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CN1303288A - 治疗肿瘤的联合疗法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种治疗胃泌素依赖性肿瘤的联合疗法。该方法包括对患者免疫接种抗胃泌素(17)免疫原性组合物并联合给予化疗剂如5－氟尿嘧啶和甲酰四氢叶酸。

Description

治疗肿瘤的联合疗法
发明领域
本发明涉及抑制(肿瘤)生长的肿瘤治疗方法，系通过免疫中和生长刺激肽类激素，并联合应用5-氟尿嘧啶衍生物和甲酰四氢叶酸的化疗。
发明背景
胃泌素是一种肽类激素，以两种成熟形式存在：三十四胃泌素(G34)和十七胃泌素(G17)，由位于胃窦(stomach antrum)部的特异性细胞，G细胞合成和分泌。在产胃泌素的细胞中，这些胃泌素激素是从含有信号肽的称为“前胃泌素(preprogastrin)”的正常前体分子翻译后加工形成的。信号肽(“前”序列)在细胞的内质网中被除去，产生“前胃泌素”肽，在分泌进入血流前，该肽在细胞中被进一步加工，产生成熟的胃泌素G34和G17(Dickinson 1991)。(用于参考的本文引用的全部文献在权利要求书前的参考文献栏中列出)。两种成熟形式G34和G17，在它们的羧基端被酰胺化(-NH2)。在人体内，发现了由该前体分子经不同加工产生的G17的多种形式，每种形式具有不同的生物活性(Dickinson，1995和Ciccotosto等人，1995)。在胃泌素的翻译后加工中，它是“成熟”的羧基酰胺化形式，可通过该肽的羧基端结合于特异性细胞受体(称为CCK-B/胃泌素受体)(Kopin等人，1992)。
胃泌素激素被分泌到循环血液中，并结合于胃里的特异性细胞，称为肠嗜铬样(ELC)(enterochromaffin-like)细胞和壁细胞，这些细胞间接或直接影响胃的酸分泌。过去，一直认为这两种胃泌素激素与刺激胃酸的分泌相关。近年，累积的证据显示，胃泌素还作为肠胃道的营养因素起作用(Johnson，L.1997)，并且促进肠胃癌的生长(Watson等人，1989,Dickinson,C.J,1995)，以及非肠胃癌，包括小细胞性肺癌(Rehfeld等人，1989)的生长。
一些肿瘤类型，包括结肠直肠、胃、胰和肝细胞腺癌在它们的质膜上拥有CCK-B/胃泌素受体，且这些肿瘤细胞对胃泌素的反应是强力细胞增殖(Rehfeld,J.F,1972,Upp等人，1989和Watson等人，1993)。在结肠直肠癌患者中血浆总胃泌素水平升高，而且，特别是在许多使用胃泌素抗血清的结肠直肠肿瘤中已测到该激素前体前胃泌素量的增加(Ciccotosto等人，1995)。最近，发现许多癌细胞也分泌胃泌素，从而影响了自主增殖途径(Van-Solinge等人，1993,Nemeth等人，1993和Seva等人，1994)。
肽类激素G17和G34结合于正常细胞胞膜上的CCK-B/胃泌素受体。然而，已发现G17刺激胃泌素依赖性癌细胞的生长，而G34不能。特别是，血清相关的G17能够在肿瘤细胞中以CCK-B/胃泌素受体介导的内分泌方式，刺激结肠直肠肿瘤的生长(Watson等人，1993)。G17与其它种类的胃泌素激素相比，由于对肿瘤细胞上CCK-B/胃泌素受体亲和力可能增加，特别涉及到刺激结肠直肠腺癌的生长(Rehfeld,1972和1993)。已发现CCK-B/胃泌素受体以高亲和力形式表达于56.7％人原代结肠直肠肿瘤上(Upp等人，1989)。
许多研究显示，除了能够对外源性内分泌胃泌素起反应外，人的胃和结肠直肠肿瘤还产生胃泌素和它的前体(Ciccotosto等人，1995,Finley等人，1993,Kochman等人，1992,Nemeth等人，1993,Van Solinge等人，1993)，从而影响自分泌生长刺激途径。肿瘤细胞的胃泌素产生不同于内分泌G细胞。具体地说，这些肿瘤细胞含有高比例的前体前胃泌素和较低浓度的成熟肽。推测这一异常的比例是由于胃泌素固有失调性释放的联合肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶的活性受限造成的(Ciccotosto等人，1995,Kelly,1985)。非调节性释放的胃泌素将导致不同分子形式的该激素的异常产生和分泌。具体地说，结肠癌细胞不能有效加工前胃泌素，导致较少的前体胃泌素转变为成熟肽，由此产生了大部分不完整或畸变的胃泌素(Dickinson,1993和Rehfeld等人，1993)。另外，结肠直肠肿瘤中胃泌素水平的增加部分是由于结肠直肠肿瘤细胞中胃泌素基因的异常表达造成的(Hoosein等人，1990,Baldwin等人，1992和Finley等人，1993)。已在这些细胞中鉴定到类胃泌素肽(Hoosein等人，1988,Watson等人，1991和Finley等人，1993)，并证明为前体胃泌素(Van-Solinge等人，1993和Nemeth等人，1993)。
