CN1293184C - 生产l－亮氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种使用属于埃希氏菌属的细菌生产L-亮氨酸的方法，该方法产生的L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-高亮氨酸的量小于生产的L-亮氨酸的1%，这是由于编码支链氨基酸转氨酶的ilvE基因的失活，并且由于tyrB基因编码的芳族氨基酸转氨酶的活性增加，该方法生成的L-亮氨酸的量增加。

Description

生产L-亮氨酸的方法

                    本发明的背景

发明领域

本发明涉及微生物工业，特别涉及一种生产氨基酸的方法。更具体地说，本发明涉及一种使用属于埃希氏菌属(Escherichia)的细菌生产L-亮氨酸的方法，其中生成的L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-高亮氨酸的量小于生产的L-亮氨酸的1％。

相关技术的描述

通常地，L-氨基酸已经通过利用微生物菌株发酵的方法工业化生产，使用的菌株是由天然来源获得的或是其突变株，特别是为提高L-氨基酸产率经修饰的突变株。

属于埃希氏菌属的不同菌株经过发酵用于制备L-亮氨酸是已知的。存在菌株耐L-亮氨酸及其类似物，如4-氮杂亮氨酸或5，5，5-三氟代亮氨酸(美国专利US 5,744,331)，β-2-噻吩丙氨酸和β-羟基亮氨酸(美国专利US 5,763,231)，L-缬氨酸、4-氮杂亮氨酸、3-羟基亮氨酸和L-亮氨酸(原苏联专利RU 2140450)；存在菌株需要硫辛酸用于生长(美国专利US 6,214,591)；存在菌株具有涉及L-亮氨酸生物合成的提高活性的酶，如ilvE基因产物(美国专利US 5,120,654)；存在菌株含有对生成的L-亮氨酸造成的反馈抑制作用脱敏的靶酶，如异丙基苹果酸合酶(欧洲专利EP1067191)。

最熟知的生产L-亮氨酸的菌株同时产生L-缬氨酸和少量的L-异亮氨酸。例如，大肠杆菌菌株AJ11478(美国专利US 5,763,231)同时生产出1.9g/l L-亮氨酸和0.09g/l L-缬氨酸(L-缬氨酸的产量是L-亮氨酸的4.7％)。L-缬氨酸和L-异亮氨酸与L-亮氨酸同时产生使L-亮氨酸从培养液中的回收不便。此外，L-缬氨酸和L-异亮氨酸副产品的产生降低了L-亮氨酸产量，因为这两种氨基酸来源于同一前体，2-酮异戊酸。

早先表明：非天然的氨基酸，如正缬氨酸、高异亮氨酸和正亮氨酸可以在粘质沙雷氏菌中借助L-亮氨酸生物合成酶分别由α-酮丁酸、α-酮基-β-甲基戊酸和α-酮戊酸形成(Kisumi M.，Sugiura M和Chibata I.，J.Biochem.1976，80(2)333-9)。

发明公开

本发明的目的是获得一种L-亮氨酸生产菌，其产生的L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-高亮氨酸的量小于生产的L-亮氨酸的1％。

这个目标是通过使编码支链氨基酸转氨酶的ilvE基因失活实现的。

ilvE基因的失活减少了L-亮氨酸的形成，因为这种转氨酶参与由其酮基前体，即2-酮基-甲基-戊酸形成L-亮氨酸。另一种可以参与L-亮氨酸产生的转氨酶是tyrB基因编码的芳族氨基酸转氨酶。因此，为了在ilvE基因失活时恢复甚至提高L-亮氨酸的产量，提高由tyrB基因编码的酶的活性，例如用含有tyrB基因的多拷贝质粒转化细菌。

这样就完成了本发明。

因此，本发明提供一种属于埃希氏菌属的L-亮氨酸生产菌，其产生的L-缬氨酸、L-异亮氨酸或L-高亮氨酸的量小于生产的L-亮氨酸的1％。此外，本发明提供一种属于埃希氏菌属的L-亮氨酸生产菌，其产生的L-缬氨酸、L-异亮氨酸或L-高亮氨酸的量小于生产的L-亮氨酸的1％，并且通过提高tyrB基因编码的酶的活性增加L-亮氨酸的产量。

