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CN1268177A - 新的核酸分子及其应用 - Google Patents

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CN1268177A
CN1268177A CN98808538.0A CN98808538A CN1268177A CN 1268177 A CN1268177 A CN 1268177A CN 98808538 A CN98808538 A CN 98808538A CN 1268177 A CN1268177 A CN 1268177A
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CN
China
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seq
nucleic acid
nucleotide sequence
acid molecule
plant
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Pending
Application number
CN98808538.0A
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默罕·辛格
普雷穆·伯哈拉
许慧玲
艾尼斯·斯沃伯达
曼吉特·辛格
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University of Melbourne
Original Assignee
University of Melbourne
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Abstract

本发明总的涉及新的核酸分子。更具体地,本发明涉及植物中雄性生殖细胞系细胞特异性的遗传序列。雄性生殖细胞系细胞包括生殖细胞和精细胞。进一步更具体地,本发明提供雄性生殖细胞系特异性基因或其功能性等价物及上述基因的启动子或其功能性衍生物及其在产生一系列包括雄性不育植物和转座子标记植物的突变植物中的应用。

Description

新的核酸分子及其应用
发明领域：
本发明总的来说涉及新的核酸分子。更具体地，本发明涉及植物中雄性生殖细胞系细胞特异性的遗传序列。雄性生殖细胞系细胞包括生殖细胞和精细胞。更进一步具体地，本发明提供雄性生殖细胞系特异性基因或其功能性等价物及上述基因的启动子或其功能性衍生物及其在产生一系列包括雄性不育植物和转座子标记植物的突变植物中的应用。
发明背景：
此说明书中大量参考的不断深化的公开文献的细目在本说明书的结尾处列出。
重组DNA技术大大有利于一系列工业的研究和发展并对农业和园艺工业特别有益。通过重组方法制备植物和植物产品的能力为相对较快地产生植物新品种、带有有益的遗传改变的植物和修饰的植物产品如谷物和水果提供很大的潜力。
植物工业的一个重要领域是生产杂交植物。从基本上纯合的亲本产生杂交植物可以引入一系列有益的特性包括疾病抗性、更高的种子产量、抗霜性和改变的营养特性。
总的来说由于杂交植物对农业和园艺工业的重要性，现已进行了大量研究以发现改进的、更为有效的产生杂合植物的途径。杂合植物的产生需要雌性亲本不发生自花受精。一系列物理、化学和遗传技术已经用于或准备用于防止自花受精。尽管这些技术中的一些已部分成功，但仍需发展其它的可更广泛应用的防止自花受精的方法。
农业和园艺工业的另一个重要领域是突变体的产生。突变植物自身可用在去除有害特性上或者用作进一步遗传操作如引入新的遗传物质的受体。通过一系列方法包括化学的和遗传的操作以及物理的操作和传统的育种已获得突变植物。一个特别有用的突变产生机制是“转座子标记”。
转座子是能在相同细胞内插入基因组不同位点的不同的遗传元件。已知两种较广泛类型的转座子包括通过DNA中介体进行转座的DNA为基础的转座子和通过RNA中介体进行转座的逆转座子或逆转录因子。转座子是转座子标记的有用工具，该技术依赖于通过插入转座子基因形成的可识别的表型。已发现转座子标记在基因的克隆中有特别的应用。
转座子标记的一个体系使用来自玉米的激活/解离(Ac/Ds)元件(1)。此体系包含反式激活蛋白，Acst，它提供转座酶和顺式应答Ds元件。转座酶促进了Ds的高频率生殖切除，然后Ds在切除后频繁地再整合入新的基因组位点。
然而，尽管需要雄性不育植物和致突变技术如转座子标记的有效性，但是该方面的进展由于不能靶向生殖细胞系细胞而受到阻碍。在导致本发明的工作中，发明者已鉴定出表现出严格的生殖细胞特异性表达的cDNA克隆。
雄配子的发育是开花植物生活周期中最重要的事件之一。生殖细胞，雄配子的祖先，在此过程中起到核心作用。此作用是产生两个雄配子，即参与受精的精子细胞。生殖细胞残留在另一细胞-营养细胞细胞质中，且至今仍被认为是无转录活性的。
在导致本发明的工作中，发明者已鉴定出雄配子特异性的基因。本发明中的上述基因及其相应的启动子能进行雄性生殖细胞系的特异性遗传操作包括产生雄性不育植物或促进雄配子特异性的转座子标记。
发明概述：
在本说明书的全文中，除非上下文的其它需要，词语“包含”，或它的其它时态，应理解为是指包括所称的元素或整数或元素或整数的集合但并不排除任何其它的元素或整数或元素或整数的集合。
说明书中所参考的核苷酸和氨基酸序列的序列鉴定号(SEQ IDNOs)在参考文献之后定义。
本发明的一个方面提供包含对应于一基因或其衍生物或上述基因中利于其表达的区域的核苷酸序列或互补序列的分离的核酸分子，其中上述基因在植物的雄配子中特异性表达。
本发明的另一个方面导向包含编码选自SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6和SEQ ID NO：8的氨基酸序列或与SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6或SEQ ID NO：8中任一者具有至少40％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或互补序列的核酸分子，其中上述核酸分子表现出在植物的雄配子中特异性表达的特点。
