CN1213401A - Exodus化学激活素物质及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供纯化的和分离的编码人巨噬细胞来源的命名为Exodus的C－C化学激活素的多聚核苷酸序列。亦提供纯化的和分离的化学激活素蛋白、其片段及多肽类似物、其抗体和其重组生产的材料和方法。这些产物可以用于治疗、诊断和医学成像应用。
Description
本发明一般涉及化学激活素、更具体地说涉及纯化的和分离的编码命名为Exodus的人C-C化学激活素及其类似物的多聚核苷酸，涉及由所述多聚核苷酸编码的纯化的和分离的化学激活素多肽，涉及用于这些多肽之重组生产的材料和方法，涉及这些多肽的治疗用途、特别是化疗中的脊髓保护、治疗骨髓组织增生性疾病和用于治疗获得性免疫缺陷综合症(AIDS)。
本发明背景技术
化学激活素(亦称为“间分泌素”和“SIS细胞因子”)包括一个超家族的小分泌蛋白(约70-100氨基酸，大小约8-12千道尔顿)，它们主要调节白细胞迁移和激活，因此帮助刺激和调节该免疫系统。该“化学激活素”名称来自名词趋化细胞因子，指这些蛋白质刺激白细胞趋化性的能力。确实，化学激活素可以包括炎症细胞进入病理组织的主要引诱剂。[一般参见Baggiolini等，Advances in Immunology,55:97-179(1994)；Oppenheim,The Chemokines,Lindley等编辑，第183-186页，Plenum Press,NY(1993))]。尽管化学激活素一般由白细胞分泌，但有几种化学激活素在众多组织中表达。Baggiolini等，见上述，表Ⅱ。一些化学激活素亦激活或吸引除白细胞之外的多种细胞，例如内皮细胞和成纤维细胞。
以前鉴定的化学激活素一般展示彼此之间有20-70％的氨基酸相同并含有四个高度保守的半胱氨酸残基。根据这些半胱氨酸残基的前二个残基的相对位置，已经将化学激活素进一步分类为二个亚家族。在“C-X-C”或“α”亚家族(由定位于第4条人染色体上的基因编码)中，前二个半胱氨酸被一个氨基酸隔开。在“C-C”或“β”亚家族(由基因定位于第17条人染色体上的基因编码)中，前二个半胱氨酸相邻。对几种化学激活素的X-射线晶体学和NMR研究已经表明在每个家族中，第一和第三个半胱氨酸形成第一个二硫桥，而第二个和第四个半胱氨酸形成第二个二硫桥，强烈地影响所述蛋白的天然构象。仅在人类中，对每个化学激活素亚家族已描述了将近十个不同的序列。这两个亚家族的化学激活素都有20-25个氨基酸的特征前导序列。
当比较任何二种氨基酸序列时，C-X-C化学激活素(包括IL-8、GROα/β/γ、血小板碱性蛋白、血小板因子4(PF4)、嗜中性粒细胞激活肽-2(NAP-2)、巨噬细胞趋化激活因子(MCAF)、IP-10和其它化学激活素)有25％-60％的相同性(除了GROα/β/γ成员，它们之间有84-88％相同性)。大多数的亚家族成员(不包括IP-10和血小板因子4)在前二个半胱氨酸残基的上游都有一共同的E-L-R三肽基元。C-X-C化学激活素一般是嗜中性粒细胞的有效刺激剂，导致迅速的外形改变、趋化性、呼吸释放和去颗粒。某些C-X-C化学激活素(包括IL-8)N末端氨基酸序列的特定截短与活性的显著增加相联系。
C-C化学激活素(包括巨噬细胞炎症蛋白MIP-1α[Nakao等，Mol.Cell Biol.,10:3646(1990)]和MIP-1β[Brown等，J.Immunol.,142:679(1989)]、单核细胞趋化蛋白MCP-1[Matsushima等，J.Exp.Med.,169:1485(1989)]、MCP-2[Van Danune等，J.Exp.Med.,176:59(1992)和Chang等，Int.Immunol.,1:388(1989)]和MCP-3[Van Damme等，见上述]、RANTES[Schall等，J.Immunol.141:1018(1988)]、Ⅰ-309[Miller等，J.Immunol,143:2907(1989)]、eotaxin[Rothenberg等，J.Exp.Med.,181:1211-1216(1995)]和其它，相互之间有25％-70％的氨基酸相同。C-C化学激活素一般激活单核细胞、淋巴细胞、嗜碱细胞和嗜酸性细胞，但不激活嗜中性粒细胞。大多数已报道的C-C化学激活素激活单核细胞，导致钙流出和趋化性。在淋巴细胞例如对RANTES最强烈应答的T-淋巴细胞上可以看到更加选择性的效果。
根据结构同源性和相似活性可以将C-C化学激活素进一步亚分类。与该家族的其它成员相比，MIP-1α、MIP-1β和RANTES有更相近的同源性和生物学活性范围。C-C化学激活素家族的另一亚家族是单核细胞趋化蛋白(MCP)，它们相互之间在结构上比C-C化学激活素家族的其它成员更相似，并且优先刺激单核细胞迁移和对炎症刺激物应答。
用缺失和置换类似物的研究已经表明关键受体结合区似乎主要在所述化学激活素的氨基末端残基，其后是在第二个半胱氨酸之后的环内的第二个区。功能的这些一般要求看起来对所有的化学激活素都是相同的。[Clark-Lewis等，J.Leukocyte Bio.57:703(1995)]。
化学激活素受体是七个跨膜区类视紫质G蛋白偶联受体。Holmes等(Science,253:1278-83(1991))已克隆了IL-8的特异性受体，而Murphy和Tiffany(Science,253:1280-83(1991))已克隆了识别IL-8、GRO和NAP-2的相似受体(77％相同性)。迄今为止已克隆了5个C-C化学激活素受体:识别MIP-1α和RANTES的C-C化学激活素受体-1(CCR-1)[Neote等，Cell,72:415-425(1993)],MIP-1α、RANTES和MCP-1的受体(CCR-4)[Power等，J.Biol.Chem.,270:19495-19500(1995)]、MCP-1受体(CCR-2B)[Charo等，Proc.Nat.Acad Sci.,91:2752-56(1994)]和eotaxm受体(CCR-3)[Combadiere等，J.Biol Chem.27D:16491-16494(1995)]以及MIP-1α、MIP-1β和RANTES的受体(CCR-5)[Raport等，J.Biol.Chem.,271:7161-17166(1996)]。
这些受体趋向于多功能，可以结合多种不同的化学激活素。所述受体本身在人类疾病中可以起作用。例如，与包括IL-8、NAP-2、GROα、RANTES、MCP-1的化学激活素积极结合的人血红细胞上的Duffy抗原(也称为红细胞化学激活素受体)是引起疟疾的寄生虫Plasmodium knowlesi的侵入受体。二种疱疹病毒科病毒松鼠猴疱疹病毒和人巨细胞病毒也似乎编码功能性化学激活素受体同系物。[Ahuja等，Immunol.Today,15:281-(1994)；Murphy,Ann.Rev.Immnol.,12:593-633(1994)；Horuk,TIPS,15:159(1994).]
因为化学激活素的前炎症活性，据信化学激活素在广泛的涉及炎症组织破坏的多种疾病(例如类风湿性关节炎、心肌梗塞和成人呼吸窘迫综合症)中起作用。已有充分文字记录多种化学激活素特别是C-X-C化学激活素IL-8在各种病理状态下的作用。一般参见Baggiolini等，见上述，表Ⅶ。例如，几项研究已观察到在患风湿性疾病、骨关节炎和痛风的病人发炎关节滑液中有高水平的IL-8。牛皮癣也与IL-8过量产生有联系。
已有文件证明C-C化学激活素在病理状态中的作用。例如，患类风湿性关节炎的病人滑液中的MCP-1浓度比患其它关节疾病的病人高。依赖于MCP-1的单核吞噬细胞的流入在特发性肺纤维变性的发展中可能是重要的事件。目前强烈关注的是C-C化学激活素在补充单核细胞到动脉粥样硬化区域的作用，在富有巨噬细胞的动脉壁区域检测到增强MCP-1表达，但在正常动脉组织中未检测到增强的MCP-1表达。MCP也可能参与诱导血管发生和肿瘤生长或转移。MCP-1在恶性细胞中的表达已显示抑制这类细胞在体内形成肿瘤的能力。(参见美国专利5,179,078号，该专利通过引用结合到本文中)。
其它化学激活素活性包括抑制骨髓祖细胞增殖的能力。重组MCP-1α而不是MCP-1β已显示抑制干细胞和祖细胞的骨髓组织形成，并似乎在其抑制多能祖细胞(粒细胞-红系-巨噬细胞-巨核细胞的集落形成单位，CFU-GEMM)和红系爆增形成单位的亚群(BFU-E)和粒细胞-巨噬细胞祖细胞的集落形成单位(CFU-GM)的生长因子刺激的增殖的能力上有选择性。[Broxmeyer等，Blood,76:1110-1116(1990)。]这些效应不是细胞毒性效应，而是细胞周期停滞。亦有报道MIP-2α、IL-8、PF4和MCAF是造血干细胞/祖细胞增殖的抑制剂。[Broxmeyer等，J.Immunol.,150:3448-3458(1993)；Broxmeyer等，Ann.Hematol.,71:235-246(1995)]。这些化学激活素看来直接在骨髓祖细胞水平上作用。一些报道表明MIP-1α有保护多能造血细胞免受化疗药剂的细胞毒性作用的潜力。[Dunlop等，Blood,79:2221-2225(1992)和Lord等，Blood,79:2605-2609(1992).]。据报道正在进行做为具有Cytoxan_(来自Bristol-Myers Squibb Oncology的环磷酰胺)的骨髓保护剂的MIP-1α类似物(命名为BB10010,British Biotechnology)的应用的临床试验。
最近，有几个报道表明一些C-C化学激活素(MIP-1α、MIP-1β和RANTES)抑制人免疫缺陷病毒(HIV)的产生。[Cocchi等，Science,270:1811(1996)；Fauci,Nature,378:561(1996).]。一项研究报道那些接触HIV但却保持HIV阴性的个体的CD4+淋巴细胞表达高水平的这些C-C化学激活素。[Paxton等，Nature Med.,2:412(1996).]。通过分离和鉴别做为该化学激活素受体家族成员的HIV辅受体(coreceptor)提出了这种抑制的潜在机制。结合RANTES、MIP-1α和MIP-1β的CCR-5受体已鉴定出是大多数亲巨噬细胞HIV毒株的主要辅受体[Deng等，Nature,381:661(1996)；Dragic等，Nature,381:667(1996)；Alkhatib等，Science,272:1955(1996)]。已有报道特定原代HIV-1亲巨噬细胞毒株于体外与CCR-3和CCR-2B受体相互作用[Choe等，Cell,85:1135(1996)；Doranz等，Cell,85:1149(1996)]。命名为“融合素(Fusin)”的化学激活素受体(现已知为C-X-C化学激活素受体CXCR-4)已被鉴定为HIV亲T细胞毒株的受体[Feng等，Science,272:872(1996)]。这些HIV辅受体属于化学激活素受体家族，看来是与CD4一起的、HIV病毒融合和进入人靶细胞的辅因子。
因此有必要鉴别和表征其它的C-C化学激活素，以进一步阐明该重要的分子家族在病理状态下的作用，并开发使用化学激活素衍生产物对这类疾病的改进治疗。
本发明感兴趣的是于1996年2月29日公布的国际公开WO96/05856，它报告了从分别得自人胆囊和9周龄人胎组织的cDNA文库中鉴别了二种化学激活素，分别称为人化学激活素β-4(Ckβ-4)和人化学激活素β-10(Ckβ-10)。Ckβ-4与此处描述的Exodus化学激活素在DNA和氨基酸序列方面非常相似(与Exodus前导序列的22个氨基酸相比，区别在于Ckβ-4在成熟Exodus化学激活素的残基4后有一个额外的丙氨酸，并且报道的Ckβ-4的推测前导序列是24个氨基酸)。尚未确定化学激活素Ckβ-4或Ckβ-10的生物学活性。具体地说，该公开并未提及这些化学激活素在HIV感染的发病机制中的任何潜在作用，也未具体描述这些化学激活素治疗骨髓组织增生性疾病的用途。