在一些结肠直肠癌中存在酰胺化的G17(G17-NH2)，证明一些肿瘤保留了只在分泌性颗粒中发生的胃泌素酰胺化那样的完整的加工途径(Varro等人，1994)。由于结肠直肠细胞系的基础生长显示可被抗胃泌素抗体抑制，内源性产生的胃泌素也可作为自分泌生长因子(Hoosein等人，1988)。这在第二个研究中得到证实，即用Northern印迹分析在同一细胞系中显示有胃泌素mRNA，且放射免疫试验显示细胞培养上清液中有胃泌素样免疫反应性(Hoosein等人，1990)。胃泌素肽也起旁分泌作用(Watson等人，1991b)，这在显示恶性结肠直肠粘膜细胞亚群中胃泌素免疫反应性更显著的实验(Finley等人，1993)中得到了证实。
当G17结合于它的受体时，形成了一个G17/受体复合体，它通过调节细胞功能的第二信使方式刺激了细胞生长(Ullrich等人，1990)。G17结合于CCK-B/胃泌素受体导致：触发了对磷脂酰肌醇的破坏；蛋白激酶C的激活，从而增加了胞内钙离子的浓度；和通过促分裂原活化的蛋白激酶诱导了c-fos和c-jun原癌基因，显示于对细胞增殖的调节(Tadisco等人，1995)。另外，已将结合于CCK-B/胃泌素受体的胃泌素与随后的酪氨酸激酶造成的磷酸化增加相关联，该酪氨酸激酶pp125FADK(粘着斑激酶)在传递促分裂信号中也起作用(Tanaguchi等人，1994)。
由于近年来在存活率上只得到了很小的改进，结肠直肠癌仍是难以治疗的可怕疾病。手术是原发病的有效治疗手段，但对经常存在的残留潜在病灶是无效的。通常向直肠癌患者推荐手术后的放射治疗，来减少疾病复发的风险。晚期直肠癌患者，手术后最有效的传统治疗是用5-氟尿嘧啶(5-FU)作的化疗。然而已表明，5-FU治疗对患者只有有限的益处，因为5-FU有高毒性且治疗费用高，并且无论是单独使用还是与其它细胞毒类药物联用，5-FU都不能明显延长存活。在大多数情况下，潜伏的或不宜手术的结肠直肠肿瘤对化疗或放疗的反应不是很好，故需要新的治疗手段来补充现有的方案。
最近，一些研究显示用5-FU和甲酰四氢叶酸的辅佐性联合化疗在晚期结肠直肠癌患者中改善了5-FU的效果。甲酰四氢叶酸是叶酸的衍生物，也称为亚叶酸、噬橙菌因子或5-甲酰-5,6,7,8-四氢叶酸。研究显示对杜克(Duke)阶段C的患者，5-FU/甲酰四氢叶酸的联合治疗可以减少10-15％的死亡率(Moertel,1994)。对相同的患者组，用5-FU/甲酰四氢叶酸进行静脉内和腹腔内联合治疗结果没有明显的病愈存活和总体存活优势点的倾向(Scheithauer等人，1995)。在晚期疾病中，相同的药物联合可导致存活优点(Taylor,1993)，显示出联合组存活的中值为13.5个月，而用5-FU治疗的患者为7.5个月(Petrioli等人，1995)。然而，这种联合化疗仍有显著发病并其造成有害的副作用，包括口炎、腹泻和骨髓抑制(Mahood等人，1991；Erlichman等人1988；Pietnelli等人，1989)，从而造成生活质量问题，尤其对于晚期患者。
在许多实验性胃肠癌中体内和体外治疗性评价了许多高亲和力CCK-B/胃泌素受体拮抗剂。例如，丙谷胺，一种谷氨酸的衍生物(Seva等人，190；Harrison等人，1990和Watson等人，1991a)；Benzotrip，色氨酸的一种N-酰衍生物；L-365,260,Aspercillin的一种衍生物(Bock等人，1989)；和CI-988，一种模仿CCK五肽序列C端的分子(Hughes等人，1990)，已显示出在体内和体外都能有效地中和外源胃泌素对肠胃肿瘤生长的作用(Watson等人和Romani等人，1994)。然而，这些拮抗剂有严重的毒副作用而且缺少特异性，它们封闭了正常细胞中该受体所有潜在配体(如G34和CCK)的作用。最近，也已描述了高潜能和选择性的CCK-B/胃泌素受体拮抗剂，如YM022(Yuki等人，1997)和YF476(Takinami等人，1997)。
在临床前期的研究中已广泛评估了丙谷胺和Benzotript。这些化合物的主要问题在于它们缺乏药效，而且替代G17需要相当高的浓度(Watson等人，1992a；Watson等人，1992b)。除了这一点，丙谷胺和Benzotript还抑制了许多细胞系的基础的胃泌素刺激性增殖(Seva等人，1990；Watson等人，1991a)。另外，在受治疗的动物中，丙谷胺增加了胃泌素敏感性小鼠结肠肿瘤MC26异种移植的小鼠存活达39天，而对照动物为25天。
由于这类胃泌素拮抗剂对胃泌素/CCK-B受体的低特异性，故认为对生长的抑制是由胃泌素受体非依赖性作用诱导的。另外，识别和结合胃泌素的细胞受体不结合于测试的所有抑制剂(Seva等人，1994)。所以，如果在自分泌生长级联反应中不发生对胃泌素与受体结合的完全抑制，则胃泌素拮抗剂可能无法阻断这种肿瘤生长的启动机理。
由此，需要新的治疗方法，它既可以自身作为一种疗法，又可用于与化疗联合。联合治疗提供了提高治疗指数和/或减少所需化疗剂量的可能性，从而限制了不良副作用。
一种选择性免疫中和胃泌素激素生物活性的治疗方法，将提供一种有效的手段来控制或防止与结肠直肠癌相关的过量胃泌素激素产生引起的病理性改变。