本发明还提供一种通过发酵生产L-亮氨酸的方法，包括在培养基中培养上述细菌以在培养基中产生和富集L-亮氨酸，和从培养基中收集L-亮氨酸的步骤。因此，本发明提供了：

(1).一种属于埃希氏菌属的L-亮氨酸生产菌，其产生的L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-高亮氨酸的量小于生产的L-亮氨酸的1％。

(2).根据(1)的细菌，其中细菌产生的L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-高亮氨酸的量小于生产的L-亮氨酸的1％，这是由于ilvE基因失活或ilvE基因编码的蛋白的活性降低。

(3).根据(2)的细菌，其中tyrB基因编码的蛋白的活性增加。

(4).根据(3)的细菌，其中tyrB基因编码的蛋白的活性增加是通过含有tyrB基因的DNA转化该细菌而完成。

(5).根据(4)的细菌，其中转化是使用多拷贝载体进行的。

(6).一种生产L-亮氨酸的方法，该方法包括的步骤有：

-在培养基中培养根据(1)至(5)任一项的细菌以在培养基中产生和富集L-亮氨酸，和

-从培养基中收集L-亮氨酸。

(7).根据(6)的方法，其中细菌已经进行修饰而具有了增强的L-亮氨酸生物合成基因表达。

下面对本发明进行详细描述。

1.本发明的细菌

本发明的细菌是一种属于埃希氏菌属的细菌，其产生的L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-高亮氨酸的量小于生产的L-亮氨酸的1％。

在本文中使用的术语“L-亮氨酸生产菌”意指一种细菌，该细菌较大肠杆菌的野生型或亲代菌株，如大肠杆菌K-12菌株，在培养基中能够产生并富集更大量的L-亮氨酸，优选意指能够在培养基中产生并富集L-亮氨酸的量不少于0.5g/L，更优选产生并富集不少于1.0g/L的L-亮氨酸。

术语“属于埃希氏菌属的细菌”意指根据微生物学领域技术人员已知的分类法分在埃希氏菌属的细菌。可以提及的用于本发明的属于埃希氏菌属的微生物的实例是大肠杆菌。

术语“产生的L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-高亮氨酸的量小于生产的L-亮氨酸的1％”意指L-亮氨酸产生菌的培养完成后，培养基中存在的L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-高亮氨酸的量与主产品L-亮氨酸的量相比是相当少的。所述培养基中L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-高亮氨酸的量与L-亮氨酸的量相比是相当少的，例如L-缬氨酸、L-异亮氨酸或L-高亮氨酸的量每种都小于生产的L-亮氨酸的量的1％，优选小于0.5％，更优选小于0.1％。优选意指L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-高亮氨酸的量用常规方法，例如薄层色谱法(TLC)或HPLC，甚至不能检测出来。

术语“ilvE基因失活”意指靶基因被修饰以至于用已知的方法检测不到该被修饰的基因编码的突变型酶(失活酶)的活性水平或被修饰的基因不能表达任何酶。ilvE基因编码的支链氨基酸转氨酶(309个氨基酸残基)能催化α-酮羧酸及其盐的氨基化反应。支链氨基酸转氨酶，例如将α-酮己酸转化为L-亮氨酸，α-酮异戊酸转化为L-缬氨酸，α-酮基-β-甲基戊酸转化为L-异亮氨酸。ilvE基因(GenBank登记号NC_000913.1中的第3950107至3951036号，gi：16131628)位于ilvM和ilvD基因之间。使基因失活可以采用常规方法，如使用紫外线照射或亚硝基胍(N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍)处理进行诱变处理，定点诱变，使用同源重组或/和插入-缺失诱变造成基因破坏(Datsenko K.A.和Wanner B.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97(12)，6640-6645)。

术语“ilvE基因编码的蛋白质的活性降低”意指ilvE基因的蛋白编码序列或ilvE基因的表达调节序列已经进行修饰以至子每个细胞中的该酶的活性都降低。降低蛋白质的活性也可以采用常规方法，如使用紫外线照射或亚硝基胍(N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍)处理诱突，或定点诱变后选择具有所需表现型的细菌。在所述蛋白质中具有“渗漏型”突变的细菌也可用于本发明。具有渗漏型突变的蛋白质是一种其序列变化未完全消除该蛋白活性的突变蛋白质(LewinB.，Genes VII，Oxford出版，2000，第16页)。

