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CN1236370A - 化学修饰的多肽 - Google Patents

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CN1236370A CN98801074A CN98801074A CN1236370A CN 1236370 A CN1236370 A CN 1236370A CN 98801074 A CN98801074 A CN 98801074A CN 98801074 A CN98801074 A CN 98801074A CN 1236370 A CN1236370 A CN 1236370A
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Abstract

本发明提供一种化学修饰的多肽,其中该多肽分子中的至少一个羟基被用聚亚烷基二醇衍生物修饰;一种制备该修饰多肽的方法;一种使用该修饰多肽的治疗方法;修饰多肽的用途;一种包含该修饰多肽的药物制剂;以及包含该修饰多肽的治疗组合物。

Description

化学修饰的多肽
技术领域
本发明涉及一种化学修饰的多肽，其中该多肽分子中的至少一个羟基被用聚亚烷基二醇衍生物修饰；一种制备该修饰多肽的方法；一种使用该修饰多肽治疗粒细胞或血小板减小病人的方法；一种包含该修饰多肽的用于治疗的组合物；以及该修饰多肽的用途。
背景技术
业已知其中多肽分子中的至少一个氨基、羧基、巯基或胍基被用聚亚烷基二醇衍生物修饰(WO95/023165)以及多肽分子中的半胱氨酸残基的游离巯基被修饰(EP0668353)的化学修饰的多肽。然而，当多肽分子中的至少一个氨基、羧基、巯基、胍基或半胱氨酸残基的游离巯基被用聚亚烷基二醇衍生物修饰时，多肽的活性可能显著增加或完全丧失。
例如，当其氨基被用聚乙二醇修饰时，白介素-15的活性完全消失[生物化学杂志，272:2312(1997)]。
对其中多肽分子中的至少一个羟基被用聚亚烷基二醇衍生物修饰的化学修饰的多肽了解甚微。
主要注意力针对开发(1)一种用于分析羟基对多肽活性的影响的方法，其中相关的羟基位于多肽的活性位点，(2)一种新的化学修饰方法，其中其可避免当多肽被用常规化学修饰方法处理时，多肽的生物活性被极大地破坏的可能的情况，以及通过该方法获得的化学修饰的多肽，和(3)一种新的可提高多肽对蛋白酶、冻融和变性剂的抗性的方法。
发明公开
本发明涉及一种化学修饰的多肽，其中该多肽分子中的至少一个羟基被用聚亚烷基二醇衍生物修饰；一种制备该修饰多肽的方法；一种使用该修饰多肽治疗粒细胞或血小板减小病人的方法；修饰多肽的用途；包含该修饰多肽的药物组合物；以及包含该修饰多肽的用于治疗的组合物。
对于可用于本发明的多肽，可使用任何多肽，只要它含有一个羟基并具有生理活性或药物活性。实例包括具有如天冬酰胺酶、谷氨酰胺酶、尿酸酶、超氧化物歧化酶、乳铁结合蛋白、链激酶、纤溶酶、腺苷脱氨酶、白介素-1至13、白介素-15、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、人粒细胞集落刺激因子(下文称为“hG-CSF”)等活性的那些。
具有hG-CSF活性的多肽的实例包括包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的多肽、包含该序列部分氨基酸序列的多肽、包含其中序列的某些部分的氨基酸被不同的氨基酸置换的氨基酸序列的多肽[自然，319:415(1986)，日本公开未审专利申请号267292/88、日本公开未审专利申请号299/88、WO87/01132]等。包含其中SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的某些部分的氨基酸被不同的氨基酸置换的氨基酸序列的多肽的具体实例(hG-CSF衍生物)示于表1中。表1
从N末端氨基酸开始的位置(具有SEQ ID NO:1的hG-CSF) 在各种hG-CSF衍生物中被置换的氨基酸
a) b) c) d) e) f) g) h) i) j) k) l)
    1st(Thr)3rd(Leu)4th(Gly)5th(Pro)17th(Cys)   *GluLysSerSer  ValIleArgSerSer  CysIleArgSerSer  TyrIleArgSerSer  ArgThrArgSerSer  *ThrArgSerSer  AsnGluArgSerSer  IleThrArgSerSer  SerThrArgSerSer      **Arg*Ser  AlaThrTyrArgSer      ****Ser
*未被置换的氨基酸
聚亚烷基二醇衍生物的实例包括聚乙二醇衍生物、聚丙二醇衍生物、聚乙二醇-聚丙二醇共聚物衍生物等。
可使用包括上面的聚亚烷基二醇衍生物的化学修饰剂制备本发明的被化学修饰的多肽，由下式(Ⅰ)所示的化合物可例举为优选的化学修饰剂。
化合物包括由下式代表的聚亚烷基二醇衍生物
R1-(M)n-X-R2    (Ⅰ)(其中R1代表烷基或烷酰基；M代表
-OCH2CH2-,-OCH2CH2CH2-或
(OCH2CH2)r-(OCH2CH2CH2)s(其中r和s相同或不相同，各自代表任意可变的正整数)；n为任意可变的正整数；X代表一个键、O、NH或S；以及R2代表<其中R3代表OH、卤素或
-Xa-(Ma)na-R1a)(其中Xa、Ma、R1a和na均分别具有与上面X、M、R1和n相同的含义)；和Y代表卤素或
-Z-(CH2)p-(O)m-W[其中Z代表O、S或NH；和W代表羧基或其活性衍生物或
Figure A9880107400082
(其中R4代表烷基，以及Hal代表卤素)；p为0-6的整数；和m为0或1]>，
-(CO)m-(CH2)t-W(其中t为0-6的整数；和m和w具有如上定义的相同的含义)，
Figure A9880107400083
(其中Hala、pa和R4a各自分别具有与上面Hal、p和R4相同的含义)，
Figure A9880107400084
(其中R3和W具有如上定义的相同含义)，(其中R3、t和W具有如上定义的相同含义)，(其中W具有如上定义的相同含义)，或
Figure A9880107400094
(其中R5代表其中一个氨基和一个羧基被从氨基酸中除去的残基；以及W具有如上定义的相同含义)｝。
对于由式(Ⅰ)代表的上述化合物，由R1、R4等代表的烷基的实例包括具有1-18个碳原子的直链或支链烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、异己基、庚基、辛基、异辛基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基等；由R1代表的烷酰基包括具有1-18个碳原子的直链或支链烷酰基，如甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、新酰基、戊酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基等。由R3、Y、Hal等代表的卤素的实例包括氯、溴和碘原子；由W等代表的羧基的活性衍生物的实例包括酰基卤、如酰基氯、酰基溴等。活性酯，为如对硝基苯基酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯等，以及含有碳酸单乙酯的混合酸酐、碳酸单异丁酯等；由R5代表的氨基酸的实例包括谷氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-丝氨酸、D-丙氨酸、D-缬氨酸、D-亮氨酸、D-丝氨酸、β-丙氨酸等。由n、r或s代表的正整数为1-20,000，对于n优选为50-5,000，对于r和s优选为1-5,000。
聚亚烷基二醇衍生物具有500-1,000,000的分子量，优选3,000-1,000,000。
在多肽分子中可存在多个羟基，当多肽被化学修饰时，化学修饰这些基团中的至少一个可能是足够的。
多肽分子中的羟基的实例包括丝氨酸或苏氨酸残基的羟基，优选丝氨酸残基的羟基。
