CN1438486A - 一种免疫层析检测abo血型的方法和制备的试纸及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，公开了一种免疫层析检测ABO血型的方法及试纸的制备。具体方法步骤为(1)待检样品的处理；(2)硝酸纤维素膜检测线和质控线的制备；(3)示踪粒子结合物垫的制备；(4)组装试纸条。样品中的血型抗原通过层析作用与示踪粒子标记抗体/凝结素和硝酸纤维素膜上抗体/凝结素形成夹心，示踪粒子显色达到简便，快速检测ABO血型之目的。主要用于血液，唾液，尿液，骨骼、毛发及各种体液斑痕的ABO血型检测。

Description

一种免疫层析检测ABO血型的方法和制备的试纸及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，公开了一种免疫层析检测ABO血型的方法及试纸的制备。

背景技术

1900年Landsteiner发现了人类红细胞与血清间的同种凝结反应，并将人类血液分为ABO三型。1902年Landsteiner的学生Decastelle和Sturl继续研究发现AB型。这样确定了人类血液有四种型。血型在临床输血、组织器官移植、人类学、遗传学、法医学、考古学等方面均有广泛应用。

ABO血型分类原则为：红细胞上无A和B血型抗原，而血清中有抗A及抗B抗体者，称为O型；红细胞上有A抗原，而血清中有抗B抗体者，称为A型；红细胞上有B抗原，而血清中有抗A抗体者，称为B型；红细胞上有A和B抗原，而血清中无抗A及抗B抗体者，称为AB型。H抗原的生物合成先于A和B抗原，所以除变异体外，A型、B型、AB型和O型红细胞均存在H抗原。

A型、B型和H抗原不仅存在于红细胞，而且也存在于组织细胞，特别是在各种体液里含量丰富，例如血清、唾液、胃液、卵巢囊肿液、精液、羊水、汗液、尿液、泪液、胆汁、乳汁等。通过检测体液中的血型抗原也能确定血型。

目前检测ABO血型的技术可分为两类，一类为检测细胞膜上结合血型抗原的免疫技术及其改进技术，包括红细胞盐水凝结法、中和试验、吸收试验、解离试验和混合凝集反应等。另一类为直接检测游离血型抗原的免疫技术，包括协同凝结反应、放射免疫分析、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。

红细胞盐水凝结法是通过已知的IgM型抗体检测新鲜红细胞表面的血型抗原并使红细胞发生凝结来判断结果。红细胞盐水凝结法已广泛用于临床输血检验，是最常规的血型鉴定技术。红细胞盐水凝结法成本低廉，操作简便，结果准确可靠，但只能检测新鲜红细胞的血型，试剂需用冰箱保存，不能用于体液、血痕、毛发等的血型检测。

红细胞盐水凝结法的改进方法如中和试验、吸收试验、解离试验和混合凝集反应能用于体液、血痕、毛发等的血型检测。中和试验、吸收试验需15-18小时，既费时且灵敏度低，结果不易观察；解离试验、混合凝结反应，虽然时间较短，但它的技术要求较高，每做一个试验需反复摸索条件，直到标准对照正确才能判读结果。以上实验灵敏度较低，并且均需新鲜标准ABO红细胞指示，此新鲜细胞不易保存，不易携带，易污染溶血，从而影响结果判断。

协同凝结反应是用IgG型抗体致敏葡萄球菌表面的A蛋白，通过葡萄球菌的凝结与否来判断结果。协同凝结试验操作简便、快捷、敏感性高，既节省了时间又减少了繁琐的检验程序，更不需要高精的仪器设备。但此法试剂常温保存不便，使法医现场检案应用受到一定限制。

放射免疫分析和酶联免疫吸附试验(ELISA)是用已知的抗体或特异性凝结素来检测游离的血型抗原，灵敏度高，但试剂无法常温保存，单人份测定也不方便，无法实现现场检测。放射免疫分析更有放射性污染，使应用受到限制。

检测游离血型抗原的抗体类型主要有IgG，IgM和IgA，检测游离血型抗原的凝结素主要有抗A凝结素(腺豆凝结素、蜗牛凝结素等)，抗B凝结素(桃叶卫矛凝结素，泥鳅卵凝结素，鲈鱼卵凝结素等)和抗H凝结素(荆豆凝结素，牛角花凝结素，鳝鱼凝结素等)。