亦值得注意的是另一个命名为Exodus-2的C-C化学激活素的克隆，看来它与Exodus/MIP-3α-LARC紧密相关，有31％的氨基酸相同性和在头二个半胱氨酸周围有同一特有的Asp-Cys-Cys-Leu基元。[Hromas等，J.Immunol,159:2554-2558(1997).]。
已显示C-C亚家族的化学激活素有在医学成像(例如感染部位、炎症部位和其它具有C-C化学激活素受体分子的部位的成像)方面的用途。参见例如Kunkel等，美国专利5,413,778号，该专利通过引用结合到本文中。这类方法涉及用本领域已知的技术将标记剂(例如放射性同位素)化学连接至该化学激活素(参见例如美国专利4,965,392号和5,037,630号，这些专利通过引用结合到本文中)、将该标记化学激活素在药学上可接受的载体中给与受治疗者、使该标记化学激活素在目标部位富集、并在该目标部位使该标记化学激活素成像。本领域需要其它的新C-C化学激活素以增加可用的医学成像工具库。
更普遍的是，由于化学激活素做为趋化性和炎症的介质的重要性，需要鉴定和分离该化学激活素家族的新成员以促进炎症和免疫应答的调节。例如，促进免疫应答的物质可以促进伤口愈合或从提高传染性疾病(例如肺炎)康复的速度。抑制化学激活素的前炎症效果的物质可以用于治疗由炎症介导的病理状态，例如关节炎、Crohn病和其它自免疫疾病。
另外，已建立的化学激活素表达与炎症性疾病和疾病状态之间的相互关系提供了使用化学激活素和特异性地与化学激活素进行免疫反应的抗体物质的诊断和预后指标；有必要鉴定和分离新的化学激活素以促进这类诊断和预后指标。
由于以上所有理由，需要新发现化学激活素生产的重组方法，该方法促进涉及所述化学激活素和/或化学激活素抑制剂的临床应用。
发明概述
本发明通过提供纯化的和分离的编码命名为Exodus的人C-C化学激活素的多聚核苷酸及其片段或类似物；纯化的和分离的Exodus多肽及其片段和类似物；重组生产这些多肽及其片段和类似物的材料和方法；抗这类Exodus多肽和类似物的抗体；包含这些多肽、片段、类似物或抗体的药用组合物；和使用这些多肽、片段、类似物或抗体的治疗(包括预防性和治疗性治疗)，满足了一个或多个上述需要。
Exodus是C-C化学激活素家族的一员，它优先在淋巴细胞和单核细胞中表达并由炎症刺激物显著增量调节。编码Exodus的cDNA的推导氨基酸序列长95个氨基酸，其中首22个N末端残基包含一个信号序列。在本文中证明的其生物学活性预计使其在多种不同的临床应用中有用。与其它C-C化学激活素一样，它刺激单核细胞的趋化性。Exodus显著地抑制造血祖细胞增殖并且也抑制在受感染细胞中HIV的产生。
本发明具体提供：纯化的编码SEQ IN NO:2的Exodus氨基酸序列的多聚核苷酸(即DNA和RNA，有义链和反义链)，特别是包含由SEQ ID NO:1的核苷酸序列的Exodus蛋白编码部分(核苷酸43-327)组成的核苷酸序列的DNA；纯化的编码SEQ IN NO:2的第1-73个氨基酸的多聚核苷酸，特别是包含由SEQ ID NO:1的109-327核苷酸组成的核苷酸序列的DNA；和纯化的编码选自以下的全长Exodus的多聚核苷酸：(a)SEQ ID NO:1的DNA的第43-327核苷酸；(b)在严格条件下与SEQ ID NO:1的DNA的第43-327核苷酸的互补链杂交或若不是该遗传密码的简并性就可在严格条件下与其杂交的多聚核苷酸；和(c)与SEQ ID NO:1的DNA的第43-327核苷酸编码的相同的Exodus多肽的多聚核苷酸。本发明亦提供包含这类多聚核苷酸的载体，特别是其中编码Exodus的DNA可操作地与一表达控制DNA序列连接的表达载体，亦提供用这种多聚核苷酸DNA稳定转化和转染的宿主细胞和通过培养这些宿主细胞生产Exodus以及从所述宿主细胞或其营养培养基分离该Exodus的相应方法。本发明另外亦提供纯化的Exodus多肽，特别是包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽、或包含SEQ ID NO:2的第1-73氨基酸的多肽。本发明的另一方面提供与Exodus特异性反应的抗体，包括单克隆抗体和产生这类单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
本发明的再一方面提供通过向受治疗者(特别是该受治疗者有接触HIV的风险或曾经接触过HIV或已被HIV感染)给与一定量的有效抑制HIV增殖的Exodus蛋白产物以增强对HIV感染抗性的方法。本发明的这一方面亦提供治疗HIV感染的方法，包括向感染HIV的受治疗者给与一定量的有效抑制HIV增殖的Exodus蛋白产物。本发明的另一方面提供保护骨髓祖细胞免受细胞毒性作用的方法，包括给与一定量的有效抑制骨髓祖细胞增殖的Exodus蛋白产物，特别是其中该受治疗者正接受化疗或放疗。本发明的再一方面提供治疗骨髓组织增生性疾病的方法，包括给与一定量的有效抑制恶性骨髓祖细胞增殖的Exodus蛋白产物。下面更完全地描述本发明。
本发明提供纯化的和分离的编码Exodus的多聚核苷酸(即DNA和RNA，有义链和反义链)。本发明优选的DNA序列包括基因组序列和cDNA序列和化学合成的DNA序列。
SEQ ID NO:1提出了编码该Exodus化学激活素包括5’和3’非编码序列的cDNA的核苷酸序列。第43-327核苷酸包含SEQ ID NO:1的DNA的Exodus蛋白编码部分，本发明优选的DNA包含SEQ ID NO:1的第109-327核苷酸，它包含该成熟的分泌Exodus蛋白的推断编码序列但无其信号序列。
化学激活素Exodus的氨基酸序列列于SEQ ID NO:2。本发明优选的多聚核苷酸除上述多聚核苷酸之外，包括编码列于SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多聚核苷酸，并且仅因该遗传密码众所周知的简并性而不同于前述段落中描述的多聚核苷酸。
同样地，因为SEQ ID NO:2的22个氨基酸(位置-22至-1)包含被切割而产生成熟Exodus化学激活素的信号肽，优选的多聚核苷酸包括那些编码SEQ ID NO:2的第1-73氨基酸的多聚核苷酸。因此，优选的多聚核苷酸是一纯化的多聚核苷酸，它编码具有包括SEQ ID NO:2的第1-73氨基酸的氨基酸序列。
在本发明的多聚核苷酸的用途之中是做为杂交探针使用，以识别和分离编码人Exodus的基因组DNA，该基因可能具有C-C化学激活素基因的三个外显子/二个内含子的特征性结构(参见Baggiolini等，见上述)；以鉴别和分离编码与Exodus同源的蛋白的非人类基因；以交鉴别具有与Exodus相似性的人类和非人类化学激活素；和以识别那些表达Exodus的细胞和表达该蛋白的条件。
因此，在另一方面，本发明提供在严格条件下与SEQ ID NO:1的DNA的Exodus编码部分的互补链杂交的纯化多聚核苷酸。同样地，本发明提供若不是该遗传密码的简并性就可在严格条件下与SEQ IDNO:1的DNA的Exodus编码部分的互补链杂交的纯化的多聚核苷酸。典型的严格杂交条件如下述:于42℃在5X SSC、20mM NaPO4、pH6.8、50％甲酰胺中进行杂交；于42℃在0.2X SSC中清洗。本领域技术人员理解最好根据欲杂交的序列的长度和GC核苷酸碱基的含量经验性地变化这些条件，并有确定这种变化的准则。[参见例如Sambrook等，分子克隆：实验手册。第二版，冷泉港，纽约：冷泉港实验室(1989)。]
在另一方面中，本发明包括加入本发明DNA(包括任何上述的DNA)的质粒和病毒DNA载体。优选的载体包括表达载体，其中加入的Exodus编码cDNA可操作地与一内源或异源表达控制序列连接。这类表达载体亦可以包括与该Exodus编码DNA序列可操作地连接的多肽编码DNA序列，该载体可以表达这些序列，产生包含该目的Exodus多肽的融合蛋白。
在另一方面中，本发明包括用本发明的DNA或载体稳定转染或转化的原核或真核宿主细胞。在优选的宿主细胞中，表达由本发明的DNA或载体编码的该Exodus多肽。本发明的DNA、载体和宿主细胞可以用于例如重组生产大量的本发明Exodus多肽的方法中。这些方法本身也是本发明的方面。例如，本发明包括生产Exodus的方法，其中本发明的宿主细胞在合适营养培养基中生长并从该细胞或该培养基中分离Exodus蛋白。
在再一方面，本发明包括纯化的和分离的Exodus多肽。优选的多肽是具有包含SEQ ID NO:2的第1-73氨基酸的氨基酸序列的纯化的化学激活素多肽。可以从天然来源纯化本发明的多肽，但最好使用本发明的DNA、载体和/或宿主细胞用重组方法生产或化学合成。本发明的纯化多肽可以是糖基化(例如O-连接或N-连接)或非糖基化、水溶性或不溶性、氧化的、还原的等等，取决于选择的宿主细胞、重组生产方法、分离方法、加工、储存缓冲液之类。或者，采用已成功地用于其它化学激活素例如IL-8[Clark-Lewis等，J.Biol Chem.,266:23128-34(1991)]和MIP-1生产的技术，通过化学肽合成制备Exodus多肽。
本发明亦考虑Exodus多肽片段，其中缺失一个或多个N末端或C末端氨基酸残基，并且保持一个或多个C-C化学激活素的特征生物学活性。
本发明的另一方面包括Exodus多肽类似物，其中从本发明的Exodus上添加、缺失或置换了一个或多个氨基酸残基，并且保持一个或多个C-C化学激活素的特征生物学活性。这类类似物是有用的，例如上述的医学成像方法或下述的治疗方法。它们可以用本领域已知的任何重组或合成方法(包括在实施例7中描述的方法)制备。
典型的类似物包括在Exodus氨基酸序列中设计的置换以实现与它最紧密联系的化学激活素的更大的同源性。设计以实现与C-C化学激活素家族更大同源性的置换包括在该成熟蛋白序列的第31位用苏氨酸置换丙氨酸，或于第26位用酪氨酸置换苯丙氨酸。其它产生与MIP-1α、MIP-1β和RANTES更大同源性的置换包括用MIP-1α的第1-10残基或RANTES的第1-9残基置换Exodus的1-8残基、用苯丙氨酸置换第11位的亮氨酸、用丝氨酸置换第12位的甘氨酸、用谷氨酸置换第25位的甘氨酸、用丝氨酸置换第36位的谷氨酸、用谷氨酰胺置换第46位的丝氨酸、用酪氨酸置换第60位的异亮氨酸、和用天冬氨酸置换第67位的丝氨酸。可以单个或以所有组合进行这些置换，并预期它们具有增强Exodus在骨髓抑制或抑制HIV产生方面的活性的潜力。
其它设计用来增强给定位置氨基酸特性的置换(例如，如果一氨基酸是疏水性的，则置换物的疏水性更强)亦可以增强Exodus的活性：用天冬氨酸置换第6位的天冬酰胺、用异亮氨酸置换第18位的亮氨酸、用谷氨酸置换第29位的谷氨酰胺、用天冬氨酸置换第38位的天冬酰胺、用异亮氨酸置换第50位的缬氨酸以及用谷氨酸置换第56位的谷氨酰胺。可以单个或以所有的组合进行这些置换。
本发明的相关方面包括不具有Exodus生物学活性的类似物，但它能够竞争性或非竞争性地抑制C-C化学激活素与其受体的结合。这类类似物可以用于例如抑制内源性Exodus或宿主中其它C-C化学激活素的生物学活性的治疗组合物或方法中。特别考虑这类Exodus多肽类似物调节Exodus与化学激活素受体和/或其它据认为在把Exodus向其受体呈递的过程中起重要作用的分子(例如，肝素、糖胺聚糖、红细胞化学激活素受体)的结合特性。
在相关方面，本发明提供纯化的和分离的编码这类Exodus多肽类似物的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸可以用于例如重组生产所述Exodus多肽类似物；加入这类多聚核苷酸的质粒和病毒载体；和用这类DNA或载体稳定转化的原核和真核宿主细胞。
在另一方面，本发明包括与本发明Exodus多肽和多肽类似物特异地免疫反应的抗体物质(例如单克隆和多克隆抗体、单链抗体、嵌合或人化抗体的之类)。本发明亦包括生产本发明抗体物质的杂交瘤细胞系。这类抗体可以用于例如纯化本发明的多肽、例如用众所周知的ELISA技术检测或定量测定流体或组织样品中的Exodus、以及调节Exodus与其受体的结合。一些化学激活素抗体(例如抗IL-8抗体)已显示显著的抗炎作用。
