CN1425772A - 一种新型植物dna病毒载体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型植物DNA病毒载体及其用途。本发明提供的植物DNA病毒载体包括中国番茄黄化曲叶病毒DNA－A和DNAβ的侵染性载体及由它衍生的植物基因沉默载体和病毒表达载体。本发明还提供了一种新型的构建植物DNA病毒载体的卫星DNA分子，它与Seq ID No.1－12至少有72％的同源性。本发明还提供一种利用植物DNA病毒载体进行病毒功能基因组研究、植物功能基因组研究和外源蛋白表达的用途及其方法。本发明为研究病毒基因组结构、功能和表达调控机制以及病毒与植物间互作提供了一个至关重要的平台，为研究植物功能基因组提供了一种优良的工具，并为利用植物作为生物反应器表达外源蛋白建立了技术平台。

Description

一种新型植物DNA病毒载体及其用途

                           技术领域

 本发明涉及一种新型植物DNA病毒载体及其用途，具体地，本发明涉及中国番茄黄化曲叶病毒DNA-A和DNAβ的侵染性载体及由它衍生的植物基因沉默载体和病毒表达载体。本发明还涉及一种构建植物DNA病毒载体的DNAβ卫星分子及其全基因组序列。本发明还涉及一种利用植物DNA病毒载体确定基因组功能、植物基因组功能和表达外源蛋白的应用及方法。

                          背景技术

粉虱传双生病毒(whitefly-transmitted geminivirus，WTG)是世界范围内广泛发生的一类植物单链DNA病毒，近年来已在热带、亚热带地区多种作物上引起严重危害，给作物生产造成了严重损失。WTG在分类上属于双生病毒科(Geminiviridae)中的菜豆金黄花叶病毒属(Begomovirus)病毒，包括100多个独立种。在自然条件下，WTG均由烟粉虱(Bemisia tabaci)传播，其病毒粒子形态为孪生颗粒状，大小18×30nm，基因组为单链环状DNA，大小2.5-3.0kb。大多WTG病毒包含2个大小相近的DNA组份，称DNA-A和DNA-B。DNA-A和DNA-B大部分序列不同，但在非编码区中有约200个核苷酸序列几乎相同(同源性大于95％)，称为共同区(common region，CR)，共同区包含有病毒复制、转录起始和包装所需的序列，并可形成茎环结构。DNA-A编码病毒复制所必须的复制相关蛋白(Rep)、复制增强蛋白(Ren)、外壳蛋白(CP)和控制晚期基因表达的转录激活蛋白(TrAP)，这些蛋白与病毒的复制和介体传播有关；DNA-B编码一个核穿梭蛋白(NSP)和一个运动蛋白(MP)，与病毒在植物体内的运输和病毒的寄主范围有关。目前，WTG中少数病毒，如番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)(泰国的TYLCV除外)、番茄曲叶病毒(TLCV)、棉花曲叶病毒(CLCuV)和胜红蓟黄脉病毒(AYVV)，仅发现有DNA-A，对TYLCV和TLCV的致病性测定表明，DNA-A能侵染番茄、本氏烟(Nicotiana benthamiana)和普通烟(N.tabacum)，并表现出与田间相近的症状，侵染后的植株能被粉虱传播。而与TYLCV、TLCV不同的是，用胜红蓟黄脉病毒(AYVV)的DNA-A的侵染性克隆虽能系统侵染胜红蓟，却小形成典型的黄脉症状。进一步研究发现，AYVV DNA-A需要一种新型的DNA分子共同侵染才能引起典型的症状。本发明在中国番茄黄化曲叶病毒上发现了这类新型的DNA卫星分子。

植物病毒侵染性载体是研究病毒基因组功能的重要的平台，病毒侵染性载体的构建，可以人为地对病毒基因组在分子水平上进行操作，获得野生型分子或者突变型分子的均一群体，进而利用DNA重组技术进行突变、缺失、插入、置换以及互补实验对病毒基因组进行功能区域的定位，从而能在寄主植物表型水平上反映和评价基因功能的表达。该技术是深入研究病毒的基因功能以及病毒与寄主植物互作的有效手段，该技术首先在噬菌体病毒Qβ和脊髓灰质炎病毒中获得成功，植物DNA病毒的侵染性克隆是1982年在番茄金色花叶病毒(TGMV)上通过磨擦接种的方法构建成功，植物RNA病毒是1983年在雀麦花叶病毒(BTV)上首次获得侵染性cDNA克隆。虽然该技术产生较迟，但是发展却是极为迅速，现已广泛应用于病毒的遗传表达和复制分析。本发明在获得新型卫星分子的基础上，构建了该卫星分子的侵染性载体，以应用于病毒的功能基因组研究。

病毒诱导的基因沉默的载体是一种通过正向遗传学研究植物基因组功能的非常有效的途径，它是把植物内源基因插入病毒载体，随着病毒的复制形成dsRNA的中间体，这些dsRNA被一个称为Dicer的酶降解成21-23nt的RNA并与RNAase结合形成复合体，这个复合体在21-23nt的RNA指导下特异性地攻击它的同源序列，从而使植物中的同源基因功能失常，因此可以在植物的表型以及生化特征上研究植物基因组的功能。在当前植物基因组大量测定的情况下，越来越多的序列不清楚其功能，分子生物学下一个工作重心是功能基因组研究，这需要开辟多种途径来研究植物基因组的功能，而病毒诱导的基因沉默是从基因组到功能的一种非常有效的方法。

将外源基因放入植物细胞内可以生产外源蛋白，因而植物是一种具有广泛应用前景的生物反应器。植物具有合成、折叠、翻译后修饰及装配蛋白的机制，外源蛋白在植物体内可以大量繁殖，因此可以利用植物进行大量、廉价地生产重要药用蛋白(特别是疫苗)。生长利用植物生产药物主要有两种方法：(1)外源基因暂时存在于植物细胞中(如利用植物病毒载体)，植物可表达由外源基因编码的蛋白质；(2)外源基因长期存在于植物细胞中，即导入的外源基因将成为植物基因组的一部分，然后持续不断地产生由外源基因编码的蛋白质。但是转基因植物中外源基因的表达量都比较低，一般在可溶性蛋白的1％以下，而且基因转化和植株再生过程费力费时，这在很大程度上影响了利用转基因植物生产药用蛋白的全面产业化进程。植物病毒一般都具有很强的繁殖能力，基于植物病毒的这一特性，从80年代起，世界各地的研究人员就开始探索利用植物病毒载体高效表达外源基因的可行性，并成功地表达了多种蛋白。本发明在构建好的植物DNA病毒侵染性克隆的基础上，建立了一种利用植物DNA病毒表达外源蛋白的表达载体。

