片断，说明了用CMP治疗Afu致敏小鼠后，气道的发炎和阻塞程度的不同。用PBS治疗的变应原激发的小鼠的支气管周围发炎的平均得分为2.5，相比之下，也用变应原激发的CMP治疗的小鼠的得分为1。这表示变应原引发的发炎减少了60％。用PBS治疗的非致敏小鼠的得分为0。图13a显示了用PBS治疗后正常小鼠的肺，图13b显示了用PBS治疗后变应性肺，图13c显示了每日4个用剂量的25μg CMP鼻内治疗后的变应性肺。

实施例14

表1a显示了在Der-p和Afu感染的小鼠内治疗对于IL-12、IFN-γ、TNF-α和IL-4水平的作用。试验组施以4个每日剂量的变应原提取物，然后用25μg CMP经鼻内治疗，或用聚苯乙烯微球作为非特异性颗粒对照物(PC)。通过测量高度染色的细胞的比例来评估细胞因子产生的活性，所述细胞对于被藻红蛋白标记的相应的抗细胞因子的抗体为阳性。结果显示为±SEM。在Der p模型中，IL-12显著增加了77％(Der-CMP，p＜0.005)，在Afu模型中，IL-12增加了43％(Afu-CMP)。颗粒对照组的IL-12水平没有增加。在Der p模型中，TNF-γ显著增加了41％(Der-CMP，p＜0.05)，在Afu模型中，TNF-γ增加了22％(Afu-CMP)。在Der p模型中，TNF-α显著增加了44％(Der-CMP，p＜0.05)，在Afu模型中，TNF-α增加了22％(Afu-CMP，p＜0.05)，在Der p激发的小鼠中治疗对于GM-CSF水平的作用显示于表1b。用40μg CMP治疗小鼠。通过细胞内细胞因子染色和流式细胞仪测量GM-CSF。用CMP进行的治疗相对于单独用PBS进行的治疗使GM-CSF显著(p＜0.05)降低，接近非变应性自然小鼠中的水平。比较IL-4染色的脾细胞的几何平均荧光(GMF)(表1c)，显示在Der p模型中有34％的降低(Der-CMP)，而在Afu模型中有27％的降低(Afu-CMP)。在颗粒参照组中没有发现任何降低。

实施例15

图14显示了用CMP对于绿脓假单胞菌感染的小鼠的预处理效果。小鼠先用2×10⁰绿脓假单胞菌经鼻内感染，然后用250μg CMP的PBS溶液经鼻内预处理3天。10天后测量动物存活率。实验进行两次，合并所得结果。在变应原感染1天后，40％的对照治疗小鼠已经死亡，而相比之下，CMP治疗的小鼠具有100％的存活率。在变应原感染3天后，70％的对照治疗小鼠已经死亡，而相比之下，CMP治疗的小鼠具有80％的存活率。在感染多达10天后没有看到这些存活率的变化。

实施例16

图15显示了250μm CMP对于小鼠的清除肺炎链球菌的预处理效果。从0至12小时，在PBS和CMP治疗的小鼠之间没有观察到差别；但是在24小时的时间点，CMP治疗的小鼠的肺内具有显著低的细菌cfu(p＜0.001)。

实施例17

图16显示了250μm CMP对于感染小鼠血液中肺炎链球菌出现的预处理效果。在12小时点没有观察到细菌，在24小时(p＜0.005)和48小时，血液细菌显著变少，说明CMP在12至24小时内在肺内产生保护作用。

实施例18

图17显示了0.1μg/ml CMP对于在LPS活化的CD14人单核细胞内TNF-α产量的影响。仅用0.1μg/ml CMP培育的单核细胞的TNF-α产率非常小。但是，与仅由LPS刺激的细胞相比，用0.1μg/ml CMP并补充以5ng/ml的LPS作为单核细胞活化剂的血液培育可使得CD¹⁴⁺单核细胞内的TNF-α产量显著(p＜0.001)增加。

实施例19

图18显示了0.1μg/ml CMP对于在LPS活化的CD14/CD16的前发炎人单核细胞内TNF-α产量的影响。在没有CMP或LPS培育的前发炎单核细胞内TNFα产量很小。当与仅用LPS刺激的细胞相比时，用0.1μg/ml CMP并补充以5ng/ml的LPS的培育可导致TNFα产量增加至约350MFI。

实施例20

图19显示了通过0.1μg/ml CMP产生的由PMA/离子霉素刺激的人T淋巴细胞的IFN-γ的产量。加入CMP使得了IFN-γ的产量提高了20％，所述IFN-γ来自于体外培养的PMA/离子霉素刺激的CD2⁺T淋巴细胞。结果表明，CMP能够促进Th1淋巴细胞的活性或增殖。

表1

a)

b)

c)

参考文献

本文提到的参考文献均清楚地引入本文以供参考。

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10.kadioglu et al.Infect.Immun.2：492-501.2000.

