CN1294677A - 全血样本分析仪的校准 - Google Patents

Abstract

用光学扫描设备(54)光学地分析静态抗凝全血样本中的有形成分,所述样本盛放在具有不同通过面厚度的样本室(14)中。使用该设备可以计算含有血浆空隙的血液样本中任何视野的厚度,所述厚度是空隙中着色血浆发射的信号强度的函数。信号发射可以是样本荧光的结果或者是样本发出的信号强度的结果。可以测定颗粒体积,所述体积是血液样本中成形成分引起的信号发射抑制的函数。扫描设备通过包含与室连接的校准区域(13,38,40)的方法而被校准,所述校准区域包括从血样中接收已知深度的着色血浆的部分(37),所述校准区域也包括具有已知体积结构的着色—发射—改变结构(36)。扫描设备扫描校准区域已知深度的部分,以测定信号发射强度与该已知深度的相关程度,扫描设备也扫描着色—发射—抑制结构,以测定信号改变与前述结构的已知体积的相关程度。该设备贮存由校准区得到的信息,然后进行血样成形成分体积的分析和单位血液样本的成分计数。

Description

全血样本分析仪的校准

技术领域

本发明涉及分析静态的血液或其它生物流体样本的设备和方法，优选地在可操作的容器内进行，在分析过程中不需要液流穿经血液样本的分析设备。由此，使用光学扫描设备，可以进行单位体积样本的血液成份计数和血液成份体积测定。更具体而言，本发明涉及用于对分析系统的每种应用进行校准的方法和设备。

背景技术

生物液流分析特别是血液学分析的最新进展，提高了由患者血液样本获得的信息的数量和质量。其结果是，利用患者血样作为诊断工具的医学界也大大受益，而且，对抗凝全血进行的最普通的检验是全血细胞计数，或CBC，全血细胞计数通常被认为是包括下列测定的一组检验：血细胞比容(Hct)、血红蛋白(Hgb)、红细胞计数(RBC)、白细胞计数(WBC)和血小板计数(Plt)的测量、红细胞测量如平均红细胞容积(MCV)等，以及白细胞分类计数(LDC或“Diff”)，后者是对存在的白细胞进行分型。与任何其它的实验室检验相比，本发明对CBC具有独到的特性，其它任何设备或方法在操作时必须进行四种不同类型的分析。首先，样本的一般物理特性，即血细胞比容和各种细胞或粒子计数，必须使用与整个样本有关的定量方法进行分析。在传统设备和方法中，这需要准确的样本计量和稀释，接下来需要特异的测量仪器。第二，样本的特定化学特性，即血红蛋白浓度，通常必须使用定量化学方法进行测定。第三，设备必须对各个细胞进行定量测定，这通常涉及提供高度稀释的样本，接下来使稀释样本通过流通池，流通池利用电或光学手段测量细胞。第四，定量测定用于将由特定亚群构成的全部白细胞中各类白细胞所占的百分比加以归类。亚群的数量取决于所使用的设备的复杂性，亚群可以是少至2类或者多至7类。

传统上，使用分开的方法已经完成了CBC的不同方面的测定。例如，CBC的LDC部分测定的传统方法是这样进行的：将小量未稀释血液涂于一玻片上，染色，显微镜下检测血涂片。由这样的血涂片可以获得合理的结果，但是数据的准确性和可信度很大程度上取决于技术人员的经验和技术。另外，使用的血涂片是劳动密集型的而且成本高，因此，商业应用通常没有利润。另一方法是使用电子阻抗或光学流式血细胞仪。流式血细胞仪包括：将稀释血液样本通过一个小管，当血细胞连续通过小管时，小管中的电子阻抗或光传感器可以测量细胞组分。同一个设备也可用于同时计数和提供细胞计量数据。为测量WBC和／或血小板，必须稀释血样，必须对血样进行处理以除去远远超出WBC和血小板的RBC。尽管较上述血涂片方法更为方便和结果一致，但是流式血细胞仪也有一些缺点。一个缺点是，流式血细胞仪是管路式和必要的用于控制稀释血样通过传感器的液流速度的控制器。现有流式血细胞仪中的管路常常出现渗漏，因而，可能影响设备准确性和安全性。许多现有流式血细胞仪的另一缺点涉及内部液流控制器和自动稀释设备的准确度。流式血细胞仪的准确性取决于液流控制器和样本稀释设备的准确性，以及它们保持精确校准的能力。液流控制器和稀释设备需要定期重新校准。需要重新校准说明，许多现有流式血细胞仪存在不准确结果的潜在可能性和不期望的操作成本。在发表于细胞计量设备(Cytometry Supplement)1988；3：7-17上的署名John L．Haynes的文章中描述了阻抗和光学流式血细胞仪的原理，和此类技术在各种领域的应用情况。流式血细胞仪中检测的血液样本无论如何要被稀释为10∶1～50000∶1。