共同转让的美国专利No.5,023,077、5,468,494、5,607,676、5,609,870和5,622,702公开了通过产生抗胃泌素抗体，用于控制患者G17和G34水平的免疫原和免疫原性组合物，还公开了这些组合物用于治疗胃和十二指肠溃疡及胃泌素诱导的癌症的用途。本发明涉及美国专利No.5,023,077、5,468,494、5,607,676、5,609,870和5,622,702中公开的抗G17免疫原和免疫原性组合物与化疗剂联合治疗胃泌素依赖性结肠直肠癌的用途。
本文描述的治疗癌的方法有几个优点优于现有的结肠直肠癌治疗方法。与单用化疗相比，抗G17免疫联合化疗剂(如5-FU和甲酰四氢叶酸)增加了控制或抑制结肠直肠肿瘤生长的治疗效果。
发明概述
本发明提供一种治疗肿瘤的联合方法，包括在与化疗联合中免疫中和促进肿瘤细胞分裂的肽类激素和因子。具体地说，本发明提供一种治疗胃泌素依赖性癌症(如结肠直肠腺癌)的方法。本方法包括，对需要治疗的患者进行包括抗G17免疫接种的联合治疗，结合给予一种或多种化疗剂。用于治疗胃泌素依赖性肿瘤的抗G17免疫接种，在产生抗G17抗体上惊人地有效，尽管已知所用化疗剂有骨髓抑制作用。
抗G17免疫接种包括，用针对激素G17的抗G17免疫原主动或被动免疫接种患者，来控制患者的G17水平。结果由于在患者体内诱导了抗G17抗体，G17激素在体内被中和，它的生理效应被抑制，从而抑制了G17依赖性肿瘤细胞生长。
另外，用抗G17免疫接种联合标准化疗，增加了结肠直肠癌的治疗效果，因为在联合中治疗患者所需的化疗剂剂量较低，从而降低了其对正常组织的毒性作用。此外，患者的生活质量可以得到改善，他的存活时间也可延长。
在一优选实施例中，本方法包括用抗G17免疫原主动免疫接种患有胃泌素依赖性肿瘤的哺乳动物，并联合给予一种或多种化疗剂，如5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、左旋咪唑、顺氯氨铂、肿瘤坏死因子和丙谷氨。抗G17免疫原可以按患者需要，在治疗开始和后续间隔给予。在免疫接种后，患者体内产生的抗G17抗体可结合并中和G17(成熟、酰胺化的G17和G17的前体形式，如，G17-Gly)，并防止G17与其受体结合，从而防止胃泌素依赖性肿瘤细胞的生长。在预定的间隔时间，用标准技术监视免疫接种患者产生的抗G17抗体的滴度。另外，按标准的治疗方案给予化疗剂或按患者的需要给予较低剂量。
在另一实施例中，本发明还提供一种治疗胃泌素依赖性肿瘤的方法，包括用抗G17抗体被动免疫患胃泌素依赖性肿瘤的患者，并联合给予一种或多种化疗剂，如5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、左旋咪唑、顺式铂氨、肿瘤坏死因子和丙谷氨。在本发明的优选实施例中，抗体可以是由本领域已知方法制得的嵌合性、人化的或人单克隆抗体。按患者的需要，此抗体可以和化疗剂一起在治疗起始和初期治序后的后续阶段给予。
附图说明
图1描绘的图显示了用500μg/ml大鼠抗G17(1-9)-DT免疫原免疫接种大鼠后，血清抗体滴度与时间的关系。
图2描绘的图显示了30mg/kg剂量5-FU/甲酰四氢叶酸治疗，对用本发明的免疫原免疫接种的大鼠所得的抗G17(1-9)抗体滴度的影响。
图3描绘的Scatchard印迹显示了30mg/kg5-FU/甲酰四氢叶酸治疗对BDIX大鼠白血球平均数的影响。
图4描绘的柱状图显示了未治疗的、抗G17(1-9)DT治疗的和DT治疗的大鼠的肿瘤重量的中值。
图5描绘的棒状图显示了用30mg/kg 5-FU/甲酰四氢叶酸；30mg/kg 5-GU/甲酰四氢叶酸和DT免疫原；30mg/kg5-FU/甲酰四氢叶酸和抗G-17(1-9)-DT；25mg/kg 5-FU/甲酰四氢叶酸和DT免疫原；25mg/kg 5-FU/甲酰四氢叶酸和抗G-17(1-9)DT；20mg/kg 5FU/甲酰四氢叶酸和DT免疫原；20mg/kg 5FU/甲酰四氢叶酸和抗G17(1-9)DT；12.5mg/kg 5-FU/甲酰四氢叶酸和DT免疫原；和12.5mg/kg 5-FU和抗G17(1-9)DT治疗的大鼠的肿瘤重量的中值。
发明详述
本发明提供治疗肿瘤，尤其是与胃泌素依赖性结肠直肠癌相关肿瘤的方法，所用的联合治疗包括用抗G17免疫原接种患者，用化疗剂如5-FU和甲酰四氢叶酸治疗患者。令人惊讶的是，已发现抗G17免疫接种/5-FU-甲酰四氢叶酸联合治疗较以前的治疗结肠直肠癌方法更有效。用于联合治疗的化疗剂不会显著抑制免疫接种患者的抗G-17抗体的产生，并且可用较低剂量的化疗剂治疗肿瘤的生长。另外，免疫接种产生的抗G17抗体滴度能有效中和所有形式的G17激素。
在一优选实施例中，本方法包括用抗G17免疫原性组合物主动性免疫接种患胃泌素依赖性结肠直肠癌的患者结合给予患者化疗剂。按患者所需，即用标准方法和肿瘤标准放射评估分析免疫接种后患者血清中抗G-17滴度，给予后续抗G17免疫原加强免疫接种。也可在肿瘤手术前向患者提供抗G-17免疫接种。