本发明免疫层析技术检测ABO血型，是以已知的抗体或特异性凝结素用夹心法来检测游离的血型抗原。因此有放射免疫分析和酶联免疫吸附试验(ELISA)的优点。同时，本发明有简单、快速、常温保存、单份测定、一次试验测出ABO血型、除商品试剂外不需任何仪器设备的优点，特别适合现场ABO血型的现场快速检测，也可用于血型的自检。

免疫层析是出现于80年代初期的一种独特的免疫分析方式，它往往以条状纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，并同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体(如抗体或抗原)发生高特异高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域(检测带)，通过酶反应或直接运用可目测的标记物(如胶体金)而得到直观的实验现象(如显色)。而游离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离之目的。免疫层析技术常见的示踪粒子有胶体金、乳胶、胶体硒、明胶等，其中运用最成功的标记物为胶体金。

免疫层析技术目前已广泛应用于临床医疗检测中。国内外现有的商品供应及文献报道的检测项目主要包括以下方面：违禁药物检测(苯丙胺、可卡因、大麻、吗啡、海洛因等)、传染病病原检测(梅毒螺旋体、淋球菌、泌尿生殖系沙眼衣原体、幽门螺杆菌等)、激素检测、寄生虫、肿瘤标记物、心血管病检测标志物等。免疫层析技术用于检测ABO血型未见报道。

发明内容

本发明的目的是建立一种免疫层析检测ABO血型的方法并制备ABO血型检测试纸。

为实现本发明的目的采取的方案：

1.一种免疫层析检测ABO血型的方法，包括如下步骤：

(1)待检样品的处理；(2)硝酸纤维素膜检测线和质控线的制备；(3)示踪粒子结合物垫的制备；(4)组装试纸条；其特征是

硝酸纤维素膜检测线和质控线的制备，包括如下步骤：

①用能与血型抗原A和B结合的抗体或凝结素线状点样作为检测线；

②用能与血型抗原H结合的抗体或凝结素，示踪粒子标记抗体的抗抗体或示踪粒子标记凝结素的抗体线状点样作为质控线。

2.制备检测线的抗体和凝结素是这样选择的：

①选择血型抗原A的IgG型抗体、IgM型抗体、IgA型抗体、腺豆凝结素、蜗牛凝结素的一种用于制备一条检测线；

②选择血型抗原B的IgG型抗体、IgM型抗体、IgA型抗体、桃叶卫矛凝结素，泥鳅卵凝结素，鲈鱼卵凝结素的一种用于制备另一条检测线。

3.质控线选择一条至两条，制备质控线的抗体和凝结素是这样选择的：

①选择血型抗原H的IgG型抗体、IgM型抗体、IgA型抗体、荆豆凝结素，牛角花凝结素，鳝鱼凝结素的一种用于制备一条质控线；

②选择示踪粒子标记抗体的抗抗体或示踪粒子标记凝结素的抗体线状点样制备另一条质控线。

4、检测线和质控线是这样制备的：

将硝酸纤维素膜按10-35mm宽的尺寸剪裁；将经生理盐水缓冲液充分透析，浓度调整为0.01-0.3mg/ml血型抗体抗A和抗B溶液或A，B凝结素在膜上分别线状点样作为检测线，检测线点样位置离膜底边4-16mm，两条检测线之间的距离为2-12mm；然后在膜的顶端用浓度调整为0.01-0.3mg/ml的相应抗体或凝结素喷涂质控线，选用双质控线时，两条质控线之间的距离为2-12mm；硝酸纤维素膜室温干燥30min，置于1％牛血清白蛋白的生理盐水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃孵育30min，置室温下干燥处密封储藏。