可通过将化学修饰剂与具有羟基的多肽反应来对多肽进行化学修饰，其中化学修饰剂为如选自聚乙二醇衍生物、聚丙二醇衍生物、聚乙二醇-聚丙二醇共聚物衍生物等的聚亚烷基二醇衍生物。
将多肽分子中的羟基与化学修饰剂如聚乙二醇衍生物或聚丙二醇衍生物反应的方法的实例包括描述在日本公开未审专利申请号316400/89，生物技术通讯，14:559-564(1992)，生物/技术，8:343-346(1990)等中的方法以及其改进方法。即，可使用的方法的具体实例包括将聚乙二醇衍生物或聚丙二醇衍生物加入到被调至pH6-10的为1-200摩尔蛋白量的蛋白水溶液中并在0-37℃的温度下让其反应1小时-3天的方法。
将多肽分子中的羟基与聚乙二醇衍生物-聚丙二醇共聚物的衍生物反应的方法的实例包括描述在日本公开未审专利申请号59629/84、日本公开未审专利申请号176586/85、WO89/06546、EP0539167A2等中的方法以及其改进方法。即，可使用的的方法的具体实例包括将选自聚乙二醇-聚丙二醇共聚物衍生物的化学修饰剂加入到被调至pH6-10的为1-200摩尔蛋白量的蛋白水溶液中并在0-37℃的温度下让其反应1小时-3天的方法。
通过上面方法用聚亚烷基二醇衍生物修饰多肽分子中的至少一个羟基可提供(1)在相关的羟基位于多肽的活性位点的情况下，一种用于分析羟基对多肽活性的影响的方法，(2)当多肽被用常规化学修饰法处理时，一种可避免多肽生物活性减弱的新的化学修饰法，以及由该方法获得的化学修饰的多肽，和(3)一种新的可提高多肽对蛋白酶、冻融或变性剂抗性的方法，以及具有增加的抗蛋白酶、冻融或变性剂抗性的化学修饰的多肽。
被作为本发明具体描述的化学修饰的多肽的一个实例为具有hG-CSF活性的多肽。
其中hG-CSF或hG-CSF衍生物中的至少一个羟基被用由下式(Ia)或(Ib)代表的化学修饰剂进行化学修饰的化学修饰的多肽可例举为本发明的化学修饰的多肽。
化学修饰剂(Ia)：
R1-(OCH2CH2)n-X-R2a    (Ia){其中R1、n和X具有如上定义的相同含义；以及R2a代表
Figure A9880107400111
[其中R3a代表OH、卤素或
-Xb-(CH2CH2O)nb-R1b(其中Xb、R1b和nb各自分别具有如上面X、R1和n的相同含义)]}。
化学修饰剂(Ib)：(其中R1、M、R3、Z、n和p具有如上定义的相同含义；以及Wa代表羧基或其活性衍生物)。
至少一个聚乙二醇衍生物、聚丙二醇衍生物或聚乙二醇-聚丙二醇共聚物衍生物与化学修饰的hG-CSF或化学修饰的hG-CSF衍生物结合。因此，化学修饰的hG-CSF或化学修饰的hG-CSF衍生物可以混合物形式或通过分离一个或多个分子与其相连的化合物来使用。
可使用各种类型的层析法来进行化学修饰的hG-CSF或化学修饰的hG-CSF衍生物的分离，如离子交换层析、凝胶过滤层析、反向层析、疏水层析等，以及通常用于长链多肽等的分离的硫酸铵分级分离等方法。
通过使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)方法监测化学修饰的hG-CSF的迁移率的变化可确定化学修饰的程度。
根据本发明的多肽的含量可通过下面分析方法来测定。分析方法1：
通过Lowry的方法[Lowry O.H.等生物化学杂志，193:265(1951)]测定多肽的含量。分析方法2：
根据Laemmli的方法[U.K.Laemmli，自然，227:680(1970)]，通过进行SDS-PAGE，用考马斯亮兰染色在凝胶上被分离的多肽以及接着用层析扫描仪(CS-930,Shimadzu公司)测定来计算多肽含量。
本发明的化学修饰的多肽可以其本身或以各种剂量的制剂形式使用。
本发明的药物制剂可通过将有效量的作为活性成分的化学修饰的多肽均匀地与药学上可接受的载体混合来制备。这些药物制剂优选为适宜于注射给药的单剂形式。
可使用化学活性多肽和包括蒸馏水、盐溶液、葡萄糖或盐溶液与葡萄糖的混合物的载体来制备溶液形式的注射剂。还以常规方式使用适宜助剂将它们制成溶液剂、悬浮剂或分散剂。也可通过冷冻干燥溶液而将它们制成冷冻干燥制剂。虽然冷冻干燥条件没有特别限制，但通常通过在-50℃或更低时冷冻1-5小时，在50-150毫乇的真空度下，在-20℃-0℃的贮存温度下干燥24-48小时并接着在50-100毫乇的真空度下，在10℃-30℃的贮存温度下干燥16-24小时来获得冷冻干燥产物。
而且，化学小时多肽制剂可含有各种常用的药物载体、填料、稀释剂、稳定剂、防吸附剂等。
在为本发明的化学修饰的多肽，例如含有化学修饰的hG-CSF或化学修饰的hG-CSF衍生物的嗜中性粒细胞和凝血细胞生长增强性制剂的情况下，根据给药方式、各病人的年龄和体重、治疗的疾病以及各病人的疾病情况来决定其剂量和给药方式；然而，每个成人通常每周以15μg-1.5mg，优选25-500μg的量给药1-7次含有化学修饰的hG-CSF或化学修饰的hG-CSF衍生物的药物制剂。
本发明的化学修饰的多肽制剂的给药方法的实例包括静脉注射、皮下注射等以及以栓剂或鼻滴剂形式的给药。
下面，通过试验实施例描述本发明的化学修饰的多肽的药物活性。试测试例
化学修饰的hG-CSF或化学修饰的hG-CSF衍生物对小鼠白血病细胞NFS60的生长促进活性：
根据Asano等的方法[Yakuri to Chiryo,19:2767(1991)]测定在后面将描述的参考实施例和实施例5,14,17和20中获得的G-CSF衍生物、化学修饰的hG-CSF和化学修饰的hG-CSF衍生物的增强小鼠白血病细胞NFS60生长的活性[K.Holmes等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:6687(1985)]。让表2-1和2-2所示的各种浓度的每一种化合物作用于细胞，结果也示于表2-1和2-2中。表2-1
    化合物     浓度   NFS60细胞生1长促进活性
                     (ng/ml)  (％)*1
参考例1的hG-CSF衍生物 12.5    100实施例5的取代物1      12.5    100实施例5的-取代物2     12.5    100实施例5的二取代物     12.5    100实施例5的三取代物1    12.5    72实施例5的三取代物2    12.5    93
 hG-CSF                5      100实施例14的一取代物1    5      86实施例14的一取代物2    5      81实施例14的二取代物     5      81
*1：通过根据参考实施例1中获得的hG-CSF衍生物(12.5ng/ml)的活性(=100)或
hG-CSF(5ng/ml)的活性的相对值(％)表示。
                            表2-2
    化合物    浓度    NFS60细胞生长促进活性(ng/ml)       (％)*1
参考例1的hG-CSF衍生物  25    100实施例17的三取代物1    25    92实施例17的三取代物2    25    80实施例17的二取代物     25    99实施例20的三取代物1    25    65实施例20的三取代物2    25    73实施例20的二取代物     25    98
*1：通过根据参考实施例1中获得的hG-CSF衍生物(25ng/ml)的活性(=100)的相对值(％)表示测试例2在全身辐射小鼠中的促进血小板减少症恢复的作用：
通过137Cs辐射源(RI-433,Toshiba制造)，使用3Gy/小鼠对每组4只雄性BALB/c小鼠(6周龄)进行全身辐射(下文称为“全身辐射”)，并接着饲养在为特定的无病原体(SPF)的饲养环境的装置的干净支架上。对它们随意提供饮用水和饲料。作为未处理的对照组，将未辐射的小鼠以与其类似的方式饲养。
将在后面将描述的实施例4中获得的各种化学修饰的hG-CSF衍生物溶解在生理盐水中，在全身辐射的第二天以5μg/0.2ml/动物的剂量经皮下对小鼠给药一次化学修饰的hG-CSF衍生物溶液。