本发明的重组Exodus多肽和多肽类似物可以用于在结合反应中代替抗体，以鉴别表达Exodus受体的细胞和在标准表达克隆技术中分离编码所述受体的多聚核苷酸。分别参见例如以下之实施例16和Holmes等(见上述)和Charo等(见上述)的IL-8和MCP-1受体的克隆。这类Exodus多肽、Exodus多肽类似物和Exodus受体多肽可以用于调节Exodus化学激活素活性、鉴别多肽和化学(例如小分子)Exodus激动剂和拮抗剂。
本文使用的“Exodus蛋白产物”包括Exodus多肽、片段或其类似物(包括Exodus的保持Exodus相关生物学活性的二者挑一的剪接变异体，例如国际公开WO 96/05856号(见上述)描述的化学激活素Ckβ-4。我们已证明在Ckβ-4中发现的该多出的丙氨酸(在Exodus的第4残基之后)位于内含子-外显子边界。跨越该区的测序提示这二种形式Exodus源于二者挑一的剪接。
本发明亦考虑用于增强受伤或患传染性疾病的哺乳动物免疫应答的方法中的包含Exodus蛋白产物的药用组合物。亦考虑用于在炎症介导病理状态(例如关节炎、Crohn病或其它自身免疫疾病)中减轻炎症的方法之中的包含Exodus蛋白产物或其抗体的药用组合物。还考虑用于减轻动脉粥样硬化、血管发生或肿瘤生长或转移的药用组合物。
特别考虑用于抑制造血干细胞或祖细胞增殖的药用组合物。这种骨髓抑制可以在化疗或放疗中保护干细胞/祖细胞免受细胞毒性作用。亦考虑使用Exodus蛋白产物制造抑制骨髓祖细胞增殖的药物，所述药物特别希望给与接受化疗或放疗的受治疗者。
亦特别考虑用于治疗骨髓组织增生性疾病的药用组合物和使用Exodus蛋白产物制造治疗骨髓组织增生性疾病的药物。
另外特别考虑用于治疗刚刚接触HIV但尚未用标准诊断程序检测或确认HIV阳性的病人(例如HIV阳性母亲的新生儿、接触HIV阳性血的医务人员)、有接触HIV风险的病人或已被HIV感染的病人(即HIV阳性病人)的药用组合物。亦考虑使用Exodus蛋白产物制造抑制HIV增殖的药物，所述药物特别希望给与有接触HIV风险、或已接触HIV或已感染HIV的受治疗者。另外考虑使用Exodus蛋白产物制造治疗HIV感染的药物。
这种药用组合物包含Exodus蛋白产物或其抗体以及生理上可接受的稀释剂或载体，并且根据该临床应用可选地包括其它合适的治疗剂，例如抗炎剂或抗HIV剂。Exodus蛋白产物的剂量将根据欲治疗的病理状态在约1μg至100mg/kg体重之间变化，优选为5至100μg/kg体重。可以根据欲治疗疾病通过各种途径给与这种药用组合物，包括通过皮下、肌内、静脉内、肺内、经皮、鞘内、经口或栓剂给药。
可以由主治医生决定增加或减少Exodus蛋白产物的剂量以及缩短或延长治疗时间。用药频率取决于该药剂的药物动力学和给药途径。本领域技术人员根据给药途径和所需剂量可以确定最佳药物配方。参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版(1990,MackPublishing Co.,Easton,PA18042)，第1435-1712页，其内容通过引用结合到本文中。这类配方可以影响物理状况、稳定性、体内释放速率和所给与药剂的体内清除速率。
本领域一般技术人员可以根据良好医疗实践和病人的临床状况容易地优化有效剂量和同时的用药制度。在不考虑用药方式的情况下，可以根据体重、体表面积或器官大小计算具体剂量。为确定涉及上述每种配方的治疗合适剂量所必需的进一步的精确计算可以由本领域一般技术人员按常规进行而不需过度试验，特别是可以根据本文公开的剂量信息和检测以及上述讨论的人体临床试验观察到的药效学数据进行。通过使用已建立的确定血液水平剂量的检测给与适当的剂量反应数据可以确定合适的剂量。可以由主治医生考虑修改药物作用的各种因素决定最终剂量制度，这些因素例如药物的具体活性、损伤的严重性和病人的反应性、病人的年龄、状况、体重、性别和饮食、感染的严重性、用药时间和其它临床因素。随着研究的进行，会出现其它有关治疗各种疾病和状况的适当剂量水平的信息。
上述Exodus材料和方法可以应用于几种临床应用中。首先，由于化学激活素吸引并激活单核细胞和巨噬细胞(Baggiolini等，见上述)，Exodus在致病炎症环境下的表达通过补充额外的单核细胞和巨噬细胞或其它白细胞到发病部位、通过激活已在该处的白细胞或通过诱导淋巴细胞停留在该部位可以加重病情。因此，抑制Exodus的化学引诱剂活性预期可以减轻有害的炎症过程。值得注意的是，这种方法的潜在益处已在涉及IL-8(一种吸引并激活嗜中性粒细胞的C-X-C化学激活素)的试验中直接证明。抗IL-8抗体具有抑制由嗜中性粒细胞介导的炎症性疾病的极度能力[Haada等，J.Leukoc.Biol.,56:559(1994)]。抑制Exodus预期在假设单核细胞和巨噬细胞起作用的疾病(例如Crohn病、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、心肌梗塞或急性呼吸窘迫综合症(ARDS))中有类似效果。
另一方面，增强Exodus的作用可能在疾病中起有益作用，因为已知化学激活素在伤口愈合和血管发生中有正效应。因此，外源Exodus蛋白产物或Exodus激动剂可以在促进这种疾病康复方面有益。
正如C-C化学激活素TCA3在小鼠中抑制肿瘤形成的能力(参见Laning等，见上述)所提示的，Exodus蛋白产物或Exodus激动剂亦可以在治疗肿瘤方面在临床上是重要的。Exodus可以例如通过将各种非特异性效应细胞吸引至肿瘤部位并将其激活，或通过刺激特异性抗肿瘤免疫，直接或间接作用抑制肿瘤形成。
另外，本文证明的Exodus的骨髓抑制效应表明，Exodus蛋白产物或Exodus激动剂可以通过减轻化疗或放疗对病人骨髓干细胞或祖细胞产生的有害影响而对接受化疗或放疗的病人产生相当大的益处。例如，在给与细胞周期特异性化疗药剂之前或期间(例如一天前，用药之前或同时)用Exodux蛋白产物治疗可以保护骨髓免受所述药剂的细胞毒性作用。这类细胞周期特异性化疗药剂包括长春花碱、依托泊甙、柔红霉素、阿霉素、去甲氧柔红霉素、氨甲蝶呤、羟基脲、氟尿嘧啶、阿糖胞苷、巯基嘌呤、硫代鸟嘌呤、喷司他丁、氟达拉滨和2-氯脱氧腺苷(2-CDA)。如上所述，目前将MIP-1α类似物(命名为BB10010,British Biotechnology)做为Cytoxan_治疗法(来自Bristol-Myers SquibbOncology的环磷酰胺)的骨髓保护剂进行临床试验。
正如本文所表明的，Exodus抑制细胞因子依赖性骨髓细胞系增殖的能力表明Exodus蛋白产物亦可用于治疗骨髓组织增生性疾病，包括(但不限于)慢性髓细胞性白血病、特发性血小板增多、骨髓纤维化和真性红细胞增多。为此目的给与Exodus蛋白产物可以与其它化疗药剂或其它细胞因子(例如干扰素)同时给与。
另外，C-C化学激活素RANTES、MIP-1α和MIP-1β已显示抑制人免疫缺陷病毒HIV-1的复制[Cocchi等，Scienc,270:1811-1815(1995)]，提示它们可做为预防或治疗AIDS的可能的治疗剂。正如本文证明的，Exodus抑制HIV增殖的能力表明Exodus蛋白产物在预防AIDS发病或进程或在促进接触HIV后对HIV感染抗性方面亦将有益于治疗AIDS患者。感染HIV后不会立即出现AIDS完全发病；在可变时间范围内患者保持健康但表现出病毒血症。这种病毒血症由病毒复制和再感染血细胞的连续周期维持。一项研究发现测定血浆病毒载量(以及CD4淋巴细胞计数)可以预测后续AIDS或死亡风险。[Ho,Science,272:1124-1125(1996).]。因此干扰病毒复制的连续周期可以导致改善的预后。
另外，已建立的化学激活素表达与炎性疾病和疾病状态的相互关系提供了使用Exodus蛋白产物包括特异性与Exodus起免疫反应的抗体物质的诊断和预后指症。这类Exodus材料可以用于诊断和评价炎症性疾病条件和疾病状态的预后以及涉及这种条件和疾病状态区域的医学成像方法中。
在考虑了下述描述本发明目前优选实施例的对本发明的详细描述后，本发明的很多其它方面和优点对本领域技术人员是显而易见的。
附图简述
图1显示各种浓度Exodus对单核细胞趋化性的影响。
图2显示未处理和CAN处理的Exodus对小鼠血细胞生成的影响。
图3显示Exodus单独或与MCP-1或MIG一起对小鼠造血祖细胞细胞周期的影响。
图4显示Exodus对骨髓细胞系MO7E增殖的影响。
图5显示Exodus对骨髓细胞系TF-1增殖的影响。
图6显示纯化的合成Exodus对骨髓细胞系MO7E增殖的影响。
图7显示Exodus对感染HIV后单核细胞释放HIV p24蛋白的影响。
图8显示纯化的合成Exodus蛋白产物对感染HIV后单核细胞释放HIV p24蛋白的影响。
发明详述
本发明基于鉴别编码Exodus的cDNA序列和Exodus活性的表征。
化学激活素Exodus的全cDNA的长度是821个核苷酸。于第786位有一共有多聚腺苷酸化位点。3’不转译序列有一些在许多细胞因子基因中介导mRNA稳定性的AAAU序列。这些序列促进信息降解并是许多细胞因子转录物(包括化学激活素)半衰期短的原因之一。有一个短的43个核苷酸的5’不转译区。
在Exodus的推断氨基酸序列中有95个氨基酸。这与C-C化学激活素家族一致，该家族成员的长度范围为91-99。Exodus的首22个氨基酸组成一个强疏水性信号肽。定义该家族的参与二硫键的四个半胱氨酸亦保存在Exodus中。在氨基酸水平上Exodus与MIP-1α和RANTES关系最密切(相同性为26-28％)，当考虑保守变化时，约75％相似性。Exodus与RANTES在氨基酸24-46和58-75上特别相似，在这些位置中间仅有6个非保守变化。
虽然Exodus具有其它人类C-C化学激活素的最多保守氨基酸特征，但Exodus的几个独特的特征值得注意。Exodus有一个高度碱性的羧基末端，与RANTES相比与MCP亚家族更一致。另外，Exodus于第47和51位分别缺失一个保守酪氨酸和苏氨酸，这二者在所有其它人类C-C化学激活素包括RANTES中都存在。不清楚这二个高度保守氨基酸是否在C-C化学激活素活性中的作用，因为预期它们不接触该受体。
通过考虑下列描述性实施例，会理解本发明的各种方面和优点。实施例1描述Exodus cDNA的鉴别。实施例2描述检测Exodus基因在各种人类细胞系和组织中表达方式的实验。实施例3描述该Exodus基因在哺乳动物细胞中的重组表达。实施例4描述该Exodus基因在哺乳动物细胞中重组表达的另一方法和纯化产生的蛋白。实施例5提供在原核细胞中表达该Exodus基因和纯化产生蛋白的方法。实施例6提供在酵母或无脊椎动物细胞中重组生产Exodus的方法。实施例7描述通过肽合成或重组生产方法生产Exodus和Exodus类似物。实施例8提供产生与Exodus特异性免疫反应的单克隆抗体的方法。实施例9论述Exodus体外对单核细胞趋化性的影响。实施例10论述Exodus对骨髓祖细胞、骨髓细胞系和慢性髓细胞性白血病祖细胞增殖的影响。实施例11论述Exodus对HIV p24蛋白产生的影响。实施例12、13、14和15提供化学引诱剂和白细胞激活、肿瘤生长抑制、腹膜内或皮下注射后白细胞激活的体内检测。实施例16描述Exodus受体的克隆。
实施例1
编码Exodus的cDNA序列的鉴别
如Takeda等(Human Mol.Genetics,2:1793-1798(1993))所述，从解剖的正常成人胰岛细胞制备信使RNA，用含有一个XhoⅠ位点的引物通过寡聚(dT)引物法合成第一链cDNA。在第二链cDNA合成和钝化后，将EcoRⅠ连接物连接至该cDNA，然后对后者进行大小分级分离以除去大小小于1000个碱基对的产物。用XhoⅠ消化后，将产物克隆至λZAPⅡ，并在XL1-Blue MRF细胞(Stratagene,La Jolla,CA)中扩增。按照制造商说明书通过解救pBluescript SK将该文库转化为质粒。通过单程自动测序确定这些随机分离的胰岛细胞cDNA的1000的部分序列。这些序列保存于GenBank(Takeda等，见上述)并与国立生物技术情报中心数据库(NCBI)的其它序列比较。用于比较的cDNA序列的平均长度约为200bp。该工作已发表于Takeda等，见上述。