本发明的细菌还可以是一种属于埃希氏菌属的细菌，其产生的L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-高亮氨酸的量小于生产的L-亮氨酸的1％，并且tyrB基因编码的蛋白的活性增加。

术语“tyrB基因编码的蛋白的活性增加″意指细胞中该蛋白质的分子含量提高，或者是每个蛋白质本身的活性提高。tyrB基因编码芳族氨基酸转氨酶(397个氨基酸残基)，该酶催化的是以谷氨酸作为氨基供体，由α-酮酸到氨基酸的转氨基反应，如分别催化苯丙酮酸和4-羟基苯丙酮酸到苯丙氨酸和酪氨酸的转氨基反应。而这里的术语“活性”意指以谷氨酸作为氨基供体将α-酮己酸转化为L-亮氨酸的活性(Escherichia coli and Salmonella，第二版，主编：F.C.Neidhardt，ASM出版，Washington D.C.，1996)。tyrB基因(GenBank登记号NC_000913.1中的第4264693至4265886号，gi：16131880)位于alr和aphA基因之间。

增加蛋白活性的技术，特别是增加细胞中蛋白的分子含量的技术，包括增加基因的拷贝数和改变编码本发明蛋白质的DNA的表达调节序列或增强子序列，但是不局限于这些。

术语“用具有包含tyrB基因的DNA转化细菌”意指例如用常规方法将DNA导入细菌细胞内以增加基因的拷贝数。基因的拷贝数的增加可以通过将基因插入到多拷贝载体中形成重组DNA，随后将重组DNA导入微生物。用于重组DNA导入的载体例如：质粒载体，如pMW118、pBR322、pUC19、pET22b、pACYC184等等，噬菌体载体，如11059、IBF101、M13mp9、Mu噬菌体(日本专利申请公开号2-109985)等等和转座子(transposon)(Berg，D.E.和Berg，C.M.，Bio/Technol.，1，417(1983))，如Mu、Tn10、Tn5等等。也可以通过将质粒用于同源重组或类似的方法将基因整合到染色体中以增加基因拷贝数。

改变表达调节序列或增强子序列的技术可以与基于基因拷贝复制的扩增的技术相结合。

为了培育属于埃希氏菌属且具有表达量增加的基因的微生物，可以主要基于现有的大肠杆菌基因资料，通过PCR(聚合酶链反应)获得必要的基因区域。例如，tyrB基因可以使用PCR技术由E.coli K12或E.coli MG1655菌株的染色体DNA进行克隆。用在这里的染色体DNA可以来源于E.coli的任何其它菌株。

改变编码tyrB蛋白质的DNA的表达调节序列可以通过将tyrB结构基因设于强启动子的控制之下而完成。例如，lac启动子、trp启动子、trc启动子、λ噬菌体的p_L启动子被认为是强启动子。另外，可以通过例如将突变引入启动子以提高位于启动子下游的基因的转录水平增强启动子。此外，众所周知在核糖体结合位点(RBS)与起始密码子之间的间隔区，且特别是紧接起始密码子上游的序列中替换若干核苷酸会深刻地影响mRNA翻译能力(Gold等人，Annu.Rev.Microbiol.，35，365-403，1981；Hui等人，EMBO J.，3，623-629，1984)。

而且，为了提高基因的转录水平可以重新引入一种增强子。在例如国际专利公开WO00/18935和日本专利申请公开号1-215280中描述了将含有基因或者启动子的DNA导入染色体DNA。

本发明的细菌可以通过增强涉及L-亮氨酸生物合成的一种或多种基因的表达得到进一步改进。这类基因的范例有：L-亮氨酸操纵子，即leu操纵子，它优选含有编码异丙基苹果酸合酶的基因(leuA基因，GenBank登录号NC_000913.1中的第81985至83529号，gi：16128068)，该异丙基苹果酸合酶的L-亮氨酸反馈抑制被脱敏(欧洲专利EP1067191)。L-亮氨酸操纵子还包括leuB(gi：16128067)，leuC(gi：16128066)和leuD(gi：16128065)基因(分别为GenBank登记号NC_000913.1中的第80867至81961号；79464至80864号；和78848至79453号)。