从小鼠眼底静脉定期收集血样以通过自动血细胞计数器(CC-180A,Toa Iyo Denshi制造)测定血小板的数目。结果示于表3。
在用3Gy的全身辐射处理的小鼠中，观察到血小板数目的显著减少，并且在全身辐射后8-9天时血小板的数目变得最低，接着逐渐增加，但未恢复到辐射处理前的水平。另一方面，在给药了化学修饰的hG-CSF衍生物的小鼠中，血小板数目的减少被抑制，且在第8或9天时或之后，血小板的数目显著增加，在第11或12天时完全恢复到辐射处理前的同等水平。在全身辐射的第二天或第5天进行给药的组中观察到类似作用。
                              表3
化学修饰的hG-CSF衍生物               血小板的平均数    (％)*1
辐射后的天数  0      6       8       10      11      12
未给药 100    58.9    26.6    35.1    38.3    45.1
实施例4的二取代物 100    55.1    30.5    62.7    98.5   103.6
*1：通过根据全身辐射来处理对照组中的血小板的平均数(=100)的相对值(％)表示测试例3小鼠中的白细胞增加作用：
使用在从日本Charles River购得后被初步饲养的SPF/VAF小鼠(BALB/cAnNCri系，雄性，8周龄，4只动物/组)，证实了正常小鼠中的白细胞增加活性。
用生理盐水将实施例5获得的二取代物(0.34mg/ml)稀释至100或10μg/ml，以10μl/g(小鼠体重)的比例经皮下给药一次。因此，剂量为1或0.1mg/kg。作为对照组，经皮下给药一次生理盐水。给药前以及从给药后的第二天定期收集血样，使用自动血细胞计数器(Sysmex F800)测定外周血细胞数目。
结果，在给药后2天时，两组给药组中白细胞的数目增加至比对照组高2.4-2.6倍的水平。此后，在0.1mg/kg的给药组中，这种药效减弱并在给药后4天时回到对照组的类似水平，但是，甚至在给药后2天时，1mg/kg给药组中的白细胞数目继续增加，在给药后4天时达到比对照组高3.5倍的水平。此后，在给药后7天时数目恢复到与对照组类似的水平。
实施例和参考例示于下文中。实施发明的最好方式实施例1聚乙二醇修饰的hG-CSF衍生物反应溶液的制备：
用磷酸盐缓冲液(pH7.5)将参考例1中制备的hG-CSF衍生物调至4.6mg/ml，并将12ml被如此调节的溶液与205.5mg一甲氧基聚乙二醇丙酸的N羟基琥珀酰亚胺酯(M-SPA-20,000,ShearwaterPolymer制造)混合，4℃下将混合物搅拌一整昼夜以制备聚乙二醇修饰的hG-CSF衍生物反应溶液(1)。实施例2聚乙二醇修饰的hG-CSF衍生物反应溶液的制备：
用磷酸缓冲液(pH7.5)将参考实施例1中制备的hG-CSF衍生物调至4.6mg/ml，并将12ml如此调节的溶液与469.8mg羧甲基一甲氧基聚乙二醇的N-羟基琥珀酰亚胺酯(M-SCM-20,000,ShearwaterPolymer制造)混合，4℃下将混合物搅拌一整昼夜以制备聚乙二醇修饰的hG-CSF衍生物反应溶液(2)。实施例3聚乙二醇修饰的hG-CSF衍生物反应溶液的制备：
用磷酸缓冲液(pH7.5)将参考例1中制备的hG-CSF衍生物调至4.6mg/ml，并将6.6ml如此调节的溶液与96.9mg一甲氧基聚乙二醇丙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(M-SSPA-20,000,ShearwaterPolymer制造)混合，4℃下将混合物搅拌一整昼夜以制备聚乙二醇修饰的hG-CSF衍生物反应溶液(3)。实施例4聚乙二醇修饰的成分的分离：
将实施例2中制备的聚乙二醇修饰的hG-CSF衍生物反应溶液(2)(蛋白含量为55mg)用20mM含有150mM氯化钠的乙酸盐缓冲液(pH4.5)稀释5倍，将其通过用已事先用相同缓冲液平衡的填充有Sephacryl S-400(Pharmacia制造)的柱，并将洗脱液分级分离。通过此操作，获得主要含有被两分子聚乙二醇修饰的成分(二取代物)的级分以及主要含有被一分子聚乙二醇修饰的成分(一取代物)的粗级分。
将各种级分通过用TSK凝胶G4000SWXL(7.8mm I.D.×300mm,Tosoh公司制造)填充的柱以获得含有二取代物或一取代物的级分。此后，在下面条件下，用SP-5PW(21.5mmI.D.×150mm,Tosoh公司制造)纯化各种级分以获得一种二取代物为主成分的级分(0.39mg/ml×3.0ml)和一种一取代物为主成分的级分(0.55mg/ml×3.0ml)。SP-5PW纯化条件：
柱：SP-5PW(21.5mm I.D.×150mm)(Tisoh公司制造)
检测：280nm
溶液A:20mM乙酸盐缓冲液(pH4.5)
溶液B：含有0.5M氯化钠的20mM乙酸盐缓冲液(pH4.5)
洗脱：用溶液A至溶液B的线性密度梯度洗脱实施例5聚乙二醇修饰的成分的分离：
将实施例1中制备的聚乙二醇修饰的hG-CSF衍生物反应溶液(1)(蛋白含量为55mg)用20mM含有150mM氯化钠的乙酸盐缓冲液(pH4.5)稀释5倍，将其通过用已事先用相同缓冲液平衡的填充有Sephacryl S-400(Pharmacia制造)的柱，并将洗脱液分级分离。通过此操作，获得含有被三分子聚乙二醇修饰的成分(三取代物)的级分以及含有被二分子聚乙二醇修饰的成分(二取代物)的粗级分和含有被一分子聚乙二醇修饰的成分(一取代物)的粗级分。
将各种级分通过用TSK凝胶G4000SWXL(7.8mm I.D.×300mm,Tosoh公司制造)填充的柱以获得含有三取代物、二取代物或一取代物的级分。此后，在如实施例4描述的相同条件下，使用阳离子交换柱SP-5PW(Tosoh公司制造)纯化各种级分以获得两种三取代物为主成分的级分(三取代物1:1.4mg/ml×0.5ml，三取代物2:1.0mg/ml×0.8ml)，一种二取代物为主成分的级分(0.34mg/ml×3.0ml)和两种一取代物为主成分的级分(一取代物1:0.48mg/ml×0.4ml，一取代物2:1.58mg/ml×0.5ml)。
如在后面实施例中将描述的，从一取代物1N末端算起的66位Ser的羟基和一取代物2的N末端Met被一分子聚乙二醇修饰。实施例6聚乙二醇修饰的成分的分离：
将实施例3中制备的聚乙二醇修饰的hG-CSF衍生物反应溶液(3)(蛋白含量为30mg)用20mM含有150mM氯化钠的乙酸盐缓冲液(pH4.5)稀释5倍，将其通过用已事先用相同缓冲液平衡的填充有Sephacryl S-400(Pharmacia制造)的柱，并将洗脱液分级分离。通过此操作，获得含有被二分子聚乙二醇修饰的成分(二取代物)的粗级分。
将该级分通过用TSK凝胶G4000SWXL(7.8mm I.D.×300mm,Tosoh公司制造)填充的柱以获得含有二取代物的级分。
在如实施例4描述的相同条件下，使用阳离子交换柱SP-5PW(Tosoh公司制造)纯化由此获得的级分以获得一种三取代物为主成分的级分(0.43mg/ml×3.0ml)。实施例7hG-CSF衍生物的肽作图：
用磷酸缓冲液(pH7.5)将参考实施例1中制备的hG-CSF衍生物调至2mg/ml，在“蛋白质和多肽的高效液相色谱(Ⅱ),Kagaku Zokan117(153-160(1990)；由Kagaku Zokan公开)”中描述的条件下，用V8蛋白酶(Seikagaku Kogyo制造)处理1.0ml一份的如此调节的溶液，接着将50μl如此处理的溶液注射到HPLC中以在下面条件下进行HPLC分析。HPLC分析的条件：
柱：PROTEIN & PEPTIDE C18(4.6mm I.D.×250mm)(VYDAC)
溶液A:0.1％三氟乙酸
溶液B:90％的含有0.1％三氟乙酸的乙晴
洗脱：从溶液A至溶液B的线性密度梯度洗脱
检测：215nm
流速：0.5ml/分钟
在用V8蛋白酶消化的hG-CSF衍生物的分析图谱中发现9个峰。当分离各个峰并对其分子量进行分析时，这些峰被确定为如表4所示。
           表4通过V8蛋白酶的对hG-CSF衍生物的肽作图
                    分析的分子量峰号   肽片段       (计算值)*(加入Na)