                          发明内容

本发明的另一个目的是提供一种新型植物DNA病毒载体，该载体包括植物DNA病毒侵染性载体及由它衍生的植物基因沉默载体和病毒表达载体；

本发明的一个目的是提供一种新型的构建植物DNA病毒载体的卫星DNA分子；

本发明的另一个目的是提供一种利用植物DNA病毒载体研究病毒功能基因组、植物功能基因组和表达外源蛋白的用途。

本发明的一个方面，提供了一种新型的卫星DNA分子，具体的说是一种粉虱传双生病毒中国番茄黄化曲叶病毒DNAβ分子，所述的DNAβ全长核苷酸序列与Seq ID No1-12至少有72％的同源性。DNAβ大小是DNA-A的一半，和DNA-A之间没有序列同源性。不同的DNAβ比较，具有一段非常保守的区域，大约115bp，含有高度保守的复制起始序列TAATATT/AC，DNAβ除了一段共同区以外，和已知的序列同源性非常低。在已知的DNAβ之间还具有一个在位置上非常保守的开放阅读框，在基因组中具有一段A富含区。

本发明的另一个方面，提供了一个侵染性载体，更具体地说构建了中国番茄黄化曲叶病毒DNA-A和新型卫星分子DNAβ的侵染性载体，其特征是该系统是一套互补的载体，DNA-A能够系统侵染植株，但是并不引发典型的症状。单独的DNAβ不能独立复制，它必须依赖与DNA-A，而DNAβ反过来也会作用与DNA-A，只有DNA-A和DNAβ一起存在时，植株才能引发典型的严重的致病型，并且DNAβ能够大大促进DNA-A的基因组含量。本发明的侵染性载体可用于病毒功能基因组和病毒与植物互作研究，其方法为：

a.针对病毒的目的基因设计突变引物，通过Overlap-PCR对病毒的目的基因进行突变，

b.构建两个正向copy的突变的重复，

c.把构建的两个正向copy的突变的重复插入农杆菌载体上，

d.把c中构建的农杆菌载体导入农杆菌载体，

e.通过农杆菌注射法把病毒接种到植物体内，

f.观察症状及病毒分子水平的检测。

本发明还提供了一个由侵染性载体衍生的植物基因沉默的载体，该载体诱导植物基因发生沉默从而研究植物基因的功能。本发明提供的植物基因沉默的载体可用于研究植物基因组的功能，其方法为：

a.对植物进行RNA抽提，用植物内源基因的引物进行cDNA第一链的合成，继而进行RT-PCR扩增，获得目的植物基因的cDNA片段，

b.对DNAβ的C1基因进行缺失，并设计引物加入多克隆位点，

c.把植物目的基因的cDNA片段插入DNAβ的多克隆位点，

d.构建两个copy的带有植物内源基因的DNAβ，

e.把d中构建的两个copy的β插入农杆菌载体，

f.把e中构建的农杆菌载体导入农杆菌，

e.把f中的农杆菌与含有DNA-A侵染性克隆的农杆菌一起接种寄主植物，

g.观察植物表型或检测植物生理生化变化。

本发明还提供一个由侵染性载体衍生的外源基因表达载体，该表达载体可用于表达外源基因，其表达构建方法包括：

a.设计特异性引物拉出准确缺失C1的β基因组，并构建至pGEM-T easyVector，

b.用另外一对含有特异性引物拉出的缺失C1的β后插入a中构建的载体，拼接以后得到两个正向重复的并缺失C1基因的DNAβ，并在C1的位置上引入了多克隆位点，

c.通过酶切把b中构建的正向重复的DNAβ引入植物表达载体，

d.在植物表达载体上就可以直接插入外源基因进行表达。

在本发明中，术语“植物DNA病毒载体”，包括中国番茄黄化曲叶病毒DNA-A和DNAβ的侵染性载体及由它衍生的植物基因沉默载体和病毒表达载体。

本发明的优点：

1.本发明构建的侵染性载体是一种极有价值的分子工具，能够方便地获得自然分子或者突变分子的均一群体，利用这种分子工具，可以进行病毒的分子生物学研究，能够通过对病毒基因的突变、缺失、插入、重组等技术来研究病毒基因组结构、功能和表达调控机制，它是研究病毒功能基因组和病毒与植物间互作的一个至关重要的平台。本发明中DNAβ上有一个未知功能的开放阅读框(open reading frame，ORF)，本发明对这个基因进行了突变并明确了该基因的功能。对于该侵染性载体功能基因组研究，还可以包括其它编码区和非编码区的功能研究。

2.本发明的植物基因沉默载体是一种用正向遗传学研究植物功能基因组非常优良的工具。传统的反向遗传学的方法筛选突变体包括用T-DNA和转座子插入的方法，这是一种发现新基因非常有效的方法，但是这些方法也存在一些缺点，传统的正向遗传学不能研究早期发育过程中突变就发生致死型的基因，另外也不能研究基因家族中的基因，而病毒诱导的基因沉默是在成株以后进行沉默的，所以可以对一些致死型的基因进行研究，另外对多基因家族，基因沉默不仅仅攻击准确的同源基因，并且也攻击有10-20％浮动的同源基因，因此也可以对基因家族中的基因进行研究。相对于通过转基因转座子插入这种正向遗传学的方法来研究来说，本发明的工作量小，构建简易，周期性短，可以进行大规模沉默来研究植物基因组的功能。在有些病毒载体中，病毒本身在寄主上造成严重的致病性，从而在表型上干扰沉默以后的症状，本发明中的植物基因沉默载体对致病性起关键作用的基因进行了缺失，但仍能够进行复制转录，而DNA-A侵染植物没有任何症状，植物内源基因片段插入DNAβ后诱导的表型完全是植物基因被沉默以后的表型，病毒侵染对植物的影响在最大限度上得以缩小。

3.构建了具有自主知识产权的植物DNA病毒表达载体，可以把外源蛋白基因插入病毒载体，病毒感染植物后，外源基因就可以随着病毒的繁殖扩增而得到表达。利用转基因的方法表达的外源基因的量都比较低，一般在可溶性蛋白的1％以下，而且基因转化和植株再生过程费力费时，这在很大程度上影响了利用转基因植物生产药用蛋白的全面产业化进程。病毒的表达系统复制量大，构建简易，工作量小，周期性短，本发明的植物病毒载体一般在15-30dpi就可以在植物体内大量扩增繁殖。