紧接着Takeda等的工作，按下述从这些1000个胰岛细胞表达序列标记(ESTs)中鉴别出编码Exodus的克隆。用NCBI的BLAST服务将一共有化学激活素序列与这些ESTs比较，发现其中一个克隆具有与C-C化学激活素家族的远缘同源性。在用手动双脱氧双链测序鉴别出初始自动通过的几个测序错误并正确地表征该编码区和读框后，这种与该化学激活素家族的同源性得以增加。这个最初由Takeda等命名为HBC2850的克隆与任何其它已知化学激活素都不相同。该克隆的cDNA由821个核苷酸组成，含有该化学激活素蛋白的完整开放读框。将此化学激活素命名为Exodus。
SEQ ID NO:1列出的该Exodus cDNA序列与Takeda等的EST序列之间的差异如下(以SEQ ID NO:1中的核苷酸号码为参照)：于核苷酸64(Exodus中为“C”)，该EST核苷酸为“N”；于核苷酸71(Exodus中为“C”)，该EST核苷酸为“N”；在核苷酸130和131之间，EST含有一个额外的“G”碱基，导致该读框移位；在核苷酸150和151之间，该EST含有一个额外的“T”碱基，导致该读框移位；于核苷酸193(Exodus中为“C”)，该EST核苷酸为“N”；于核苷酸196(Exodus中为“C”)，该EST核苷酸为“N”；于核苷酸271(Exodus中为“A”)，该EST核苷酸为“N”；和于核苷酸309(Exodus中为“T”)，该EST核苷酸为“GC”。
实施例2
Exodus基因在细胞系和组织中的表达方式
通过Northern印迹分析从各种人体组织和细胞系提取的mRNA，检测Exodus mRNA表达方式。所用的探针为含有完整Exodus编码区的cDNA，用琼脂糖凝胶电泳分离，按照制造商说明书(BMB,Indianapolis,IN)用随机引物法进行32P-dCTP和32P-dTTP(DuPont-NEN,Boston,MA)标记。A.Exodus基因在人体组织中的表达
按照制造商说明书用RNA STAT-60(Tel-Test B Inc.,Friendswood,TX)从细胞系和培养单核细胞中分离RNA。将总RNA(20μg)在0.8％甲醛琼脂糖凝胶上分级分离，转移至硝酸纤维素，在严格条件下杂交并清洗。将底片于-80℃用增感屏曝光一天。
按照制造商说明书在严格条件下亦用该Exodus cDNA探针检测人多种组织Northern印迹和人免疫系统多种组织Northem(Clontech,Palo Alto,CA)并清洗。将放射自显影如上述曝光1-4天。
看来Exodus具有很有限的表达方式。它在很多受测试的细胞系(包括TMR323成神经细胞瘤、MDA乳腺癌、K562红白血病、JurkatT-细胞白血病、HL60前髓细胞白血病、用视黄酸分化为粒细胞的HL60细胞、3T3胚性成纤维细胞或293胚性肾细胞)中不表达。当用多种正常人体组织的市售Northern印迹分析Exodus表达时，在肺中检测到表达，而在心脏、大脑、胎盘、成人肝脏、骨骼肌、肾脏、胰脏、脾脏或骨髓中未检测到表达。转录物的大小约0.9kB，假如加上一polyA尾，则与本文报道的cDNA大小一致。
然而，当用淋巴组织的市售Northern印迹检测Exodus表达时，发现它在几种不同的淋巴器官中高度表达。Exodus在外周淋巴结、阑尾、外周血单核细胞和胎肝中高度表达。它在胸腺中表达略低，而在脾脏和骨髓中未检测到表达。
这是许多化学激活素的典型表达方式。Exodus主要在淋巴组织特别是淋巴结、阑尾和外周血中表达。可能用于此Northern印迹分析的该淋巴组织可以被一些免疫刺激物激活，由此导致比正常水平高的Exodus表达。与在外周血中相反，Exodus在骨髓中表达差可能是因为骨髓主要由未成熟骨髓和红细胞前体组成，而在外周血中有多的多的成熟单核细胞。B.炎症刺激后的Exodus基因表达
因为许多化学激活素的表达是由炎症刺激在单核细胞中诱导的，所以用Northern印迹分析法分析各种细胞系接触LPS、TNF-α或PMA后Exodus的表达。
从美国典型培养物保藏中心(Rockville,MD)获得单核细胞系THP-1。将细胞保持于添加了10％胎牛血清(FCS,Hyclone Laboratories,Inc.,Logan,Utah)、25Mm HEPES、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(组织培养抗生素，Life Technologies,Gaithersburg,MD)的RPMI1640培养基(Biowhitaker,Walkersville,MD)。为进行刺激实验，将细胞在有佛波醇酯(PMA,Signa,St.Louis,MO)存在的条件下于一百万细胞每毫升的密度下培养。
从俄勒冈州大学的Jay Nelson博士获得无限增殖化人体脐静脉内皮细胞系1-HUVEC，并培养于添加了10％FCS(Hyclone)、400μg/mlG418(Life Technologies,Grand Island,NY)、1u/ml肝素(Sigma)和30μg/ml内皮细胞生长因子(Collaborative Biomedical Products,Bedford,MA)RPMI 1640上至会合70-80％，然后在有或无10ng/ml肿瘤坏死因子-α(TNF-α,Peprotech,NJ)的情况下培养不同时间。
在Histopaque梯度(Signa)上纯化外周血单核细胞，并通过塑料吸附分离单核细胞。将单核细胞培养6天，每2天更换培养基一次，以使之分化成巨噬细胞。用100ng/nl脂多糖(LPS,Sigma)刺激细胞不同的时间。
当外周血单核细胞接触LPS 8或12小时后，高度诱导Exodus表达。当脐静脉内皮细胞接触TNF-α仅3小时后，又高度诱导Exodus表达。值得注意的是，只要有炎症刺激物存在，就保持Exodus高度表达。当用PMA处理单核细胞白血病细胞系THP-1时，亦诱导Exodus表达，并在接触48小时后达到表达峰值，然后略微下降。
这些结果表明除非炎症刺激存在，否则Exodus表达很差。然而，一旦存在这种刺激物，则Exodus立即和稳定地被增量调节。该刺激物本身的性质亦不受限制，LPS、TNF-α和PMA均增量调节Exodus。Exodus的产生看来是成熟淋巴吞噬细胞(特别是在炎症刺激后)的功能，而不是未成熟骨髓细胞的功能。
实施例3
在COS细胞中生产重组Exodus
通过将该Exodus cDNA瞬时转染入COS细胞生产重组Exodus。用常规限制位点将全长Exodus cDNA以有义定位亚克隆入SV-40驱动的表达载体pECE[Ellis等，Cell,45:721(1986)]的多接头位点。将对数期的COS细胞(美国典型培养物保藏中心(ATCC)CRL 1651号)以每个100mm培养皿100万细胞的密度接种于含有10％FCS(Hyclone)和100U/ml青霉素以及100μg/ml链霉素(组织培养抗生素，Life Technologies,Gaithersburg,MD)的DMEM并培养过夜。按照制造商的说明书用Lipofectin(Life Techologies,Bethesda,MD)，用每平皿20μg纯化的pECE-Exodus质粒DNA转染所述COS细胞。做为对照，将纯化的pECE质粒(无Exodus DNA)同样转染入COS细胞。将具有报道基因β-半乳糖苷酶的表达载体(SV40/β-Gal,Pharmacia,Piscataway,NJ)共转染以控制转染效率。72小时后，用0.2μm滤器过滤该COS细胞培养物的上清液并将其储存于-70℃。除去上清液后，制备细胞溶胞产物并按Rosenthal先前所述(Meth.Enzymol.,152:704(1987))检测β-半乳糖苷酶活性。当进行pECE和pECE-Exodus转染时，用β-半乳糖苷酶活性测定的同时转染效率在各自的10％之内。
实施例4
在CHO细胞生产重组Exodus及其纯化
用PCR扩增该Exodus cDNA(示于SEQ ID NO:1)的第30-330碱基，该cDNA包括13bp的5’非编码序列和3bp的3’非编码序列。所述PCR引物的序列是：5’-GGCGAAGCTTTGAGCTAAAAACCATG(SEQ ID NO:3)和5’-GCGGGAATTCTTACATGTTCTTGACT(SEQID NO:4)。为便于克隆，这些引物分别包含HindⅢ和EcoRⅠ限制位点(用斜体表示)。将该片段克隆入载体pDC1(描述于于1995年11月16日申请的共同拥有、共同未决的美国专利申请序号08/558,658号，该专利通过引用结合到本文中)，该载体是pBR322衍生物，它含有与该克隆位点相邻的CMV立即早启动子以便于表达该插入物，并且含有细菌β-内酰胺酶基因和鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因以分别在细菌和哺乳动物细胞中进行质粒的筛选(Sambrook等，见上述)。将含有该Exodus插入物的该构建物用在该载体序列内切割的PvuI(BMB,Indianapolis,IN)限制消化而线性化。该线性化质粒用乙醇沉淀并重新溶于HBS(20mM HEPES-NaOH,pH7.0；137mM NaCl,5mM KCl；0.7mM Na2HPO4；6mM右旋糖)。为进行电穿孔，将107该CHO细胞系DG44[Urlab等，Cell,33:405(1983)]在细胞清洗，再悬浮在1ml PBS中，与10微克的线性化质粒混合并转移至0.4cm的电穿孔杯中。用Biorad基因脉冲发生器(Gene Pulser)(Richmond,CA)于290伏、960微法兰第对该悬浮液进行电穿孔。在含有10％透析FCS(Hyclone,Logan,UT)并缺乏次黄嘌呤和胸苷的DMEM/F12培养基(Gibco)上培养以挑选转化体。将来自几百个转化集落的细胞混合并再接种于含有20nM氨甲蝶呤(Sigma,St.Louis,MO)的DMEM/F12培养基。分离该轮选择生存的集落并扩增以得到单个克隆。如下测定Exodus表达水平。
将克隆在组织培养平板上于含有10％透析FCS的DMEM/F12培养基中培养至约90％会合时，更换该培养基。使所述细胞在含有1％透析FCS的EMEM/F12培养基中生长4天。将上清液上HeparinSepharose CL-6B(Pharmacia,Piscataway,NJ)柱。该柱用含有0.2M NaCl的20mM Tris,pH7.5清洗，并用含有0.6M NaCl的20mM Tris,pH7.5洗脱该化学激活素。将该洗脱的Exodus用SDS-PAGE通过18％Tris甘氨酸凝胶(NOVEX,San Diego,CA)分级分离并转移至PVDF膜(Millipore,Bedford,MA)上。通过用Exodus特异性兔多克隆抗血清(按以下实施例8所述制备)检测而确认迁移至约7kD的该Exodus条带。
可以将Exodus化学激活素表达水平最高的克隆扩增以进行大规模蛋白生产。按下述从该上清液生产和纯化得到的重组Exodus。将迁移至约7kD的该Exodus条带切下并在自动测序仪(Applied Biosystems,473A型，Foster City,CA)上对N末端测序。
做为进一步的纯化步骤，将从该Heparin-Sepharose柱洗脱的Exodus加至1.6M NaCl并上HI-Propyl 40微米树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ)柱。用含有1.6M NaCl的20mM Tris,pH7.5清洗该柱，用20mM Tris,pH7.5洗脱该Exodus。
通过氨基酸分析以确认蛋白测序预测的氨基酸比例并通过质谱法(mass spectrophotometry)确认预测的大小而确证该洗脱Exodus的完整性。