    1    94-9 8    524.5*(502)2    20-33     1512.8(1514)3    34-46     1648.8(1649)4    163-174   1438.9(1440)5    -1-19     2241.7(2241)6    124-162   4028.0(4029)7    105-123   2263.8*(2240)8    47-93     5060.5(5060)9    99-123    2836.9(2836)
实施例8通过肽作图对聚乙二醇结合位点的推断：
通过与实施例7中描述的hG-CSF衍生物肽作图的类似方法，将实施例5中获得的各种一取代物1、一取代物2、二取代物、三取代物1和三取代物2用蛋白酶消化。
结果，在实施例5中获得的各种一取代物1、一取代物2、二取代物、三取代物1和三取代物2中发现特定峰消失或显著降低(表5)。
                    表5
纯化的聚乙二醇修饰的hG-CSF衍生物成分的肽作图
        (与未修饰的hG-CSF衍生物比较)
    成分     消失或显著降低的峰号
实施例5的一取代物1实施例5的一取代物2实施例5的二取代物实施例5的三取代物1实施例5的三取代物2           855,    83,    5,    83,    5,    8
现认为当与实施例7的hG-CSF衍生物的分析图谱比较时，与聚乙二醇连接的肽片断的HPLC峰将发生变化。根据表4的结果，在为如实施例5所示的一取代物1、二取代物、三取代物1和三取代物2情况下，推测聚乙二醇的结合部位为至少一个对应于hG-CSF衍生物的-1-19个氨基酸残基片段(峰5)的肽残基(包括N末端氨基基团)。
对于一取代物2，发现一取代物2的N末端Met残基被一分子的聚乙二醇修饰，因为当使用由Shimadzu公司制造的蛋白质测序仪PPSQ-10测定序列时未观察到其N-末端序列。
对于三取代物1和三取代物2，推测聚乙二醇还与至少一个对应于hG-CSF衍生物的34-46个氨基酸残基片段(峰3)的肽残基(包括Lys的氨基基团)结合。
此外，由于在各种一取代物1、二取代物、三取代物1和三取代物2中峰8消失或明显降低，因此推测聚乙二醇还与对应于各种成分的47-93个氨基酸残基片段的一个肽残基(除开赖氨酸等的游离氨基基团)结合。实施例9通过肽作图对聚乙二醇结合位点的推断：
通过与实施例7中描述的hG-CSF衍生物肽作图的类似方法，将实施例6中获得的二取代物级分用蛋白酶消化。
当与实施例7的hG-CSF衍生物的分析图谱比较时，在实施例6获得的二取代物中发现表6所示的特定峰消失或显著降低。
                    表6
纯化的聚乙二醇修饰的hG-CSF衍生物成分的肽作图
       (与未修饰的hG-CSF衍生物比较)
成分                   消失或显著降低的峰号实施例5的二取代物                  5,8
预测当与实施例7的hG-CSF衍生物的分析图谱比较时，与聚乙二醇连接的肽片断的HPLC峰将发生变化。根据类似于实施例8的情况的表5的结果，在如实施例6所示的二取代物的情况下，推测聚乙二醇的结合位点为对应于hG-CSF衍生物的-1-19个氨基酸残基片段的肽残基(包括N-末端氨基基团)和对应于hG-CSF衍生物的47-93个氨基酸残基片段的肽残基(除开Lys等的游离氨基基团)。实施例10通过肽作图的对聚乙二醇结合位点的判断：
通过与实施例7和8类似的方式的肽作图测定通过类似于实施例4的方法获得的二取代物的聚乙二醇结合位点。在如实施例4所示的二取代物的情况下，推测聚乙二醇还与对应于hG-CSF衍生物的-1-19个氨基酸残基片段的肽残基(包括N-末端氨基基团)和对应于hG-CSF衍生物的47-93个氨基酸残基片段的肽残基(除开Lys等的游离氨基基团)结合。实施例11聚乙二醇修饰的肽的纯化
为了测定在对应于hG-CSF衍生物或hG-CSF的47-93位点的氨基酸残基并不含游离氨基的肽片段中的聚乙二醇结合的氨基酸残基，通过下面方法从二取代物组分中分离聚乙二醇结合肽片段，其中这些残基为在实施例4,5,6的二取代物、实施例5的三取代物1和三取代物2、实施例5的一取代物、实施例14的一取代物1和二取代物、实施例17的二取代物、三取代物1和三取代物2或实施例20的二取代物、三取代物1和三取代物2中证实的聚乙二醇结合位点。
即，以类似于实施例5的方法，通过阳离子交换层析柱SP-SPW，从用类似于实施例1的方法制备的聚乙二醇修饰的hG-CSF衍生物反应溶液中获得30ml含有二取代物作为主成分的级分(蛋白浓度为2.2mg/ml)。接着将其用嗜热芽孢茵蛋白酶(Sigma制造)。使用凝胶过滤柱(Sephacryl S-300,Pharmacia制造)，分级分离酶反应溶液以获得所需的与聚乙二醇结合的肽级分(约30mg)。
肽级分的质谱法(MALDI-TOFMS)结果为22155.89(M+H)，氨基酸分析的结果显示Ser 2.7(3),Pro 1.0(1),Leu 1.0(1)和Cys 0.9(1)。
根据质谱法和氨基酸分析的结果，推断通过上面方法分离的样品为其中聚乙二醇与hG-CSF衍生物的61位残基至66位残基肽[亮氨酰丝氨酰丝氨酰半胱氨酰脯氨酰丝氨酰(亮氨酰丝氨酰丝氨酰-S-酰氨基甲基半胱氨酰脯氨酰丝氨酸)残基]结合的片段。实施例12通过1H-NMR对聚乙二醇结合位点的测定：
通过肽固相合成法(PSSM 8,Shimadzu公司)合成对应于hG-CSF衍生物的61-66位氨基酸残基的肽LeuSerSerCysProSer(亮氨酰丝氨酰丝氨酰半胱氨酰脯氨酰丝氨酸)并在如“蛋白质和肽的高效液相色谱(Ⅱ),Kagaku Zokan 117(153-160(1990)；Kagaku Dojin公开)”所示条件下将其酰氨基甲基化，接着通过反向HPLC纯化酰氨基甲基化的肽(亮氨酰丝氨酰丝氨酰-S-酰氨基甲基半胱氨酰脯氨酰丝氨酸)。将0.6mg一份的酰氨基甲基化肽溶解在氘取代的二甲亚砜(d6-DMSO)中以进行1H-NMR分析(500MHz)。用类似方法，使用20mg实施例11获得的聚乙二醇结合肽进行1H-NMR分析。各分析中观察到的质子的化学位移(除开来源于聚乙二醇的那些)示于表7和8中。从这些结果中，证实所有来自于三个Ser的γOH基团的质子在于通过合成获得的酰氨基甲基化的肽中。另一方面，除开来源于聚乙二醇的质子信号，在实施例11获得的聚乙二醇结合肽中观察到一些现象，即未观察到来源于hG-CSF衍生物的66位Ser残基的γOH基团的质子，相同Ser残基的β质子位移至约低0.6ppm的磁场中以及与其它酰氨基质子相比，相同的Ser残基的酰氨基质子产生宽的信号。根据上面的结果，证实聚乙二醇的结合位点为hG-CSF衍生物的66位Ser残基。
                表7
在合成的酰氨基甲基化的肽的NMR分析中的
          质子的化学位移(ppm)残基    NH     CαH    CβH           其它Leu61  8.06    3.86  1.52,157    γH1.67,δCH30.92Ser62  8.66    4.47  3.57,364    γOH5.13
   8.66    4.49  3.63        γOH5.04Ser63  8.03    4.32  3.58        γOH4.85
   8.06    4.32  3.57        γOH4.80Cys64  8.19    4.68  2.63,2.96    CH23.12,NH2 7.05,7.42
   7.97    4.60  2.63,2.90    CH23.12,NH27.10,7.45Pro65          4.42  1.91,2.02   γH1.86,δH3.61
           4.80  1.98,2.20   γH1.83,δH3.45,3.40Ser66  7.98    4.23  3.60,3.70   γOH4.94
   8.40    4.24  3.80,3.72   γOH4.90斜体形式代表Cis-Pro.