                        具体实施方式实例1 新型DNA分子的克隆和测序

收集中国番茄黄化曲叶病毒样品，抽提植物总DNA，以此为模板，以beta01(5’- GGTACCACTACGCTACGCAGCAGCC-3’，含KpnI位点)与heta02(5’- GGTACCTACCCTCCCAGGGGTACAC-3’，含KpnI位点)为引物，对DNAβ全长基因组进行PCR扩增，PCR产物经QIAquick Gel Extraction Kit纯化后克隆至pGEM-T Easy Vector，获得一个全长copy的克隆pGEM-T-β(New)并进行序列测定，获得DNA-β的全长基因组序列1.3kp，序列如No.1-12。中国番茄黄化曲叶病毒DNAβ之间的同源性在72％-99％，与已报道的其他DNAβ(AYVVβ，CLCuMVβ，CLCuRVβ and BYVMVβ)的同源性只有35-43％。DNAβ大小是DNA-A的一半，与所有的双生病毒DNA-A之间除了高度保守的复制起始序列TAATATT/AC之外没有序列同源性。虽然DNAβ之间同源性非常低，但所有的DNAβ都有一段高度保守的将近115个碱基的序列，该区域可能包含了复制酶结合位点，但没有TATA box区，因此可能区别于DNA-A和DNA-B的双向转录启动子的另外一种独特的启动区域。所有的DNAβ在±760-±1000碱基处都有一段A富含区(＞56％)。DNAβ具有多个开放阅读框，但是不同DNAβ之间的ORF在大小和位置上都有很大的变化，只有其中的一个ORF(C1)具有长度、大小以及位置的保守性。实施例2 侵染性载体的构建以及病毒功能基因组研究方法的建立

1.侵染性载体的构建

对克隆的中国番茄黄化曲叶病毒全长DNA-A构建1.7个copy的基因组插入植物表达载体pBinPLUS，然后通过三亲交配的方法导入农杆菌EHA105，同样方法将DNAβ构建2个copy的基因组插入植物表达载体pBinPLUS，并导入EHA105。重组后的农杆菌接种本氏烟(N.benthamiana)，接种时分单DNA-A接种，单DNAβ接种和DNA-A+DNAβ接种。单DNA-A接种能够系统侵染，但是并不引发在田间观察到典型的曲叶症状；单DNAβ接种的植株没有出现症状，上部叶片也没有检测到病毒DNAβ，说明DNAβ并不能独立复制。当DNA-A与DNAβ两个组分一起接种的时候，10dpi后，上部叶片开始出现下卷，25-35dpi症状发展到顶峰，并出现曲茎，叶片皱缩，植株矮化，到后期出现耳突；用SouthernBlot检测表明有DNAβ的存在，DNA-A基因组的量显著比单DNA-A接种的DNA量高，因此DNA-A和DNAβ是相互依赖的，DNAβ必须依赖DNA-A复制，而DNAβ则能大大加强DNA-A的基因组DNA含量，并且DNAβ对于病毒对寄主的致病性是必需的。

2.病毒功能基因组研究方法的建立

a.针对病毒的目的基因设计引物，通过Overlap-PCR及酶切的方法对病毒的目的基因进行重组、突变、插入或者缺失，把突变的基因组插入pGEM-T Vector，

b.在pGEM-T Vector再插入另外一个全长的突变的病毒基因组，

c.把构建的两个正向重复的突变基因组插入植物表达载体pBINplus上，

d.把c中构建的重组载体导入农杆菌EHA105，

e.通过农杆菌注射法把突变型的侵染性克隆接种到植物体内，

f.观察症状及病毒分子水平的检测。

DNA-A必须要在DNAβ存在的时候才能致病，而DNAβ只有一个长度和位置上都保守的基因C1，因此对C1基因进行突变将能够明确C1的功能。本发明在引物上引入突变碱基的方法对Y10 DNAβ的C1基因进行了突变，使这个基因不能得以转录。当这个突变体与DNA-A一起接种本氏烟后，不表现典型的曲叶症状，进一步对植物叶片的DNA进行Southern Blot检测发现，在没有症状的植株中检测到了DNAβ，说明C1基因突变以后不再引发致病性，但是却仍然能够复制，表明该基因在致病中确实发挥了重要的作用。实施例3 病毒诱导的基因沉默载体的构建以及方法的建立

DNAβ中的C1基因突变以后DNAβ依然能够复制，因此如果用外源片段替换C1基因也能够复制，并且外源基因可以利用C1基因的启动子和终止子来得以转录，而病毒诱导的基因沉默只要具有少量的dsRNA就可以诱发植物内源基因的沉默。本发明把植物的八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase，PDS)基因cDNA插入DNAβ上，这个基因是植物类胡萝卜素合成途径中的关键酶，如果这个酶的基因被诱导沉默而导致合成途径受阻，则使植物叶片产生白色效应。其方法包括：

a.对植物进行RNA抽提，用植物PDS基因的引物进行cDNA第一链的合成，继而进行RT-PCR扩增，获得PDS基因的409bp cDNA片段；

b.对DNAβ的C1基因进行缺失，并换至以多克隆位点设计引物加入多克隆位点 GGATCCAAGCTTGATATCCTGCAGCTCGAG TCTAGA，酶切位点依次为BamHI，HindIII，EcoRV PstI，XhoI， XbaI，用New Bet01与Beta02拉出其全长插入到pGEM-T Easy Vector上；

c.把PDS基因的cDNA片段插入DNAβ的多克隆位点；

d.在pGEM-T Easy Vector构建两个正向重复带有PDS cDNA的DNAβ；

e.利用pGEM-T Easy Vector两边的EcoRI把两个正向重复的带有PDS的DNAβ插入植物表达载体pBinPLUS上；

f.把构建好的载体通过三亲交配的方法导入农杆菌EHA105；

e.重组农杆菌与含有DNA-A的农杆菌一起接种寄主植物；

f.观察植物表型。

接种后25-30天，接种植株上部叶片沿着叶脉开始翻白，逐渐扩展，以至上部叶片沿叶脉全部发生白化现象，植株发生沉默以后，可以持久很长一段时间。接种的病毒由于缺失了C1基因而在植株上并不表现任何症状，寄主植物上表现出来的表型就是植物被诱导沉默以后的表型。实施例4 植物表达载体的构建及体系的建立