细胞分析的另一途径是在美国专利5547849、5585246等中描绘的容积毛细管扫描，其中将相对未稀释的全血样本置入已知容积和厚度的毛细管中，在血液处于静止状态时进行检测。该技术处理存在的红细胞的方法是通过限定扫描波长至使得红细胞呈相对透明，该技术需要处理样本以使得红细胞在测定过程中不发生集聚。这样，该技术局限于使用较长波长的荧光，没有检验红细胞和血小板或检验任何细胞形态的措施。而且，由于计数必须发生在恒定的容积中，所以在单个样本管中检测大范围样本颗粒组分是困难的和不可能的，因为这些组分在全血样本中的相对数量可以相差1000倍以上。有大量可用于进行CBC或相关检验的市售设备，但是，这些设备除了提供少量CBC检验之外，就变得复杂、昂贵和容易发生故障。此外，有大量旨在进行特定血液学检验的方法，但是这些方法不能提供CBC中所期望的所有临床有用信息。

检测CBC的更为复杂的目前可利用设备的另一问题是必须对设备进行校准。这是因为大多数稀释和测量均是相对的而非绝对的，因此，为了提供精确的数量、实际的颗粒，通常必须用设备分析已知数值的稳定的全血样本，并调整设备从而可以提供准确的数值。在标准材料的制备及其转移与贮存期间的稳定性方面，这类校准出现差错的倾向是显而易见的。标准材料也很昂贵，这就增加了检测的成本。

在一共同未决美国专利申请代理人卷号No．UFB-016中，公开了允许在基本上不稀释的全血的静态层内测定许多重要血液参数的方法。所述发明的重要特征是不需要任何外标校准材料，但是要达到最理想的精确度，需要精确地确保所述装置的室的尺寸精确度的方法。

期望具有检测静态抗凝全血样本的设备和方法，所述方法和设备能够对大量不同血液学参数提供准确的定性和定量结果，而不需要样本液流在样本分析期间穿经样本室。期望提供此类由静态血液样本即能够得出体积红细胞计数和细胞体积信息而不需要外标物质的方法和设备。

发明详述

本发明涉及用于检验盛装在样本室中的静态的、基本上不稀释的、抗凝全血样本，并从中获得信息的方法和设备。本发明使用的术语“基本上不稀释”，是描述血液样本的稀释不超过约1∶1，优选更小。通常，在施行本发明方法中将会用到的试剂仅仅是染料、颜料和抗凝剂，而这些试剂即使是液体，也不旨在稀释样本。优选地，样本室中数个区域的不同通过面(through plane)厚度将在室的所有区域产生足够的毛细管力，从而使得血液样本遍布全室，由此最终在室中形成静态的血液样本。分析时血液样本仅有的运动是血液样本成形成份的布朗运动，该运动不影响本发明设备的使用。装置包括盛放样本的样本室，它具有相对的样本密闭壁，至少一个壁是透明的，室壁在室的至少一部分汇合。因此，室的通过面厚度在室的不同区域不相同。本说明书中使用的术语“通过面”，指相当于在室的任何区域中会聚壁之间最短距离的视线。正如后面将要描述的那样，两壁之间会聚的程度，即两壁之间距离，在室的任何一个特定点是已知的，或者，就象后面将要描述的那样，在样本盛放于室之后是可以测得的。该方法和设备在共同未决美国专利申请代理人卷号No．UFB-016中作了更全面的描述。