                           表8在从聚乙二醇修饰的hG-CSF衍生物分离的聚乙二醇修饰的肽的NMR分析中的质子
              的化学位移(ppm，除开聚乙二醇部分)残基    NH        CαH           CβH               其它Leu61             3.66         1.44,1.56      γH1.70, δCH30.90
              3.73         1.47,1.60      γH1.67, δCH30.90Ser62  8.51      4.43          3.57,3.64      γOH5.17
   8.90      4.37          3.64Ser63  8.03      4.30          3.60           γOH4.85
   8.06      4.21          3.58,3.63Cys64  8.18      4.68          2.6 8,3.03     CH23.12, NH27.02,7.43
   8.08      4.62          2.67,2.90      CH23.12, NH27.02,7.62Pro65            4.33          1.87,2.02      γH1.86, δH3.67
             4.60          2.12,2.04      γH1.72, 1.83,δH3.40,3.52Ser66  7.88      4.28          4.17,4.32
   7.66      4.21          4.16,4.46斜体形式代表Cis-Pro实施例13聚乙二醇修饰的hG-CSF衍生物反应溶液的制备：
将用磷酸缓冲液(pH7.5)制备的一份4.0ml的4.0mg/ml hG-CSF衍生物溶液与83g一甲氧基聚乙二醇丙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(M-SPA-20,000,Shearwater Polymer制造)混合，4℃下将混合物搅拌一整昼夜。实施例14聚乙二醇修饰的成分的分离：
将实施例13中制备的聚乙二醇修饰的hG-CSF衍生物反应溶液(蛋白含量为16mg)用20mM含有150mM氯化钠的乙酸盐缓冲液(pH4.5)稀释5倍，将其通过用已事先用相同缓冲液平衡的填充有SephacrylS-400(Pharmacia制造)的柱，并将洗脱液分级分离。通过此操作，获得主要含有被两分子聚乙二醇修饰的成分(二取代物)的级分以及主要含有被一分子聚乙二醇修饰的成分(一取代物)的粗级分。将各种级分通过用TSK凝胶G4000SWX1,(7.8mm I.D.×300mm,Tosoh公司制造)填充的柱以获得含有二取代物或一取代物的级分。此后，用SP-5PW(21.5mm I.D.×150mm,Tosoh公司制造)纯化各种级分以获得一种二取代物为主成分的级分(0.61mg/ml×0.6ml)和两种一取代物为主成分的级分(一取代物1:0.46mg/ml×1.0ml，一取代物2:0.61mg/ml×0.7ml)。实施例15通过肽作图的对聚乙二醇结合位点的判断：
通过与实施例7中描述的hG-CSF衍生物肽作图的类似方法，将实施例14获得的各种一取代物1、一取代物2、二取代物用蛋白酶消化。
结果，当与实施例8中发现的hG-cSF的分析图谱比较时，发现特定峰的消失或显著降低。
根据与实施例8类似的方法，推断聚乙二醇的结合位点如下：一取代物1：
该位点位于对应于由SEQ ID NO:1代表的氨基酸序列的47-93位残基的肽片段中(不包括Lys等的游离氨基基团)，并根据实施例12描述的方法，证实从N末端算起的66位Ser的羟基基团被一分子聚乙二醇修饰。一取代物2：
该位点位于对应于由SEQ ID NO:1代表的氨基酸序列的-1-19位残基的肽片段中(包括N末端氨基基团)，并根据实施例7描述的方法，证实N末端Met被一分子聚乙二醇修饰。二取代物：
对应于由SEQ ID NO:1代表的氨基酸序列的-1-19位残基的肽片段(包括N末端氨基基团)，以及对应于47-93位残基的肽片段(不包括Lys等残基的游离氨基基团)。实施例16聚乙二醇修饰的hG-CSF衍生物反应溶液的制备：
用磷酸缓冲液(pH7.2)将参考实施例1中制备的hG-CSF衍生物调至0.9mg/ml以获得600ml的调节溶液。在冰浴冷却的同时，将如此获得的溶液与8.7g通过与参考例2类似的方法获得的2,4-双(邻甲氧基-聚乙二醇)6-(3羧基丙基氨基)-s一三嗪的N-羟基琥珀酰亚胺酯混合，4℃下将混合物搅拌48小时以制备聚乙二醇修饰的hG-CSF衍生物反应溶液(4)。实施例17聚乙二醇修饰的成分的分离：
将通过与实施例16类似的方法获得的聚乙二醇修饰的hG-CSF衍生物反应溶液(4)(蛋白含量为40mg)通过用已事先用20mM含有150mM氯化钠的乙酸盐缓冲液(pH4.5)平衡的填充有Sephacryl S-400(Pharmacia制造)的柱，并将洗脱液分级分离。通过此操作，获得含有被三分子聚乙二醇修饰的成分(三取代物)的粗级分以及含有被二分子聚乙二醇修饰的成分(二取代物)的粗级分。
以类似于实施例4的方法，使用阳离子交换柱SP-5PW(Tosoh公司制造)纯化各种级分以获得两种三取代物为主成分的级分(三取代物1:0.49mg/ml×1.3ml，三取代物2:0.57mg/ml×1.5ml)和一种二取代物为主成分的级分(1.94mg/ml×1.2ml)。实施例18通过肽作图的对聚乙二醇结合位点的判断：
通过与实施例7和8中描述的肽作图类似的方式测定在实施例17中获得的二取代物、三取代物1和三取代物2的聚乙二醇结合位点。
还在实施例17所获得的的二取代物、三取代物1和三取代物2中，推测聚乙二醇与对应于hG-CSF衍生物的-1-19位残基的肽片段(包括N-末端氨基基团)和对应于hG-CSF衍生物的47-93位残基的肽片段(不包括Lys等的游离氨基基团)结合。在三取代物1和三取代物2中，推测聚乙二醇还与至少一个对应于hG-CSF衍生物的34-46位残基(峰3)的肽片段(包括Lys的氨基基团)结合。实施例19聚乙二醇修饰的hG-CSF衍生物反应溶液的制备：
用磷酸缓冲液(pH7.3)将参考实施例1中制备的hG-CSF衍生物调至0.9mg/ml以获得560ml的调节溶液。在冰浴冷却的同时，将如此获得的溶液与22.4g通过与参考例4类似的方法获得的2,4-双(邻甲氧基-聚乙二醇)-6-(3羧基丙基氨基)-s一三嗪的N-羟基琥珀酰亚胺酯混合，4℃下将混合物搅拌48小时以制备聚乙二醇修饰的hG-CSF衍生物反应溶液(5)。实施例20聚乙二醇修饰的成分的分离：
将通过与实施例19类似的方法获得的聚乙二醇修饰的hG-CSF衍生物反应溶液(蛋白含量为15mg)通过用已事先用20mM含有150mM氯化钠的乙酸盐缓冲液(pH4.5)平衡的填充有Sephacryl S-400(Pharmacia制造)的柱，并将洗脱液分级分离。通过此操作，获得含有被三分子聚乙二醇修饰的成分(三取代物)的粗级分以及含有被二分子聚乙二醇修饰的成分(二取代物)的粗级分。
以类似于实施例4的方法，使用阳离子交换柱SP-5PW(Tosoh公司制造)纯化各种级分以获得两种三取代物为主成分的级分(三取代物1:3.53mg/ml×0.4ml，三取代物2:0.26mg/ml×2.1ml)和一种二取代物为主成分的级分(0.84mg/ml×1.2ml)。实施例21通过肽作图对聚乙二醇结合位点的判断：
通过与实施例7和8中描述的肽作图类似的方法测定实施例20中获得的二取代物、三取代物1和三取代物2的聚乙二醇结合位点。还在实施例20所获得的的二取代物，三取代物1和三取代物2中，推测聚乙二醇与对应于hG-CSF衍生物的-1-19位残基的肽片段(包括N-末端氨基基团)和对应于hG-CSF衍生物的47-93位残基的肽片段(不包括Lys等的游离氨基基团)结合。在三取代物1和三取代物2中，推测聚乙二醇还与至少一个对应于hG-CSF衍生物的34-46位残基的肽片段(包括Lys的氨基基团)结合。实施例22化学修饰的多肽的蛋白酶抗性：
将实施例14获得的0.5ml一份的两种以一取代物为主成分的级分通过已用10mM磷酸缓冲液(pH5.0)平衡的凝胶过滤柱[SephadexG-25(NAP-5,Amersham Pharmacia制造)]，以1.0ml一份回收洗脱液液。
将由此回收的各种级分用10mM磷酸缓冲液(pH5.0)稀释以将蛋白质浓度调至0.2mg/ml。
将2ml一份的各种稀释级分与0.2mg/ml嗜热芽孢菌蛋白酶混合(酶/底物比例=1/50),30℃下，让混合物发生反应。
以100μl一份定期从反应溶液中收集样品并与2μl乙酸混合以终止反应。
使用50μl各种反应终止样品，在下面条件下进行HPLC分析：
柱：TSK凝胶G4000SWxL(7.8mm I.D.×300mm)(Tosoh制造)
检测：280nm