本发明的另一个方面提供包含选自SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：7的核苷酸序列或互补核苷酸序列或与SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7中任一者具有至少50％相似性的核苷酸序列或能与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：7中任一者于42℃在低严紧性条件下进行杂交的核苷酸序列的分离的核酸分子。
本发明的另一个方面提供包含能在与其可操作地连接的核苷酸序列中引导植物雄配子特异性表达的启动子或其功能性衍生物的核酸分子。
本发明的另一个方面提供包含能于42℃在低严紧性条件下与包括至少约2Kb的对应于SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7中任一者的核苷酸序列的上游的基因组区进行杂交的核苷酸序列或互补序列的分离的核酸分子，其中上述核酸分子能引导与其可操作地连接的核苷酸序列的植物雄配子特异性表达。
本发明的另一个方面导向包含基本上与SEQ ID NO：9相同的核苷酸序列或互补序列或能与其于42℃在低严紧性条件下进行杂交的核苷酸序列或与SEQ ID NO：9具有至少50％相似性的核苷酸序列的分离的核酸分子，其中上述分子能引导与其可操作地连接的核苷酸序列的植物雄配子特异性表达。
本发明进一步的方面涉及到在植物中诱导或促进雄性不育的方法，该方法包括使毒害细胞的核酸分子与在上述植物中引导雄配子特异性表达的启动子可操作地连接，从而在上述启动子的表达下，毒害细胞的核酸分子表达产生钝化、杀死或致使上述植物中的雄配子基本上无功能的产物。
本发明的另一个方面提供包含如上文所述的与转座酶基因可操作地连接的雄配子特异性启动子的遗传构建体，上述转座基因能诱导转座因子的转座，从而在上述启动子的表达下，转座酶基因的表达有利于上述转座因子的转座。
这里所指的“雄配子”包括生殖细胞和精细胞。
附图简述：
图1表示LGC1的核苷酸序列[SEQ ID NO：3]和推定的氨基酸序列[SEQ ID NO：4]。
图2是显示百合的不同组织中LGC1 mRNA的表达的照片。(A)用32P标记的LGC1探针探测的组织的Northern印迹。GCs，生殖细胞。(B)不同组织的RT-PCR。花粉mRNA来自生殖细胞及营养细胞。号码16、31、64代表各自贡献的mRNA的1/16、1/32和1/64。分子大小在左侧表示。
图3是显示LGC1mRNA与全样载片的百合花粉的原位杂交的照片。生殖细胞中的黑色染色(箭头)表示通过碱性磷酸酶偶联的抗DIG的抗体检测出的杂交信号。花粉的外壁看来类似雕刻的图案。(A)用DIG-UTP标记的LGC1反义核糖核酸探针探测的花粉。(B)用有义核糖核酸探针探测的对照花粉。
图4是显示LGC1mRNA与全样载片的不同发育阶段的百合花粉的原位杂交的照片。为进行更好的分离，将发育的花粉的原生质从具雕纹的花粉外壁中释放出来(9)。用DIG-UTP标记的核糖核酸探针探测发育的花粉(A-E)和花粉管(K)然后用4’，6’-二脒-2-苯基吲哚(DAPI)复染以显示花粉(F-J)中的营养和生殖核及花粉管(L)中的精核。箭头表示处于早期发育阶段的生殖细胞。GN，生殖核；VN，营养核；SC，精细胞；SN，精核。
图5表示gcH2A cDNA的核苷酸[SEQ ID NO：5]和推定的氨基酸[SEQ ID NO：6]序列。推定的氨基酸序列(在右边编号)在相应核苷酸序列(在左边编号)的下面给出。
图6表示gcH3 cDNA全长的核苷酸[SEQ ID NO：7]和推定的氨基酸[SEQ ID NO：8]序列。左边的数字表示核苷酸序列的碱基位置，右边的数字表示推定的氨基酸序列的残基位置。
图7是显示gcH2A和gcH3表达模式的照片。
图8是显示花粉中gcH2A和gcH3的原位杂交的照片。将花粉外壁去除以更好地显示信号。
(A)用生殖细胞中显示强杂交信号来探测的花粉。
(B)用DIG标记的正义gcH2A探测的对照花粉。
(C)用生殖细胞中显示强杂交信号来探测的花粉。
(D)用DIG标记的正义gcH3探测的对照花粉。
图9是显示花粉发育期间gcH2A和gcH3的表达的照片。生殖细胞刚刚形成后的小孢子(A，D，G)、接近成熟的花粉(B，E，H)及成熟花粉(C，F，I)进行的原位杂交。箭头表示接近形成的生殖细胞，VN，营养核，GN，生殖细胞核。将花粉外壁去除以更好地显示信号。
(A)，(B)，(C)用DIG标记的仅在成熟花粉中显示强烈杂交信号的反义gcH2A探测的样品。
(G)，(H)，(I)用DIG标记的仅在成熟花粉中显示强烈杂交信号的反义gcH3探测的样品。
(D)，(E)，(F)相应发育阶段的DAPI染色。
图10表示LGC1启动子的核苷酸序列。转录起点(核苷酸位置817)和翻译起点(核苷酸位置894)用黑体和下划线表示。
图11是表示包含与DNA序列可操作地连接的LGC1启动子和选择性标记基因(报道基因序列)的不同构建体的图示。
图12(A)是表示包含与Gus报道基因可操作地连接的LGC1启动子的遗传构建体的图示。遗传构建体进一步包含具有选择性标记的基因。
图12(B)是用图12(A)中的成熟花粉的遗传构建体以4’，6’-二脒-2-苯基吲哚(DAPI)进行复染所显示出的Gus基因表达的照片。因此所观察到的LGC15’-侧翼区的活性反映了百合花粉中内源LGC1的表达。
优选实施方案的详述：
本发明提供包含对应于一基因或其衍生物或上述基因中利于其表达的区域的核苷酸序列或互补序列的分离的核酸分子，其中上述基因在植物的雄配子中特异性表达。雄配子应被理解为可包括营养细胞和精细胞。
本发明的核酸分子延伸到对应于一基因或其衍生物或上述基因的启动子或上述启动子的功能性衍生物的基因组或cDNA分子，只要该启动子可使该基因或其衍生物在雄配子中特异性表达。
植物可以是单子叶植物或双子叶植物。优选的植物包括但不限于豆科植物、作物、谷类植物和天然草、水果植物、开花植物等。一种特别优选的植物是百合植物。