5.示踪粒子结合物垫的制备包括如下步骤：

①选用能与血型抗原A，B和H结合的抗体或凝结素标记示踪粒子；

②把标记好的示踪粒子，分散在玻璃纤维纸上。

6.制备示踪粒子结合物垫的抗体和凝结素选择是这样的：

①选择血型抗原A的IgG型抗体、IgM型抗体、IgA型抗体、腺豆凝结素、蜗牛凝结素的一种用于标记示踪粒子；

②选择血型抗原B的IgG型抗体、IgM型抗体、IgA型抗体、桃叶卫矛凝结素、泥鳅卵凝结素、鲈鱼卵凝结素的一种用于标记示踪粒子；

③选择血型抗原H的IgG型抗体、IgM型抗体、IgA型抗体、荆豆凝结素、牛角花凝结素、鳝鱼凝结素的一种用于标记示踪粒子。

7.示踪粒子结合物垫制备的抗体和凝结素组合为如下一种：

①在示踪粒子结合物垫分散抗原A，抗原B和抗原H的抗体或凝结素；

②在示踪粒子结合物垫分散抗原A和抗原B的抗体或凝结素。

8.制备示踪粒子结合物垫的示踪粒子为如下一种：

①胶体金颗粒；

②乳胶颗粒；

③胶体硒颗粒；

④明胶颗粒；

⑤磁性颗粒。

9.组装试纸条，步骤如下：

①在衬垫上加上有检测线和质控线的硝酸纤维素膜；②在衬垫上加上示踪粒子结合物垫；③在衬垫上加上样品垫；④在衬垫上加上吸水垫；组装为检测试纸条。

10、一种免疫层析检测ABO血型的试纸，其特征是用本发明所述的免疫层析法制备而成，能快速、简便、灵敏地应用于检测ABO血型。

具体方法：

本发明实现免疫层析检测ABO血型的方法及试纸的制备包括如下步骤：1.待检样品的处理；2.硝酸纤维素膜检测线和质控线的制备

用能与血型抗原A和B结合的抗体或凝结素线状点样作为检测线，检测线共2条。

用能与血型抗原H结合的抗体或凝结素，示踪粒子标记抗体的抗抗体或示踪粒子标记凝结素的抗体线状点样作为质控线，质控线共2条。3.示踪粒子结合物垫的制备：

选用能与血型抗原A，B和H结合的抗体或凝结素标记示踪粒子。把标记好的示踪粒子，分散在玻璃纤维纸上，作为示踪粒子结合物垫。4.试纸条的组装：

①在衬垫上加上有检测线和质控线的硝酸纤维素膜；②在衬垫上加上示踪粒子结合物垫；③在衬垫上加上样品垫；④在衬垫上加上吸水垫；组装为检测试纸条。

方法可细分为四部分：

1.待检样品的处理；2.硝酸纤维素膜检测线和质控线的制备；3.示踪粒子结合物垫的制备；4.试纸条的组装。1.待检样品的处理1)血液样品

用蒸馏水稀释10-10000倍，溶解红细胞直接使用。2)血斑、精斑、唾液斑、阴道分泌物斑等样品

加入适量蒸馏水，煮沸1-30分钟，冷却到室温使用。3)唾液样品

用蒸馏水稀释10-10000倍，直接使用或煮沸1-30分钟，冷却到室温使用。4)尿样：

取适量尿样直接进行试验(尿样混浊时建议离心或过滤)。5)组织样品

组织样品加适量蒸馏水匀浆，离心取上清备用。6)骨骼样本

用铁锉制备骨粉，加入适量蒸馏水，煮沸1-30分钟，冷却到室温使用。7)毛发样本

用剪刀剪成细小片段，加入适量蒸馏水研磨，煮沸1-30分钟，冷却到室温使用。2.硝酸纤维素膜检测线和质控线的制备

将硝酸纤维素膜按10-35mm宽的尺寸剪裁；将经生理盐水缓冲液充分透析，浓度调整为0.01-0.3mg/ml血型抗体抗A和抗B溶液或A，B凝结素在膜上分别线状点样作为检测线，检测线点样位置离膜底边4-16mm，两条检测线之间的距离为2-12mm；然后在膜的顶端喷涂质控线，质控线为如下的一条或两条。一条用能与血型抗原H结合的抗体或凝结素，另一条用示踪粒子标记抗体的抗抗体或示踪粒子标记凝结素的抗体。选择两条质控线时，两条质控线之间的距离为2-12mm；硝酸纤维素膜室温干燥30min，置于1％牛血清白蛋白的生理盐水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃孵育30min，置室温下干燥处密封储藏。3.示踪粒子结合物垫的制备(1)示踪粒子的制备和标记①胶体金溶胶制备标记：

胶体金溶胶制备：取0.01％四氯化金水溶液200ml，加热至沸腾，加入1-20ml 1％柠檬酸钠水溶液，煮沸5min，出现橙红色，胶体金颗粒直径由电镜测定为10-80nm；