流动相：150mM NaCl/20mM乙酸钠缓冲液(p4.5)
流速：0.8ml/分钟
一取代物1和2在12分钟的保留时间处被洗脱。当用嗜热芽孢茵蛋白酶水解这些一取代物时，在12分钟的位置发现检测峰降低，这样可证实嗜热芽孢菌蛋白酶对这些一取代物的水解程度。
表9表明从在12分钟位置发现的检测峰的降低比例而计算的一取代物的剩余比例的周期性变化。
                                表9
                     抗嗜热芽孢菌蛋白酶的稳定性
    反应时间(hr)     实施例14的一取代物1  实施例14的一取代物2
    01523          1009589         1007268
从表9所示结果发现其中Ser被聚乙二醇修饰的一取代物1比其中N末端被修饰的一取代物2对嗜热芽孢茵蛋白酶更具有抗性。实施例23化学修饰的多肽的抗冻融的稳定性：
将实施例5获得的1ml一份的每两种一取代物成分通过已用5mM乙酸钠缓冲液(pH4.5)或5mM乙酸钠缓冲液(pH5.0)平衡的两个凝胶过滤柱[Sephadex G-25(NAP-10,Amersham Pharmacia制造)]，以1.5ml一份从各柱回收洗脱液液。
将由此回收的各种级分的蛋白浓度调至300μg/ml。
将各种调节的级分以500μl一份分散，冷冻于-30℃下，并接着室温下在水浴中融化。
将这种冻融处理重复4遍，接着在实施例22描述的凝胶过滤HPLC条件下测定各种修饰多肽的剩余量(回收产率)。
结果示于表10中。
                            表10
聚乙二醇修饰的产物     四次冻融处理后的回收产率％
    pH4.5        pH5.0
实施例5的一取代物1实施例5的一取代物2     100          10191.3         85.5
从表10所示的结果发现其中Ser被聚乙二醇修饰的一取代物1比其中N末端被修饰的一取代物2对冻融更为稳定。实施例24化学修饰的多肽的体外活性：
根据Asano等的方法[Yakuri to Chiryo,19:2767(1991)]，通过下面系列稀释法测定实施例14获得的两种一取代物为主成分的级分的增强小鼠白血病细胞NFS 60生长的活性[K.Holmes等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:6687(1985)]。
将用G-CSF(-)培养基洗涤的细胞悬液以50μl一份分散在96井平板的各井中。
将实施例14获得的一取代物1调节至25ng/ml，将50μl一份的调节溶液加入到第一个井中并充分混合以将溶液调至12.5ng/ml。
从井中吸取50μl一份的溶液，加入到第二个井中，并充分混合以将溶液调至6.25ng/ml。通过重复该步骤，制备11步两倍稀释的系列。
以相同方式，使用实施例14获得的一取代物2(25ng/ml)和含有参考实施例1的hG-CSF衍生物的标准溶液(5ng/ml)制备二倍稀释系列。通过这种方法，在各井以50μl一份从12.5ng/ml制备一取代物2的稀释系列和从2.5ng/ml制备标准溶液的稀释系列。
将各种样品溶液和标准溶液的NFS60细胞的生长活性测定三次，根据标准溶液的活性(100％)计算各种一取代物的相对活性。
一取代物1显示比一取代物2高1.06-1.13倍的活性。参考例1
根据日本审查专利申请号096558/95参考实施例中描述的方法，通过用丙氨酸置换1位的苏氨酸，苏氨酸置换3位的亮氨酸，酪氨酸置换4位的甘氨酸，精氨酸置换5位的脯氨酸以及丝氨酸置换17位的半胱氨酸，从hG-CSF获得具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的hG-CSF衍生物(表1中的化合物K)。
即，37℃下，将含有包含编码上述hG-CSf衍生物的DNA片段的质粒pCfBD28的大肠杆菌W3110strA菌株(大肠杆菌ECfBD,FERMBP-1479)在LG培养基[通过将10g细菌培养用胰蛋白胨、5g酵母、5g氯化钠和1g葡萄糖溶解在1L水中并用NaOH将其pH调至7.9来制备]中培养18小时，将5ml一份的培养肉汤接种到100ml含有25μg/ml色氨酸和50μg/ml氨苄青霉素的MCG培养基中(0.6％Na2HPO4、3％KH2PO4、0.5％氯化钠、0.5％水解酪蛋白氨基酸、1mMMgSO4和4μg/ml维生素B1,pH7.2),30℃下，将混合物培养4-8小时。接着，将10μg/ml色氨酸诱导物3β-吲哚丙烯酸(下文称为“IAA”)加入到培养基中，再继续培养2-12小时。以8,000rpm将产生的培养肉汤离心10分钟，将收集的细胞用30mM氯化钠和30mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)洗涤。将洗涤的细胞悬浮于30ml上述缓冲液中，0℃下，使用超声破碎仪(SINIFIER CELL DISRUPTOR 200,OUTPUT CONTROL 2,BRANSON SONIC POWER COMPANY制造)超声破碎10分钟。超声破碎后，以9,000rpm将细胞悬液离心30分钟以获得细胞残渣。
此后，根据Marston等的方法[F.A.O.Marston等，生物/技术，2:800(1984)]从细胞残渣中提取和纯化hG-CSF衍生物并溶解和再生。参考例22,4-双(邻甲氧基聚乙二醇)-6-(3-羧基丙基氨基)-s一三嗪的N-羟基琥珀酰亚胺酯的制备
将412mg(4.0mmol)γ-氨基丁酸溶解在300ml 0.1M硼酸盐缓冲液(pH10)中，将产生的被冰浴冷却的溶液与20g(2mmol)2,4-双(邻甲氧基聚乙二醇)-6-氯-s-三嗪(Seikagaku Kogyo制造)混合，4℃下，让混合物反应一整昼夜并接着在室温下反应6小时。
通过加入1N盐酸将反应溶液调至pH1，并接着用氯仿萃取2，4-双(邻甲氧基聚乙二醇)-6-(3-羧基丙基氨基)-s-三嗪。氯仿相用无水硫酸钠干燥，过滤除去不溶物，减压蒸发溶剂以获得羧酸衍生物。
从无水丙酮中将羧酸衍生物重结晶以获得15.8g(1.6mmol)的羧酸衍生物晶体。
将10g(1.0mmol)一份的晶体和230mg N-羟基琥珀酰亚胺溶解在100ml无水二氯甲烷中，在冰浴和氩气流中冷却的同时，将产生的溶液与413mgN,N’-二环己基碳化二亚胺(DCC)混合，并将混合物搅拌30分钟。完成搅拌后，让反应混合物的温度回到室温，再搅拌1.5小时，过滤除去不溶物(N,N’-二环己基脲(DCU))，接着减压下将产生的滤液浓缩至40ml。
将浓缩液滴加至600ml无水二乙基醚中以形成沉淀。将沉淀用无水二乙基醚洗涤，接着减压除去溶剂以获得7.7g(0.77mmol)2,4-双(邻甲氧基-聚乙二醇)-6-(3羧基丙基氨基)-s一三嗪的N-羟基琥珀酰亚胺酯(产率77％)。参考例32,4-双(邻甲氧基-聚乙二醇)-6(3-羧基丙基氨基)-s一三嗪的制备
将100g(8.33mmol)充分干燥的具有12,000平均分子量的一甲氧基聚乙二醇(Nippon油脂公司制造)、9.3g氧化锌(Wako纯化学品工业公司)和83.5g分子筛(4A型)(Wako纯化学品工业公司)溶解在无水苯中，室温下氩气流中，让溶液静置一整昼夜。
除去分子筛后，接着80℃氩气流中，使用蒸馏装置蒸馏反应溶液，80℃氩气流中使用已用约100g分子筛(4A型)填充的Soxhlet提取器(用于固相)将其共沸蒸馏一整昼夜。
冷却通过脱水回流获得的反应溶液，与736mg(4.0mmol)氰尿酰氯混合，接着用与上述类似的方式共沸蒸馏5天。此后，将溶液冷却至室温，与300ml无水苯混合，接着以3,600rpm将混合物离心10分钟以除去不溶物。
减压下，将获得的上清浓缩至300ml，并滴加到3,000ml无水二乙基醚中以形成沉淀。回收沉淀，用无水二乙基醚洗涤，减压除去溶剂以获得干燥的沉淀。
在冰浴冷却的同时，将100g干燥的沉淀加入到通过将1.24g(12.0mmol)γ-氨基丁酸溶解在1,000ml 0.1M硼酸钠缓冲液(pH10)而制备的溶液中，4℃下，将混合物搅拌一整昼夜。室温下再搅拌6小时后，用1N盐酸将溶液调至pH1.0，接着用氯仿萃取2,4-双(邻甲氧基-聚乙二醇)-6-(3-羧基丙基氨基)-s一三嗪。
将含有化合物的氯仿相用无水硫酸钠干燥并过滤，减压下从产生的滤液中除去溶剂。将形成的白色固体从无水丙酮中重结晶以获得90g 2,4-双(邻甲氧基-聚乙二醇)-6-(3-羧基丙基氨基)-s一三嗪(产率90％)。参考例42,4-双(o-甲氧基-聚乙二醇)-6-(3-羧基丙基氨基)-s一三嗪的N-羟基琥珀酰亚胺酯的制备：
将25g(1.0mmol)用与参考例3类似的方法合成并充分干燥的2,4-双(邻甲氧基-聚乙二醇)-6-(3-羧基丙基氨基)-s一三嗪和240mg N-羟基琥珀酰亚胺溶解在400ml无水二氯甲烷中，在冰浴和氩气流中冷却的同时，将产生的溶液与431mg N,N’-二环己基碳化二亚胺(DCC)混合，将混合物搅拌30分钟。
完成搅拌后，让反应混合物回到室温，再搅拌1.5小时，过滤除去不溶物(N,N’-二环己基脲(DCC))，减压下将产生的滤液浓缩至160ml。