在另一个实施方案中，本发明导向包含编码选自SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8的氨基酸序列或与SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8中任一者具有至少40％相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或互补序列的核酸分子，其中上述核酸分子表现出在植物的雄配子中特异性表达的特点。本发明此方面中优选基因是指“LGC1”基因。
优选地，与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8中任一者的相似性的百分比是至少约50％，更优选的是至少约60％，进一步更优选的是至少约70％，再进一步更优选的是至少约80％-90％或更高。
本发明的另一个方面提供包含选自SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：7的核苷酸序列或互补核苷酸序列或与SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7中任一者具有至少50％相似性的核苷酸序列或能与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：7中任一者于42℃在低严紧性条件下进行杂交的核苷酸序列的分离的核酸分子。
优选地，与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7中任一者的核苷酸相似性的百分比水平是至少约60％，更优选的是至少约70％，进一步更优选的是至少约80％，再进一步更优选的是至少约90％或更高。
这里所指的42℃低严紧性包括从至少约1％v/v到至少约15％v/v的甲酰胺和从至少约1M到至少约2M的用于杂交的盐，以及至少约1M到至少约2M的用于洗涤条件的盐。其它严紧性条件也可在需要时使用，如中度严紧性，它包括从至少约16％v/v到至少约30％v/v的甲酰胺和从至少约0.5M到至少约0.9M的用于杂交的盐，以及至少约0.5M到至少约0.9M的用于洗涤条件的盐，或者用高严紧性，它包括从至少约31％v/v到至少约50％v/v的甲酰胺和从至少约0.01M到至少约0.15M的用于杂交的盐，以及至少约0.01M到至少约0.15M的用于洗涤条件的盐。一般而言，洗涤在Tm＝69.3+0.41(G+C)％[19]时进行。然而，错配碱基对的数目每增加1％(20)，DNA双螺旋的Tm就下降1℃
如这里所用到的术语“相似性”包括相比较的序列之间在核苷酸水平或氨基酸水平完全相同。当在核苷酸水平不完全相同时，“相似性”包括导致不同氨基酸的序列差异，但这些不同的氨基酸在结构、功能、生化和/或构象水平上仍然彼此相关。当在氨基酸水平上不完全相同时，“相似性”包括在结构、功能、生化和/或构象水平仍然彼此相关的不同氨基酸。
优选地，是按照核苷酸和氨基酸序列的相同的百分比进行比较，并且这包括用标准算法如但不限于基因works programme(Intelli基因tcs)适当校准的确切核苷酸或氨基酸配对数目。
这里所指的“衍生物”包括核苷酸或氨基酸序列的单个或多个核苷酸或氨基酸替换、缺失和/或添加及其部分、片段、同源物和类似物。
本发明的核酸分子在植物的雄配子，即生殖细胞中特异性表达。雄配子特异性表达由雄配子特异性启动子部分决定。
因此，本发明的另一方面提供包含在与其可操作地连接的核苷酸序列中引导雄配子特异性表达的启动子或其功能性衍生物的核酸分子。
更具体地，本发明的此方面提供包含能于42℃在低严紧性条件下与包括至少约2Kb的对应于SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQID NO：7中任一者的核苷酸序列的上游的基因组区进行杂交的核苷酸序列或互补序列的分离的核酸分子，其中上述核酸分子能引导与其可操作地连接的核苷酸序列的植物雄配子特异性表达。
进一步更具体地，本发明的此方面包含基本上与SEQ ID NO：9相同的核苷酸序列或互补序列或能与其于42℃在低严紧性条件下进行杂交的核苷酸序列或与SEQ ID NO：9具有至少50％相似性的核苷酸序列的分离的核酸分子，其中上述分子能引导与其可操作地连接的核苷酸序列的植物雄配子特异性表达。
SEQ ID NO：9的核苷酸序列代表LGC1基因的启动子并且在这里称为LGC1启动子。本发明包括包含基本上与SEQ ID NO：9相同的核苷酸序列的LGC1启动子或其任何衍生物包括其突变体、片段、同源物和类似物。该衍生物可被进一步定义为能与SEQ ID NO：9于42℃在低严紧性条件下进行杂交并且/或者具有与SEQ ID NO：9约50％的相似性。一般地，衍生物保留有至少部分启动子活性并因此是“功能性”衍生物。但是，本发明也包括非功能性的衍生物，因为它们具有应用性例如抑制启动子活性及作为其它相似启动子的探针。
在SEQ ID NO：9中，转录起点是核苷酸位置817，翻译起点(ATG)是核苷酸位置894。
本发明进一步延伸到包含LGC1启动子或其衍生物以及与启动子可操作地连接的核苷酸序列并可选择地是报道分子的多种遗传构建体。与启动子可操作地连接的核苷酸序列的例子包括，但不限于那些编码GUS、GFP、核糖核酸酶、DTA、反义分子、转座子、核酶的基因和致命基因等。
雄配子特异性启动子和基因的鉴定可产生一系列雄性不育植物以及雄配子特异性转座子标记。
在一个实施方案中，本发明涉及一种诱导或促进植物中雄性不育性的方法，该方法包括使毒害细胞的核酸分子与在上述植物中引导雄配子特异性表达的启动子可操作地连接，从而在上述启动子的表达下，毒害细胞的核酸分子表达产生钝化、杀死或致使上述植物中的雄配子基本上无功能的产物。
毒害细胞的核酸分子可编码或包含具有细胞毒性的蛋白、特定基因的反义分子、核酶或plantabody等分子。