胶体金标记抗体或凝结素：取50ml胶体金，用0.1mol/L碳酸钾调pH(IgG的pH值用8.0；荆豆凝结素用6.3；麦胚凝结素用9.9)，搅拌下将胶体金溶胶分别和血型抗体混合，再加入聚乙二醇水溶液，使最终浓度为0.05％。将粗制品6000g离心45min，沉淀用生理盐水混悬至1.5ml，4℃保存。②胶体硒溶胶制备和抗体标记：

胶体硒溶胶制备：在1升容量的四颈圆底烧瓶内加入去离子水550ml和聚丙烯酸10g，通氮室温搅拌并加入水合肼69.5ml，继续搅拌20分钟。亚硒酸9.63g溶解于280ml水，室温搅拌下滴入反应混合液内，得到120nm红色硒溶胶。

胶体硒抗体标记：抗体IgG用20mmol/L pH7.3磷酸盐缓冲液配成4.6mg/ml浓度溶液，加25ul于pH7.3的25ml硒溶胶中，室温搅拌10分钟后加1％PEG8000 1ml，混匀，于4℃以5000rpm离心5分钟，得到松软的红色沉淀，用含0.05％ NaN3的磷酸盐缓冲液配成1ml悬液。③乳胶的制备和抗体标记：

彩色乳胶颗粒购自Bangs LABOratories`公司。抗体标记程序为：用pH7.1的磷酸盐缓冲液将乳胶稀释到1％浓度，搅拌下加入一定量的IgG溶液，室温搅拌30分钟后于37℃水浴孵化60分钟，4℃放置4-5小时。15000rpm离心30分钟，用适量磷酸盐缓冲液重悬。(2)示踪粒子结合物垫的制备：

将标记示踪粒子的血型抗体或凝结素按比例混合分散在厚度为1mm的玻璃纤维纸上，冻干密封干燥保存。4.纸条的组装：

①在衬垫上加上有检测线和质控线的硝酸纤维素膜；②在衬垫上加上示踪粒子结合物垫；③在衬垫上加上样品垫；④在衬垫上加上吸水垫；组装为检测试纸条。

本发明的优点及应用范围

本发明同以往检测体液、血痕、毛发ABO血型的技术相比具有如下优点：(1)操作简便、快捷，仅需5-10分钟；(2)灵敏度高，如唾液稀释千倍以上仍能测出血型；(3)无需特殊仪器设备(包括显微镜、震荡器、冰箱等)，除商品试剂外不需任何仪器设备，所耗费用低；(4)无需新鲜红细胞指示，而直接通过颜色判断结果；(5)室温保存、单份测定，可随身携带。

本发明属于生物医学领域，主要用于血液，体液，骨骼、毛发及各种体液斑痕的ABO血型检测。本发明的试纸条的使用单位主要为医院、部队、公检法部门、运动员兴奋剂检测部门等，个人也可进行血型自检。

附图说明

图1：免疫层析检测ABO血型试纸条的结构和检测原理图

检测试纸是这样构成的：在衬垫1上按顺序有样品垫4用于吸附样品，加入样品后，样品中可能有抗原A(18)，抗原B(19)和抗原H(20)；示踪粒子结合物垫3上有示踪粒子17标记的抗A(14)，抗B(15)和抗H(16)；硝酸纤维素膜2上有检测线6，检测线7，质控线8和质控线9，检测线6上有抗A或A抗原凝结素(10)，检测线7上有抗B或B抗原凝结素(11)，质控线8有抗H或H抗原凝结素(12)，质控线9有抗A(14)，抗B(15)和抗H(16)的抗抗体(13)；5为吸水垫。

检测原理是这样的：在样品垫4上滴加样品，如果样品中有抗原A(18)，抗原B(19)和抗原H(20)，经层析作用移动到示踪粒子结合物垫3，和示踪粒子17标记的抗A(14)，抗B(15)和抗H(16)结合，当移动到检测线6，检测线7和质控线8时，抗原A(18)，抗原B(19)和抗原H(20)又分别与检测线6，检测线7和质控线8上的抗体或凝结素10，11，12结合显色。多余的示踪粒子标记抗体和质控线9上的抗抗体(13)结合并显色。