用外源蛋白代替DNAβ的C1基因，在病毒的复制过程中，借助C1基因的启动子终止子来启动外源基因的转录和表达。基于双生病毒的载体需要两个正向重复的基因组序列，因此引进多克隆位点后仍需进行两次的外源片段的插入，因此在上面的载体构建方法的基础上进一步进行了改造，更加利于外源蛋白的表达。

a.Y10-beta Substition Sal/F(5’- GTCGACATACATATATATACGTATTC-3’，含SalI位点)和Y10-beta Substition Xba/R( TCTAGAGTTTATTTGTTGTGGATGATACATG，含XbaI位点)准确缺失C1的DNAβ基因组，PCR产物插入pGEM-T Easy Vector，

b.用另外一对含有特异性引物Y10-beta Substition  XbaSmaBam/F(5’ TCTAGACCCGGGGGATCCATACATATATATACGTATTCAAATATATG，含XbaI，SmaI，BamHI)和Y10-beta Substition Xba/R拉出的缺失C1的DNAβ，并通过XbaI位点与a中构建的载体进行拼接，拼接以后刚好得到两个正向重复β，缺失一个C1基因，并在C1的位置上引入了多克隆位点XbaI，SmaI，BamHI.SmaI这个酶切位点可以用于PCR产物的克隆，

c.利用SalI和EcoRI位点把b中构建的正向重复序列插入植物表达载体pBINplus上，

d.在植物表达载体上就可以直接插入外源基因进行表达。

SEQ ID NO.1-12的说明：SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征

(A)长度：1338碱基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：环形(ii)分子型：基因组DNA(iii)序列描述：SEQ ID NO.1accggtggcg agcggggtct ttgccgttga ggtgggtccc acatgaaaaa agaaagagaa      60aatgggcctt ggtgatgcaa ttgggccttt aatttatggg ctttgagtat tggactttgt     120atattgggcc tacttaaaat aattcaaatg ggcaggaata acaggaattt tatttaattc     180atatatttga atacgtataa atacgtattc atacatctga attcataaat acatcatatt     240catctcctac atctatatct tcaactggtg cttcttccat catgattata tctataactt     300gtaccatatc ttcttgcctg aactctccaa ttgtagcttc tttgtacatt attttgaggc     360agtttttgat gccttcttct aggctgttga agtcgaatgg tgggattatc ccatggtgtc     420tgtatgggat catgaatttc ttcttggcta atgctggtga ctttgttgat gctagttcaa     480tctgtacaag gattgaagtg tcttcttgca acttcacatc tatgatgaac tccataccct     540tcatgttgtt gtatttgatt gtcatgttta cttgttgtgg atcattcatg agactggtct     600tcttaaataa tgctaggatt gatgagttat ggactggaat gatttaacgt ggttcattgt     660tgttcatatg cttagtagtg gagatatgta tgattgatag tgacaatact attaatcata     720agtactttta gtaatgacat aataatccaa attattatgg ttaattataa ttgaaatagg     780aatagaaaag gaaataaaaa gaaaaggaaa ataaaaagaa aaggaaataa gataataaac     840ataaacccaa acaaatattt attaagaaag aaaagggagc gcagcgaaaa aaaaaatcaa     900atttgaaaca accaaaatca aataaacaca aaaagagaaa acaaaagaat aaaataataa     960aattaaagca aaataaaata aaaacagtaa aaacgtcgtc acgattttac tgcgcggtaa    1020taaaaaaata ctttcactta ggaggttata aatcgggaca ccaatggtaa atgggacacc    1080gatacatcag tgccccctat tagtgtctaa tgtgcaattt ccaaaaatac ccttatccct    1140gtgtctgtta ggcgcgtggg agtgcgctga aaaagttaat tttctctctc ctaaactcgt    1200cggagaagac gattgaggca cttcccggca tcaatttgcg acacgcgcgg cggtgtgtac    1260ccctgggagg gtagaaacca ctacgctacg cagcagcctt agctacgccg gagcttagct    1320cgccaccgtt ctaatatt                                                  1338SEQ ID NO.2的信息(iv)序列特征

(A)长度：1340碱基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：环形(v)分子型：基因组DNA序列描述：SEQ ID NO.2accggtggcg agcggggtct ttgccgttga ggtgggtccc acattaaaaa agaaagagaa      60aatgggcctt ggtgatgcaa ttgggccttt aatttatggg ctttgagtat tggactttgt     120atattgggcc tacttaaaat aattcaaatg ggcaggaata acaggaattt tatttaattc     180atatatttga atacgtataa atacgtattc atacatctga attcataaat acatcatatt     240catctcctac atctatatct tcaactggtg cttcttccat catgattata tctataactt     300gtaccatatc ttcttgcctg aattctccaa ttgtagcttc tttgtacatt attttgaggc     360agtttttgat gccttcttct aggctgttga agtcgaatgg tgggattatc ccatggtgtc     420tgtatgggat catgaatttc ttcttggcta atgctggtga ctttgttgat gctagttcaa     480tctggacaag gattgaagtg tcttcttgca acttcacatc tatgatgaac tccataccct     540tcatgttgtt gtatttgatt gtcatgttta cttgttgtgg atcattcatg agactggtct     600tcttaaataa tgctaggatt gatgagttat ggactggaat gatttacgtg gttcattgtt     660gttcatatgc ttagtagtgg agatatgtat gattgatagt gacaatacta ttaatcataa     720gtacttttag taatgacata ataatccaaa ttattatggt taattataat tgaaatagga     780atagaaaagg aaataaaaag aaaaggaaaa taaaaagaaa aggaaataag ataataaaca     840taaacccaaa caaatattta ttaagaaaga aaagggagcg cagcgaaaaa aaaaaactca     900aatttgaaac aagcaaaatc aaataaacac aaaaagagaa aacaaaaaaa taaaataata     960aaattaaagc aaaataaaat aaaaacagta aaaacgtcgt cacgatttta ctgcgcggta    1020ataaaaaaat actttcactt aggaggttat aaatcgggac accaatggta aatgggacac    1080cgatacatca gtgcccccta ttagtgtcta atgtgcaatt tccaaaaaat acccttatcc    1140ctgtgtctgt taggcgcgtg ggagtgcgct gaaaaagtta attttctctc tcctaaactc    1200gtcggagaag acgattgagg cacttcccgg catcaatttg cgacacgcgc ggcggtgtgt    1260acccctggga gggtaggtac cactacgcta cgcagcagcc ttagctacgc cggagcttag    1320ctcgccaccg ttctaatatt                                                1340SEQ ID NO.3的信息(vi)序列特征