优选地，启动子对应于在低严紧性条件下与包括至少约2Kb的对应于SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7中任一者的核苷酸序列的上游的基因组区进行杂交的核苷酸序列。更优选地，启动子是LGC1启动子或其衍生物。
或者，毒害细胞的核酸分子与天然可操作地连接于上述启动子的基因融合，从而在上述基因的表达下，毒害细胞的核酸分子钝化、杀死上述植物中的雄配子或使其基本上无功能。
在另一个实施方案中，雄配子特异性启动子和/或基因用于促进雄配子特异性转座子标记。这有利于在带有转座子标记的植物中产生花粉粒。然后可以筛选一系列具有目的表型的后代，然后再将转座子标记植物用于克隆特定的基因。
因此，本发明的另一方面提供包含如前所述的与转座酶基因可操作地连接的雄配子特异性启动子的遗传构建体，上述转座酶基因能诱导转座因子的转座，从而在上述启动子的表达下，转座酶基因的表达有利于上述转座因子的转座。
特别有用的转座体系是DsALS体系(1，5)其中激体(Ac)转座酶将在本发明启动子的控制之下促进解离(Ds)因子的转座。
根据本发明植物选自如作物植物、豆科植物、草类植物或开花植物等单子叶植物和双子叶植物以及制备的愈伤组织培养物。将含有雄配子特异性启动子和可选择地与上述可操作地连接于毒害细胞的核酸分子或转座基因的启动子联合的雄性基因特异性基因的遗传构建体引入愈伤组织细胞。然后使植物再生。雄配子特异性构建体可处于其它调控机制如环境的、发育的、生理的或营养调控机制之下，从而在这些机制的调控下，雄配子特异性启动子得到活化。在任何情况中，在雄配子特异性启动子的表达之下，将产生转座子标记或表达毒害细胞的核酸分子。这将导致产生标记的花粉或雄性不育性。
含有一系列转座子插入和有利于本发明实践的遗传构建体的雄性不育植物是本发明所包括的内容，同时还包括其所有后代、新的植物变种和突变植物。
本发明延伸到如这里所述的启动子及其功能性突变体。功能性突变体包括与其它启动子融化的启动子，及单个或多个核苷酸的缺失、添加和/或替换包括其部分、片段、同源物和类似物。
尽管本发明并不限于任何类型的雄配子特异性基因或启动子，但编码组蛋白的基因和启动子是特别有用的。
本发明的另一个优点提供了发展无种子水果或种子含量降低的水果的潜力。这在受粉刺激水果发育和缺乏受精导致产生无种子水果的情况下特别有用。
本发明延伸到任何转座因子例如但不限于Ac、Ds、En/Spm、dspm、Tam3、dTam3、Mu1、Tat1、Tag1、dTph1、Tnt1、Tto1、Tto2、Ac-like、dTnp和Tos17。这些因子在参考文献16中可以很容易地查到。
本发明由下列非限制性的实施例进一步描述。
实施例1：LGC1的分离
从百合(Lilium longifolrum)中分离生殖细胞并从该生殖细胞中分离mRNA。从如前所述的百合的新鲜花粉中分离生殖细胞(6)并贮存于-70℃直至使用。用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia-LKB)从1×105个贮存的生殖细胞中直接提取mRNA。将纯化的生殖细胞mRNA进行逆转录并将通过PCR扩增得到的cDNA按大小分开并克隆到λgt11表达载体中。
用示差杂交法获得对应于在生殖细胞中特异性表达的基因的cDNA克隆。将克隆命名为LGC1。在示差杂交方法中，从生殖细胞cDNA文库中随机挑取大量的cDNA克隆，并用λgt11正向和反向引物通过PCR获得cDNA插入体。PCR的条件为以94℃ 1分钟、60℃ 2分钟和72℃ 3分钟进行30个循环，于72℃进行终止延伸10分钟。纯化所扩增的cDNA插入体，用随机引物试剂盒(Bresatec Ltd，SouthAustralia)标记32P并将其用于探测含有约300ng的来自包括叶、茎、花瓣、柱头/花柱、子房、花粉和生殖细胞的mRNA的RNA狭线印迹。杂交和洗涤按前面所描述的进行(18)。选出表现出优先或特异性地与生殖细胞mRNA杂交的dDNA克隆进行进一步分析。
将一个克隆，LGC1的cDNA插入体亚克隆入pBluescript(SK)+(Strata基因)并用ABI PRISM(商标)染料终止子循环测序试剂盒(Perkin-Elmer)进行测序。LGC1 cDNA插入体表现为618bp长，编码128个氨基酸，计算分子量为13.8kDa的推定的基因产物(图1)。通过Northern印迹分析表明LGC1对应于以高水平存在于生殖细胞的0.6kbp转录物(图2A)。
当在含有花粉的生殖细胞中可见到较弱的信号时，在所测试的两种营养组织叶和茎中未检测到信号。LGC1的组织特异性用扩增编码区0.3kbp部分的特异性PCR引物通过RT-PCR进行进一步检测。为进行RT-PCR，使来自生殖细胞和各种组织的mRNA进行逆转录并用一对测序特异性引物(L13A：5′-GTACTCTTAAGCATACAACATGAG-3′[SEQ ID NO：1]；L13B：5′-CAGGCATACTTGAATGCTACAAGA-3′[SEQ ID NO：2])使用Access RT-PCR体系通过PCR进行扩增。对于每种组织，使mRNA进行连续的2倍稀释。基于扩增产物的信号强度，可估计每种组织中LGC1 mRNA的相对量。
用控制量的来自百合植物不同组织的RNA进行RT-PCR扩增。在生殖细胞和花粉中得到期望大小(0.3kbp)的PCR产物，但在所有其它测试的组织包括营养部分如叶、茎以及生殖部分如花瓣、雌柱头/花柱和子房中未得到该片段(图2B)。基于信号强度，发明者估计从生殖细胞mRNA得到的PCR产物是从花粉mRNA得到的约20倍。由于生殖细胞构成花粉的一小部分，发明者认为用花粉mRNA获得的扩增的LGC1产物仅能代表生殖细胞的构成。LGC1的生殖细胞特异性通过如下所述的原位杂交进一步确证。
在发育的和成熟的花粉中通过前面所述的方法进行非同位素的全样载片原位杂交(3，4，5)。将处于不同发育阶段的新鲜花粉于室温固定(50mM PIPES缓冲液中的1％ v/v戊二醛，pH7.4)2小时。然后将固定的花粉在缓冲液中洗涤并于4℃贮存于70％ v/v乙醇中直至使用。正义和反义的标记DIG-UTP的核糖核酸探针均从线性化的DNA模板产生。通过碱性磷酸酶偶联的抗DIG的抗体使用DIG核酸检测试剂盒(Boehringer Mannheim)来检测杂交信号。为获得较好的分辨率，通过如前所述地用酶溶液(1％ v/v解析酶，0.5％ w/v纤维素酶和0.5％ w/vBSA)处理使发育的花粉的原生质体从外壁(花粉的外壁)中释放出来(6)。花粉内的营养和生殖核通过用4’，6’-二脒-2-苯基吲哚(DAPI)进行复染可见。
