CN1302005C - 硫代磷酸寡核苷酸的制备方法 - Google Patents

Abstract

提供一种合成硫代磷酸寡核苷酸的方法，其中包括在乙腈存在下组装结合于固相支持物上的寡核苷酸；从固相支持物上切除寡核苷酸之前除去乙腈；以及从固相支持物上切除寡核苷酸。该方法特别适于大规模核苷酸合成。可通过一或两步干燥和通过溶剂洗涤除去固相支持物中的乙腈。优选的洗涤溶剂含三烷基胺。

Description

硫代磷酸寡核苷酸的制备方法

本发明涉及一种硫代磷酸寡核苷酸的合成方法。

过去大约15年来，寡聚脱氧核糖核苷酸(DNA序列)、寡聚核糖核苷酸(RNA序列)及其类似物的合成方面已有很大进展(′Methods inMolecular Biology，Vol.20，Protocol for Oligonucleotides andAnalogs′，Agrawal，S.Ed.，Humana Press，Totowa，1993)。大量工作已在微摩尔或更低水平实现，包括单体亚磷酰胺模块的自动化固相合成(Beaucage，S.L.；Caruthers，M.H.Tetrahedron Lett.，1981，22，1859-1862)已被证明是最方便的方法。实际上，现在用商业合成仪已可常规制备高分子量DNA和相对高分子量RNA序列。这些合成寡核苷酸已满足生物学和生物技术方面的许多基本需要。

毫克量一般已满足分子生物学目的，而临床试验需要克级到大于100克的量。作为潜在的反义药物，几种寡核苷酸类似物现已进入高级临床试验，看起来可能在很近的将来，如果这些序列中的一个被批准，也即，用于治疗AIDS或某种癌症，将需要千克、几千克、或更大量的特定序列。

当前制药业关心的很多寡核苷酸是天然寡核苷酸的类似物，其中含有核苷间硫代磷酸连接。存在硫代磷酸连接时，特别是大部分连接是这种连接，尤其是100％的核苷间连接都是这种连接时，将最终产物中的杂质浓度、非硫代磷酸连接保持在药物允许水平是非常需要的。

大量寡核苷酸合成方法用乙腈作为所用试剂的溶剂。用乙腈作溶剂很吸引人，因为它对试剂和寡核苷酸呈惰性，具有良好的溶解性能，且是环境允许的。一般对于大规模合成来说，在从固相支持物上切除寡核苷酸产物的阶段存在高浓度乙腈。迄今为止，因为乙腈已知的惰性，这已被大规模合成接受。然而，在导致本发明的研究期间，令人惊奇的发现，通过降低切除步骤中的乙腈浓度可以获得更高纯度的寡核苷酸。

根据本发明的一个方面，提供一种大规模合成硫代磷酸寡核苷酸的方法，其中包括：

a)在乙腈存在下组装结合到固相支持物上的寡核苷酸；和

b)从固相支持物上切除寡核苷酸；

其特征在于在从固相支持物上切除寡核苷酸之前，将乙腈浓度降低到寡核苷酸加固相支持物重量的10％以下。

可通过已知的固相合成方法组装硫代磷酸寡核苷酸，例如用H-膦酸酯或特别是亚磷酰胺化学体。对于亚磷酰胺方法，一般使用的顺序是：将结合到固相支持物上的核苷脱保护，优选在5’-位置；优选在3’-，偶联亚磷酰胺核苷形成结合于支持物上的寡核苷酸；通过与硫化剂反应硫化支持物上的寡核苷酸，生成支持物上的硫代磷酸寡核苷酸；用封闭剂将支持物上的未反应核苷封闭。然后重复该循环，这对于组装期望的寡核苷酸序列经常是必要的。当希望得到混合的磷酸/硫代磷酸产物时，可以用氧化步骤代替硫化步骤以在预定位置生成磷酸键连接。组装完成时，从支持物上切除之前，经常用乙腈洗涤支持物上的寡核苷酸以去除痕量的未反应试剂。

可通过干燥支持物上的寡核苷酸除去乙腈，这可以在负压下进行。通常在室温脱乙腈，例如15到30℃，尽管也可以提高温度，如从30到80℃，例如从40到60℃。

根据本发明第一个方面的方法适用于大规模寡核苷酸合成。大规模寡核苷酸合成经常被认为是每批量10mmol寡核苷酸或更多，通常是15mmol或更多，经常是25mmol或更多，例如大于50mmol，尤其是大于75mmol的寡核苷酸。在很多实施方案中，本发明的方法适用于寡核苷酸合成的规模范围在100-500mmol。