(A)长度：1341碱基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：环形(vii)分子型：基因组DNA序列描述：SEQ ID NO.3accggtggcg agcggggtct ttgccgttga ggtgggtccc acatgaaaaa agaaagagaa      60aatgggcctt ggtgatgcaa ttgggccttt aatttatggg ctttgagtat tggactttgt     120atattgggcc tacttaaaat aattcaaatg ggcaggaata acaggaattt tatttaattc     180atatatttga atacgtataa atacgtattc atacatctga attcataaat acatcatatt     240catctcctac atctatatct tcaactggtg cttcttcctt catgattata tctataactt     300gtaccatatc ttcttgcctg aattctccaa ttgtagcttc tttgtacatt attttgaggc     360agtttttgat gccttcttct aggctgttga agtcgaatgg tgggattatc ccatggtgtc     420tgtatgggat catgaatttc ttcttggcta atgctggtga ctttgttgat gctagttcaa     480tctgtacaag attggaagtg tcttcttgca acttcacatc tatgttgaac tccataccct     540tcatgttgtt gtatttgatt gtcatgttta cttgttgtgg atcattcatg agactggtct     600tcttaaataa tgctaggatt gatgagttat ggactggaat gatttacgtg gttcattgtt     660gttcatatgc ttagtagtgg agatatgtat gattgatagt gacaatacta ttaatcataa     720gtacttttag taatgacata ataatccaaa ttattatggt taattataat tgaaatagga     780atagaaaagg aaataaaaag aaaatgaaaa taaaaaagaa aaggaaataa gataataaac     840ataaacccaa acaaatattt attaagaaag aaaagggagc gcagcgaaaa aaaaaactca     900aatttgaaac aagcaaaatc aaataaacac aaaaagagaa aacaaaaaaa taaaataata     960aaattaaagc aaaataaaat aaaaacagta aaaacgtcgt cacgatttta ctgcgcggta    1020ataaaaaaat actttcactt aggaggttat aaatcgggac accaatggta aatgggacac    1080cgatacatca ggtgccccct attagtgtct aatgtgcaat ttccaaaaat acccttatcc    1140ctgtgtctgt taggcgcgtg ggagtgcgct gaaaaaggtt aattttctct ctcctaaact    1200cgtcggagaa gacgattgag gcacttcccg gcatcaattt gcgacacgcg cggcggtgtg    1260tacccctggg agggtagaaa ccactacgct acgcagcagc cttagctacg ccggagctta    1320gctcgccacc gttctaatat t                                              1341SEQ ID NO.4的信息(viii)序列特征

(A)长度：1338碱基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：环形(ix)分子型：基因组DNA序列描述：SEQ ID NO.4accggtggcg agcggggtct ttgccgttga ggtgggtccc acatgaaaaa agaaagagat      60aatgggcctt ggtgatgcaa ttgggccttt aatttatggg ctttaagtat tggactttgt     120atattgggcc tacttaaaat aattcaaatg ggcaggaata acaggaattt tatttaattc     180atatatttga atacgtataa atacgtattc atacatctga attcataaat acatcatatt     240catctcctac atctatatct tcaactggtg cttcttccat catgattata tctataactt     300gtaccatatc ttcttgcctg aattctccaa ttgtagcttc tttgtacatt attttgaggc     360agtttttgat gccttcttct aggctgttga agtcgaatgg tgggattatc ccatggtgtc     420tgtatgggat catgaatttc ttcttggcta atgctggtga ctttgttgat gctagttcaa     480tctgtacaag gattgaagtg tcttcttgca acttcacatc tatgatgaac tccataccct     540tcatgttgtt gtatttgatt gtcatgttta cttgttgtgg atcattcatg agactggtct     600tcttaaataa tgctaggatt gatgagttat ggactggaat gatttacgtg gttcattgtt     660gttcatatgc ttagtagtgg agatatgtat gattgatagt gacaatacta ttaatcataa     720gtacttttag taatgacata ataatccaaa ttattatggt taattataat tgaaatagta     780atagaaaagg aaataaaaag aaaaggaaaa taaaaagaaa aggaaataag ataataaaca     840taaacccaaa caaatattta ttaagaaaga aaagggagcg cagcgaaaaa aaaaactcaa     900atttgaaaca agcaaaatca aataaaagta aaaagagaaa acaaaaaaat aaaataataa     960aattaaagca aaataaaata aaaacagtaa aaacgtcgtt acgattttac tgcgcggtaa    1020taaaaaaata ctttcactta ggaggttata aatcgggaca ccaatggtaa ttgggacacc    1080gatacatcag tgccccctat tagtgtctaa tgtgcaattt ccaaaaatac ccttatccct    1140gtgtctgtta ggcgcgtggg agtgcgctga aaaagttaat tttctctctc ctaaactcgt    1200cggagaagac gattgaggca cttcccggca tcaatttgcg acacgcgcgg cggtgtgtac    1260ccctgggagg gtagaaacca ctacgctacg cagcagcctt agctacgccg gagcttagct    1320cgccaccgtt ctaatatt                                                  1338SEQ ID NO.5的信息(x)序列特征

(A)长度：1336碱基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：环形(xi)分子型：基因组DNA序列描述：SEQ ID NO.5accggtggcg agcggggtct ttgccgttga ggtgggtccc acataaagaa aagtaaggaa      60aatgggcttt ggtaatgcaa ttgggccgtt aagttatggg cctatattta atggactttg     120tatattgggc ctatttaaaa taaataaatt aggtcagaat aataagaatt ttatttaatt     180catatatttg aatacgtata tatatgtatt catacatctg aatttgtaaa tacatcatac     240tcatccccta catctatatc ttctactggg gcttcttcca tcatgattat gtctataact     300tgtaccatat cttcttgcct aaattcccca attgtagact ccttatacat tattttgagg     360cagtttttga tgccttcttc taaaatgttg aagtcgaatg gtgggataat cccatggtgt     420ctgtatggga tcatgaattt cttcttggct aatgctggtg actttgttga tgctagttca     480atccttacaa ggattgaagt gtcttcctgt aacttgacat caatgatgaa ctccaaaccc     540ttcatgttgt tgtatttgat agtcatgttt atttgttgtg gatgatacat gagtctgttc     600tgcttaaata atgctaggaa ttgtgatata tggactgtaa tgatttacgt gtttcattgt     660tgttcatatg cctactagtg gagatatgta tgtttgatag tgacatgaat attaaccatg     720attactttta ctaatgacat aataatctgg attattatgt gtaaaaagaa atggaaagag     780gagtagaaag aagaagtaaa tatagaataa aataaaaaag aaaaggaaat aagataataa     840acataaaccc aaacaaatat atattaagaa agaaaaggga gcgcagcgga aaaaaaaaaa     900ggtaaatttg aaacaaataa aatcaacaag atagtaaaat aaaaaaataa aaagaataaa     960atcaaaacaa ataaactaaa atagtaaaat cgtcatgatg attttactgc gcggtaataa    1020aaaaactact ttcatctcag aggtaaataa ttgggacacc aatggtaatt gggacaccga    1080tacatcggtt cccctattag tgccccaatg tgcaatttcc aaaaataccc ttatccctgt    1140gtctgagggg cgcgtggtat tgcgctgaaa aagttaagtt tctctctcca aaaactcacc    1200ggaactccga ttgagggcct tccggtcatc aatttgcgac acgcgcggca gtgtgtaccc    1260ctgggagggt agaaaccact acgctacgca gcagccttag ctacgccgga gcttagctcg    1320ccaccgttct aatatt                                                    1336SEQ ID NO.6的信息(xii)序列特征