抗G-17免疫原包括天然或合成的G17 N端氨基酸的肽片段作为免疫原的免疫部分。该肽片段偶联于一个免疫原性载体如白喉类毒素(DT)。在本发明的优选实施例中，抗G17免疫原包括G17的氨基端氨基酸，从位点1到9，所具有的氨基酸序列为pyroGlu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu，偶联于白喉类毒素。其它适合的免疫原性蛋白载体包括牛血清白蛋白、匙孔_血蓝蛋白(keylimpethemocyanin)、血青蛋白和破伤风毒素。
本发明的免疫原还包括适合于将此免疫肽突出于蛋白载体，提高其结合于淋巴细胞受体能力的一个延伸肽或间隔肽(spacer peptide)序列。适合的间隔肽序列是SSPPPPC(序列表中的SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。当然其它间隔肽也适合。在本发明的一个优选实施例中，优选延伸序列附着于此免疫肽的羧基端。本发明的免疫原用标准方法制得，并在美国专利No.5,023,077、5,468,494、5,607,676、5,609,870、5,688,506和5,662,702中公开，在这里纳入本文作为参考。免疫接种后，在接受免疫接种的动物内，本发明的免疫原产生高亲和性中和的抗体，抑制了成熟形式和前体形式的G17对肿瘤生长的作用。产生的抗G17抗体结合并中和成熟和前体G17，从而防止了G17结合于肿瘤细胞上的受体，最终抑制了肿瘤细胞的生长。免疫原产生的抗体中和了羧基酰胺化和甘氨酸延伸的G17，并显示出对G34或CCK没有交叉反应。
组合物(其中用于主动免疫接种的免疫原用于治疗患者的胃泌素依赖性肿瘤)可以是多种形式的。它们包括，例如固态、半固态和液态剂型，如粉状、液体溶液、悬浮液、栓剂、和注射用及难溶性溶液。优选的形式依赖给药模式和治疗用途。该组合物包含本发明的免疫原和合适的药学上可接受的成分，也可包含其它药物制剂、载体、佐剂、赋形剂等，它们可用标准方案混合。较佳地，该组合物是单元剂量的形式。一次或一段时间中，用于免疫接种或作为药物施用的活性组合物的量将依赖于接受治疗者、给药的方法和形式以及治疗大夫的判断。
用于治疗肠胃癌时，给予患者的免疫原性组合物的有效剂量范围为0.001-2mg。免疫接种后的1-3个月，有效剂量的该免疫原性组合物，可以引发患者免疫应答产生有效水平的抗体滴度以结合和中和成熟和前体形式的G17。在免疫接种和用化疗剂(如5-FU/甲酰四氢叶酸)治疗结肠直肠癌患者后，用标准临床方案评估对肿瘤生长的治疗效果，如超声波和核磁共振成像(MRI)来检测肿瘤的存在和肿瘤的大小(如果存在肿瘤)。抗G17抗体的滴度也可通过从患者获得的血样进行监测。
应按需要予以加强免疫接种，来维持有效抗体滴度。按照本方法可有效治疗胃泌素依赖性结肠直肠腺癌和其它胃泌素依赖性癌，如胃、肝、胰和肺的小细胞性癌，能够抑制肿瘤的生长和减小肿瘤的大小。
对于被动免疫，用药学上可接受的载体如盐水(例如磷酸盐缓冲盐水)，静脉给予患者抗G-17抗体。
按照标准治疗方案推荐的剂量给予化疗剂，可以在治疗初期同时、免疫接种前或免疫接种后与抗G17免疫原一起给药。在一些病例中，在免疫接种前或后均给予化疗剂可能有利。也可按患者的需要给予后续的化疗治疗，然后作MRI和超声波成像来评定。
进行以下实施例来证明本联合治疗对结肠直肠癌的作用。
实施例1
进行以下试验来测定抗G17(1-9)-DT提供的潜在临床益处。本项研究的目的为：
(a)确定特异性大鼠抗G17(1-9)-DT免疫接种对大鼠肠胃道组织学表现的长期影响。
(b)评估5-FU/甲酰四氢叶酸联用对抗G17(1-9)-DT产生的抗体滴度的影响；和
(c)确定抗G17-(1-9)-DT和5-FU/甲酰四氢叶酸联用对大鼠结肠模型的治疗作用。
细胞系
DHDK12是大鼠上皮肿瘤细胞系(Martin,1993)。该细胞系在含有10％胎牛血清(FCS,Sigma,Poole,UK)的RPMI 1640生长培养基(Gibco,Paisley,Scotland)中，湿润条件、37℃、5％CO2培养。
免疫原
抗G17(1-9)-DT免疫原包括G17的氨基酸残基1-9，通过羧基端连接于肽间隔臂SSPPPPC(序列表中的SEQ ID NO:1)，然后与DT偶联。用于这些研究的免疫原，用大鼠G17的氨基端9个氨基酸替换人G17表位，通过肽间隔臂连接于白喉类毒素(DT)制成对大鼠G17是特异性的。由大鼠抗G17(1-9)-DT产生的抗血清以抗大鼠G17(1-9):DT表示。
实验动物
由Cancer Studies Unit,University of Nottingham,UK提供雌性和雄性BDIX大鼠，6-10周龄、340-420g。这些将大鼠成对地关养，25℃、50％湿度，并保持12小时明亮12小时黑暗的循环。
在每次试验前，动物按相同重量分。每组6-13只动物。所有动物实验的免疫接种方案都遵照UK Coordinating Committee for Cancer Research(UKCCCR)指南进行。