实施例5
在细菌中生产重组Exodus
以下是在细菌中重组表达Exodus并纯化得到的产物的典型方法。
用PCR扩增编码该蛋白成熟形式的DNA序列并克隆入载体pGEX-3X(Pharmacia,Piscataway,NJ)。设计该pGEX载体使产生融合蛋白，该融合蛋白包含由该载体编码的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和由插入该载体克隆位点的DNA片段编码的蛋白。该PCR的引物是SEQ IDNO:4和5’-TAT CGG ATC CTG GTT CCG CGT GAA TCA GAA GCAAGC AAC T-3’，它含有一个BamHi限制位点、一个凝血酶切割位点[Chang,Eur.J,Biochem.,151:217(1985)]和SEQ ID NO:1的第109-127核苷酸。用BamHⅠ和EcoRⅠ消化得到的PCR产物并插入用BglⅡ和EcoRⅠ消化的质粒pGEX-3X。
用凝血酶或因子Xa(Pharmacia,Piscataway,NJ)处理该重组融合蛋白预期切割该融合蛋白，从该GST蛋白释放该化学激活素。将该pGEX-3X/Exodus构建物转化入大肠杆菌XL-1蓝细胞(Stratagene,LaJolla CA)，分离各个转化体并使之生长。从各个转化体纯化质粒DNA并用自动测序仪部分测序以确认所需Exodus基因插入物以正确定位存在。
将该转化XL-1蓝培养物于37℃在LB培养基(添加了羧苄青霉素)上生长至600nm波长的光密度为0.4，接着在有0.5mM异丙基β-D-硫代半乳吡喃糖(Sigma Chemical Co.,St Louis MO)的情况下进一步培养4小时以达到诱导该GST/Exodus融合蛋白。
可以如下述纯化预期做为细菌内不溶性包涵体产生的该融合蛋白。离心收获细胞；在0.15M NaCl、10mM Tris、pH8、1mM EDTA中清洗；用0.1mg/ml溶菌酶(Sigma Chemical Co.)于室温处理15分钟。通过超声处理澄清该裂解液，于12,000Xg离心10分钟使细胞碎片沉淀。将含有融合蛋白的沉淀再悬浮于50mM Tris,pH8和10mM EDTA中，铺于50％甘油上，于6000Xg离心30分钟。将该沉淀再悬浮于不含Mg++和Ca++的标准磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)中。通过将该再悬浮沉淀于变性SDS聚丙烯酰胺凝胶(Sambrook等，见上述)中分级分离进一步纯化该融合蛋白。将该凝胶浸泡于0.4M KCl以显现该蛋白，将该蛋白切下在缺乏SDS的凝胶电泳缓冲液中电洗脱。如果该GST/Exodus融合蛋白在细菌中以可溶蛋白产生，则可以用GST纯化组件(Purification Module)(Pharmacia Biotech)纯化。
可以将该融合蛋白进行凝血酶消化，以将该GST从该成熟Exodus蛋白切割出来。将消化反应物(20-40μg融合蛋白，在0.5ml PBS中有20-30单位人凝血酶(4000 U/mg(Sigma))于室温培育16-48小时并上变性SDS-PAGE凝胶以分级分离该反应蛋白。将该凝胶浸泡于0.4M KCl以显现该蛋白条带。可以通过用自动测序仪(Applied Biosystems 473A型，Foster City,CA)进行部分氨基酸序列分析，确认对应于预期Exodus分子量的蛋白条带的身分。
另一方面，可以将编码预期成熟Exodus蛋白的该DNA序列克隆入含有所需启动子和可选地前导序列[参见例如Better等，Science,240:1041-43(1988)]的质粒。可以通过自动测序确认该构建物的序列。然后采用标准方法使用CaCl2培育和对细菌进行热震处理(Sambrook等，见上述)将该质粒转化入大肠杆菌菌株MC1061。将该转化细菌在添加了羧苄青霉素的LB培养基上生长，并通过在适当培养基上生长诱导该表达蛋白的产生。如果存在，则该前导序列将导致该成熟Exodus蛋白分泌并在分泌后被切割。
通过上述实施例4描述的方法或例如采用以前描述的纯化重组产生的RANTES化学激活素[Kuna等，J.Immunol.,149:636-642(1992)]、MGSA化学激活素[Horuk等，J.Biol.Chem.268:541-46(1993)]和IP-10化学激活素(在昆虫细胞中表达)[Sarris等，J.Exp.Med.,178:1127-1132(1993)]的方法，从该细菌培养基中纯化该分泌的重组蛋白。
实施例6
在酵母或无脊椎动物细胞中重组生产Exodus
以下是在酵母或无脊椎动物细胞中重组表达Exodus并纯化得到的产物的典型方法。
用PCR扩增该Exodus cDNA的编码区。用含有α接合因子基因第1-20核苷酸的引物和与该基因的255-235核苷酸互补的另一引物[Kurjan和Herskowitz,Cell,30:933-943(1982)]，在PCR反应中从酵母基因组DNA扩增编码酵母前原α前导序列的DNA。将该前原α前导编码序列和Exodus编码序列片段连接入含有酵母乙醇脱氢酶(ADH2)启动子的质粒，使得该启动子指导表达由融合到该成熟Exodus多肽的该前原α因子组成的融合蛋白。如Rose和Broach(Meth.Enz.185:234-279,D.Goeddel编辑，Academic Press,Inc.,San Diego,CA(1990))所指出的，该载体另外含有在克隆位点下游的ADH2转录终止子、酵母“2微米”复制起点、酵母leu-2d基因、酵母REP1和REP2基因、大肠杆菌β-内酰胺酶基因和大肠杆菌复制起点。β-内酰胺酶和leu-2d基因分别提供在酵母和大肠杆菌中的筛选。该leu-2d基因亦促进增加质粒在酵母中的拷贝数以诱导高水平的表达。REP1和REP2基因编码参与调节该质粒拷贝数的蛋白。
用已知方法例如乙酸锂处理[Stearns等，Meth.Enz.，见上述，第280-297页]将前段描述的DNA构建物转化入酵母细胞。生长培养基中葡萄糖耗竭时诱导该ADH2启动子[Price等，Gene,55:287(1987)]。该前原α序列导致该融合蛋白从细胞分泌。酵母KEX2蛋白将相伴地该前原序列从该成熟Exodus化学激活素切割出来[Bitter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:5330-5334(1984)]。
另一方面，用市售表达系统例如Pichia表达系统(Invitrogen,SanDiego,CA)，按照制造商说明书在酵母中重组表达Exodus。该系统亦依赖该前原α序列指导分泌，但由甲醇诱导时由乙醇氧化酶(AOX1)启动子驱动该插入物的转录。
用例如用于从细菌核哺乳动物上清液纯化Exodus的方法(参见上述实施例4和5)，从该酵母生长培养基中纯化分泌的重组Exodus。
或者，将编码Exodus的cDNA克隆入杆状病毒表达载体pVL1393(PharMingen,San Diego,CA)。然后按照制造商说明书(PharMingen)用该含有Exodus的载体感染sF9无蛋白培养基中的草地贪夜蛾细胞并产生重组蛋白。用肝素-Sepharose柱(Pharmacia,Piscataway,NJ)和连续分子筛分柱(Amicon,Beverly,MA)从该培养基中纯化和浓缩该蛋白并再悬浮于PBS中。SDS-PAGE分析显示一个单一条带并确认该蛋白的分子量，在Porton 2090肽测序仪上的Edman测序确认了其N末端序列。
实施例7
生产Exodus类似物
可以用诸如先前实施例中描述的重组技术制备Exodus多肽类似物。更详细地说，使用已知技术例如定点诱变和聚合酶链式反应修饰编码Exodus的多聚核苷酸，以编码目的多肽类似物。一般参见Sambrook等，见上述，第15章。重组表达该修饰多聚核苷酸，用先前实施例所述方法纯化该重组多肽类似物。
例如通过与其它C-C化学激活素的同源性和通过用丙氨酸替代天然Exodus氨基酸残基，鉴别Exodus活性的关键残基。半胱氨酸通常对蛋白功能完整性很关键，因为它们具有形成二硫键的能力。为确定Exodus中的四个半胱氨酸的任一个对酶活性是否重要，将每个半胱氨酸单独突变为丝氨酸。
其它典型的类似物包括设计用来造成与其最紧密相关的化学激活素同源性更高的Exodus氨基酸序列中的置换。设计用于造成与C-C化学激活素家族同源性更高的置换包括将成熟蛋白序列中第31位的丙氨酸替换为苏氨酸、或将第26位的苯丙氨酸用酪氨酸替换。其它产生与MIP-1α、MIP-1β和RANTES更高同源性的置换包括用MIP-1α的第1-10残基或RANTES的第1-9残基置换Exodus的第1-8残基、用苯丙氨酸取代第11位的亮氨酸、用丝氨酸取代第12位的甘氨酸、用谷氨酸取代第25位的甘氨酸、用丝氨酸取代第36位的谷氨酸、用谷氨酰胺取代第46位的丝氨酸、用酪氨酸取代第60位的异亮氨酸、和用天冬氨酸取代第67位的丝氨酸。可以单个或以所有组合进行这些取代，并预期它们具有增强Exodus在骨髓抑制或抑制HIV产生方面的活性的潜力。
设计用来增强给定位置氨基酸特性的其它取代(例如，如果一氨基酸是疏水性的，则取代物的疏水性更强)亦可以增强Exodus的活性：用天冬氨酸取代第6位的天冬酰胺、用异亮氨酸取代第18位的亮氨酸、用谷氨酸取代第29位的谷氨酰胺、用天冬氨酸取代第38位的天冬酰胺、用异亮氨酸取代第50位的缬氨酸和用谷氨酸取代第56位的谷氨酰胺。可以单个或以所有的组合进行这些取代。
可以通过例如用核酸外切酶Ⅲ消化Exodus编码序列的3’末端不同的时间、然后将该缩短的编码序列连接至编码所有三个读框中的终止密码子的质粒DNA而制备C末端缺失。用类似方法通过消化该编码序列的5’末端，并然后将该消化片段连接至包含启动子序列和恰好在该启动子上游的起始甲硫氨酸的质粒而制备N末端缺失。亦可以将这些N末端缺失做为融合蛋白表达。
或者，亦可以用已成功地用于生产其它化学激活素例如IL-8[Clark-Lewis等，J.Biol Chem.,266:23128-34(1991)]和MCP-1的技术，通过化学肽合成制备Exodus多肽类似物。这类方法是优越的，因为它们快速、对例如化学激活素的短序列可靠，并允许选择性第导入新的、非天然氨基酸和其它化学修饰。
Exodus类似物对涉及炎症过程的一种或多种类型的细胞(例如，T淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜碱细胞、嗜酸性细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、内皮细胞、上皮细胞或其它细胞)的性质通过本领域认可的、已用于检测许多其它化学激活素的性质的技术检测。也按照下述实施例10和11检测Exodus类似物抑制骨髓增生和HIV产生的性质。
实施例8
制备Exodus的抗体
基本上按照实施例7所述化学合成Exodus化学激活素。为储存，将Exodus稀释于含有1％牛血清白蛋白(Sigrna,St.Louis,MO)的RPMI培养基中。接着通过肝素Sepharose CL-6B柱(Pharmacia,Piscataway,NJ)，从该培养基纯化Exodus。用0.2M NaCl和20mM Tris,pH7.5的溶液清洗该柱，用0.6M NaCl和20mM Tris,pH7.5洗脱该化学激活素。
为产生多克隆抗血清，将50μgExodus在弗氏完全佐剂中乳化以免疫兔子。以21天的间隔，将50μgExodus在弗氏不完全佐剂中乳化以加强免疫。这些抗血清在Western印迹上识别该化学合成Exodus和CHO细胞来源的Exodus(按照实施例4所述制备)。