(A)长度：1350碱基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：环形(xiii)分子型：基因组DNA序列描述：SEQ ID NO.6accggtggcg agcggggttt tttgcccaaa tgtgggtccc acattggaga tgaaagagaa      60agatgggttt ggttatgcaa ttgggccttt aatggtgggc cgaattttat ggacctcgta     120ttttgggcct aatgagtata aataaattgg gctgtaatag aaaggaattt tatttaattt     180atatatttga atacgtataa ctacgtattc atacacttga attcaaaaat acatcgtatt     240catctcctac atctatatct tcaactggtg cctcttccat catgagaatg tctacgactt     300gtatcatgtc ttcttgcctg aattcccata tggtagactc tttgtacatt attttgaggc     360agtgtctgat gccttcctct aagctattga agtcaagtgg tggtattatc ccattgtgcc     420tgtatgggat catgaatttc ttcttggcta gtgctggtga ccttgttgat gcgagttcaa     480tctgtactag gattgaagtg tcttcctgca acttcacatc tatgatgaat tctaaaccct     540tgttgttgtt gtatttgata gtcattttaa ctggtgtgga ttatacgtga gtctggtcct     600gttaaataat gtttgggatt gttatatatg gacttaaacg atttacgtgg ttcattgttg     660ttcatgtaac tactagtgga gatatttatg attgatagtg acataactat caatcatgat     720tactttaaca aattacatga taatctagat tatcataggc aaatagaatt ggaaagaaga     780aaagaagaat agaaaagaag aagaaagaaa taaaaaataa aaaatgaaaa taaagaagat     840aataaggata aacagaaaca aatatatatt aagaaagaaa gggagcgcag cgattaaaaa     900aaaattgaaa aaatgaaaac aacaaaagaa taaaataaca aaacaaaaaa aactaaaaag     960aaacaagaaa aaaatataaa tcaaataaaa taaaacagta aaaacgtaga aacggtttta    1020ctgcgcggta ataaaaaaag actttgacct aggaggttaa aaattgggac accaatggta    1080aatgagaccc cgatacatcg gtgcctctat tgggtccttg aaagttaaat tcccaaaata    1140cccttatccc tgtgtctgag aagcgcgtgg tattgcgctg aaaaagttaa gtttctctct    1200ccaaaaactt gccggaacgc cgattgaggg tcttccggtc atcaatttgc gacacgcgcg    1260gcggtgtgta cccctgggag ggtaggaaac cactacgcta cgcagcagcc ttagctacgc    1320cggagcttag ctcgccaccg ttctaatatt                                     1350SEQ ID NO.7的信息(xiv)序列特征

(A)长度：1333碱基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：环形(xv)分子型：基因组DNA序列描述：SEQ ID NO.7accggtggcg agcggggtct ttgccgtaga cagtgggtcc cacatagaag aatacaagaa      60attgggcctt gggtatgcaa tttgggccta gaattatggg cttcatttaa cggcctttga     120atattgggcc taattaaaat aattaagttg gctttaataa aatgaagttt attcaataca     180tatagttgaa tacgtatagc tacgtattca tacatctgaa tttataaata catcatattc     240atcacctaca tctatatcct caactggtgc ttcttccatc atgagaatat ctattacttg     300taccatgtct tcttgcctga attcccaaat tgtagattct ttgtacatta ttttgagaca     360gtgtttgatg ccttcttcta agctgttaaa gtcgagtggt ggtattatcc cattgtgcct     420gtatgggatc atgaatttct tcttggctaa tgctggtgat cttgttgatg ctagttcgat     480ctgtacaagg attgaagtgt cttcctgcaa tttcacatct atgatgaatt ccaaaccctt     540gttgttgttg tatgtgatag tcattttatt tggtgtggat tatacatgac tctggtcctg     600ttaaataatg ctgggaattg ttatacatgg acctgaatga tttacgtgga tcattattgt     660tcatgtaact tctagtggag atatttatga ttgatagtga cataactagc aagcatgagt     720attttaatta attacataat aatctagatt atcataggta aatagaagtg gaaagaataa     780tagaagagga aattaaacat attaagaaaa gaaaaaatga aaagaaaaaa gacaataaac     840ataaacacaa acaaatatat attaagaaaa aaagggagcg cagcgaaaaa aaaaaaaatt     900gatacaatca aaagcaacta agaaagaaaa aacaaaatag aaaaagaata aaaaaaagaa     960taaaacaaat aaaataaaac agtaaaaacg ttgaaacggt tttactgcgc ggtaataaaa    1020aaatactttc atctggcaag ttaaaaattg ggacaccaat ggtaaatgag accccgatac    1080atcggtgcct ctattaggtc cttgaaagtc aatttccaaa aataccctta tccctgtgtc    1140taagaagcgc gtgttattgc gctgaaaaag ttaagtttct ctctccaaaa actcgccgga    1200acggcgattg agggtcttcc ggttatcaat ttgcgacacg cgcggcggtg tgtacccctg    1260ggagggtaga aaccactacg ctacgcagca gccttagcta cgccggagct tagctcgcca    1320ccgttctaat att                                                       1333SEQ ID NO.8的信息(xvi)序列特征

(A)长度：1340碱基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：环形(xvii)分子型：基因组DNA序列描述：SEQ ID NO.8accggtggcg tgcggggttt tttgccattt tgtgggtccc acatagaaga agaaagagaa      60agtgggcctt ggctatgcaa ttgggccttt aatttatggg cctggagtta ttggactttg     120tatattgggt ttaatcagaa taaataaatt gggttaaaat aatatgaaat ttatttaatg     180tatatgattg aatacgtatg catacgtatt catacacttg agtttataaa tacatcgtat     240tcatccccta catctatatc ctcaactggt ggttcttcca tcatgaggat gtctataact     300tgtaccatat cttcttgcct gaattcccca attgtagact ctttgtacat gattttgagg     360cagtgtttga tgccttcttc taagctgttg aagtctattg gtgggatgat cccctggtgc     420ctgtatggta tcatgaactt cttcttggct aatgctggtg actttgttga tgttagttca     480atctgaacaa ggaatgaagt gtcgtcctgc aacttcacat ctatgatgaa ctccatgccc     540ttcatgttat tgtatgtgat tgtcatgttt tatgctgtgg attatacatg agtcgtgcct     600tcttaaataa tgtctggaat tgtgatatat ggatttgaat caattacgtg gttcattgtt     660gttcatatat atattagtgg agataggtat gtttgatagt gacattacta tgtaacctga     720ttacttttag taatgacata ataatctaga ttattatggc taatagaggt gtaaagagta     780ttatgaaaga aaaatcaaag aataataaaa taaaaaagaa aaaaaataca ataaacataa     840acccaaacaa atatatatta agaaaaaaag ggagcgcagc ggaaaaaaaa aaaaggaaag     900aataattaaa tgtgaaacaa gcaaatgcaa caaaaaagaa agagaaaaga aatagataaa     960aaaatataaa acaaataaaa caacacggta aaatcgttcc aacggtttta ccgcgcggta    1020ataaaaaaat actttaacct cataggtaat taattgggac accaaaggta aatgggacac    1080cgatacactg gttcccctat taggtgctca atattcaatt tccaaaaata cccttatccc    1140tgtgtctgag gggcgcgtgg aaatgcgctg aaaaagttaa gtttctctct ccaaaaactc    1200accggacctc cgattgaggg ccttccggtc atcaatttgc gacacgcgcg gcggtgtgta    1260cccctgggag ggtaggaaac cactacgcta cgcagcagcc ttagctacgc cggagcttag    1320ctcgccaccg ttctaatatt                                                1340SEQ ID NO.9的信息(xviii)序列特征