将浓缩液滴加到2,400ml无水二乙基醚中以形成沉淀。将沉淀用无水二乙基醚洗涤，接着减压除去溶剂以获得21.4g(0.89mmol)2,4双(邻甲氧基-聚乙二醇)-6-(3-羧基丙基氨基)-s一三嗪的N-羟基琥珀酰亚胺酯(产率89％)。工业实用性
本发明提供一种化学修饰的多肽，其中该多肽分子中的至少一个羟基被用聚亚烷基二醇衍生物修饰；一种制备该修饰多肽的方法；一种使用该修饰多肽的治疗方法；修饰多肽的用途；一种包含该修饰多肽的药物制剂；以及包含该修饰多肽的治疗组合物。
序列表SEQ ID NO:1序列长度：174序列类型：氨基酸链型：单链拓朴学：线性分子类型：蛋白质序列Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu-1   1               5                  10                  15Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu
             20                  25                  30Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu
        35                  40                  45Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser
    50                   55                  60Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His
65                   70                  75Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile80                  85                  90                 95Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala
            100                 105                 110Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala
        115                 120                 125Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala
    130                 135                 140Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser
145                 150                 155Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro160                 165                 170

Claims (14)

1．一种化学修饰的多肽，其中该多肽分子中的至少一个羟基基团被用聚亚烷基二醇衍生物修饰。
2．根据权利要求1的化学修饰的多肽，其中多肽分子中的羟基基团为来源于丝氨酸残基的羟基基团。
3．根据权利要求1或2的化学修饰的多肽，其中多肽为具有粒细胞集落刺激因子活性的多肽。
4．根据权利要求3的化学修饰的多肽，其中具有粒细胞集落刺激因子活性的多肽为包含SEQ ID NO:1代表的氨基酸序列的多肽，或包含在SEQ ID NO:1代表的氨基酸序列中至少一个氨基酸缺失、取代或掺入的氨基酸序列并具有粒细胞集落刺激因子活性的多肽。
5．根据权利要求1或2的化学修饰的多肽，其中聚亚烷基二醇衍生物具有500-1,000,000的分子量。
6．根据权利要求1的化学修饰的多肽，其中它被包括聚亚烷基二醇衍生物的化学修饰剂修饰。
7．根据权利要求6的化学修饰的多肽，其中化学修饰剂为由下式代表的聚亚烷基二醇衍生物
R1-(M)n-X-R2    (Ⅰ)
(其中R1代表烷基或烷酰基；M代表
-OCH2CH2-,-OCH2CH2CH2-或
-(OCH2CH2)r-(OCH2CH2CH2)s-
(其中r和s相同或不相同，各自代表任意可变的正整数)；n为任意可变的正整数；X代表一个键、O、NH或S；以及R2代表
Figure A9880107400021
<其中R3代表OH、卤素或
-Xa-(Ma)na-R1a(其中Xa、Ma、R1a和na均分别具有与上面X、M、R1和n相同的含义)；
和Y代表卤素或
-Z-(CH2)p-(O)m-W[其中Z代表O、S或NH；和W代表羧基或其活性衍生物或
Figure A9880107400031
(其中R4代表烷基，以及Hal代表卤素)；p为0-6的整数；和m为0或1]>，
-(CO)m-(CH2)t-W(其中t为0-6的整数；和m和w具有如上定义的相同的含义)，
Figure A9880107400032
(其中Hala、pa和R4a各自分别具有与上面Hal、p和R4相同的含义)，
Figure A9880107400033
(其中R3和W具有如上定义的相同含义)，
(其中R3、t和W具有如上定义的相同含义)，
Figure A9880107400041
(其中W具有如上定义的相同含义)，
或
Figure A9880107400043
(其中R5代表其中一个氨基和一个羧基被从氨基酸中除去的残基；以及W具有如上定义的相同含义)}。
8．根据权利要求7的化学修饰的多肽，其中化学修饰剂为由下式(Ib)代表的聚亚烷基衍生物
Figure A9880107400044
(其中R1、M、R3、Z、n和p具有如上定义的相同含义；以及Wa代表羧基或其活性衍生物)。
9．一种制备化学修饰的多肽的方法，其特征在于将多肽分子中的至少一个羟基基团与包括聚亚烷基二醇衍生物的化学修饰剂反应。
10．包含根据权利要求1-8任一项化学修饰的多肽的药物制剂。
11．一种治疗粒细胞或血小板减小病人的方法，其包括给药有效量的根据权利要求1-8任一项化学修饰的多肽。
12．根据权利要求1-8任一项化学修饰的多肽在制备可有效治疗粒细胞或血小板减小病人的药物组合物中的用途
13．根据权利要求1-8任一项化学修饰的多肽在治疗粒细胞或血小板减小病人中的用途。
14．一种用于治疗粒细胞或血小板减小病人的组合物，其包含药物可接受的载体和为药物可接受剂量形式的有效量的根据权利要求1-8任一项化学修饰的多肽。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114364393A (zh) * 2019-05-31 2022-04-15 光谱制药有限公司 使用g-csf蛋白质复合物治疗的方法

Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100361933B1 (ko) * 1993-09-08 2003-02-14 라 졸라 파마슈티칼 컴파니 화학적으로정의된비중합성결합가플랫폼분자및그것의콘주게이트
JP4011124B2 (ja) * 1997-06-06 2007-11-21 協和醗酵工業株式会社 化学修飾ポリペプチド
US6458953B1 (en) * 1998-12-09 2002-10-01 La Jolla Pharmaceutical Company Valency platform molecules comprising carbamate linkages
US6646110B2 (en) 2000-01-10 2003-11-11 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF polypeptides and conjugates
US6555660B2 (en) 2000-01-10 2003-04-29 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
HUP0203751A3 (en) 2000-01-10 2005-01-28 Maxygen Holdings Ltd Redwood C G-csf conjugates
US6831158B2 (en) 2000-01-10 2004-12-14 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
ES2325877T3 (es) 2000-02-11 2009-09-23 Bayer Healthcare Llc Moleculas de tipo factor vii o viia.