将大鼠抗G17(1-9)-DT溶于无菌盐水(0.9％)pH7.3到1mg/ml。在偶联物溶液中加入佐剂，正胞壁酰二肽(Peninsula Labs.,Belmont,CA,USA)，得到终偶联物的浓度在200-500μg/ml之间。用油性载体(montanide ISA 703；AMSSeppic Inc.,Paris,France)以1∶2(v/v)的比例通过乳化，配制该含水溶液。在置于一个通过三路栓与另一注射器相连的玻璃注射器后，将混合液在注射器内来回挤压40次形成乳化液。类似地配制含有DT肽和胞壁酰二肽的乳化液用于对照大鼠。皮下注射200μl体积的乳化液(50μg/大鼠)  (实验动物的右侧)。对动物免疫接种如下所述一次注射或21天间隔后重复。
细胞毒性处理治疗方案
在第1、3和5天，大鼠接受静脉注射12.5和25mg/kg的5-氟尿嘧啶(5-FU,David Bull Labs.,Warwick.UK)和12.5-25mg/kg甲酰四氢叶酸(Lederle Labs.,Gosport,Hants,UK)，在整个研究中期间每4周重复一次(Asao,1992)。在免疫接种抗G17(1-9)-DT(200μg/ml)前或后，给予大鼠细胞毒性组合物。
引发肿瘤的生长
以2.5×107/ml的细胞浓度，将DHDK 12细胞悬浮于无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS,Oxoid,Hants.,UK)中。对大鼠腹腔注射1ml Hypnorm(0.315ng/ml柠檬酸芬太奴和10mg/ml氟阿尼酮；Jannsen,Berrse,Belgium)、Hypnovel(5ng/ml咪达唑仑；Roche,Basel,Switzerland)和无菌蒸馏水(以1∶1∶5比例)。在右边皮下切开后，将200μl体积的细胞悬浮液注射到腹壁肌肉层中，用创缘夹闭合手术切口。每个实验组由6-13个动物组成。
测定大鼠抗G17(1-9)-DT-免疫接种的大鼠中特异性抗体的水平
为了得到分析用的血样，在整个试验的各个时间点大鼠尾部采血，试验终止时在末端麻醉下心脏穿刺采血。抗大鼠G17抗体血清水平用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定。将大鼠G17牛血清白蛋白(BSA)偶联物溶于0.1M甘氨酸缓冲液(pH 9.5)中至2μg/ml，然后以每孔25μl置于96-孔免疫(Immunulon)U平板(Dynatech Labs.,Sussex,UK)上。4℃培育诸孔，过夜后吸出未吸附的偶联物，用缓冲液(0.9％盐水，0.5％Tween-20[Sigma],0.02％NaN3[Sigma],pH7.3)洗涤诸孔。该缓冲液用于所有的洗涤步骤和试剂稀释。按10倍系列稀释度处理血清，起始稀释度为1∶100。阳性对照为上述免疫接种动物的大鼠抗大鼠G17(1-9)-DT抗血清，阴性对照为正常大鼠血清和单用DT免疫接种的大鼠的血清。所有对照血清都采用与测试血清相同的稀释度。以25μl每份将稀释的血清加入到孔中，有或无25μl/孔大鼠G17-BSA(100μg/ml)(作为可溶性抑制剂)。基线对照孔只加入25μl的试验缓冲液。室温培育平板60分钟，然后用试验缓冲液洗涤。以1∶500稀释度、50μl/孔，将羊抗大鼠免疫球蛋白(H+L)-生物素(Zymed,SanFrancisco,CA,USA)加入到孔中，室温暗处培育60分钟。洗涤后，以1∶100稀释度加入亲和素-碱性磷酸酶(Zymed)，室温培育平板60分钟。进一步洗涤后，将ρ硝基苯磷酸盐(pNPP)底物(Sigma)加入到孔中(50μl/孔)，5分钟显色后，在405nm读取吸光度。未用大鼠G17-BSA处理和用其处理的血清吸光度间的差异计算为特异性吸光度。
测定血白细胞数
在实验中通过尾部放血和在实验结束时通过心脏穿刺，从大鼠收集肝素化血。用FACScan(荧光激活细胞分选仪)分析血白细胞数目(在HematologyDepartment at the University Hospital,Nottingham)。
组织学
在长期抗G17(1-9)-DT免疫接种大鼠终止时，解剖并用福尔马林固定免疫接种大鼠和年龄相匹配对照大鼠的胃、结肠和直肠的代表性区域。将这些切片包埋在石蜡中，用切片机切成4μm的切片，苏木精和曙红染色，并由不知道处理组的组织病理学家作评价。
隐窝细胞(crypt cell)的增殖率
处死动物1小时前，腹腔注射长春花碱(2mg/kg,Sigma)，以在评估结肠隐窝细胞增殖(CCPR)前诱导结肠上皮停滞于分裂中期。计数每隐窝分裂中期的细胞数。从每只大鼠中取出结肠和直肠，纵向切开，在Camoys溶液中固定每只大鼠的粘膜。在解剖显微镜下，平缓地纵向挤压隐窝成片，计数处于分裂中期的细胞数(放大率×25)。
统计分析
用IBM PC的SPSS统计软件包，分析体内实验结果进行Mann Whitney非参数检验。
抗G17(1-9)-DT的长期研究