(A)长度：1334碱基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：环形(xix)分子型：基因组DNA序列描述：SEQ ID NO.9accggtggcg agcggggatt ttccgaactt tgtgggcccc acatactgga agaaagagaa      60agtggactct ggttatgcaa ttgggccttt aatgaatggg ctttatctta atgtaaatgt     120ctattgggct tgagtaaaaa agaatagttg ggctcaaata aaatacaatt ttatttaatt     180atatatctga atacatactt tatacgtatt catacatctg aattcataaa tacatcgtat     240tcatcaccta catctatatc ttcaactggt gcctcttcca tcattagtat gtctataact     300tgtaccatat cttcttgcct gaattcccag atatttgagt gcttgtacat tattttgagg     360cagtgtttta tgccttcttc taggctgttg aagtcgattg gtgggatgag gccttggtgc     420ctgtaaggga tcatgaattt cttcttggct aatgctggtg accgtgttga gcttagttct     480acctgaacga ggaaggaagt gtctgcttcc aatttgacat ctattttgaa ttccagaccc     540ctcttgttgt tgtatttgat agtcattctt atttggtgtg gattgtacat gagtttgatc     600tgcttaaata atgcaagtaa ttttgataca tggacttgat tgatttacgt gtttcattgt     660tgttcatata ggttatagtg gaaatatttg tcattgatag tgacattact atcaatgtta     720agtactttta ctaatgacat tataatctag attataatga ataagtataa gtggaaagaa     780aaataggaaa taaaatttga agaaaataaa ataaaaaaag aaagaagaca attaacatga     840acacaaacaa acatatacta agaaaagaaa agggagcgca gcgaaaaaaa aaaacataga     900ttcaaaacca acagaatcaa ccaaacagaa aaaaagaaaa ataaaataaa caattaattc     960aaaaaaaaaa aaataatcag taaaaacata agcaggtttt tacggcgcgg taaaaaaata    1020aattacattc acctcgtagg taaataatta ggaccccaaa ggtaaatgag accccgatac    1080atcggggtct ctattaggtc ctcaataatt acattccaaa aataccctta tccctgtgtc    1140tgaaaggcgc gtggtattgc tctgaaaaag ttaagtttct ctctccaaaa accccccgga    1200gctccgattg agggccttcc ggtcgtcaat ttgcgacacg cgcggcggtg tgtacccctg    1260ggagggtagg aaaccactac gctacgcagc agccttagct acgccggagc ttagctcgcc    1320accgttataa tatt                                                      1334SEQ ID NO.10的信息(xx)序列特征

(A)长度：1344碱基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：环形(xxi)分子型：基因组DNA序列描述：SEQ ID NO.10accggtggcg agcggggatt ttccgaactt tgtgggcccc acatactgga agaaagagaa      60agtggactct ggttatgcta ttgggccttt aatgaatggg ctttatctta atgtaaattt     120atattgggct tgaataaaaa agaatagttg ggctcagata aaatacaatt ttatttaatt     180atatatctga atacgtataa gtacgtattc atacatctga attcataaat acatcgtatt     240catcacctac atctatatct tcaactggtg cctcttccat cattagtatg tctataactt     300gtaccatatc ttcttgcctg aattcccaaa tatttgagtg cttgtacatt attttgaggc     360agtgttttat gccttcttct aggctgttaa agtcgattgg tgggatgagc ccttggtgcc     420tgtaagggat catgaatttc ttcttggcta atgctggtga tcgtgttgag cttagttcga     480cctgaacaag gaaggaagtg tctgcttcca atttgacatc tattttaaat tccagacccc     540tcttgttgtt gtatttgata gtcattctta tttggtggtg gattgtacat gagtttgatc     600tgcttaaaaa atgcgagtaa tgttgataca tggactggat tgatttacgt gtttcattgt     660tgttcatata gggtatagtg gagatatttg tcattgatag tgacatgact atcaatgtta     720attactttta ctaatgacat tataatctag attataatga ataagtaaaa tttaaaagaa     780aaatagaaaa taaaataaaa aatgtgaaga aaataaaata aaaaaagaaa gaagacaata     840gacataaaca caaacaaaca tatactaaga aaagaaaagg gagcgcagcg gaaaaaaaaa     900acatagattc aaaagcaata gttgcaagaa aacagaaaaa aaagaaaaag acaaataaac     960aattaaaaca aaatgaataa aataaaacag taaaaacctg gccaggtttt taccgcgcgg    1020ttaaaaaaat aaattacatt cacctcaaag gtaaataatt aggaccccaa aggtaaatga    1080ggcaccgata tatcggtgcc tctatcaggt cctcaataat tacattccaa aaataccctt    1140atccctgtgt ctgaaaggcg cgtggtattg cgctgaaaaa gttaagtttc tctctccaaa    1200aaccccccgg agctccgatt gagggccttc cggtcatcaa tttgcgacac gcgcggcggt    1260gtgtacccct gggagggtag aaaccactac gctacgcagc agccttagct acgccggagc    1320ttagctcgcc accgttataa tatt                                           1344SEQ ID NO.11的信息(xxii)序列特征