组装完预期产物后，可以从固相支持物上将该产物切除。给定固相支持物的切除方法本领域公知。如果产物通过可切除的连接结合到固相支持物上，也可使用适于该连接的切除方法，例如，与甲胺、甲胺水溶液、液氨、氨气接触，尤其是与浓氨水溶液接触。切除之后，可用本领域已知的方法纯化产物，如离子交换色谱、反相色谱和从适当溶剂中沉淀的一种或多种。也可用例如超滤对产物进一步处理。

根据本发明方法中使用的固相支持物在所用溶剂中基本上不溶，它们包括在寡核苷酸固相合成领域中熟知的支持物。实例包括硅胶、控制孔径玻璃，聚苯乙烯、含聚苯乙烯的共聚物如聚苯乙烯-聚乙二醇共聚物和聚合物如聚乙酸乙烯酯。另外，微孔或软凝胶支持物，特别是聚丙烯酰胺支持物，如更常用于固相肽合成的类型，需要时也可使用。优选的聚丙烯酰胺支持物是胺基官能化的支持物，特别是由丙烯酰-肌氨酸甲酯、N，N-二甲基丙烯酰胺和双-丙烯酰乙二胺共聚制备的支持物衍生的类型，如以目录名PL-DMA销售的商品支持物(PolymerLaboratories)。这些支持物的制备方法见Atherton，E.；Sheppard，R.C.；in Solid Phase Synthesis：A Practical Approach，Publ.，IRL Press at Oxford University Press(1984)。这些支持物上的官能团是甲基酯，首先通过与烷基二胺如乙二胺反应转变成伯胺基官能团。

根据本发明的另一方面，提供一种硫代磷酸寡核苷酸的合成方法，其中包括：

a)在乙腈存在下组装结合到固相支持物上的寡核苷酸；

b)在从固相支持物上切除寡核苷酸之前，用使用一或多步溶剂洗涤的洗涤操作洗涤结合到固相支持物上的寡核苷酸；和

c)从固相支持物上切除寡核苷酸。

其特征在于所用洗涤操作的最后洗涤步骤使用除乙腈或二烷以外的溶剂。

洗涤操作包括一或多步溶剂洗涤。如果洗涤操作含有单步洗涤，所用溶剂不含乙腈和二烷。如果包括一步以上溶剂洗涤，可以在最后洗涤步骤以外的洗涤阶段使用乙腈和二烷。然而，优选在洗涤操作的任何步骤中不使用乙腈和二烷。

优选使用在溶剂使用条件下不降解寡核苷酸的惰性溶剂。可用的惰性溶剂的实例包括惰性有机溶剂和惰性水性溶剂。

优选地，溶剂洗涤要达到使乙腈浓度降低到寡核苷酸加固相支持物重量的10％以下。

可使用的有机溶剂包括芳香烃，例如甲苯；脂肪烃，例如环己烷；卤代烷，特别是二氯甲烷；酯，特别是烷基酯如乙酸乙酯和丙酸甲酯或乙酯；醇，特别是脂肪醇如C_1-4烷基醇，例如甲醇、乙醇或异丙醇；酰胺，如二甲基甲酰胺和N-甲基吡咯烷酮；碱，亲核溶剂如吡啶或烷基胺，尤其是三(烷基)胺，如三(C_1-4烷基)胺；极性醚如四氢呋喃；和亚砜，例如二甲基亚砜。

可使用的水性溶剂包括水、水性缓冲液、水和水互溶性惰性有机溶剂的混合物，尤其是与上述溶剂的混合物。

可使用的固相支持物在有关本发明第一方面内容中已有描述。在许多实施方案中，如果支持物是疏水的如聚苯乙烯时，优选使用有机溶剂。在另外一些实施方案中，如果支持物是亲水的，如控制孔径玻璃或硅胶，优选使用水性溶剂。在进一步的实施方案中，如果支持物是微孔性的，优选使用可溶胀支持物的溶剂。

在某些优选实施方案中，所用溶剂用于从寡核苷酸上去除保护基，特别是从核苷酸间连接上去除β-氰乙基保护基，和核碱基(nucleobase)保护基。优选溶剂是烷基胺，尤其是三(烷基)胺，如三(C_1-4烷基)胺，最优选三乙胺。