具体实施方式

实施例一：

胶体金免疫层析检测ABO血型的方法及试纸的制备并用于检测血斑样品

本实施例分为5部分：(1)待检样品的处理；(2)硝酸纤维素膜的制备；(3)胶体金结合物垫的制备；(4)试纸条的组装；(5)检测和结果判断：(1)待检样品的处理：

血斑1-5立方毫米，加入适量蒸馏水1ml，煮沸15分钟，冷却到室温备用。(2)硝酸纤维素膜的制备：①选择制备检测线和质控线的抗体或凝结素：

血型抗体抗A和抗B用于制备检测线，桃叶卫矛凝结素或泥鳅卵凝结素、鲈鱼卵凝结素、腺豆凝结素、蜗牛凝结素的一种用于制备检测线，抗体为IgM型或IgA型。②制备检测线和质控线

将硝酸纤维素膜按25mm宽的尺寸剪裁。将经生理盐水缓冲液充分透析，浓度调整为0.2mg/ml血型抗体抗A和抗B溶液在膜上分别线状点样作为检测线，检测线点样位置离膜底边5mm，两条检测线之间的距离为4mm。然后在膜的顶端喷涂一条荆豆凝结素或牛角花凝结素、鳝鱼凝结素的一种作为质控线，室温干燥30min，将膜置于1％牛血清白蛋白的生理盐水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃孵育30min，置室温下干燥处密封储藏。(3)胶体金结合物垫的制备：

分别取50ml颗粒直径为30-50nm胶体金，用0.1mol/L碳酸钾调pH至8.0，搅拌下将胶体金溶胶和抗A，抗B和抗H单克隆抗体混合，再加入聚乙二醇水溶液，使最终浓度为0.05％。将粗制品6000g离心45min，沉淀用生理盐水混悬至1.5ml，4℃保存。将标记胶体金颗粒的抗体混合并分散在厚度为1mm的玻璃纤维纸上，冻干密封干燥保存。(4)试纸条的组装：

①在衬垫上加上有检测线和质控线的硝酸纤维素膜；②在衬垫上加上胶体金结合物垫；③在衬垫上加上样品垫；④在衬垫上加上吸水垫；组装为检测试纸条。(5)检测和结果判断

 检测：取处理好的样本0.5ml，离心片刻，垂直插入试纸条，插入深度不超过样品垫，在样本中停留约5秒，垂直取出试纸，5分钟后观察。

 结果判断如下：A线，B线和H线处有红线出现为阳性，无红线出现为阴性

A	B	H	结果判断
				+/-	+/-	-	结果不可靠或样本中无血型抗原
+	-	+	A型
				-	+	+	B型
+	+	+	AB型
				-	-	+	O型

实施例二：

胶体金免疫层析检测ABO血型的方法及试纸的制备并用于检测体液斑痕(血斑、精斑或唾液斑等)样品

本实施例分为5部分：(1)待检样品的处理；(2)硝酸纤维素膜的制备；(3)胶体金结合物垫的制备；(4)试纸条的组装；(5)检测和结果判断(1)待检样品的处理：

体液斑痕1-5立方毫米或有斑痕样品的纤维少许，加入蒸馏水0.5-1ml，煮沸15分钟，冷却到室温备用。(2)硝酸纤维素膜的制备：①选择制备检测线和质控线的抗体

血型抗体抗A和抗B用于制备检测线，抗体为小鼠IgG型，兔抗鼠IgG用于制备质控线。②制备检测线和质控线

将硝酸纤维素膜按25mm宽的尺寸剪裁；将经生理盐水缓冲液充分透析，浓度调整为0.2mg/ml血型抗体抗A和抗B溶液在膜上分别线状点样作为检测线，检测线点样位置离膜底边5mm，两条检测线之间的距离为4mm；然后在膜的顶端喷涂一条兔抗鼠IgG作为质控线，室温干燥30min，将膜置于1％牛血清白蛋白的生理盐水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃孵育30min，置室温下干燥处密封储藏。(3)胶体金结合物垫的制备：

分别取50ml颗粒直径为30-50nm胶体金，用0.1mol/L碳酸钾调pH至8.0，搅拌下将胶体金溶胶与不同株的抗A和抗B单克隆抗体混合，再加入聚乙二醇水溶液，使最终浓度为0.05％。将粗制品6000g离心45min，沉淀用生理盐水混悬至1.5ml，4℃保存。将标记胶体金颗粒的抗体混合并分散在厚度为1mm的玻璃纤维纸上，冻干密封干燥保存。(4)试纸条的组装：