(A)长度：1341碱基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：环形(xxiii)分子型：基因组DNA序列描述：SEQ ID NO.11accggtggcg agcggggttt ttccgaactt tgtgggaccc acatactgga agaaagagaa      60agtggactct ggttatgcaa ttgggccttt aataaatggg ctttatctta atggaaatgt     120gtattgggct tgaaaaaaaa aaaatagttg gactcaaata aaatacaatt ttatttaatt     180atatatctga atacgtataa gtacgtattc atacatctga attcataaat acatcatatt     240catcacctac atctatatct tcaactggtg cctcttccat cattagtatg tctataacct     300gtaccatatc ttcttgcctg aattcccaaa tatttgagtg tttgtacatt atcttgaggc     360attgttttat gccttcttct aggctgttga agtcgattgg tgggatgagc ccttggtgcc     420cgtaagggat catgaatttc ttcttggcta gtgctggtga ccgtgttgag cttagttcaa     480cctgaacaag gaaggaagta tctgcttcca atttgacatc tattttgaat tccagacccc     540tcttgttgtt gtatttgata gtcattctta tttggtgtgg attgtacatg agtttgatct     600gcttaaataa tgcaagtagt tttgatacat ggacttgatt gatttacgtg tttcattgtt     660gttcatatag gttatagtgg agatatttgt cattgatagt gacattacta tcaatgttaa     720gtacttttac taatgacata ataatctaga ttattatgaa taagtataag tgaaaggaaa     780aatagaaaaa aatataaaat ttgaagaaaa taaaataaaa aaagaaagaa gacaataaac     840ataaacacaa acaaacatat actaagaaaa gaaaagggag cgcagcgaaa aaaaaaaaca     900tatatccaaa accaatagaa gcaagaaaac agaataaaaa gaaaaagaaa aataaacaat     960taaaacaaat tgaataaaat aaaacagtaa aaacatgaca cggtttttac tgcgcggtaa    1020aaaaaataaa ttacattcac ctcgtaggta ataatttgga caccaaaggt aaatgagacc    1080ccgatacaat tggtgtacct attagtgtct caatattgaa tttccaaaaa tacccttatc    1140cctgtgtctg aaaggcgcgt gggagtgcgc tgaaaaagtt aagtttctct ctccaaaaac    1200tcaccggagc tccgattgag ggccttccgg tcatcaattt gcgacacgcg cggcggtgtg    1260tacccctggg agggtagaaa ccactacgct acgcagcagc cttagctacg ccggagctta    1320gctcgccacc gttataatat t                                              1341SEQ ID NO.12的信息(xxiv)序列特征

(A)长度：1339碱基

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑：环形(xxv)分子型：基因组DNA序列描述：SEQ ID NO.12accggtggcg agcggggttt ttccgaactt tgtgggcccc acatattgga agaaagagaa      60agtggactct ggttatgcaa ttgggccttt aatgaatggg ctttatctta atgtaaatgt     120ctattgggct tgagtaaaaa agaatagtag ggctcaaata aaatacaatt ttatttaatt     180atatatctga atacgtataa ttacgtattc atacatctga attcataaat acatcgtatt     240catcacctac atctatatct tcaactggtg cctcttccat cattagtata tctataactt     300gtaccatatc ttcttgcctg aattcccaaa tatttgagtg cttgtacatt attttgaggc     360agtgttttat gccttcttct aggctgttga agtcgattgg tgggatgagc ccttggtgcc     420tgtaagggat catgaatttc ttcttggcta atgctggtga ccgtgttgag cttatttcga     480cctgaacaag gaaggaagtg tctgcttcca acttgacatc tattttgaat tccagacccc     540ttttgttgtt gtatttgata gtcattctta tttggtgtgg attgtacatg agtttgatct     600gcttaaataa tgcaagtaat tttgatacat ggacttgatt gatttacgtg tttcattgtt     660gttcatatag gttatagtgg agatatttgt cattgatagt gacattacta tcaatgttaa     720gtacttttac taatgacata ataatctaga ttattatgaa taagtataat gggaaaaaga     780atagaaaaaa aataaaaaac ttaagataag aaaataaaaa aggaaagaag ataatacatg     840taagcacaaa caaaaatata tttagaaaag aaaaagggag cgcagcgaaa aaaaaaaaat     900aaattcaaaa ccaacagagt caacaaaaca taaaaaataa aaaaataaaa ataaagaatt     960aaagcaaaac aaattaaata aaatagtaaa aacatgagca ggtttttacg gcgttgttaa    1020aaaatagtta cattaaccgc ataggtaaat aatcgggaca ccaaaggtaa atgggacacc    1080gatacaattg gtgtacctat tagtgtctca aaattgaatt tccaaaaata cccttatccc    1140tgtgtctgaa aggcgggtgg tattgcgctg aaaaagttaa gtttttctct ccaaaaactc    1200cccggagctc cgattaaggg ccttccggtc atcaatttgc gacacgcgcg gcggtgtgta    1260cccctgggag ggtagaaacc actacgctac gcagcagcct tagctacgcc ggagcttagc    1320tcgccaccgt tataatatt                                                 1339

Claims (10)

1.一种新型植物DNA病毒载体，其特征在于，它包括中国番茄黄化曲叶病毒DNA-A和DNAβ的侵染性载体及由它衍生的植物基因沉默载体和病毒表达载体。

2.一种新型的构建植物DNA病毒载体的卫星DNA分子，其特征在于，它包括：一种粉虱传双生病毒中国番茄黄化曲叶病毒DNAβ分子，所述的核苷酸序列与Seq ID No.1-12至少有72％的同源性。

3.一种新型植物DNA病毒载体的用途，其特征在于，它用于确定病毒基因组功能、植物基因组功能和表达外源蛋白；

4.如权利要求3所述一种新型植物DNA病毒载体的用途，其特征在于，其确定病毒基因组功能、植物基因组功能和表达外源蛋白的方法包括：

a.将两个正向重复的突变或插入植物cDNA或插入外源蛋白的DNAβ构建至植物表达载体；

b.把a中构建的载体导入农杆菌宿主；

c.通过注射将b中的农杆菌接种寄主植物；

d.观察表型及分子水平的检测。

5.如权利要求1所述的一种新型植物DNA病毒载体，其特征在于，它为中国番茄黄化曲叶病毒DNA-A和DNAβ的侵染性载体，该侵染性载体接种寄主植物，DNA-A能够系统侵染，但只有与DNAβ一起接种时引发典型的症状。

6.如权利要求3或4所述的一种新型植物DNA病毒载体的用途，其特征在于利用植物DNA侵染性载体明确病毒基因组功能，在引物上引入突变碱基，通过Overlap-PCR对病毒基因组的目的基因实现突变。

7.如权利要求1所述的一种新型植物DNA病毒载体，其特征是，它是侵染性载体衍生的植物基因沉默载体，该载体诱导植物基因发生沉默从而研究植物基因的功能。

8.如权利要求3所述的一种新型植物DNA病毒载体的用途，其特征在于，利用植物基因沉默载体明确植物基因组功能，其方法是对DNAβ的一个开放阅读框进行缺失并换之以多克隆位点，在其多克隆位点上插入植物内源基因的cDNA片段进行诱导沉默。

9.如权利要求1所述的一种新型植物DNA病毒载体，其特征是，它是侵染性载体衍生的DNA病毒表达载体，其特征是该表达载体能够表达外源基因。

10.如权利要求3所述所述的一种新型植物DNA病毒载体的用途，其特征在于，利用病毒载体表达外源蛋白，其方法是构建两个缺失一个开放阅读框的DNAβ并只有一组多克隆位点，外源蛋白直接插入多克隆位点进行表达。