结果清楚地表明LGC1 mRNA是属于成熟花粉中的生殖细胞的(图3)。通过Northern印迹和RT-PCR检测的花粉中的LGC1 mRNA是来源于生殖细胞的。
为测定存在于生殖细胞中的LGC1 mRNA是生殖细胞特异性基因活性的产物还是在发育的花粉中生殖细胞形成之前由不对称的RNA定位和分布导致的结果，发明者监测LGC1 mRNA在这一过程中的积累。发明者检查了生殖细胞的6个不同发育阶段。在较早的阶段，新形成的生殖细胞黏附于花粉的一极，同时营养核位于其附近(图4A，F)。当发育进行时，生殖细胞开始从花粉内壁(花粉的内细胞壁)分离，同时营养核移向花粉的中心(图4B，G)。在这两个早期发育阶段中未观察到可检测到的信号(图4A，B)。随着花粉大小的迅速扩增，生殖细胞与花粉内壁完全分离并游离地悬浮在营养细胞的原生质体中。在此阶段，它的形状变得更长，在中心有一很大的核，大部分细胞质位于细胞的两端(图4C，H)。在生殖细胞的两端均可检测出较弱的信号，表示LGC1mRNA转录的起始(图4C)。当发育继续进行时，生殖细胞变为梭形(图4D，I)并且生殖细胞中LGC1 mRNA的积累变得更为明显(图4D)。当花粉成熟时，可在生殖细胞中观察到非常高水平的LGC1 mRNA(图3A，图4E，J)。然后，花粉开始在雌性柱头上萌发并且花粉管在雌性花柱组织内生长。然后生殖细胞移入花粉管并进行有丝分裂产生两个雄配子，即精子细胞(图4K，L)。如下面所更详尽地描述的，在两个精子细胞中的花粉管内(图4K)可清楚地检测LGC1 mRNA。
在百合中，生殖细胞分裂在花粉管于雌性花柱组织中生长时发生在花粉管中。因此，精细胞mRNA的原位杂交仅能在花粉管中进行。花粉管通过用新鲜收集的花粉进行人工授粉的雌蕊在体内生长。
48小时后，从花柱的基部取下1厘米长的一节并切成对称的两半。将生长在中空的花柱腔中的花粉管取出、固定然后用于如下所述的原位杂交中。
在营养细胞花粉发育的任何阶段中未检测到信号。这些结果表明LGC1 mRNA的生殖细胞特异性积累是由于生殖细胞的差别基因活性引起的。
雄性生殖细胞系特异性基因表达代表开花植物中基本的重要性质中的新的方面。LGC1是开花植物中第一个得到鉴定的雄性生殖细胞系特异性基因并且因此，针对生殖细胞特异性基因表达的本研究在理解雄配子发育的分子基础上具有重要的提示。几方面的研究可立即从此基因及其启动子的可得性获益。例如，雄配子的选择性去除可通过使用生殖细胞特异性启动子-细胞毒素融合来实现。LGC1基因启动子的可得性使引入在分子水平监测精-卵识别与融合过程的标记基因成为可能。并且，雄配子特异性启动子可用于产生一系列转座子以特化标记的花粉基因。
实施例2：H2A和H3组蛋白基因的雄配子细胞特异性表达
下面的实施例表示分别编码组蛋白H2A和H3的雄配子特异性变体的两个cDNA克隆，gcH2A和gcH3的鉴定。发明者表明gcH2A和gcH3的mRNA均专门在雄性生殖细胞系细胞，生殖细胞中积累。对gcH2A和gcH3转录物在花粉发育过程中的空间分布的检测表明这些基因的表达是在处于花粉成熟的较晚阶段的生殖细胞中开始的。结果表明这些组蛋白变体是生殖细胞转录活化的产物。此实施例提供了对开花植物中雄性生殖细胞系细胞特异性组蛋白基因表达的第一种认识。
1.简介
组蛋白是真核细胞细胞核染色质的主要蛋白组分。组蛋白包括5个主要的组：4种核心组蛋白H2A、H2B、H3、H4和一种连接组蛋白H1。核心组蛋白是较小的碱性蛋白(11-15kDa)，含有高比例的带正电荷的氨基酸，主要为赖氨酸和精氨酸。组蛋白在整个进化过程中高度保守并由多基因家族编码。编码组蛋白主要组的基因常在S期(DNA合成)开始时以细胞周期依赖的方式表达并在细胞周期中的转录和转录后水平得到同等的调节(7)。
2.方法
(a)cDNA文库的构建和筛选
如前所述(8)从百合(Lilium longiflorum)的成熟花粉中分离生殖细胞并贮存于-70℃直至使用。用寡(dT)-纤维素亲合柱(Pharmacia)按照制造商的介绍从约1×105个贮存的生殖细胞中分离Poly(A)+RNA。寡(dT)引物合成第一链cDNA。还使用了Capswitch引物以保证全长克隆的合成。得到的cDNA用下列条件通过PCR进行扩增：以94℃ 1分钟、42℃ 2分钟和72℃ 2分钟进行35个循环。通过Sephadex-50柱使不同大小的PCR产物分开并将适当大小的cDNA克隆入λgt11表达载体中。
为进行筛选，随机挑取大量的cDNA克隆并用λgt11正向和反向引物通过PCR得到cDNA插入体。差异筛选通过用扩增的cDNA插入体检测不同组织的RNA狭线印迹来进行。cDNA克隆对生殖细胞RNA表现出强烈的杂交，对花粉RNA表现出较弱的杂交，对认为是推定的生殖细胞特异性克隆的其它组织没有杂交。
(b)测序分析
将推定的生殖细胞cDNA克隆亚克隆入pBluescript IISK+(Strata基因)中。用ABI PRISM(商标)染料终止子循环测序试剂盒(Perkin-elmer)在自动化测序仪上通过双脱氧链-终止方法(9)在两条链上进行测序。序列特异性引物用于产生重叠的序列信息。DNA和蛋白序列分析通过使用BLAST检索工具进行。
(c)RNA凝胶印迹分析
从不同组织中制备总RNA(10)。用SNAP RNA提取试剂盒(Invitro基因)按照制造商的方法分离生殖细胞RNA。为进行凝胶印迹分析，通过变性琼脂糖凝胶电泳分离20μg总RNA，将其印迹到Hybond N+尼龙膜(Amersham)上并用32P标记的gcH2A和gcH3 cDNA插入体检测。探针与RNA印迹的杂交在50％ v/v去离子的甲酰胺、2×SSPE(1×SSPE是0.15M NaCl，0.01M NaH2PO4和1mM EDTA，pH7.4)、1％ w/v PEG、0.5％ w/v BLOTTO、7％ w/v SDS和0.5mg/ml变性鲑精DNA中于42℃过夜进行。印迹用2×SSC(1×SSC是0.15MNaCl和15mM柠檬酸钠，pH7.0)、0.1％ w/v SDS于室温洗涤15分钟并用0.2×SSC、0.1％ w/v SDS于65℃洗涤15分钟，再在0.2×SSC中简单洗涤。印迹用百合核糖体RNA再次探测以确证所带有RNA的相对量。