为产生Exodus的单克隆抗体，用实施例3-7的任一项得到的重组Exodus(例如在弗氏完全佐剂中乳化的10-20μg)周期性地注射小鼠。用PBS中的Exodus对该鼠进行最后融合前加强注射，四天后，杀死该小鼠并取出其脾脏。将该脾脏置于10ml无血清RPMI 1640中，将脾脏在浸泡于无血清RPMI 1640中的二片冷冻的玻璃显微镜载玻片的末端之间研磨制得单细胞悬浮液，该RPMI 1640添加了2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素(RPMI)(Gibco,Canada)的。将该细胞悬液通过无菌的70目Nitex细胞滤过器(BectonDickinson,Parsippany,New Jersey)过滤，并通过于200g离心5分钟清洗二次，并将沉淀再悬浮于20ml无血清RPMI。用类似方法制备从三只首次用于实验的Balb/c小鼠取出的脾细胞并用做对照。将在融合前在含有11％胎牛血清(FBS)(Hyclone Laboratories,Inc.,Logan,Utah)的RPMI中以对数期保存的NS-1骨髓瘤细胞于200g离心5分钟，按照上述段落将沉淀清洗二次。
将1×108脾细胞与2.0×107NS-1细胞混合并离心，吸去上清液。轻敲试管使细胞沉淀移动，在1分钟加入1ml 37℃ PEG 1500(在75mM Hepes,pH 8.0中50％)并搅拌，接着用7分钟加入7ml无血清RPMI。另外加入8ml RPMI并将细胞于200g离心10分钟。除去上清液后，将沉淀再悬浮于200ml含有15％FBS、100μM次黄嘌呤钠、0.4μM氨基蝶呤、16μM胸苷(HAT)(Gibco)、25单位/ml IL-6(Boehringer Mannheim)和1.5×106脾细胞/ml的RPMI，并接种于10个Cornmg平底96孔组织培养板(Commg,Cornmg New York)。
融合后第2、4和6天，从所述融合平板的孔中取出100μl培养基并用新鲜培养基替换。第8天，用ELISA筛选融合，按下述检测与Exodus结合的鼠IgG的存在。用100ng/孔在25 mM Tris,pH7.5中稀释的Exodus将Immulon 4板(Dynatech,Cambridge,MA)于37℃包被2小时。吸出包被溶液并加入200μl/孔封闭溶液[稀释于CMF-PBS的0.5％鱼皮胶(fish skin gelatm)(Sigma)]并于37℃培育30分钟。用含有0.05％吐温20(PBST)的PBS将板清洗三次，并加入50μl培养上清液。于37℃培育30分钟后，如上述进行清洗，加入在PBST中稀释至1∶3500的50μl结合辣根过氧化物酶的山羊抗鼠IgG(fc)(JacksonImmunoResearch,West Grove,Pennsylvania)。如上述培育板，用PBST清洗四次，加入由100mM柠檬酸，pH4.5中的1mg/ml邻苯二胺(Sigma)和0.1μl/ml 30％H2O2组成的100μl底物。5分钟后加入50μl 15％H2SO4终止颜色反应。在读板仪(Dynatech)上测定A490。
将选择的融合孔通过稀释至96孔板并于5天后目视计数每孔的集落数而克隆二次。用Isostrip系统(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)将杂交瘤产生的单克隆抗体同种型化。
实施例9
Exodus对单核细胞趋化性的作用
按照先前Martinet等(J.Immunol.Meth.,174:209,1994)和Keller等(J.Immunol.Meth.,1:165,1972)所述，进行趋化性检测以评价Exodus的活性。在10ml肝素化的试管中从健康志愿者收集20ml外周血。用PBS 1∶1稀释血液，然后用10ml Histopaque(Sigma)铺垫。于400g离心25分钟后，收集在界面处的细胞并在用PBS中清洗二次。将细胞以106/ml再悬浮于含有100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(组织培养抗生素，Life Technologies)的DMEM(Life Technologies,Gaithersburg,MD)。加入无菌的牛血清白蛋白(Sigma)至最终浓度为0.2mg/ml。
向每个转孔插入物(transwell insert)(Costar)加入100μl的该细胞悬浮液。将含有抗生素和0.2％BSA和含或不含纯合成Exodus的DMEM加入该24孔板的下部孔。所有的Exodus浓度都做三份检测。将转孔插入物置于所述下部孔中，并于37℃培育90分钟。培育结束后，取出插入物并用橡胶淀帚擦该滤器的顶部以除去附着的细胞。然后用Wright-Giemsa将整个插入物染色。在三个高功率场下计数附着在该插入物下表面和迁移至下部孔的细胞，求和得出迁移细胞的总数。
以5、50和500ng/ml的浓度测试纯化的合成Exodus。为比较，以833ng/ml的浓度测试MIP-α。对照不含化学激活素。结果示于图1。数值代表以三份进行的二个实验的平均值并加上或减去标准差。星号代表在p＜0.05下用未配对“学生”t检验与对照在统计学上差异显著。
这些结果表，如以转移孔迁移测试的，Exodus刺激正常人外周血单核细胞的趋化活性。最高浓度的Exodus比最有效浓度的MIP-1α更有效地刺激趋化性。
用Exodus蛋白产物(在残基4后有一额外的丙氨酸的Exodus)得到了类似的结果。
实施例10
Exodus对骨髓细胞增殖的作用A．对骨髓祖细胞的作用
基本上按照先前在例如Broxmeyer等(Blood,76:1110(1990))中所述，检测Exodus蛋白产物对造血集落形成的影响。在得到许可后，从献血者采集骨髓细胞。将低密度的5×104/ml的人骨髓细胞接种于含有1％甲基纤维素的Iscove改良基本培养基(Biowhitaker,Walkersville,MD)，该培养基添加了30％FCS(Hyclone)、重组人红细胞生成素(EPO,1U/ml,Amgen,Thousand Oaks,CA)、重组人白介素-3(IL-3,100U/ml,Immunex,Seattle,WA)和重组人干细胞因子(SCF,50ng/ml,Amgen)，所述重组人干细胞因子用于粒细胞/巨噬细胞的集落形成单位(CFU-GM)、粒细胞/红细胞/巨噬细胞/巨核细胞的集落形成单位(CFU-GEMM)或红细胞爆增形成单位(BFU-E)的分析。在5％CO2和低氧压(5％)下培养培养物14天，以盲法用倒置显微镜计数集落形成。至少以三份进行实验二次。
在该检测中测试含有按照上述实施例3制备的Exodus的不同量的COS细胞上清液和50ng/ml的MIP-1α(R&D Systems,Minmeapolis,MN)。结果示于下表1，该表展示了每个平板的造血祖细胞集落的平均计数加上或减去标准差。
表1
*p＜0.005(其它数值与对照无显著差异或pECE是在p＜0.05)
| 培养基中的化学激活素 | CFU-GM | BFU-E | CFU-GEMM |
| 对照(无化学激活素) | 53±8 | 56±8 | 24±5 |
| MIP-1α 50ng/ml | 23±4* | 37±3* | 12±1* |
| Exodus COS细胞上清液(2ml总培养基中有0.2ml) | 21±3* | 29±2* | 11±1* |
| Exodus COS细胞上清液(2ml总培养基中有0.1ml) | 24±4* | 27±5* | 11±2* |
| Exodus COS细胞上清液(2ml总培养基中有0.05ml) | 23±5* | 36±3* | 14±1* |
| Exodus COS细胞上清液(2ml总培养基中有0.025ml) | 47±8 | 58±6 | 24±1 |
| 仅有pECE COS的细胞上清液(2ml总培养基中有0.2ml) | 50±6 | 60±7 | 23±3 |
在COS细胞上清液中的Exodus以剂量依赖性方式抑制造血祖细胞集落形成，比最大剂量的MIP-1α效率略高。在单独的COS细胞培养基和转染了空白pECE表达载体的COS细胞培养基之间没有统计学差异。当重组人MIP-1α为50ng/ml时(在该剂量时该生物学效应达到平稳状态)，CFU-GM(培养基对照的43％)、BFU-E(对照的66％)和CFU-GEMM(对照的50％)都有统计学显著减少。在这些实验中使用的重组Exodus的最高浓度下，CFU-GM(培养基对照的42％)、BFU-E(对照的48％)和CFU-GEMM(对照的48％)都有统计学显著降低。
Exodus的该抑制是剂量依赖性的，在于通过集落形成检测测定的该三个最高水平的Exodus显示抑制造血祖细胞的增殖。然而，使用的最低浓度的Exodus未显示此种抑制。与MIP-1α一样，Exodus以多谱系方式抑制祖细胞。
在该检测中亦测试了纯化的合成Exodus。结果示于下表2，该表展示了每个平板的造血祖细胞集落的平均计数加上或减去标准差。
表2
| 培养基中化学激活素的浓度 | CFU-GM | BFU-E | CFU-GEMM |
| 对照(无化学激活素) | 85±3 | 97±4 | 39±3 |
| Exodus(200ng/ml) | 43±11 | 43±2 | 19±3 |
| Exodus(100ng/ml) | 39±3 | 41±2 | 20±2 |
| Exodus(50ng/ml) | 42±10 | 42±3 | 17±2 |
| Exodus(25ng/ml) | 41±2 | 50±2 | 20±4 |
| Exodus(12.5ng/ml) | 51±3 | 70±10 | 27±1 |
| Exodus(6.25ng/ml) | 64±8 | 87±3 | 32±2 |
| MIP-1α(100ng/ml) | 41±2 | 44±3 | 19±2 |
| IL-8(100ng/ml) | 42±2 | 44±2 | 19±2 |
| PF-4(100ng/ml) | 42±4 | 44±5 | 19±1 |
| RANTES(100ng/ml) | 81±7 | 99±4 | 37±1 |
| NAP-2(100ng/ml) | 83±2 | 93±3 | 39±4 |
在Exodus浓度低至25ng/ml的情况下，所有三种类型的集落形成都有统计学显著(“学生”T检验)减少(p＜0.005)。该纯化的合成Exodux与COS细胞上清液中的Exodus表现一致。这二种来源的Exodus都有效地抑制造血骨髓祖细胞增殖，如果不比MIP-1α好，至少与它一样有效。
用纯化的合成Exodus蛋白产物(在残基4后有一额外的丙氨酸的Exodus)，通过集落形成检测测定，得到了显示抑制造血祖细胞增殖的类似结果。
这些结果显示Exodus蛋白产物抑制造血祖细胞的增殖。确实，Exodus蛋白产物与MIP-1α一样有效。这表明Exodus蛋白产物可以做为周期特异性化学保护剂使用。
另外的实验证实Exodus蛋白产物在小鼠体内对造血的影响。基本上按照Broxmeyer等(Ann.Hematol.,71:235-246(1995))所述进行实验，使用了未处理的纯合成Exodus和按照Mantel等(Proc.Natl.Acad,Sci,USA,90:2232-2236(1993))所述用30％乙腈/1％三氟乙酸(ACN)溶液处理的Exodus。对于以多体在溶液中存在的化学激活素，用ACN处理刺激形成单体，单体是体内活性形式，因此增强化学激活素活性。用ACN处理的化学激活素可以在比未处理的化学激活素浓度低200倍的情况下有活性。
简言之，制备浓度范围为0.001-50ng/ml Exodus的未处理Exodus和ACN处理的Exodus的溶液。将ACN处理或未处理的稀释剂做为对照以显示CAN无毒性。向正常C3H/HeJ小鼠静脉注射0.2ml剂量的每种溶液，并在24小时后杀死小鼠。从其股骨得到未分离的骨髓细胞并接种于或者评价CFU-GM)琼脂的含有10％(v/v)美洲商陆促细胞分裂剂的小鼠脾细胞条件培养基(PWMSCM)、或者评价BFU-E/CFU-GEMM的含有人红细胞生成素(Epogen_,Amgen,Thousand Oaks,CA)、PWMSCAM和氯高铁血红素(Eastman Kodak Co.,Rochester,NY)的甲基纤维素。在ESPEC N2-O2-CO2培养箱BNP-210(Taboi ESPECCorp.,South Plainfield,NJ)于5％CO2和5％O2下，在湿润环境中培养7天后测定集落计数。结果示于图2。