根据本发明第二方面的方法可同时用于小(即＜25mmol规模)和大规模寡核苷酸合成，如上面本发明第一方面所述。

通过上述与本发明第一方面有关的方法，可组装寡核苷酸，然后经洗涤后从固相支持物上切除。

在本发明第一和第二方面，乙腈浓度优选降低到小于寡核苷酸加固相支持物重量的5％，经常小于3％，特别是小于约2％，尤其是小于约1％。

本发明特别优选的实施方案含有在乙腈存在下组装结合于固相支持物上的寡核苷酸，空气干燥结合于支持物上的寡核苷酸，将干燥的结合于支持物上的寡核苷酸与三烷基胺，优选三乙胺接触足够时间，使寡核苷酸去保护，随后从固相支持物上切除寡核苷酸。

在本发明的相关实施方案中，提供一种硫代磷酸寡核苷酸的合成方法，其中包括：

a)在乙腈存在下组装结合到固相支持物上的寡核苷酸；

b)在从固相支持物上切除寡核苷酸之前，用使用一或多步溶剂洗涤的洗涤操作洗涤结合到固相支持物上的寡核苷酸；和

c)从固相支持物上切除寡核苷酸。

其特征在于所用洗涤操作的最后洗涤步骤使用溶液进行溶剂洗涤，其中含有烷基胺，优选三(C_1-4)烷基胺如三乙胺，其中基本上不含乙腈。可用一或多个溶剂洗涤操作。优选在任何溶剂洗涤操作中不使用乙腈。

用亚磷酰胺化学体的寡核苷酸合成被认为是新方法，其中寡核苷酸在微孔支持物的支持下合成。因此，本发明的第三个方面提供一种寡核苷酸制备方法，其中包括将核苷或寡核苷酸亚磷酰胺与固相支持物支持的含有游离羟基的核苷或寡核苷酸偶联，形成寡核苷酸亚磷酸三酯，其特征在于固相支持物是微孔支持物。

微孔支持物优选是聚丙烯酰胺支持物，如更常用于固相肽合成的类型，需要时可以使用。优选的聚丙烯酰胺支持物是胺基官能化的支持物，尤其是由丙烯酰-肌氨酸甲酯、N，N-二甲基丙烯酰胺和双-丙烯酰乙二胺共聚制备的支持物衍生的类型，如以目录名PL-DMA销售的商品(Polymer Laboratories)支持物。这些支持物的制备方法见Atherton，E.；Sheppard，R.C.；in Solid Phase Synthesis：APractical Approach，Publ.，IRL Press at Oxford UniversityPress(1984)，其中的微孔支持物在此引作参考。这些胺基官能化支持物上的官能团是甲基酯，首先通过与烷基二胺如乙二胺反应转变成伯胺基官能团。微孔支持物优选使用聚合物球形式。

根据本发明第三方面的方法优选在溶胀微孔支持物的溶剂存在下实施。这种溶剂的实例包括卤代烷，特别是二氯甲烷；酯，特别是烷基酯如乙酸乙酯和丙酸甲酯或乙酯；醚如四氢呋喃；和优选酰胺，如二甲基甲酰胺和N-甲基吡咯烷酮。最优选的溶剂是二甲基甲酰胺。

所用核苷或寡核苷酸亚磷酰胺可含3’-或5’-亚磷酰胺基团，最优选3’-亚磷酰胺基。通常亚磷酰胺是β-氰乙氧基亚磷酰胺。在不是亚磷酰胺基团的3’-或5’-位置，核苷或寡核苷酸亚磷酰胺通常含有受保护的羟基，优选在5’-位置是受保护的羟基。优选的保护基是pixyl和三苯甲基，尤其是二甲氧基三苯甲基。

所用含游离羟基的核苷或寡核苷酸可含3’-或5’-羟基，且通常通过不是游离羟基的3’-或5’-位置结合到固相支持物上。最优选地，含游离羟基的核苷或寡核苷酸通过3’-位置结合到固相支持物上，并含有游离5’-羟基。