(d)原位杂交
非放射性全样载片原位杂交在上述方法的基础上进行(11，12，13)。花粉的发育阶段用4’，6’-二脒-2苯基吲哚(DAPI)染色进行测定。用酶溶液(1％ w/v解析酶，0.5％ w/v纤维素酶和0.5％ w/v BSA)处理成熟的和发育的花粉1小时以去除外壁(花粉的外壁)。然后将花粉原生质体在50mM PIPES缓冲液中洗涤并在50mM PIPES缓冲液中的1％戊二醛里于室温固定2小时。然后将固定的花粉在50mM PIPES缓冲液中洗涤并于4℃贮存于70％ v/v的乙醇中。
在杂交之前，首先将花粉样品通过连续浓度最高达100％ v/v的乙醇进行脱水。然后用二甲苯处理样品(2×10分钟)，再经过连续浓度的乙醇进行再脱水。在100mM Tris-HCl pH8和50mM EDTA中用蛋白酶K(1μg/ml)于37℃处理40分钟。通过体外转录(Promega)合成洋地黄毒苷标记的核糖核酸探针。杂交于55℃在50％ v/v甲酰胺、6×SSC、3％ w/v SDS、100μg/ml tRNA中过夜进行。然后于室温在1×SSC、0.1％ w/v SDS中洗涤样品再于55℃在0.2×SSC、0.1％ w/v SDS中洗涤2×10分钟。于37℃在2×SSC中用RNA酶A(10μg/ml)处理1小时。用DIG检测试剂盒(Boehringer Mannheim)按照制造商的说明书检测杂交信号。营养和生殖细胞核通过用DAPI进行复染可见。
结果：组蛋白gcH2A和gcH3 cDNA克隆的分离和鉴定
根据本实施例将百合(Lilum longiflorum)用作实验体系。在花粉粒内，雄性生殖细胞系细胞(生殖细胞)包含于大得多的营养细胞中。为使获得在生殖细胞中特异性表达的基因的机会最大，发明者用从生殖细胞分离的polyA(+)RNA制备cDNA文库。用来自生殖细胞、花粉、叶、茎、雌蕊和子房的探针通过示差杂交筛选cDNA文库。认为那些与生殖细胞mRNA有强的阳性杂交信号、与花粉mRNA有弱的杂交信号及与其它组织的mRNA无信号的cDNA克隆是推定的生殖细胞特异性克隆。将这些cDNA克隆进行进一步的分析。发现这些克隆中的两个分别编码鉴定为是组蛋白H2A和H3的变体的蛋白。将这两个克隆命名为“gcH2A”和“gcH3”。
gcH2A cDNA有581bp长并含有333bp的开放阅读框，从处于49位的第一个ATG开始直到处于379位的终止密码子TAA(图1)。gcH2A衍生出的氨基酸序列包含111个氨基酸并编码计算分子量为12.1kDa的蛋白。gcH2A多肽含有10.8％的精氨酸和5.4％的赖氨酸。gcH2A衍生的氨基酸序列与其它组织的体细胞H2A组蛋白相比表现出高水平的序列相似性及可变性。蛋白的N-末端区看来比C-末端区更为保守。并且，gcH2A多肽的C-末端比体细胞H2A组蛋白短30-35个氨基酸。已有报道小麦体细胞组蛋白的C-末端可变区有两种不同的结构类型(14)。1型H2A蛋白具有1或2个已知与DNA小沟相互作用的SPKK基序的拷贝，而2型H2A蛋白的C-末端可变区较短并且无SPKK基序。使用这些标准，百合的生殖细胞特异性H2A(gcH2A)组蛋白属于2型，因为gcH2A的C-末端区不含有SPKK基序。
gcH3 cDNA克隆的完整序列如图6所示。gcH3 cDNA有485个核苷酸并含有推定的编码112个氨基酸的蛋白的336bp的开放阅读框。含有8％精氨酸和12.5％赖氨酸的推定的gcH3多肽，其计算的分子量为12.5kDa。当与体细胞组蛋白H3相比时，gcH3的推定的氨基酸序列表现出位于多肽两末端附近的两个高度保守区及位于中心区的14个氨基酸(50到60位)的可变区。
gcH2A和gcH3组蛋白克隆均转录为聚腺苷酰化mRNAs。测序分析显示出与聚腺苷酸化共有序列信号及在它们3’端的聚腺苷酸化序列碱基相似的A/T富集区。
为测定gcH2A和gcH3的表达模式，对各种器官包括生殖细胞、花粉粒、新生的叶、茎、雌蕊和子房的RNA样品进行RNA印迹分析。考虑到组蛋白编码区的高度保守的性质，杂交和洗涤均在高度严紧性条件下进行以避免与其它体细胞组蛋白mRNAs发生交叉杂交。对应于gcH2A和gcH3的mRNAs均在生殖细胞中检测到(图7)。在花粉中也检测到了较弱的杂交信号而在所测试的营养组织和其它花组织中均未显示出可检测到的gcH2A和gcH3 mRNAs水平。由于花粉粒包含营养及生殖细胞，因此可明显看出花粉RNA中检测到的较弱信号是由于仅有生殖细胞的贡献。发明者通过RNA凝胶印迹及RT-PCR分析检测具有大量分裂细胞的幼苗嫩叶和茎组织。gcH2A和gcH3的表达均未检测到。因为所测试的组织代表了较广范围的植物器官，因此可得出结论gcH2A和gcH3均只在生殖细胞中表达。从杂交信号的强度可以推测gcH2A是高丰度的基因，而gcH3代表低表达的转录本。
发明者通过原位杂交检测了花粉内gcH2A和gcH3mRNA的空间分布。将洋地黄毒苷(DIG)标记的gcH2A和gcH3用于探测全样载片的花粉粒。gcH2A和gcH3的积累均明确地限于花粉的生殖细胞内而在花粉的营养细胞中未检测到杂交信号(图8a，c)。在用作为对照的正义探针检测的花粉粒中未观察到信号(图8b，d)。gcH2A在生殖细胞中的积累看来大大高于gcH3。通过原位杂交得到的结果与RNA凝胶印迹分析的结果一致并清楚地证明了gcH2A和gcH3的生殖细胞特异性。