①在衬垫上加上有检测线和质控线的硝酸纤维素膜；②在衬垫上加上胶体金结合物垫；③在衬垫上加上样品垫；④在衬垫上加上吸水垫；组装为检测试纸条。(5)检测和结果判断

检测：取处理好的样本0.5ml，离心片刻，垂直插入试纸条，插入深度不超过样品垫，在样本中停留约5秒，垂直取出试纸，5分钟后观察。

结果判断如下：A线，B线和质控线处有红线出现为阳性，无红线出现为阴性

A线	B线	质控线	结果判断
				+/-	+/-	-	结果不可靠或样本中无血型抗原
+	-	+	A型
				-	+	+	B型
+	+	+	AB型
				-	-	+	O型

实施例三：

乳胶颗粒或明胶颗粒免疫层析检测ABO血型试纸的制备并用于检测血斑样品

本实施例分为5部分：(1)待检样品的处理；(2)硝酸纤维素膜的制备；(3)胶体金结合物垫的制备；(4)试纸条的组装；(5)检测和结果判断(1)待检样品的处理：

血斑1-5立方毫米，加入蒸馏水1ml，煮沸15分钟，冷却到室温备用。(2)硝酸纤维素膜的制备：①选择制备检测线和质控线的抗体

血型抗体抗A和抗B用于制备检测线，血型抗体抗H用于制备质控线，抗体为IgG型。②制备检测线和质控线

将硝酸纤维素膜按25mm宽的尺寸剪裁；将经生理盐水缓冲液充分透析，浓度调整为0.2mg/ml血型抗体抗A和抗B溶液在膜上分别线状点样作为检测线，检测线点样位置离膜底边5mm，两条检测线之间的距离为4mm；然后在膜的顶端喷涂一条血型抗体抗H作为质控线，室温干燥30min，将膜置于1％牛血清白蛋白的生理盐水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃孵育30min，置室温下干燥处密封储藏。(3)乳胶或明胶结合物垫的制备：

彩色乳胶颗粒购自Bangs Laboratories公司，明胶颗粒购自Zodolabs公司，颜色为兰色。用pH7.1的磷酸盐缓冲液将乳胶颗粒或明胶颗粒稀释到1％浓度，分别取50ml，搅拌下将乳胶溶液和不同株的抗A，抗B和抗H单克隆抗体混合，室温搅拌30分钟后于37℃水浴孵化60分钟，4℃放置4-5小时。15000rpm离心30分钟，用2ml磷酸盐缓冲液重悬。将标记乳胶颗粒或明胶颗粒的抗体混合并分散在厚度为1mm的玻璃纤维纸上，冻干密封干燥保存。(4)试纸条的组装：

①在衬垫上加上有检测线和质控线的硝酸纤维素膜；②在衬垫上加上胶体金结合物垫；③在衬垫上加上样品垫；④在衬垫上加上吸水垫；组装为检测试纸条。(5)检测和结果判断

检测：取处理好的样本0.5ml，离心片刻，垂直插入试纸条，插入深度不超过样品垫，在样本中停留约5秒，垂直取出试纸，5分钟后观察。

结果判断如下：相应位置出现兰色线条为阳性，无线条为阴性

A	B	H	结果判断
				+/-	+/-	-	结果不可靠或样本中无血型抗原
+	-	+	A型
				-	+	+	B型
+	+	+	AB型
				-	-	+	O型

实施例四：

胶体硒免疫层析检测ABO血型试纸的制备并用于检测骨骼、组织和毛发样品

本实施例分为5部分：(1)待检样品的处理；(2)硝酸纤维素膜的制备；(3)胶体金结合物垫的制备；(4)试纸条的组装；(5)检测和结果判断(1)待检样品的处理：

骨骼样本用铁锉制备骨粉，加入适量蒸馏水，煮沸1-30分钟，冷却到室温使用。

毛发样本用剪刀剪成细小片段，加入适量蒸馏水研磨，煮沸1-30分钟，冷却到室温使用。

组织样品加适量蒸馏水匀浆，离心取上清备用。(2)硝酸纤维素膜的制备：①选择制备检测线和质控线的抗体

血型抗体抗A和抗B用于制备检测线，抗体为小鼠IgG型单克隆抗体，兔抗鼠IgG用于制备质控线。②制备检测线和质控线

将硝酸纤维素膜按25mm宽的尺寸剪裁；将经生理盐水缓冲液充分透析，浓度调整为0.2mg/ml血型抗体抗A和抗B溶液在膜上分别线状点样作为检测线，检测线点样位置离膜底边5mm，两条检测线之间的距离为4mm；然后在膜的顶端喷涂一条兔抗鼠IgG作为质控线，室温干燥30min，将膜置于1％牛血清白蛋白的生理盐水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃孵育30min，置室温下干燥处密封储藏。(3)胶体硒结合物垫的制备：