传统地，当在标准血细胞计数室(通常称为血细胞计数器)中对生物流体中的细胞进行计数或定量测定时，众所周知，加盖玻片、清洁表面或充填室的过程中的微小误差将对测量的准确性产生显著的影响，因为室高度尺寸(名义上是100μ)上的微小误差，对于室内的任何观测体积具有极大的影响。这些室使用1∶10～1∶1000稀释的血液。在上述本发明的情况下，室垂直尺寸显著小于标准计数室，通常在约2μ到40 μ的范围，对室的尺寸的精确度有着极高的要求。尽管制造所需尺寸容许误差的室是可能的，但是，更为可行的是，特别是一次性使用的室，建构室到接近容许误差，然后测量每一个感兴趣区域的实际室高度或体积。

室的最薄区域是这样的尺寸，当样本室盛满样本后，样本中的单个红细胞或其它颗粒形成单层。此部分室的厚度应当在约2至约7微米之间，优选约5微米。这样，正如后面将要描述的那样，在室的这个区域可以测量单个红细胞、其计量如平均红细胞容积(MCV)和平均红细胞血红蛋白量(MCH)。由于细胞的体积测量将在此区域进行，所以，任何指定视野的体积或室高度必须已知为适当的精确度，优选至少+／-5％。

从室的最薄部分开始，室的厚度增加以便在室中形成逐渐增厚的区域，其可用于识别和计数血样中的其它细胞性或颗粒性成份。在所有情况下，该计数均在室的区域内进行，所述室的区域的厚度是可以测定的，由此，细胞或成份计数可以以一定体积样本中细胞或成份数量的形式给出。因此，室的该区域厚度范围通常为约7～约40微米。室含在样本贮罐(holder)中，贮罐的血液样本可以被取出。该样本贮罐的细节在共同-未决美国专利申请代理人卷号No．UFB-006中公开。由于每单位体积流体中的细胞或颗粒计数在此确定，所以，任何指定视野的体积或室高度必须已知到适当的精确度，通常在+／-5％之内，优选+／-3％或更好。

待测样本与着色剂如荧光染料混合，产生的混合物分布于室中，由于室壁的会聚而形成具有不同厚度的静置样本。着色剂可以在将样本盛装入室之前加入，或者在将样本盛装入室的同时加入，如在室壁上涂上着色剂干涂层。用具有选择的波长或选择的一个以上波长的光源对室内有关区域进行选择性照射，所述波长引起样本中的着色剂发出荧光，或者是能够以其它方式定量测定的。这样，含有血样中的各种成形成份的室内区域被扫描，优选用光学设备扫描，而扫描结果可以被扫描设备进行数字化和分析。样本是全血的情况下，对样本进行操作或处理以确保存在不含有成形成份的样本中的区域，和只含有血样的血浆部分的区域，其中细胞或其它血中的成形成份被悬浮。

在这种不含成形成份的区域，每单位面积发射荧光或发射信号的强度(光密度)数学上与血浆的厚度相关，因而，血浆的荧光或光密度随着室厚度的增加而增加。同样，来自样本的荧光或光密度的大小的减少与血样中可以置换溶于血浆中的着色剂的任何成形体的体积成比例。因此，如果在任何给定信号大小与室或邻近室的任何区域的体积(或者在一些已确定区域面积处的室高度)之间可以确立绝对关系的话，只要有足够的含有血浆空隙(lacunae)的区域，所述空隙处没有成形成份的干扰，并且校准区域和测量区域之间的着色剂浓度是完全相同的，那么，任何观测区域的确切体积或室高度即可测定出来。一旦校准区域被扫描且由此校准区域发出的着色信号被测定，扫描设备将会得知室厚度“A”发出着色信号“B”，而且“B”的分数或倍数将等于“A”的成比例的分数或倍数。有了这个信息，就可以计算出样本单位体积成形成份的数量，因为扫描设备的任何视野的面积是已知的。通过将已知视野面积乘以测得的视野厚度，可以计算出室中存在血样的澄清血浆的任何部位中的区域视野的体积。困难在于得到特定样本的校准信息。

Diether Rectenwald等在物理化学杂志(J．Phys Chem)第97卷第12期，1993年第2868-2870页发表的文章中描述了一个方法，其中将球形珠引入室，通过测量珠对着色信号的减少作用来计算单位体积的着色，因为珠置换了着色剂。实验中使用的数码照相机测定珠本身的体积。然而，对于本发明的应用，珠不能奏效，因为珠和血细胞在各自的测量中相互干扰。因此，期望在有血细胞或其它颗粒存在时可以使用的体积着色校准方法。