为测定gcH2A和gcH3的表达在时间上的特点，发明者检测了雄配子发生的5个发育阶段。可以确认在开花植物的雄配子发生过程中进行3次DNA复制。第一次复制在减数分裂之前发生在小孢子母细胞或产生4个单倍体小孢子的四分体的花粉母细胞中。第二次复制在第一次有丝分裂(花粉有丝分裂I)产生大的营养细胞和小的生殖细胞之前发生在小孢子中。第三次复制在第二次有丝分裂(花粉有丝分裂II)导致两个雄配子(精子细胞)形成之前发生在生殖细胞中。为测定是否gcH2A和gcH3与雄配子发生过程中这三次复制中的任一者相关联，发明者在小孢子母细胞、小孢子和生殖细胞发育的三个阶段中进行了原位杂交。在减数分裂前的小孢子母细胞和有丝分裂前的小孢子中未观察到杂交信号。并且，在花粉有丝分裂I(图9a，d，g)之后新形成的生殖细胞中未检测到gcH2A和gcH3。当发育过程进入到花粉成熟时，生殖细胞完全从花粉内壁脱离并游离地悬浮在营养细胞的细胞质中。在此阶段，生殖细胞变长并成为梭形，其中较大的核位于中心，大部分细胞质位于两端(图9b，e，h)。当以gcH2A进行检测时在生殖细胞的两端可观察到较弱的信号，表明gcH2A mRNA转录的开始(图9b)。当花粉成熟时，强烈的杂交信号表明生殖细胞中gcH2A mRNA的积累达到了很高的水平(图7c)。与此结果相比较，以gcH3进行检测所获得的信号显得弱得多(图7i)，并且对应于gcH3克隆的mRNA仅在花粉发育的成熟阶段才能检测出。
实施例3：LGC1启动子区的克隆
LGC1的启动子区通过使用Unever PCR的方法获得(18)。用基因特异性引物和任意引物从百合的基因组DNA中直接产生片段。进行两轮PCR扩增。
在第一轮Unever PCR中，使用了LGC1基因特异性引物(5′-CAGGCATACTTGAATGCTACAAGA-3′[SEQ ID NO：10])和任意的10-部分引物。将0.05μM 10-部分引物、0.25μM基因特异性引物、20ng百合基因组DNA、200μM dNTP和2单位AmpliTaq加入到40μl反应混合物中。Unever PCR的循环条件是94℃ 1分钟，然后进行第一个循环，94℃ 30秒、55℃ 1分钟、72℃ 1分钟，第二个循环，94℃ 30秒、42℃ 1分钟、72℃ 1分钟；循环1和2重复3次。然后进行第7个循环，94℃ 15秒、57℃ 30秒、72℃ 30秒，然后进行第8个循环，94℃ 15秒、45℃ 30秒、72℃ 30秒，循环7和循环8重复20次。最后，样品于72℃保持5分钟。第一轮产物的一部分(0.5μl)用作第二轮Unever PCR的模板。除了使用嵌套式引物(5′-TGTGAACCATACAGAAGAGAACGC-3′[SEQ ID NO：11])代替第一个特异性引物之外所有成分与第一轮反应相同。循环条件为：94℃ 1分钟，然后进行第一个循环，94℃ 15秒、57℃ 30秒、72℃ 30秒，第二个循环，94℃ 15秒、45℃ 30秒、72℃ 30秒；循环1和2重复20次；最后，在72℃保持5分钟。
将样品在1％ w/v琼脂糖凝胶中按大小分开并印迹到尼龙膜上。用32P标记的LGC1 cDNA检测印迹。然后将与LGC1 cDNA杂交的带亚克隆到pGEM T-载体中。用ABI PRISM染料终止子循环测序试剂盒在自动化的DNA测序仪上通过双脱氧链-终止方法在两条链上进行DNA测序。
LGC1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：9及图10所示。转录起始点是核苷酸817位，翻译起始点(ATG)是核苷酸894位。
实施例4：含有LGC1启动子的构建体
制备了多种遗传构建体，其中含有与之可操作地连接的LGC1启动子和报道基因序列。一些构建体如图11所示。
实施例5：LGC1在转基因烟草中的生殖细胞特异性表达
为确定LGC1的5’非编码区代表活化的启动子并研究其表达模式，将894bp的LGC1上游序列与大肠杆菌的β-半乳糖苷酶(Gus)报道基因融合(图12A)。通过农杆菌介导的转化将嵌合的融合构建体引入烟草。获得了一些独立的转化体。对转基因植物GUS酶活性的组织化学和荧光测定分析证明LGC1的894bp的侧翼区足以引导基因以生殖细胞特异性的模式进行表达。没有转化体在营养组织，象茎、叶和根，或在花的不同部分，如花瓣、萼片、雌蕊和子房中表现为兰色染色。DAPI对成熟花粉的复染证实Gus基因的表达明确地限于生殖细胞内。因此所观察到的LGC1 5’-侧翼区的活性反应了百合花粉中内源性LGC1的表达。结果如图12B所示。
本领域技术人员可以理解这里所描述的发明除了那些特别说明的可以进行改变和修饰。应当理解本发明包括所以这些改变和修饰。发明还包括本说明书中单独或共同涉及的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何和所有两个或多个上述步骤或特征的组合。
                          文献目录
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(i)申请人：(美国之外)MELBOURNE大学
        (美国)SINGH Nohan，BHALLA Prem，HUI-
   LING Xu和SWOBODA Ines
(ii)发明名称：新的核酸分子及其应用
(iii)序列数：9
(iv)联系地址：
    (A)收件人：DAVIES COLLISON CAVE
    (B)街道：1 LITTLE COLLINS STREET
    (C)城市：MELBOURNE
    (D)州：VICTORIA
    (E)国家：澳大利亚
    (F)邮政编码：3000
(v)计算机可读形式
    (A)介质类型：软盘
    (B)计算机：IBM PC兼容机
    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
    (D)软件：PatentIn Release #1.0，版本#1.25
(vi)当前申请信息：
    (A)申请号：PCT INTERNATIONAL
    (B)申请日：1998年7月24日
    (C)分类号：
(vii)在先申请信息：
    (A)申请号：PO8233
    (B)申请日：1997年7月25日
    (C)分类号：
(viii)代理人/代理机构信息：
    (A)姓名：HUGHES，DR E JOHN L
    (C)参考/文档号：EJH/AF
(ix)联系信息
    (A)电话：+61 3 92542777
    (B)传真：+61 3 92542770