如上所述用大鼠抗G17(1-9)-DT免疫原免疫接种五只雄性大鼠，在单次免疫接种后的34周内，测定它们抗体的滴度。在该时间点，给大鼠第二次注射大鼠抗G17(1-9)-DT加强免疫。图1显示了研究结果。图1显示了用500μg/ml大鼠抗G17(1-9)-DT免疫接种大鼠后40周，大鼠抗体滴度随时间的变化。每点代表一个动物。如上述，用1∶100血清稀释液作ELISA试验测量抗体滴度。箭头所指为免疫接种。在第一次免疫接种后，5只大鼠中的4只对大鼠抗G17(1-9)-DT免疫原有应答。在单次注射后，第7周在5只大鼠中的3只测到了抗体，第9周在5只大鼠的4只中测到了抗体。在第一次抗体骤增后15-20周之间又有第二次骤增，第二次骤增后抗体滴度平稳下降，在第34周达到0。在该时间点，图1也显示了在第二次用大鼠抗G17(1-9)-DT免疫接种后，所有大鼠在免疫接种后的1-2周都可测到抗大鼠G-17抗体滴度。
实施例2
对长期抗G17(1-9)-DT免疫接种的大鼠的组织学分析
如实施例1，用苏木精和曙红染色后，从组织学上评估了胃、结肠和直肠的标本。将其与年龄和性别相匹配的对照大鼠作比较。从纤毛(villae)长度/隐窝/粘膜厚度来看，用抗G17(1-9)-DT治疗的大鼠和年龄匹配对照大鼠的肠胃道都是相同的。胃中，这两个动物组的肠嗜铬细胞样(ECL)在数量和外观上都相似。然而，在抗G17(1-9)-DT治疗大鼠胃粘膜中存在G细胞颗粒化(granulation)的某些证据。
实施例3
长期抗G17(1-9)-DT免疫接种的大鼠结肠上皮隐窝细胞的增殖率(CCPR)
如上所述，分析了结肠上皮的CCPR和抗大鼠G17抗体滴度。表1显示了所评价的5只大鼠中的4只CCPR与抗大鼠G17抗体滴度比较得到的结果。对照大鼠的平均CCPR为18.93(标准差为3.2)，抗G17(1-9)-DT免疫接种的大鼠为23.7(标准差为7.9)。抗G17(1-9)-DT免疫接种的和年龄匹配对照大鼠之间CCPR没有统计学差异。这些结果表明对照和抗G17(1-9)-DT免疫大鼠的结肠上皮中隐窝细胞分裂率相同。
                表1抗大鼠G17:DT抗体滴度与结肠隐窝细胞增殖的比较
    大鼠 关于抗大鼠G17:DT抗体的特异性吸光度(1∶1000稀释) 隐窝细胞增殖率(用长春花碱处理2小时后，平均分裂中期/隐窝)
    对照组1     0     21.9
    对照组2     0     19.4
    对照组3     0     14.4
    对照组4     0     20.0
免疫接种大鼠1     0.280     29.7
免疫接种大鼠2     0.340     30.3
免疫接种大鼠3     0.415     13.6
免疫接种大鼠4     0.420     21.1
实施例4
细胞毒性处理先后对大鼠抗G17(1-9)-DT诱生抗体水平的作用
如实施例1所述，在免疫接种抗G17(1-9)-DT前或后，以1∶1比例将5-FU/甲酰四氢叶酸(30mg/kg)静脉注射入大鼠。每组大鼠由6只雄鼠和6只雌鼠组成，用1∶1000稀释的血清作ELISA测量平均抗体滴度。如实施例1所述，测量每只大鼠血样的抗体水平。
图2显示了用30mg/kg5-FU/甲酰四氢叶酸进行多轮先和后细胞毒药物治疗对抗G17(1-9)-DT免疫接种(500mg/ml)产生的抗体滴度的作用。在图中数据如下显示：-□-无细胞毒药物治疗，7次免疫接种；-◆-在4次细胞毒药物治疗前有2次免疫接种；-○-在4次细胞毒药物治疗前有1次免疫接种；-△-在4次免疫接种前有1次细胞毒药物(免疫接种期中有2次细胞毒药物治疗)；-田-在4次免疫接种前有2次细胞毒药物治疗；-*-在3次免疫接种前有3次细胞毒药物治疗；和-●-在2次免疫接种前有4次细胞毒药物治疗。
图2显示了每组6只雄鼠和6只雌鼠的平均值。标准差在平均值10％上下。与未用抗G17(1-9)-DT免疫接种的大鼠相比，用细胞毒药物治疗5-FU/甲酰四氢叶酸先处理的联合治疗对抗体滴度无显著作用，无论是所达到的抗体水平还是达到这些水平所需的时间。评价的最大治疗轮数是4次细胞毒药物治疗然后作2次免疫接种。
图3显示了治疗对BDIX大鼠的血白细胞(WBC)计数的作用。
图3显示了用30mg/kg 5-FU/甲酰四氢叶酸进行BDIX大鼠(接受4次细胞毒药物治疗然后再接受2次免疫接种)的细胞毒药物治疗处理对血白细胞(WBC)计数平均值的影响。如图所示，在细胞毒药物治疗后，评价的代表性大鼠中WBC计数有显著的减少(p＜0.005,Students’t-检验)。多轮细胞毒药物治疗减少了该读数，表示有骨髓抑制。然而，对大鼠产生的抗G17(1-9)-DT的抗体应答没有影响。如图2所示。
实施例5
5-FU甲酰四氢叶酸和抗G17(1-9)-DT联合治疗对体内DHDK12肿瘤生长的作用
如上述实施例，通过与对照组动物的肿瘤相比较，测试了5-FU/甲酰四氢叶酸(12.5-30mg/kg)和大鼠抗G17(1-9)-DT(200μg/ml)联合治疗对BDIX大鼠腹壁肌肉层中的大鼠结肠肿瘤DHDK 12细胞系生长的作用。在治疗结束后处死大鼠，用标准方案切除肿瘤并称重。每组由10-12只大鼠(混合性别)组成。肿瘤重量的中值在各柱上方用四分位差表示。如实施例1所述，用Mann Whitley U非参数检验进行统计学评价。