因此，本发明的一个目的是提供用于由静态抗凝全血样本获得容量分析有关信息的方法和设备。

本发明的另一目的是提供其特征在于不需要使用外标物质即可获得所述容量分析有关信息的方法和设备。

本发明的再一目的是，提供其特征在于允许使用基本上不稀释的全血样本或其它生物学流体以检验每单位样本体积中成形成份计数信息的方法和设备。

本发明还有一目的是提供一种方法和设备，其特征在于包括一个盛放样本的室，所述室具有由相对会聚室壁形成的不同通过面厚度的区域，至少一个壁是透明的，以便于通过此透明壁可以光学上或肉眼检测样本。

本发明另一目的是提供特征在于室中的各种通过面厚度的区域制成这样的尺寸，以便能够测定流体样本中不同大小的各个细胞以及其它成形成分的形态学特征、计数和体积的方法和设备。

本发明还有一目的是提供用于校准扫描设备的方法和设备，而使设备能够测定样本中选定视野的体积，和使设备能够测量样本中成形成份的体积。

附图简述

结合下列附图，通过接下来的本发明几个实施方案的详细说明，本发明的这些和其它目的和优点将显得更加清楚。

图1是样本室一个实施方案的横截面观，所述样本室的通过面厚度在室的不同X、Y区域是不同的，并且室具有与之相联的设备校准区域的第一个实施方案。

图2是图1所示设备-校准区域的平面图；和

图3是类似于图1的样本室的平面图，但是提供了与室相联的设备校准区域的第二个实施方案。

图4是在室的不同X、Y区域具有不同通过面厚度的样本室的一个实施方案的横截面观，并且室具有与之相联的设备校准区域的第三个

实施方案。

图5是图4的设备校准区域的平面图；和

图6是可用于分析容器中样本的扫描设备的示意图。

本发明特定实施方案详述

现在参照附图，图1是编号为2的装置的横截面观，所述装置2包括一盛放样本的室14，室具有不同的通过面厚度。装置2包括一个下面的支撑壁4和上面的壁8，为了描述的目的，壁8可以是显微镜盖玻片。壁4和壁8中至少一个壁必须是透明的，以便于通过透明壁4或8能够检测置于二者之间的样本。如果需要，壁4和壁8均透明。壁8具有一个边10和一个相对边12，边10邻接室14的最薄通过面区域，而边12邻接室14最厚通过面区域。共同-未决美国专利中请代理人卷号No．UFB-016描述了不同厚度的室14的多种变化。

扫描设备的校准可以按照如下方式完成。可以整合入装置2的一个校准部件包括模塑的校准-标准区域38，校准-标准区域38与室14邻接并且可与室14的狭窄端10的流体接触。当着色剂和样本混合物进入室14，染色的样本流体组份将会填充校准-标准区域38。校准标准区域38可以呈精确地控制深度的槽的形式，所述槽具有底板37和从底板37向上延伸的中央隆凸36，隆凸36具有精确的已知体积。应当理解，36的几何结构呈具有精确已知体积的凹陷形式。隆凸将抑制部件36发出的信号，使之达到与隆凸的体积成正比的程度，而凹陷可增强从部件36发出的信号，使之达到与凹陷体积成正比的程度。这样，底板37与室壁8的底面7之间的距离是已知的；而且部件36的体积也是已知的并且在开始扫描时与扫描设备进行信息沟通。

在扫描设备开始样本分析程序之前，它首先定位于部件38并产生区域38的强度图。然后，设备计算扫描区域底板37的平均强度。该平均值乘以区域38中像素的数量即得到值S1，此值是如果不存在隆凸36时由区域38发出的信号强度。第二个值S2，是将区域38中所有像素的信号强度加和而得出的。因此，S1-S2的差代表被隆凸置换掉的流体体积产生的信号。隆凸的实际体积V被编码到贴在装置2上的机器可读取的条码或其它标签上，并被扫描设备扫描。扫描设备可以利用此[(S1-S2)]／V]值计算室14中任何成形成份的体积或室本身任何部分的体积。由此，扫描设备将提供精确校准的室区域视野体积信息；并为特定着色剂和正被检测的装置2提供成形成份体积信息。应当指出，尽管显示的是隆凸，但是也可以使用倾坡，以及任何其体积或单位面积体积是已知的可识别形状。