胶体硒抗体标记：抗A，抗B用20mmol/L pH7.3磷酸盐缓冲液配成4.6mg/ml浓度溶液，分别取25ul加入25ml硒溶胶中，室温搅拌10分钟后加1％PEG8000 1ml，混匀，于4℃以5000rpm离心5分钟，得到松软的红色沉淀，用含0.05％NaN3的磷酸盐缓冲液配成1ml悬液。将标记胶体硒颗粒的抗体混合并分散在厚度为1mm的玻璃纤维纸上，冻干密封干燥保存。(4)试纸条的组装：

①在衬垫上加上有检测线和质控线的硝酸纤维素膜；②在衬垫上加上胶体金结合物垫；③在衬垫上加上样品垫；④在衬垫上加上吸水垫；组装为检测试纸条。(5)检测和结果判断

检测：取处理好的样本0.5ml，离心片刻，垂直插入试纸条，插入深度不超过样品垫，在样本中停留约5秒，垂直取出试纸，5分钟后观察。

结果判断如下：A线，B线和质控线处有红线出现为阳性，无红线出现为阴性

A线	B线	质控线	结果判断
				+/-	+/-	-	结果不可靠或样本中无血型抗原
+	-	+	A型
				-	+	+	B型
+	+	+	AB型
				-	-	+	O型

实施例五：

磁性颗粒免疫层析检测ABO血型试纸的制备并用于检测血斑样品：

本实施例分为5部分：(1)待检样品的处理；(2)硝酸纤维素膜的制备；(3)磁性颗粒结合物垫的制备；(4)试纸条的组装；(5)检测和结果判断(1)待检样品的处理：

血斑1-5立方毫米，加入蒸馏水1ml，煮沸15分钟，冷却到室温备用。(2)硝酸纤维素膜的制备：①选择制备检测线和质控线的抗体：

血型抗体抗A和抗B用于制备检测线，血型抗体抗H用于制备质控线，抗体为IgG型。②制备检测线和质控线

将硝酸纤维素膜按25mm宽的尺寸剪裁；将经生理盐水缓冲液充分透析，浓度调整为0.2mg/ml血型抗体抗A和抗B溶液在膜上分别线状点样作为检测线，检测线点样位置离膜底边5mm，两条检测线之间的距离为4mm；然后在膜的顶端喷涂一条血型抗体抗H作为质控线，室温干燥30min，将膜置于1％牛血清白蛋白的生理盐水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃孵育30min，置室温下干燥处密封储藏。(3)磁性颗粒结合物垫的制备：

磁性颗粒购自Bangs Laboratories公司。用pH7.1的磷酸盐缓冲液将磁性颗粒稀释到1％浓度，分别取50ml，搅拌下将其和不同株的抗A，抗B和抗H单克隆抗体混合，室温搅拌30分钟后于37℃水浴孵化60分钟，4℃放置4-5小时。15000rpm离心30分钟，用2ml磷酸盐缓冲液重悬。将标记磁性颗粒的抗体混合并分散在厚度为1mm的玻璃纤维纸上，冻干密封干燥保存。(4)试纸条的组装：

①在衬垫上加上有检测线和质控线的硝酸纤维素膜；②在衬垫上加上磁性颗粒结合物垫；③在衬垫上加上样品垫；④在衬垫上加上吸水垫；组装为检测试纸条。(5)检测和结果判断

检测：取处理好的样本0.5ml，离心片刻，垂直插入试纸条，插入深度不超过样品垫，在样本中停留约5秒，垂直取出试纸，5分钟后用磁读取仪判断结果。

结果判断如下：相应位置出现磁性增强为阳性，无磁性增强为阴性

A	B	H	结果判断
				+/-	+/-	-	结果不可靠或样本中无血型抗原
+	-	+	A型
				-	+	+	B型
+	+	+	AB型
				-	-	+	O型

Claims (10)