属于埃希氏菌属，如E.coli菌株K12、E.coli菌株W1660等等的细菌可以用作亲代菌株，要使其ilvE基因编码的支链氨基酸转氨酶失活而增强tyrB基因编码的芳族氨基酸转氨酶的活性。也可以用作亲代菌株的有属于埃希氏菌属的L-亮氨酸生产菌，如耐4-氮杂亮氨酸或5，5，5-三氟代亮氨酸的E.coli菌株H-9068(ATCC 21530)、H-9070(FERM BP-4704)和H-9072(FERM BP-4706)(美国专利US5,744,331)，L-亮氨酸对异丙基苹果酸合酶的反馈抑制被脱敏的E.coli菌株(欧洲专利EP1067191)，耐β-2-噻吩丙氨酸和β-羟基亮氨酸的E.coli菌株AJ11478(美国专利US5,763,231)等等。

用于质粒DNA的制备，DNA的消化和连接，转化，作为引物的低聚核苷酸的选择等等的方法可以是本领域技术人员熟知的普通方法。这些方法在例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，和Maniatis，T.的《Molecular Cloning A LaboratoryManual，Second Edition》，Cold Spring Harbor Laboratory出版(1989)中有描述。

2.本发明的方法

本发明的方法是一种生产L-亮氨酸的方法，该方法包括：在培养基中培养本发明的细菌以在培养基中生产和富集L-亮氨酸，和从培养基中收集L-亮氨酸的步骤。

在本发明中，进行培养，从培养基中收集和纯化L-氨基酸等等可以用与常规的使用细菌生产氨基酸的发酵方法相类似的方式。

用于培养的培养基可以是合成培养基或天然培养基，只要该培养基含有碳源和氮源以及矿物质，如有必要，还含有适量的细菌生长需要的营养物。碳源可包括各种碳水化合物如葡萄糖和蔗糖，以及各种有机酸。根据所用微生物的同化代谢方式，可以使用包括乙醇和甘油的醇类。使用各种铵盐如氨水和硫酸铵，其它含氮化合物如胺类，天然氮源如蛋白胨、大豆-水解产物和消化的发酵微生物作为氮源。使用单磷酸钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钙等等作为矿物质。使用硫胺素、酵母提取物等等作为维生素。

培养优选在有氧的条件下进行，如通气振荡培养和通气搅拌培养，培养温度20至40℃，优选30至38℃。培养液的pH通常在5至9，优选在6.5至7.2。培养液的pH可以用氨水、碳酸钙、各种酸、各种碱和缓冲剂调节。通常，培养1至5天可以在液体培养基中富集目标L-氨基酸。

培养后，可以用离心法或膜滤法将固体如细胞从液体培养基中除去，然后可以通过离子交换、浓缩和结晶的方法进行收集并纯化L-亮氨酸。

附图的简要说明

图1表明了L-亮氨酸和L-缬氨酸的代谢途径。

实施例

下面将参考实施例更具体地说明本发明。

实施例1、属于埃希氏菌属的L-亮氨酸生产菌的制备。

将野生型菌株E..coli K12(VKPM B-7)的细胞用诱变剂N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(0.05mg/ml)在37℃下处理20分钟，用生理溶液清洗4次，然后在补充有4.0mg/ml DL-4-氮杂亮氨酸的极小的琼脂培养基M9上涂平板。平板在37℃下培养5天。收集平板上显现的菌落，然后在L-琼脂平板上划线进行纯化。获得的最好的耐DL-4-氮杂亮氨酸的突变型，即突变型55，生产了2.1g/l L-亮氨酸和0.8g/l L-缬氨酸(表1，参见下文)。这种菌株E.coli 55已经被筛选出来并用于诱导L-异亮氨酸和L-缬氨酸双重营养缺陷型。得到了大量生长需要L-异亮氨酸和L-缬氨酸的双重营养缺陷型。在得到的双重营养缺陷型中，已经筛选出最好的L-亮氨酸生产菌即菌株505，产生了1.3g/l L-亮氨酸。该菌株不会产生L-缬氨酸和L-异亮氨酸，但该双重营养缺陷型导致了L-亮氨酸产量的降低。

双重的L-异亮氨酸和L-缬氨酸营养缺陷型是由ilvE基因中的突变引起的。这通过将含有ilvE基因的质粒(美国专利US5,120,654)导入菌株505后补充了L-异亮氨酸和L-缬氨酸双重营养缺陷型的事实得到了证明。而且，使用2-酮异戊酸作为底物在菌株505中测定ilVE基因编码的支链氨基酸转氨酶的酶活性表明了其活性的缺乏。测定酶活性的条件由Coller R.H.和Kohlhaw G.(Nonidentity ofthe aspartate and the aromatic aminotransferase components of transaminase A in E.coli.J.Bacteriology，1972，112(1)，365-371页)进行了说明。