结果显示当注射单剂量0.2ml 25ng/ml Exodus时，未处理Exodus将CFU-GM集落形成降低至平均对照的56％。当注射单剂量0.2ml 0.1ng/ml Exodus时，ACN处理的Exodus将CFU-GM集落形成平均降低至对照的53％。当p＜0.05时，由ACN处理和未处理Exodus诱导的体内CFU-GM形成抑制在统计学上是显著的。
在另一实验中，基本按照Broxmeyer等(Ann.Hematol.，见上述)和Mantel等(Proc.Natl.Acad.Sci，见上述)所述，用氚标记胸苷杀伤实验评价未处理Exodus对造血祖细胞体内周期的影响。简言之，用不同浓度的单独的未处理Exodus(0.5、1或10ng/ml)或与其它未处理化学激活素结合(Exodus浓度为0.01或0.1ng/ml与或者0.01或0.1ng/ml的MCP-1或MIG)处理小鼠。然后，24小时后杀死所述动物，采集骨髓以进行氚标记胸苷杀伤实验。因为处于细胞周期的S期的细胞优先掺入胸苷，它们由于掺入氚标记胸苷而杀伤，不处于S期的细胞未受伤害。基于未用氚标记胸苷处理的细胞的对照集落数，通过计算杀伤细胞数估计处于S期的细胞数。所述值做为处于S期祖细胞的百分比报告，并按照每个股骨的祖细胞总数归一化。CFU-GM的结果示于图3。
结果显示，与处于S期CFU-GM的平均对照值的56％相比，单次注射10ng/小鼠的Exodus将处于细胞周期S期的CFU-GM祖细胞的百分比显著降至平均4％(p＜0.001)。另外，Exodus诱导的CFU-GM细胞周期进程抑制与MCP-1和MIG处理是协同的。当很低浓度的Exodus与MIG或MCP-1一起注射时，处于S期的CFU-GM降低得更多。因此，化学激活素的组合可以更有效地抑制造血。
这些结果表明Exodus可以暂停骨髓祖细胞细胞周期的进程，因此可以用于保护正常骨髓细胞免受S期细胞毒性化疗的影响。B．对骨髓细胞系的作用
亦检测了Exodus蛋白产物对细胞因子依赖性骨髓细胞系的作用。人骨髓细胞系TF-1和MO7E[Avanzi等，Brit.J.Haematol.,69:359(1988)]的最大增殖需要GM-CSF和SCF。将细胞因子依赖性原发性急性髓细胞性白血病细胞系TF-1和MO7E(均受赠于Hal Broxmeyer博士，印地安那大学，Indiana)培养于添加了10％FCS(Hyclone)和100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(组织培养抗生素，Life Technologies,Gaithersburg,MD)的RPMI 1640(Life Technologies,Gaithersburg,MD)。该培养基添加了正常对数期生长所需的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF,100U/ml,Immunex,Seattle,WA)和干细胞因子(SCF,50ng/ml,Amgen,Thousand Oaks,CA)。
以最终稀释度为1/10检测按照实施例3所述制备的COS细胞上清液中的Exodus。结果示于图4(MO7E细胞)和图5(TF-1细胞)。当将COS细胞上清液加入对数期MO7细胞时，在GM-CSF和SCF的存在下，后续72小时的增殖被降低至对照的10.4％。当将COS细胞上清液加入亦连续接触GM-CSF和SCF的对数期TF-1细胞时，增殖被完全抑制。Exodus没有细胞毒性作用，因为通过台盼蓝排染所评价的，在每个时间点Exodus处理的细胞具有超过95％的存活率，这与对照细胞的存活率相等。
如图6所示，纯化的合成Exodus亦完全抑制所述MO7E细胞增殖。每个数据点是四个独立实验的平均值。星号表示用配对t-检验在p＜0.05时的统计学显著性。加入Exodus亦未改变存活率。
这些结果表明Exodus亦可以用于治疗诸如慢性骨髓性白血病的骨髓组织增生性疾病。C．对慢性骨髓性白血病祖细胞的作用
按照Hromas等(Blood,89:3315-3322(1997))所述，用集落形成检测评价Exodus(亦称为“Exodus-1”)对慢性骨髓性白血病(CML)的祖细胞增殖的影响。简言之，从处于慢性期的6个CML患者采集骨髓细胞。将低密度的5×104细胞/ml骨髓细胞接种于含有1％甲基纤维素的Iscove改良Dulbecco培养基，该培养基添加了30％胎牛血清、1U/ml人红细胞生成素(Epogen_,Amgen)、100U/ml人白介素-3(GeneticsInstitute)和50ng/ml人干细胞因子(Amgen)、含或不含100ng/mlExodus、含或不含100ng/ml MIP-1α。培养物于5％CO2和低氧压(5％)培养14天，然后用倒置显微镜对CFU-GM、CFU-GEMM和BFU-E计数。将用Exodus或MIP-1α处理的培养物集落计数与所述对照培养物的集落计数比较，并以对照CFU或BFU的百分比表示。数据示于下表3。
表3
*用未配对“学生”t检验具有统计学显著性(p＜0.05)
| 处理 | 相对于对照CFU-GM的百分比 | 相对于对照BFU-E的百分比 | 相对于对照CFU-GEMM的百分比 |
| 100ng/ml Exodus | 52±5* | 44±19* | 57±6* |
| 100ng/ml MIP-1α | 9±3 | 1±8 | 3±6 |
这些数据证明在这6名处于CML慢性期的患者中，Exodus显著地抑制祖细胞集落形成。Exodus在抑制增殖方面比MIP-1α有效得多，提示Exodus的所述作用系通过一MIP-1α不能激活的受体介导。
CML祖细胞过量表达BCR-ABL融合癌蛋白，该蛋白是刺激增殖的组成型激活细胞质酪氨酸激酶。事实上，细胞培养中BCR-ABL的强制过量表达在许多细胞类型包括NIH 3T3细胞中发生转化。按照上述用氚标记胸苷杀伤试验再探索Exodus对来自三名慢性CML患者的祖细胞细胞周期进程的影向。Exodus对所述CML祖细胞的处理使细胞周期暂停的平均比例，CFU-GM为55±5％、BFU-E为45±13％和CFU-GEMM为50±10％。因此，Exodus抑制信号能够克服CML祖细胞中BCR-ABL的过分增殖信号。
这些结果表明Exodus抑制造血并可能有效治疗慢性期CML。
实施例11
Exodus对HIV增殖的影响
按照先前Cocchi等(Science,270:1811(1996))所述，用标准p24ELISA检测测试Exodus蛋白产物抑制以HIV p24蛋白产生为衡量的HIV增殖的能力。在Ficoll梯度上分离正常志愿者人外周血单核细胞。用含有1ng/ml PHA(Sigma,St.Louis,MO)的添加了10％FCS(Hyclone)和100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(组织培养抗生素，LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)的RPMI 1640(Life Technologies,Gaithersburg,MD)将这些细胞于37℃激活48小时，在完全培养基中清洗，然后于37℃在完全培养基中用TCID50=5000的HIV毒株BAL(得自ATCC)或A018-H112-2(得自ATCC)感染1小时。然后将细胞在培养基中清洗三次以除去多余的病毒，然后以每个试验5×105细胞/0.3ml再悬浮于完全培养基中，该培养基添加了重组人IL-2(10ng/ml,Boehringer-Mannheim,Indianapolis,IN)和重组Exodus或者做为对照的转染pECE的COS细胞上清液。培养6天后，用酶联免疫吸附检测(ELISA,Abbott Laboratories,Chicago,IL)检测无细胞上清液的HIVp24含量。进行试验三次。
感染6天后，测定最终稀释度为1∶2(即在每个孔中的0.3ml总体积中有0.15ml COS细胞上清液)的含有Exodus的COS细胞上清液、最终稀释度为1∶4的含有Exodus的COS细胞上清液、浓度为625ng/ml和1250ng/ml的MIP-1α(分别是图7中的条带1和条带2)和pECE COS细胞上清液(无Exodus)。结果示于图7。当用PMA刺激的正常人外周血单核细胞用HIV的二个毒株高度多重感染时，Exodus能够显著抑制这二个毒株的HIV增殖。在使用最高浓度的重组Exodus时，HIV毒株BAL的增殖被降低至对照的39％，而HIV毒株A018的增殖被降低至对照的27％。当降低Exodus浓度时，这种抑制的显著降低。另外，这种抑制与使用MIP-1α时观察到的一致，MIP-1α被用做这些试验的阳性对照。Exodus的抑制作用不是因为细胞毒性，因为用Exodus处理的细胞的存活率与对照细胞没有差异。
浓度为1μg/ml纯化的合成Exodus蛋白产物(在残基4后有一额外的丙氨酸的Exodus)和浓度为1μg/ml的MIP-1α的类似结果示于图8。显示了感染后第3、6和9天的结果。感染后第9天，Exodus的抑制作用与同一浓度的MIP-1α观察到的类似。在这个初步实验中，未观察到浓度低于1μg/ml的该Exodus蛋白产物具有任何作用。
这些结果表明Exodus蛋白产物抑制HIV增殖，因此可以用于增强抗HIV感染的方法和治疗HIV感染的方法。
实施例12
检测Exodus对人单核细胞/巨噬细胞
和人嗜中性粒细胞的化学引诱剂和细胞激活性质
通过Devi等(J.Immunol.,153:5376-5383(1995))描述的用于评价鼠TCA3诱导的嗜中性粒细胞和巨噬细胞激活的方法，评价Exodus对人单核细胞/巨噬细胞或人嗜中性粒细胞的作用。在这类研究中测定的激活指标包括由于整合蛋白激活引起的对血纤维蛋白原的增强附着、趋化性、反应性氮中间体的诱导、呼吸爆增(respiratory burst)(产生超氧化物和过氧化氢)和在有细胞松弛素B的情况下溶菌酶和弹性蛋白酶的胞吐作用。如Devi等所讨论的，这些活动与白细胞对炎症应答的几个步骤相关。由Springer(Cell,76:301-314(1994))综述的这种白细胞应答包括白细胞附着于血管内皮细胞、穿越该内皮层迁移、趋向化学激活素源的趋化性和定点释放炎症介质。这些步骤的任一步骤中Exodus的涉及都提供了通过调节该炎症应答进行临床干涉的重要的靶。
实施例13
Exodus体内肿瘤生长抑制检测
例如通过修改Laning等(J.Immunol.,153:4625-4635(1994))所述的检测鼠TCA3的肿瘤生长抑制性质的方法，检测Exodus的肿瘤生长抑制性质。用电穿孔将Exodus编码cDNA转染入骨髓瘤来源细胞系J558(美国典型培养物保藏中心，Rockville,MD)。通过标准技术例如ELISA(酶联免疫吸附检测)，用制备的抗实施例8的Exodus的单克隆抗体筛选产生Exodus的转染体。将得自产生Exodus的克隆的一团1000万个细胞皮下注射至BALB/c小鼠的下右四分体(quadrant)。做为比较，将1000万未转染细胞注射至对照小鼠。比较这二组的肿瘤形成的速率和频率，以确定Exodus抑制肿瘤生长的效力。通过组织学方法鉴别随后与肿瘤细胞相关的细胞浸润物的性质。另外，将重组Exodus(20ng)与未转染J558细胞混合，并注射(20ng/天)入来自这种细胞的肿瘤，以检测外源给与的Exodus对肿瘤细胞的作用。
实施例14
腹膜内注射检测
按照Luo等(J.Immunol.,153:4616-4624(1994))所述，将1-100ng纯化的Exodus注射入小鼠腹膜内腔，以确定体内应答Exodus的细胞。注射后，从外周血和腹膜腔分离白细胞，并通过Diff Quick药盒(Baxter,McGraw,IL)染色进行鉴定。在不同时间测定白细胞的外形以评价不同细胞类型外观的动力学。在减单独的实验中，将针对Exodus(实施例8)的中和抗体与Exodus一起注射，以确认白细胞浸润是由Exodus的活性引起。