1.一种免疫层析检测ABO血型的方法，包括如下步骤：

(1)待检样品的处理；(2)硝酸纤维素膜检测线和质控线的制备；(3)示踪粒子结合物垫的制备；(4)组装试纸条；其特征是

硝酸纤维素膜检测线和质控线的制备，包括如下步骤：

①用能与血型抗原A和B结合的抗体或凝结素线状点样作为检测线；

②用能与血型抗原H结合的抗体或凝结素，示踪粒子标记抗体的抗抗体或示踪粒子标记凝结素的抗体线状点样作为质控线。

2.根据权利要求书1所述的一种免疫层析检测ABO血型的方法，其特征是制备所述的检测线的抗体和凝结素是这样选择的：

①选择血型抗原A的IgG型抗体、IgM型抗体、IgA型抗体、腺豆凝结素、蜗牛凝结素的一种用于制备一条检测线；

②选择血型抗原B的IgG型抗体、IgM型抗体、IgA型抗体、桃叶卫矛凝结素、泥鳅卵凝结素、鲈鱼卵凝结素的一种用于制备另一条检测线。

3.根据权利要求书1所述的一种免疫层析检测ABO血型的方法，其特征是所述的质控线选择一条至两条，制备质控线的抗体和凝结素是这样选择的：

①选择血型抗原H的IgG型抗体、IgM型抗体、IgA型抗体、荆豆凝结素、牛角花凝结素、鳝鱼凝结素的一种用于制备一条质控线；

②选择示踪粒子标记抗体的抗抗体或示踪粒子标记凝结素的抗体线状点样制备另一条质控线。

4.根据权利要求书1所述的一种免疫层析检测ABO血型的方法，其特征是所述的检测线和质控线是这样制备的：

将硝酸纤维素膜按10-35mm宽的尺寸剪裁；将经生理盐水缓冲液充分透析，浓度调整为0.01-0.3mg/ml血型抗体抗A和抗B溶液或A、B凝结素在膜上分别线状点样作为检测线，检测线点样位置离膜底边4-16mm，两条检测线之间的距离为2-12mm；然后在膜的顶端用浓度调整为0.01-0.3mg/ml的相应抗体或凝结素喷涂质控线，选用双质控线时，两条质控线之间的距离为2-12mm；硝酸纤维素膜室温干燥30min，置于1％牛血清白蛋白的生理盐水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃孵育30min，置室温下干燥处密封储藏。

5.根据权利要求书1所述的一种免疫层析检测ABO血型的方法，其特征是所述的示踪粒子结合物垫的制备包括如下步骤：

①选用能与血型抗原A，B和H结合的抗体或凝结素标记示踪粒子；

②把标记好的示踪粒子，分散在玻璃纤维纸上。

6.根据权利要求书5所述的一种免疫层析检测ABO血型的方法，其特征是制备所述的示踪粒子结合物垫的抗体和凝结素选择是这样的：

①选择血型抗原A的IgG型抗体、IgM型抗体、IgA型抗体、腺豆凝结素、蜗牛凝结素的一种用于标记示踪粒子；

②选择血型抗原B的IgG型抗体、IgM型抗体、IgA型抗体、桃叶卫矛凝结素、泥鳅卵凝结素、鲈鱼卵凝结素的一种用于标记示踪粒子；

③选择血型抗原H的IgG型抗体、IgM型抗体、IgA型抗体、荆豆凝结素、牛角花凝结素、鳝鱼凝结素的一种用于标记示踪粒子。

7.根据权利要求书6所述的一种免疫层析检测ABO血型的方法，其特征是所述的示踪粒子结合物垫制备的抗体和凝结素组合为如下一种：

①在示踪粒子结合物垫分散抗原A，抗原B和抗原H的抗体或凝结素；

②在示踪粒子结合物垫分散抗原A和抗原B的抗体或凝结素。

8.根据权利要求书5所述的一种免疫层析检测ABO血型的方法，其特征是制备所述的示踪粒子结合物垫的示踪粒子为如下一种：

①胶体金颗粒；

②乳胶颗粒；

③胶体硒颗粒；

④明胶颗粒；

⑤磁性颗粒。

9.权利要求书1所述的一种免疫层析检测ABO血型的方法，其特征是所述的组装试纸条，步骤如下：

①在衬垫上加上有检测线和质控线的硝酸纤维素膜；②在衬垫上加上示踪粒子结合物垫；③在衬垫上加上样品垫；④在衬垫上加上吸水垫；组装为检测试纸条。

10、一种免疫层析检测ABO血型的试纸，其特征是用本发明所述的免疫层析法制备而成，能快速、简便、灵敏地应用于检测ABO血型。

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