含游离羟基的核苷或寡核苷酸通常通过可切除性连接结合到固相支持物上。

核苷或寡核苷酸亚磷酰胺与含游离羟基的核苷或寡核苷酸偶联在适当活化剂存在下进行。这些活化剂的实例是常规亚磷酰胺寡核苷酸合成领域已知的类型，它们包括四唑、硫代乙基四唑、硝基苯四唑和二氰基咪唑。通常，核苷或寡核苷酸亚磷酰胺以在用于溶胀微孔支持物的溶剂中的溶液使用。在添加溶于用来溶胀微孔支持物的溶剂中的活化剂溶液之前，亚磷酰胺溶液优选与含游离羟基的溶胀支持物混合。

通常将在本发明第三方面方法中产生的寡核苷酸亚磷酸三酯氧化或硫化，形成寡核苷酸磷酸酯或硫代磷酸酯。所用氧化剂在常规亚磷酰胺寡核苷酸合成领域已知，它们包括碘和叔丁基氢过氧化物。所用硫化剂在常规亚磷酰胺寡核苷酸合成领域已知，它们包括苍耳烷氢化物、二硫化苯基乙酰和Beaucage试剂。氧化剂或硫化剂通常以溶液形式使用，其中的溶剂是用于溶胀微孔支持物的。

可用本领域已知的封闭剂进行封闭处理，例如使用吡啶和乙酸酐混合物和吡啶和N-甲基咪唑的混合物。使用封闭剂时优选存在溶胀微孔支持物的溶剂。

结合于固相支持物上的寡核苷酸磷酸酯或硫代磷酸酯上有pixyl或三苯甲基保护基，通常在5’-位置，可以用常规脱三苯甲基方法去除，例如用二氯乙酸溶液处理。二氯乙酸优选以溶液形式使用，其中溶剂是溶胀微孔支持物的溶剂，例如二氯甲烷或优选地和酰胺，特别是二甲基甲酰胺或N-甲基吡咯烷酮。去除pixyl或三苯甲基保护基产生游离羟基，然后它可用于进一步偶联。为组装预期序列可进行进一步偶联。预期序列组装完成后，可用所用连接适用的方法从固相支持物上切除产物。

根据本发明的方法可用于合成硫代磷酸脱氧核糖核酸和核糖核酸。核苷酸可含有碱基、保护基和核苷酸领域已知的其它修饰。例如，碱基可以是嘌呤和嘧啶，通常是A、G、T、C和U。可以使用的其它碱基包括次黄嘌呤、肌苷和2，6-二氨基嘌呤。可能的保护基包括碱基保护基，如苯甲基、乙酰基、苯氧乙酰基和异丁酰基，和羟基保护基，如pixyl和三苯甲基，尤其是二甲氧基三苯甲基。核糖核苷酸可用烷氧基或烷氧烷基取代基在2’-位修饰，如甲氧基或甲氧乙氧基取代基，或可在2’-位由羟基保护基保护，如叔丁基二甲基甲硅烷基，1-(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基(Fpmp)或1-(2-氯苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基(Cpmp)。也可存在其它修饰，包括反向核苷、脱碱基核苷和L-核苷。脱氧核糖核苷酸可在2’-位被2’-C-烷基修饰。可以制备嵌合型核苷酸，包括混合脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸，和/或混合磷酸/硫代磷酸核苷酸。

在很多实施方案中本发明的方法用于制备1到100个核苷间连接的寡核苷酸，经常是5到75，优选8到50，特别优选10到30个核苷间连接。通常本发明方法用于制备这些化合物，其中至少50％的核苷间连接是硫代磷酸，优选至少75％，最优选90到100％的硫代磷酸。

本发明方法中使用的可切除连接体的实例包括固相寡核苷酸合成领域熟知的类型，如氨基甲酸酯，乙二酰基，琥珀酰基和氨基衍生的连接体。优选琥珀酰基连接体。

将通过以下实施例说明本发明，这不是对本发明的限制。

实施例1-3和比较例A

含17个硫代磷酸基的全硫代磷酸化的脱氧核糖核苷酸样品用标准亚磷酰胺化学法制备。在聚苯乙烯支持物上生成带三苯甲基的产物。组装和硫化完成后，用乙腈洗涤支持物上的核苷酸。