图3显示依本发明形成的装置2，它包括可用于校准设备的第二个实施方案的板上结构，以便于在技师使用该设备期间在设备被校准后能够测定室视野厚度。在图3所示的实施方案中，已知体积并且优选约20μ厚的矩形玻璃毛细管13，与室14的较厚端区域12邻接，毛细管13填充有样本和混合的着色剂。当红细胞钱串在毛细管13内形成后，用上述方法可以测定从毛细管13中空隙发出的荧光。毛细管13的单位长度体积是已知的，因为它被制造达精确的容许误差，因此，由扫描设备可以计算出单位体积的荧光。

图4和图5显示类似于图1的实施方案，除了已知几何结构是横跨室的至少一部分的已知高度的连续台阶40。为了进行校准测量，多次读取台阶40两侧的平均流体着色强度，两侧多个读数之平均差代表给定室厚度的着色信号大小的变化。也是因为该区域的面积是已知的，此高度读数可以换算为体积，反之亦然。台阶40可以是陡峭的或者是渐增的，只要它能够为设备适当定位提供充分的限界即可。

图6是共同-未决美国专利申请代理人卷号No．UFB-017中详细描述的自动比色显微设备集成的示意图。该设备集成通常用数字54代表，它可以用于扫描盛在装置2中的血液样本，而且不需要显著的人为干预，可以对由血样本中不同白细胞和网织红细胞发出的颜色的波长进行比色分析，并因而鉴定这些细胞类型。也可以进行血样中多种白细胞类型和网织红细胞的单位血样体积计数。设计设备集成54以建立和存贮或发射正在扫描的血样中不同白细胞和网织红细胞的图象。设备54包括一个平台56，平台56包括啮合样本贮罐2和当样本贮罐2中的样本被扫描时能够使样本贮罐2在X和Y方向横向移动的夹子58。

可逆电动马达59可用于选择性地在相对方向转动驱动螺杆60，由此使得样本贮罐2可以在X和Y方向横向移动。以这种方式，样本贮罐2中的全部内容可被扫描。公开的设备集成54的自动化实施方案包括CCD相机62、光束分裂器64和镜头装置66，镜头装置66可以选择性地在Z方向移动，以使得在样本贮罐集成2含有样本的部分聚焦。CCD相机62通过安装在可选择性地旋转的滤光片轮74上的多个不同发射光波长滤光片68、70和72来观看和记录样本图象。设备集成54也包括激发光源75，光源75引导激发光在样本贮罐2处透过分光器64和聚焦镜头装置66。一系列激发光波长滤光片76、78和80可以固定在可选择性旋转的滤光片轮82上。激发光被分光器64向聚焦镜头66处偏转，并由镜头66聚焦在样本贮罐2上。这样，两个滤光片轮74和82可以允许人们选择性地控制和变化激发光源的波长，以及发射光源的波长。预编程的处理器控制机84可以任意地选择控制样本贮罐2的运动；滤光片轮74和82的旋转；和操作CCD相机62。由此，控制机84能够完全自动操纵设备集成12而不需要明显的人为干预。

尽管荧光标志物是优选的，但是也可以使用吸收发射光的染料。当使用这样的染料时，要测定的是光信号密度值而不是荧光信号强度。

由于本发明公开的实施方案可以进行多种变化和改动而不背离本发明实质，因此，公开的实施方案不是为了限制所附权利要求所请求的本发明。

Claims (10)

1．一种用于校准装在光学扫描设备(54)中的室(14)的方法，以便于使设备能够测定视野的体积或生物流体中所含成形成份的体积，所述流体包括澄清的载液，流体中的成形成份悬浮于载液中，所述方法的特征在于：

a)提供容器(2)用于接受静态生物流体样本的步骤，所述容器包括样本-接收样本-观测室(14)，室(14)具有不固定的不同通过面厚度的区域；

b)将着色剂和生物流体样本的混合物引入室的步骤，使得着色剂和生物流体样本的混合物在室中散开，以便于形成充填室的静态的着色生物流体样本层，所述着色的生物流体样本层包括着色区域，所述着色区域包括成形成份和着色的不含成形成份的澄清载液部分；