实施例15
体内活性检测-皮下注射
通过采用Meurer等(J.Exp.Med.,178:1913-1921(1993))描述的方案，体内检测Exodus的化学引诱剂特性。将重组Exodus(10-500 pmol/部位)皮内注射至适当的哺乳动物例如狗或兔子。在4-24小时，用组织学方法评价注射部位的细胞浸润。用针对Exodus的抗体通过免疫细胞化学确认Exodus的存在。通过用Baxter的DiffQuick药盒染色鉴别该细胞浸润物的性质。
实施例16
克隆Exodus受体
采用先前Holmes等(见上述)描述的分离IL-8受体基因的方法和Charo等(见上述)描述的分离MCP-1受体基因的方法克隆编码Exodus受体的DNA。
最好从通过趋化性和激活对Exodus应答的细胞制备cDNA文库。亦可以使用放射性标记的Exodus以鉴别表达高水平Exodus受体的细胞类型。值得特别注意的是不应答MIP-1α或RANTES的细胞、或对这些配体应答时表现出不同方式受体脱敏的细胞。通过放射自显影从该cDNA文库的转染克隆库中筛选放射性标记的Exodus的结合。对阳性库进行连续次分级分离并再筛选，直至得到单个阳性克隆。
另一方面，可以使用简并PCR策略，其中所述PCR引物的序列基于已知化学激活素受体序列的保守区。为增加分离Exodus受体的机会，用于该反应中的模板DNA可以是得自对Exodus应答的细胞类型的cDNA。
虽然已用具体实施例描述了本发明，本领域技术人员可以理解本发明的变化和修改。因此，只有所附权利要求书中出现的这种限制适用于本发明。
序列表(1)一般资料(ⅰ)申请人：印地安那大学基金会(ⅱ)发明名称：Exodus化学激活素物质及方法(ⅲ)序列数：4(ⅳ)通信地址：
(A)收信人：Marshall,O’Toole,Gerstein,Murray & Borun
(B)街道：233 South Wacker Drive/6300 Sears Tower
(C)城市：芝加哥
(D)州：伊利诺州
(E)国家：美国
(F)邮政编码：60606-6402(ⅴ)计算机可读形式
(A)媒体类型：软盘
(B)计算机：IBM兼容机
(C)操作系统：PC-DOC/MSDOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0，版本1.30(ⅵ)当前申请数据
(A)申请号：
(B)提交日期：
(C)分类：(ⅶ)在先申请数据
(A)申请号：US 08/749,513
(B)提交日期：1996年11月15日(ⅷ)代理律师/代理人资料
(A)姓名：Rin-Laures,Li-Hsien
(B)注册号：33,547
(C)参考/档案号：27866/34328 PCT(ⅸ)电讯资料
(A)电话：(312)474-6300
(B)传真：(312)474-0448(2)SEQ ID NO:1的信息：
(ⅰ)顺序特征：
(A)长度：821个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：CDS
(B)位置：43…327
(ⅸ)特征：
(A)名称/关键词：成熟肽
(B)位置：109…327
(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:1:GGTACTCAAC ACTGAGCAGA TCTGTTCTTT GAGCTAAAAA CC ATG TGC TGT ACC 54
Met Cys Cys Thr
-22 -20AAG AGT TTG CTC CTG GCT GCT TTG ATG TCA GTG CTG CTA CTC CAC CTC 102Lys Ser Leu Leu Leu Ala Ala Leu Met Ser Val Leu Leu Leu His Leu
-15 -10 -5TGC GGC GAA TCA GAA GCA AGC AAC TTT GAC TGC TGT CTT GGA TAC ACA 150Cys Gly Glu Ser Glu Ala Ser Asn Phe Asp Cys Cys Leu Gly Tyr Thr
1 5 10GAC CGT ATT-CTT CAT CCT AAA TTT ATT GTG GGC TTC ACA CGG CAG CTG 198Asp Arg Ile Leu His Pro Lys Phe Ile Val Gly Phe Thr Arg Gln Leu15 20 25 30GCC AAT GAA GGC TGT GAC ATC AAT GCT ATC ATC TTT CAC ACA AAG AAA 246Ala Asn Glu Gly Cys Asp Ile Asn Ala Ile Ile Phe His Thr Lys Lys
35 40 45AAG TTG TCT GTG TGC GCA AAT CCA AAA CAG ACT TGG GTG AAA TAT ATT 294Lys Leu Ser Val Cys Ala Asn Pro Lys Gln Thr Trp Val Lys Tyr Ile
50 55 60GTG CGT CTC CTC AGT AAA AAA GTC AAG AAC ATG TAAAAACTGT GCCTTTTCTG 347Val Arg Leu Leu Ser Lys Lys Val Lys Asn Met
65 70GAATGGAATT GGACATAGCC CAAGAACAGA AAGAACCTTG CTGGGGTTGG AGGTTTCACT 407TGCACATCAT GGAGGGTTTA GTGCTTATCT AATTTGTGCC TCACCTGGAC TTGTCCAATT 467AATGAAGTTG ATTCATATTG CATCATAGTT TGCTTTGTTT AAGCATCACA TTAAAGTTAA 527ACTGTATTTT ATGTTATTTA TAGCTGTAGG TTTTCTGTGT TTAGCTATTT AATACTAATT 587TTCCATAAGC TATTTTGGTT TAGTGCAAAG TATAAAATTA TATTTGGGGG GGAATAAGAT 647TATATGGACT TTCTTGCAAG CAACAAGCTA TTTTTTAAAA AAAACTATTT AACATTCTTT 707TGTTTATATT GTTTTGTACT CCTAAATTGT TGTAATTGCA TTATAAAATA AGAAAAATAT 767TAATAAGACA AATATTGAAA ATAAAGAAAC AAAAAGTTCT TCTGTTAAAA AAAA 821(2)SEQ ID NO:2的信息：
(ⅰ)顺序特征：
(A)长度：95个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白质
(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:2:Met Cys Cys Thr Lys Ser Leu Leu Leu Ala Ala Leu Met Ser Val Leu-22 -20 -15 -10Leu Leu His Leu Cys Gly Glu Ser Glu Ala Ser Asn Phe Asp Cys Cys
-5 1 5 10Leu Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Leu His Pro Lys Phe Ile Val Gly Phe
15 20 25Thr Arg Gln Leu Ala Asn Glu Gly Cys Asp Ile Asn Ala Ile Ile Phe
30 35 40His Thr Lys Lys Lys Leu Ser Val Cys Ala Asn Pro Lys Gln Thr Trp
45 50 55Val Lys Tyr Ile Val Arg Leu Leu Ser Lys Lys Val Lys Asn Met
60 65 70(2)SEQ ID NO:3的信息：
(ⅰ)顺序特征：
(A)长度：26个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：核酸
(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:3:GGCGAAGCTT TGAGCTAAAA ACCATG 26(2)SEQ ID NO:4的信息：
(ⅰ)顺序特征：
(A)长度：26个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：核酸
(ⅹⅰ)顺序描述SEQ D NO:4:GCGGGAATTC TTACATGTTC TTGACT 26
Claims (28)
1．编码SEQ ID NO:2的Exodus氨基酸序列的纯化的多聚核苷酸。
2．权利要求1的多聚核苷酸，它是DNA。
3．权利要求2的DNA，它包含由SEQ ID NO:1的第43-327核苷酸组成的核苷酸序列。
4．编码SEQ ID NO:2的第1-73氨基酸的纯化多聚核苷酸。
5．权利要求4的多聚核苷酸，它是DNA。
6．权利要求5的DNA，它包含由SEQ ID NO:1的第109-327核苷酸组成的核苷酸序列。
7．包含权利要求2、3、5或6的DNA的载体。
8．为表达载体的权利要求7的载体，其中该DNA可操作地连接至一个表达控制DNA序列。
9．用权利要求2、3、5或6的DNA稳定转化或转染的宿主细胞，其转化或转染方式使得允许在所述宿主细胞中表达Exodus。
10．生产Exodus的方法，包括在营养培养基中培养权利要求9的宿主细胞，并从所述宿主细胞或所述营养培养基中分离Exodus。
11．用权利要求10的方法制备的纯化多肽。
12．包含SEQ ID NO:2的Exodus氨基酸序列的纯化多肽。
13．包含SEQ ID NO:2的Exodus的第1-73氨基酸的纯化多肽。
14．产生与权利要求15的多肽特异性反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
15．由权利要求14的杂交瘤产生的单克隆抗体。
16．增强对人免疫缺陷病毒(HIV)感染抗性的方法，包括向受治疗者给与一定量的有效抑制HIV增殖的Exodus蛋白产物。
17．权利要求16的方法，其中该受治疗者有接触HIV的风险、已接触HIV或已感染HIV。
18．治疗人免疫缺陷病毒(HIV)感染的方法，包括向已感染HIV的受治疗者给与一定量的有效抑制HIV增殖的Exodus蛋白产物。
19．Exodus蛋白产物的用途，即用于制备预防性或治疗性治疗HIV感染的药物。
20．按照权利要求19的用途，其中该药物抑制HIV增殖。
21．保护骨髓祖细胞免受细胞毒性作用的方法，包括向受治疗者给与一定量的有效抑制骨髓祖细胞增殖的Exodus蛋白产物。
22．权利要求21的方法，其中该受治疗者正进行化疗或放疗。
23．Exodus蛋白产物的用途，即用于制备抑制骨髓祖细胞增殖的药物。
24．权利要求23的方法，其中将该药物给与接受化疗或放疗的受治疗者。
25．治疗骨髓组织增生性疾病的方法，包括向患骨髓组织增生性疾病的受治疗者给与一定量的有效抑制恶性骨髓祖细胞增生的Exodus蛋白产物。
26．权利要求25的方法，其中该骨髓组织增生性疾病是慢性髓细胞性白血病、原发性血小板增生、骨髓纤维化或真性红细胞增多。
25．Exodus蛋白产物的用途，即用于制备治疗骨髓组织增生性疾病的药物。
26．按照权利要求26的用途，其中该骨髓组织增生性疾病是慢性髓细胞性白血病、原发性血小板增生、骨髓纤维化或真性红细胞增多。
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