按以下方法处理三个结合在支持物上的寡核苷酸样品。对于实施例1，结合于支持物上的寡核苷酸在过滤漏斗中空气干燥。对于实施例2，用三乙胺洗涤样品。对于实施例3，用2.5M乙酸钠水溶液洗涤样品。在实施例2和3的任一个中，洗涤在轻微负压下在过滤漏斗中进行，但操作时注意使乙腈蒸发最低。用GC测量样品中乙腈含量(％，w/w)。用标准氨解条件用浓氨水切除实施例1-3的产物得到寡核苷酸产物。对于比较例A，结合于支持物上的另一个寡核苷酸样品在相同条件下切除，但不经干燥或洗涤处理。对于每个实例用离子交换色谱确定样品中P＝0杂质的重量百分比。结果见下表1。

表1

样品	乙腈含量	％P＝0
			比较例A	33％	9％
实施例1	＜1％	5％
			实施例2	1％	5％
实施例3	9％	5％

表1中结果表明，与切除前不降低乙腈浓度的比较方法相比，由本发明方法产生的寡核苷酸(实施例1到3)得到显著更纯的寡核苷酸产物。

实施例4-用微孔支持物合成寡核苷酸

以下反应在氮气氛中进行。

肽合成中通常使用的40ml固相烧结玻璃/鼓泡反应器中含1g胺基官能化的聚丙烯酰胺树脂(载量1mmol/g)，树脂由PolymerLaboratories获得，商品名PL-DMA，向反应器中加入3当量的5’-DMT-T-3’-琥珀酸酯。加入足量N-甲基吡咯烷酮(NMP)使树脂在氮气搅动中刚好可移动，随后加入4当量二异丙基碳二亚胺和3当量二异丙基乙胺。用氮气搅动混合物直至由Kaiser试验表明树脂已完全负载。用NMP(5X床体积)和二氯甲烷(DCM，5X床体积)洗涤树脂。加10当量吡咯到DCM润湿的树脂中，然后加入15％v/v二氯乙酸(DCA)的DCM溶液(2X床体积)。用氮气搅动混合物1小时，然后用DCM(5X床体积)和NMP(5X床体积)洗涤，形成5’-脱保护的3’-与支持物结合的T。

向上述制备的结合于支持物上的T中加入3当量5’-DMT-T-3’-(β-氰基乙氧基二异丙基氨基)亚磷酰胺。加入足量NMP使树脂在氮气搅动下刚好可移动，随后再加3.3当量S-乙基四唑。氮气搅动混合物30分钟，然后用NMP(10X床体积)洗涤。存在足量NMP使树脂在氮气搅动下刚好可移动的条件下，用Beaucage试剂(5当量)硫化60分钟。用NMP(5X床体积)和DCM(5X床体积)洗涤树脂，形成5’-DMT保护的结合于支持物上的二聚体硫代磷酸酯。再重复两次脱三苯甲基、偶联和硫化循环，形成5’-DMT结合于支持物上的四聚体硫代磷酸酯。用上面给出的条件脱三苯甲基，从固相支持物上切除，然后用浓氨水溶液室温处理48小时去除β-氰乙基。

Claims (9)

1.一种制备寡核苷酸的方法，其中包括将核苷或寡核苷酸亚磷酰胺与支持于固相支持物上的含游离羟基的核苷或寡核苷酸偶联，形成寡核苷酸亚磷酸三酯，其特征在于固相支持物是聚丙烯酰胺微孔支持物。

2.根据权利要求1的方法，其中固相支持物是胺基官能化的支持物，它由丙烯酰-肌氨酸甲酯、N，N-二甲基丙烯酰胺和双-丙烯酰乙二胺共聚制备的支持物衍生。

3.根据权利要求2的方法，其中胺基官能化的支持物含有伯胺官能团，它衍生于甲基酯基团与烷基二胺的反应。

4.根据权利要求3的方法，其中所述的烷基二胺为乙二胺。

5.根据权利要求1的方法，其中寡核苷酸通过可切除连接体结合到固相支持物上，该连接体选自：氨基甲酸酯，乙二酰基，琥珀酰基和氨基衍生连接体。

6.根据权利要求1的方法，其中通过与切除剂接触从固相支持物上切除寡核苷酸，其中所述切除剂包括甲胺，甲胺水溶液，液氨，氨气或浓氨水溶液。

7.根据权利要求1的方法，其中所制备的寡核苷酸含1到100个核苷间连接。

8.根据权利要求1的方法，其中所制备的寡核苷酸具有的至少50％的核苷间连接是硫代磷酸。

9.根据权利要求8的方法，其中90到100％的核苷间连接是硫代磷酸。