图4和图5显示了抗G17(1-9)-DT免疫接种对腹壁肌肉层中植入DHDK 12肿瘤细胞的BDIX大鼠的肿瘤最终重量中值的作用。该植入途径导致了血管化良好的肿瘤可顺从血循环给药的治疗方法(Watson,1996)。已显示当给予500μg/ml剂量时，大鼠抗G17(1-9)-DT能够抑制56.5％最终DHDK 12肿瘤的重量(Watson,1996)。在本实验中，为了测定用5-FU/甲酰四氢叶酸联合治疗的好处，将抗G17(1-9)-DT的剂量降低到200μg/ml，其导致了如图4所示的显著抑制了25.7％的肿瘤生长。图4显示了未治疗对照大鼠、抗G17(1-9)-DT免疫接种大鼠和DT免疫接种大鼠切除的肿瘤数据。50天后，未治疗大鼠肿瘤重量的中值为4.43g。DT免疫接种导致的肿瘤重量中值为4.7g，这与未治疗大鼠的肿瘤重量无显著性差异，但显著大于抗G17(1-9)-DT免疫接种大鼠肿瘤重量中值(3.49g,p=0.034,Mann Whitney)。
图5显示，单用5-FU/甲酰四氢叶酸(30mg/kg)能显著减少肿瘤重量到中值1.01g(p=0.0106，当与未治疗大鼠相比)。当大鼠用相同细胞毒性剂量的5-FU/甲酰四氢叶酸和DT免疫接种时，肿瘤重量中值无显著性差异(0.945g)。
用5-FU/甲酰四氢叶酸(30mg/kg)和大鼠抗G17(1-9)-DT免疫接种联合治疗，导致的肿瘤重量中值为0.68g，这与5-FU/甲酰四氢叶酸/DT治疗组(p=0.27)没有明显的区别。25mg/kg 5-FU/甲酰四氢叶酸和DT免疫接种联合产生的肿瘤重量中值为0.96g，与之相比，抗G17(1-9)-DT免疫接种和5-FU/甲酰四氢叶酸联合治疗组产生的肿瘤重量平均值为0.68g(无明显差异(p=0.409))。当5-FU/甲酰四氢叶酸的剂量减到20mg/kg时，5-FU/甲酰四氢叶酸/DT免疫原联合导致的肿瘤重量中值为1.23g。当20mg/kg 5-FU/甲酰四氢叶酸与抗G17(1-9)-DT免疫接种联合时，肿瘤重量中值显著减少到0.71g(p=0.027,Mann Whitney)。
最后，图5也显示了12.5mg/kg 5-FU/甲酰四氢叶酸与抗G17(1-9)-DT免疫接种联合(p=0.015,Mann Whitney)导致的肿瘤重量中值从1.34g减少到0.41g。比较了在联合中用12.5、20或30mg/kg 5-FU/甲酰四氢叶酸的5-FU/甲酰四氢叶酸-抗G17(1-9)-DT联合，它们之间不存在统计学上的显著差异。
由于用5-FU/甲酰四氢叶酸联合化疗显示在晚期癌和(特别是)辅佐治疗方法中有限的益处(Moertel,1994；Scheithauer,1995；Taylor,1993；Petrioli,1995)，需要一种新的治疗性药政，可以联合5-FU/甲酰四氢叶酸来提高治疗指数(以及可能减少化疗剂量限制毒性)，或当化疗无效时作为二线疗法。这种新疗法必须顺从这种用途。联合化疗的免疫疗法先前被认为是有问题的，因为化疗剂相关的骨髓抑制，如用5-FU/甲酰四氢叶酸所见(Mahood,1991)。然而，在本研究中按Asao等人的诱导大鼠骨髓抑制的最大可耐受剂量5-FU/甲酰四氢叶酸(30mg/kg)给药，不影响抗大鼠G17:DT抗体滴度的水平和达到此水平所需的时间(在用抗G17(1-9)-DT免疫原免疫接种后)。
在用5-FU/甲酰四氢叶酸联合抗G17(1-9)-DT的治疗研究中，20mg/kg和12.5mg/kg的剂量就实现了增强作用。当与抗G17(1-9)-DT联合时，20mg/kg的剂量和最大耐受剂量一样有效，12.5mg/kg的剂量显示出更大治疗效果的趋势。后一趋势的原因未知，但可能是因为该细胞毒性剂量比较高的剂量水平对免疫系统的影响程度较小，这可能有助于对肿瘤的全身性炎症反应。连续多轮给予5-FU/甲酰四氢叶酸将表现为对肿瘤生长“有全部或无任何”作用，就象已发现剂量降低到1mg/kg时不抑制肿瘤生长那样。通过减少给予毒性剂的轮数，可以逐步滴定出治疗效果(Watson,Personal communication)。所以，本发明的联合治疗可以给予低于通常剂量的5-FU/甲酰四氢叶酸，从而减少该药物的副作用，同时可用本发明的联合方法有效杀死肿瘤细胞，因为免疫系统只受到极小的影响。所以，提高了抗G17(1-9)-DT免疫接种对肿瘤生长的抑制作用。从化疗剂本身的骨髓抑制作用来看，本联合治疗的这些特性是出乎意外的和令人惊讶的。
另外，由于对宿主没有有害的作用，如接受单针免疫接种的大鼠中存在的可测抗体水平的时间长度所示，抗G17(1-9)-DT免疫接种可以作为长期疗法。第一次免疫接种显示80％的有效性(根据抗胃泌素抗体的诱导)，第二次免疫接种后为100％的有效性(抗体水平立即升高)。虽然单次注射抗G17(1-9)-DT可能增强化疗的效果，在大部分宿主中没有副作用，但抗G17(1-9)-DT免疫接种的特征和加强免疫后宿主应答的速度表明多次注射的治疗方案可能是理想的。如简单的组织学估测定的那样，除了抗大鼠G17抗体在循环中可维持长时间外，看来对肠胃道没有长期有害影响。另外，结肠粘膜细胞的隐窝细胞增殖指数揭示对它们的生长没有明显的影响。