Claims

1.壳多糖微粒制剂在制备用于治疗变态反应的药物中的用途，其中所述药物经鼻内或吸入递送，且壳多糖微粒的平均直径小于10μm。

2.如权利要求1所述的用途，其中变态反应是季节性呼吸变态反应；空气变应原的变态反应；可通过减少血清IgE和嗜酸粒细胞增多治疗的变态反应；哮喘；湿疹；食物过敏；皮炎；或通过变态反应脱敏作用来治疗的变态反应。

3.如权利要求2所述的用途，其中空气变应原为屋内螨、真菌孢子、草花粉、树花粉或动物皮屑。

4.如权利要求2所述的用途，其中皮炎为特应性皮炎。

5.如权利要求1所述的用途，其中壳多糖微粒成分用于变态反应脱敏作用，且另外包括变应原。

6.如权利要求5所述的用途，其中变应原为食物变应原。

7.如权利要求6所述的用途，其中食物变应原存在于牛奶、小麦、麸质、鸡蛋、坚果、或贝类中。

8.如权利要求1所述的用途，其中药物用于治疗动物。

9.如权利要求8所述的用途，其中动物为马，以及变态反应为哮喘或与复发性肺感染有关。

10.壳多糖微粒制剂在制备用于治疗疾病的药物中的用途，其中所述疾病得益于细胞介导的免疫系统的上调，其中所述药物经鼻内或通过吸入施用，且壳多糖微粒的平均直径小于10μm。

11.如权利要求10所述的用途，其中得益于细胞介导的免疫系统的上调的疾病为细菌性感染、真菌性感染或病毒性感染。

12.如权利要求11所述的用途，其中所述感染为耳、鼻、咽喉或肺感染。

13.如权利要求10至12中任一项所述的用途，其中所述药物用于治疗处于发生感染危险中的病人。

14.如权利要求13所述的用途，其中处于危险中的病人为老人、早产儿、婴儿、手术移植的病人、免疫抑制的病人、化疗的病人、处于机会性感染危险中的住院病人、使用呼吸机的病人、囊性纤维化病人或AIDS病人。

15.如权利要求10至12中任一项所述的用途，其中所述疾病为由绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、链球菌(Streptococcus)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、肺炎克雷波杆菌(Klebsiellapneumoniae)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yershinia enteocolitica)、沙门菌(Salmonella)、李斯特菌(Listeria)、分枝杆菌(Mycobacteria)引起的细菌性感染，或寄生虫感染。

16.如权利要求15所述的用途，其中链球菌为肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、化脓链球菌(Streptococcus pyrogenes)或无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)。

17.如权利要求15所述的用途，其中分枝杆菌为结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、或麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)。

18.如权利要求15所述的用途，其中寄生虫感染为由利什曼原虫(Leishmania)和血吸虫(Schistosoma)引起的感染。

19.如权利要求10至12中任一项所述的用途，其中所述疾病为细菌性肺炎如呼吸机相关的肺炎或囊性纤维化相关的感染。

20.如权利要求10至12中任一项所述的用途，其中所述疾病为中耳炎。

21.如权利要求10至12中任一项所述的用途，其中真菌性感染为侵袭性肺曲霉病和侵袭性肺念珠菌病、卡氏肺囊虫肺炎(Pneumocystiscarinii)或球孢子菌(Coccidioides)或隐球菌(Crytococcus)感染。

22.如权利要求10至12中任一项所述的用途，其中所述疾病为肺病毒性感染。

23.如权利要求10至12中任一项所述的用途，其中病毒性感染是由呼吸道合胞病毒细支气管炎、流感病毒、鼻病毒或人体免疫缺陷病毒的感染所引起的。

24.壳多糖微粒制剂在制备用于治疗疾病的药物中的用途，所述疾病得益于NK细胞活性的上调和/或免疫系统细胞分泌IFN-γ，其中所述药物经鼻内或通过吸入施用，且壳多糖微粒的平均直径小于10μm。

25.如权利要求24所述的用途，其中所述疾病为癌。

26.如权利要求24所述的用途，其中所述疾病为肺癌、肺肿瘤、或鼻-咽肿瘤。

27.如权利要求24所述的用途，其中所述疾病为慢性肺疾病。

28.如权利要求1或24所述的用途，其中所述药物被预防性地施用。

29.如权利要求1或24所述的用途，其中壳多糖微粒的平均直径小于5μm。

30.如权利要求1或24所述的用途，其中壳多糖微粒的平均直径为至少1μm。

31.如权利要求1或24所述的用途，其中壳多糖微粒来自蟹、虾、龙虾、乌贼和昆虫的外骨骼和真菌。

32.如权利要求1或24所述的用途，其中通过声波处理或研磨纯化的壳多糖得到壳多糖微粒。

33.如权利要求1或24所述的用途，其中通过用N-乙酰-D-葡糖胺、壳多糖或其片段来涂布载体颗粒得到壳多糖微粒。

34.如权利要求1或24所述的用途，其中给病人施用药物的治疗有效量按每千克体重计为0.01至100mg活性化合物。

35.如权利要求1或24所述的用途，其中将药物施用给人。

36.如权利要求1或24所述的用途，其中壳多糖微粒制剂包括一种或多种药学可接受的赋形剂、载体、推进剂、缓冲剂、稳定剂、等渗剂、防腐剂或抗氧化剂。

37.施用如前述权利要求中任一项所述的壳多糖微粒的递送装置，所述装置包括：

a)平均直径小于10μm的壳多糖微粒的储存器；

b)适于设置在病人口或鼻内的递送孔；和

c)在储存器和递送孔之间的阀门，以便操纵该阀门来控制壳多糖微粒的递送。

38.一种包括壳多糖微粒成分和变应原的组合物，其中壳多糖微粒的直径小于10μm。

39.如权利要求38所述的组合物，其中所述变应原为食物变应原。

40.如权利要求39所述的组合物，其中所述食物变应原存在于牛奶、小麦、麸质或鸡蛋中。

41.一种包括壳多糖微粒成分和变应原的组合物，其中壳多糖微粒的直径小于10μm以用于医学治疗方法中。

42.一种用于同时或按顺序施用给病人的试剂盒，所述试剂盒包括：

a)壳多糖微粒成分，其中壳多糖微粒的直径小于10μm；和

b)变应原。

43.一种鼻用喷瓶，含有壳多糖微粒组合物和可药用载体，其中壳多糖微粒的平均直径小于10μm，以及所述喷瓶具有适于经鼻内递送的颈。