US20020065397A1 (en) * 2000-10-12 2002-05-30 Joseph Roberts Protecting therapeutic compositions from host-mediated inactivation
EP1366075B1 (en) 2001-02-27 2009-05-27 Maxygen Aps New interferon beta-like molecules
KR100961859B1 (ko) 2001-07-11 2010-06-09 맥시겐 홀딩스 엘티디 지-씨에스에프 접합체
PL211175B1 (pl) 2002-06-21 2012-04-30 Novo Nordisk Healthcare Ag Koniugat polipeptydu czynnika VII, sposób wytwarzania takiego koniugatu, zawierający taki koniugat preparat farmaceutyczny oraz zastosowanie takiego koniugatu
DE602004029173D1 (de) 2003-10-10 2010-10-28 Novo Nordisk As Il-21-derivate
ES2428358T3 (es) 2003-10-17 2013-11-07 Novo Nordisk A/S Terapia de combinación
SG135176A1 (en) 2004-02-02 2007-09-28 Ambrx Inc Modified human four helical bundle polypeptides and their uses
CA2568952C (en) 2004-06-18 2019-05-21 Ambrx, Inc. Novel antigen-binding polypeptides and their uses
EP1836314B1 (en) 2004-12-22 2012-01-25 Ambrx, Inc. Modified human growth hormone
RU2007149238A (ru) 2005-06-01 2009-07-20 Максиджен Холдингз Лтд. (Ky) Пегилированные полипептиды гксф и способы их получения
JP5335422B2 (ja) 2005-06-17 2013-11-06 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 少なくとも１つの非天然のシステインを含んでいる操作されたタンパク質の選択的な還元および誘導体化
ES2547554T3 (es) 2005-11-16 2015-10-07 Ambrx, Inc. Métodos y composiciones que comprenden aminoácidos no naturales
AU2007253264A1 (en) 2006-05-24 2007-11-29 Novo Nordisk Health Care Ag Factor IX analogues having prolonged in vivo half life
MX2009002460A (es) 2006-09-08 2009-03-20 Ambrx Inc Arnt supresor hibrido para celulas de vertebrados.
CN104193815A (zh) 2006-09-08 2014-12-10 Ambrx公司 经修饰的人类血浆多肽或Fc骨架和其用途
CA2682147C (en) 2007-03-30 2017-08-08 Ambrx, Inc. Modified fgf-21 polypeptides and their uses
DE202008017456U1 (de) 2007-08-27 2009-08-27 Biogenerix Ag Flüssig-Formulierung von G-CSF-Konjugaten
EP2930182A1 (en) 2007-11-20 2015-10-14 Ambrx, Inc. Modified insulin polypeptides and their uses
EP3103880A1 (en) 2008-02-08 2016-12-14 Ambrx, Inc. Modified leptin polypeptides and their uses
CA2729851C (en) 2008-07-23 2019-01-15 Ambrx, Inc. Modified bovine g-csf polypeptides and their uses
PE20110480A1 (es) 2008-09-26 2011-07-01 Ambrx Inc Microorganismos y vacunas dependientes de replicacion de aminoacidos no naturales
CA2737026C (en) 2008-09-26 2019-12-24 Ambrx, Inc. Modified animal erythropoietin polypeptides and their uses
CN107674121A (zh) 2009-12-21 2018-02-09 Ambrx 公司 经过修饰的牛促生长素多肽和其用途
EA201290542A1 (ru) 2009-12-21 2013-07-30 Амбркс, Инк. Модифицированные свиные соматотропиновые полипептиды и их применение
AU2011222883B2 (en) 2010-03-05 2016-05-26 Omeros Corporation Chimeric inhibitor molecules of complement activation
US20120135912A1 (en) 2010-05-10 2012-05-31 Perseid Therapeutics Llc Polypeptide inhibitors of vla4
US9567386B2 (en) 2010-08-17 2017-02-14 Ambrx, Inc. Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides
NZ607069A (en) 2010-08-17 2014-10-31 Ambrx Inc Modified relaxin polypeptides and their uses
TWI480288B (zh) 2010-09-23 2015-04-11 Lilly Co Eli 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物
WO2013004607A1 (en) 2011-07-01 2013-01-10 Bayer Intellectual Property Gmbh Relaxin fusion polypeptides and uses thereof
DK2859017T3 (da) 2012-06-08 2019-05-13 Sutro Biopharma Inc Antistoffer omfattrende stedsspecifikke ikke-naturlige aminosyrerester, fremgangsmåder til fremstilling heraf og fremgangsmåder til anvendelse heraf
ES2611788T3 (es) 2012-06-26 2017-05-10 Sutro Biopharma, Inc. Proteínas de Fc modificadas que comprenden residuos de aminoácidos no naturales específicos del sitio, conjugados de las mismas, métodos para su preparación y métodos para su uso
KR102182800B1 (ko) 2012-08-31 2020-11-25 서트로 바이오파마, 인크. 아지도 기를 포함하는 변형된 아미노산
EP3019522B1 (en) 2013-07-10 2017-12-13 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising multiple site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
EP3055298B1 (en) 2013-10-11 2020-04-29 Sutro Biopharma, Inc. Modified amino acids comprising tetrazine functional groups, methods of preparation, and methods of their use
EP3909596A1 (en) 2014-10-24 2021-11-17 Bristol-Myers Squibb Company Modified fgf-21 polypeptides and uses thereof
EP3580232B1 (en) 2017-02-08 2023-09-20 Bristol-Myers Squibb Company Modified relaxin polypeptides comprising a pharmacokinetic enhancer and uses thereof
KR20210057124A (ko) 2018-09-11 2021-05-20 암브룩스, 인코포레이티드 인터류킨-2 폴리펩타이드 접합체 및 그의 용도
US20220009986A1 (en) 2018-10-19 2022-01-13 Ambrx, Inc. Interleukin-10 polypeptide conjugates, dimers thereof, and their uses
KR20210136014A (ko) 2019-02-12 2021-11-16 암브룩스, 인코포레이티드 항체-tlr 작용제 콘쥬게이트를 함유하는 조성물, 방법 및 이의 용도
AU2021233909A1 (en) 2020-03-11 2022-09-29 Ambrx, Inc. Interleukin-2 polypeptide conjugates and methods of use thereof
JP2023538071A (ja) 2020-08-20 2023-09-06 アンブルックス，インコーポレイテッド 抗体－ｔｌｒアゴニストコンジュゲート、その方法及び使用
IL307282A (en) 2021-04-03 2023-11-01 Ambrx Inc Antidote conjugates against HER2 and their applications

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4732863A (en) 1984-12-31 1988-03-22 University Of New Mexico PEG-modified antibody with reduced affinity for cell surface Fc receptors
US5194592A (en) * 1986-12-23 1993-03-16 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Monoclonal antibodies to novel polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
JPH0644927B2 (ja) * 1987-03-14 1994-06-15 日本油脂株式会社 徐放性活性成分放出剤
US5153265A (en) * 1988-01-20 1992-10-06 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
CA1340810C (en) 1988-03-31 1999-11-02 Motoo Yamasaki Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
JPH0796558B2 (ja) 1988-03-31 1995-10-18 協和醗酵工業株式会社 修飾ポリペプチド
DK0400472T3 (da) 1989-05-27 1996-05-13 Sumitomo Pharma Fremgangsmåde til fremstilling af polyethylenglycolderivater og modificeret protein
US5342940A (en) * 1989-05-27 1994-08-30 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Polyethylene glycol derivatives, process for preparing the same
JP2931622B2 (ja) 1989-05-27 1999-08-09 住友製薬株式会社 ポリエチレングリコール誘導体を得る製造方法
JPH03236400A (ja) * 1990-02-09 1991-10-22 Kirin Brewery Co Ltd 化学修飾ポリペプチド及びその用途
US5359030A (en) * 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
JPH06319537A (ja) 1993-05-18 1994-11-22 Daikin Ind Ltd 修飾ペプチドおよびその製造方法
US6245900B1 (en) 1994-02-23 2001-06-12 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Platelet production promoting agent
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US6884419B1 (en) 1996-12-23 2005-04-26 Kyowa Hakko Kogyo, Co., Ltd. hG-CSF fusion polypeptide having c-mpl activity, DNA coding for same and methods of treating anemia using same
JP4011124B2 (ja) 1997-06-06 2007-11-21 協和醗酵工業株式会社 化学修飾ポリペプチド
CA2330448A1 (en) * 1998-04-28 1999-11-04 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Peg-lhrh analog conjugates

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114364393A (zh) * 2019-05-31 2022-04-15 光谱制药有限公司 使用g-csf蛋白质复合物治疗的方法

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