实施例6
用5-FU/甲酰四氢叶酸和抗G17(1-9)-DT联合治疗人结肠癌患者的疗法
先前已显示了单用抗G17(1-9)-DT免疫接种在胃泌素依赖性癌的治疗中是有价值和安全的。本文的抗G17免疫原和5-FU/甲酰四氢叶酸联合提高了癌症治疗的有效性，尤其是对结肠癌的治疗，而且在联合治疗中可以减少所需化疗剂的剂量这将减少现用任何化疗剂的有害细胞毒副作用。本发明的免疫原和化疗剂的联合也可用作对单用化疗无反应的患者的二线治疗。
用化疗和免疫疗法联合治疗人结肠直肠肿瘤或结肠癌的患者。
具体地说，可以同时给予5-FU/甲酰四氢叶酸和抗G17免疫原组合物或抗G17抗体来治疗胃泌素反应性结肠直肠肿瘤或结肠癌患者。
确切的说，该较佳的免疫疗法提供了一种免疫原性组合物，其包含一个氨基端G17(1-9)肽:DT偶联物与药学上可接受的载体，还可以包括佐剂来进一步刺激免疫应答。
该较佳的免疫疗法可根据临床考虑在化疗之前、之间或之后开始。例如，对于患巨大肿瘤(large tumor burden)的患者，较佳的是先进行几轮化疗来减小肿瘤块，然后再开始免疫治疗。
另外，对于小肿瘤的患者或在治疗性手术后，可以在化疗之前或之间进行免疫治疗。
抗G17免疫原的主动性免疫接种的剂量范围可在300μg到1200μg之间，取决于患者的免疫状态(或免疫应答的能力)。注射间隔可以在第1、7和14天或第1，14和21天或第1、14天然后是28和56天。所有的日程表均可产生类似的抗体滴度。加速的免疫接种日程表提供了更早引发免疫应答的可能性。
抗胃泌素治疗的较佳方法是，无论用何种方案，在首次免疫接种后，每6个月给予一次加强免疫。
有效中和G17、Gly G17和G17 NH2的另一个较佳的方法是用抗G17抗体，较佳的是以纯化的形式被动免疫接种。更具体地说，为了控制胃泌素活性在多轮化疗之前、之间和/或之后，接种10-1000μg抗G17(1-9)抗体。该被动接种可以每天、每周或每两周进行。可根据治疗的有效性决定随后采用其它方案。
另一种治疗联合方案是在首轮化疗之前和/或之间提供首次动免疫接种，然后如上所述进行主动免疫接种。
许多化疗治疗方案正在使用。这些本领域认可的方案，虽然本文没有描述，但也包括在本发明的联合疗法中。一种较佳的化疗方案是静脉注射425mg/m2的5-FU丸药并静脉输注甲酰四氢叶酸(叶酸，FA,20mg/m2)1-5天，治疗期可达4周。
另一较佳的治疗方案是在2小时期间内给予200mg/m2FA，然后在2周内的1或2天静脉注射400mg/m25-FU丸药+在22小时期间给予5-FU 600mg/m2。
另一较佳治疗方案是以每天250-300mg/m2的剂量和静脉注射方式连续输注5-FU 4-6周，然后休息2周。
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Claims (11)

1．一种治疗患者肿瘤的方法，其特征在于，包括：免疫中和肿瘤生长因子和给予患者有效剂量的一种或多种化疗剂。
2．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤是胃泌素依赖性肿瘤。
3．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤生长因子是胃泌素。
4．一种用联合疗法治疗胃泌素依赖性肿瘤的方法，其特征在于：对需要所述治疗的哺乳动物给予有效剂量的抗胃泌素17免疫原，并联合一种或多种化疗剂。
5．如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的抗胃泌素G17免疫原与白喉类毒素偶联。
6．如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的抗胃泌素G17免疫原还含有间隔肽。
7．如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的抗胃泌素G17免疫原含有由氨基酸序列pGlu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu(序列表中的SEQ ID NO:1)组成的肽。
8．如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的化疗剂是5-氟尿嘧啶和甲酰四氢叶酸。
9．如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的抗胃泌素G17免疫原在给予5-氟尿嘧啶和甲酰四氢叶酸化疗前给予。
10．如权利要求4或9所述的方法，其特征在于，所述的化疗剂在治疗过程中以几轮给药。
11．如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括给予一次或多次加强免疫接种。
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