菌株大肠杆菌505已于2001年5月14日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(Russia 113545，Moscow，1 Dorozhny proezd，1)，保藏号为VKPMB-8124。

实施例2、tyrB基因从E.coli克隆到pACYC184质粒。

通过PCR方法扩增含tyrB基因的大肠杆菌K12菌株(VKPM-7)的染色体片段，使用的两种引物为：序列表中所示的引物1(SEQ ID NO：1)和引物2(SEQ IDNO：2)。分别含有包含BamHI和HindIII位点的序列的引物1和2(24体)在5′末端标记。然后，将1.7kb的BamHI-HindIII片段连接到质粒pCYC184(Chang，A.C.Y.和Cohen，S.N.，Construction and characterization of amplifiable multicopy DNAcloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid，J.Bacteriol.，134，1141-1156，1978.Rose，R.E.，The nucleotide sequence of pACYC184，Nucleic Acids Res.，16，355，1988)的对应位点，得到质粒pACYC-tyrB。通过转化作用将质粒pACYC-tyrB引入菌株E.coli 505的细胞中，这样构造了菌株505/pACYC-tyrB。

实施例3、tyrB基因扩增对L-亮氨酸生产的影响。

用一个培养物环将菌株55、505、505/PACYC-tyrB的每一种转移到装有L-肉汤的20ml试管中，然后在32℃通气条件下过夜培养。将每种过夜的培养液取0.1ml转移到20ml试管(内径22mm)中，悬浮于2ml用于发酵的培养基中，然后用旋转振荡器在32℃下培养48小时。用于发酵的培养基含有60g/l萄糖、25g/l硫酸铵、2g/l KH₂PO₄、1g/l MgSO₄、0.1mg/l硫胺素、5g/l酵母提取物Difco和25g/l白垩(pH 7.2)。葡萄糖和白垩单独灭菌。

培养后质粒的稳定性经过常规方法进行测定。培养基中富集的L-亮氨酸的量通过TLC测定。TLC得到的液相组成如下：异丙醇-80ml，乙酸乙酯-80ml，NH₄OH(30％)-25ml，H₂O-50ml。

                              表1

菌株	L-亮氨酸产量g/l	L-缬氨酸产量g/l	L-异亮氨酸产量g/l	L-高亮氨酸产量g/l
					55505505/pACYC-tyrB	2.11.32.7	0.8＜0.01＜0.01	0.2＜0.01＜0.01	0.02＜0.01＜0.01

由表1可看出，菌株505和505/pACYC-tyrB不产生任何量的L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-高亮氨酸。ilvE基因的失活导致了L-亮氨酸产量的减少。而tyrB基因的扩增通过L-亮氨酸生产菌株505改善了L-亮氨酸的富集。

                        序列表

<110>味之素株式会社

<120>生产L-亮氨酸的方法

<130>

<150>RU 2002/116773

<151>2002-06-25

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>1

agccgggatc cggtcatttt atgg                                         24

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：引物

<400>2

ttgggataag cttaacaata aaac                                         24

Claims (6)

1、一种属于埃希氏菌属的L-亮氨酸生产菌，其特征在于由于ilvE基因失活或ilvE基因编码的蛋白的活性降低，其产生的L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-高亮氨酸的量各自小于生产的L-亮氨酸的1％。

2、根据权利要求1的细菌，其中tyrB基因编码的蛋白的活性增加。

3、根据权利要求2的细菌，其中tyrB基因编码的蛋白的活性增加是通过用含有tyrB基因的DNA转化该细菌而完成。

4、根据权利要求3的细菌，其中使用多拷贝载体转化该细菌。

5、一种生产L-亮氨酸的方法，该方法包括的步骤有：

—在培养基中培养根据权利要求1至4任一项的细菌以在培养基中产生和富集L-亮氨酸，和

—从培养基中收集L-亮氨酸。

6、根据权利要求5的方法，其中细菌已经进行修饰而具有了增强的L-亮氨酸生物合成基因表达。

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