c)提供具有已知体积或深度的校准部件(13，38，40)的步骤，所述校准部件与室以能够使着色的澄清载液部分进入并充填容器校准区域的方式相联；

d)将所述校准区域的所述已知通过面体积或深度与扫描设备沟通信息的步骤；和

e)用所述设备扫描所述校准区域的步骤，为的是定量测量由所述校准区域发射的着色信号强度，以便于使得设备能够为正在扫描的特定容器确定和贮存着色信号强度与室深度的关系，由此使得设备能够确定随后扫描的视野深度，所述视野深度是由样本室不同深度区域发射的着色信号强度的函数。

2．权利要求1所述方法，其中所述校准区域包括已知体积的几何结构(36)，该结构可操作地改变从包含几何结构的校准区域部分发射的着色信号，使之达到与几何结构的体积成正比的程度，所述方法包括

f)将所述已知几何结构体积与扫描设备沟通信息的步骤；和

g)用所述设备扫描所述校准区域中的所述几何结构的步骤，为的是定量测量从所述校准区域发射的着色信号强度的程度，以使设备能够为正在扫描的特定容器确定和贮存着色信号强度改变与几何结构体积的关系，从而使得设备能够确定随后扫描的视野中所含的成形成份的体积，所述成形成份体积是从含有样本中成形成份的室之区域发射的着色信号强度的函数。

3．权利要求1所述方法，其中所述校准区域是已知体积的毛细管(13)，该毛细管与室相联通。

4．权利要求1所述方法，其中所述校准区域是已知深度的槽(38)，该槽与室相联通。

5．权利要求4所述方法，其中所述几何结构包含在所述槽中。

6．权利要求5所述方法，其中所述几何结构是在所述槽的底壁上形成的隆凸。

7．一种用于校准光学扫描设备(54)的方法，以使得设备能够测定生物流体所含的成形成份体积，所述生物流体包括澄清的载液，其中生物流体中的成形成份悬浮于载液中，所述方法的特征在于：

a)提供容器(2)接受静态的生物流体样本的步骤，所述容器包括样本-接收样本-观测室(14)，室(14)具有不固定的不同通过面厚度的区域；

b)将着色剂与生物流体样本的混合物引入室的步骤，使得着色剂与生物流体样本的混合物在室中散开，以形成充填室的静态的着色生物流体样本层，所述着色的生物流体样本层包括着色区域，所述着色区域包括成形成份和着色的不合成形成份的澄清载液部分；

c)提供具有已知体积的几何结构(36)的校准区域(38)步骤，所述结构有效地改变从包含几何结构的校准区域部分发射的着色信号，使之达到与几何结构的体积成正比的程度，所述校准区域与室以能够使着色的澄清载液部分进入并充填容器的校准区域的方式相联；

d)将所述已知几何结构体积与扫描设备沟通信息的步骤；和

e)用所述设备扫描所述校准区域中的几何结构的步骤，为的是定量测量由所述校准区域发射的着色信号强度，以便于使得设备能够为正在扫描的特定容器确定和贮存着色信号强度改变与几何结构体积的关系，由此使得设备能够确定随后扫描的视野中所含的成形成份的体积，所述成形成份的体积是由含有样本中成形成份的样本室不同区域发射的着色信号强度的函数。

8．一个具有用于校准光学扫描设备(54)的区域(13，38，40)的样本容器(2)，以便于使得扫描设备能够测定视野的体积，或者能够测定包含于包括澄清载液的生物流体样本中的成形成份的体积，所述生物流体在该容器中进行分析，所述容器的特征在于：

a)具有不固定的不同通过面厚度区域的样本接收室和样本观测室；和

b)已知通过面厚度或体积的校准区域，所述校准区域与室以这样的方式相联，使得着色澄清载液部分进入并充填容器的校准区域，由此所述校准区域发射的着色信号强度与所述校准区域的所述已知通过面厚度或体积成正比。

9．权利要求8所述的样本容器，其进一步包括在所述校准区域中已知体积的几何结构(36，40)，所述结构有效地改变从包含几何结构的校准区域部分发射的着色信号，使之达到与几何结构的体积成正比的程度。

10．权利要求8的样本容器，其还包括含有校准区域的毛细管(13)。

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