    (C)电报：AA 31787(2)关于SEQ ID NO：1的信息
(i)序列特征
    (A)长度：14个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：
GTACTCTTAA GCATACAACA TGAG(2)关于SEQ ID NO：2的信息
(i)序列特征
    (A)长度：14个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
CAGGCATACT TGAATGCTAC AAGA
(2)关于SEQ ID NO：3的信息
    (i)序列特征
        (A)长度：625个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
         (ii)分子类型：DNA
    (ix)特征：
        (A)名称/关键：CDS
        (B)位置：82..468
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：GCCATCCCAT CAACAGAAGG TTTAAGTGGA AATCCATTTC ATTAGAAAAG ATCGGACAAA      60GGGTACTCTT AAGCATACAA C ATG AGG GCG GTG GCG GTT TTC TTT GCT TGC       111
                    Met Arg Ala Val Ala Val Phe Phe Ala Cys
                      1               5                  10GTT CTC TTC TGT ATG GTT CAC AAA GCC GCA CTT GCG GAT GAT AAA ACG       159Val Leu Phe Cys Met Val His Lys Ala Ala Leu Ala Asp Asp Lys Thr
             15                  20                  25TGC AAC CCT ACA GAT TTT ATG GTT ACC CAA ACC ATA ACT GGA TTG ACA       207Cys Asn Pro Thr Asp Phe Met Val Thr Gln Thr Ile Thr Gly Leu Thr
         30                  35                  40ATC GGC GGT AAA CAA GAG TTC GAG GTC AAT TTA ATA AAC AAT TTG TAT       255Ile Gly Gly Lys Gln Glu Phe Glu Val Asn Leu Ile Asn Asn Leu Tyr
     45                  50                  55TGT GCA CAA TCT AAT GTC AAA GTT TCA TGT GAC GGG CTT CAT ACC ACC       303Cys Ala Gln Ser Asn Val Lys Val Ser Cys Asp Gly Leu His Thr Thr
 60                  65                  70GAA CCA ATA GAT CCT CAC ATT ATC AGA CCA CTT AGT GAC GGA ACG AAC       351Glu Pro Ile Asp Pro His Ile Ile Arg Pro Leu Ser Asp Gly Thr Asn75                  80                  85                  90AAC TGC CTT GTC AAC AAT GGA GCG CCT ATT TCT CAT GCT ACT CTT GTA       399Asn Cys Leu Val Asn Asn Gly Ala Pro Ile Ser His Ala Thr Leu Val
             95                 100                 105GCA TTC AAG TAT GCC TGG GAT GTT CCT CCA TCT TTC AGC ATC ATC AGC       447Ala Phe Lys Tyr Ala Trp Asp Val Pro Pro Ser Phe Ser Ile Ile Ser
        110                 115                 120TCT GAT ATA AAT TGC TCC TAA GGAGAAA ATTCTAGTTG GCAGAGAATA             495Ser Asp Ile Asn Cys Ser OCH
    125ATCATATAGT CTTTTTTACT GAGCTATTTA ATTTTTTCAA TTTTCACCAA TAAGATTATT     555TTAATGGAAT GTTAATGTAT TAGAATTGAA AAATAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA     615AAAAAAAAAA                                                            625
(2)关于SEQ ID NO：4的信息
    (i)序列特征
       (A)长度：128个氨基酸
       (B)类型：氨基酸
       (C)链型：单链
       (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：蛋白
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：Met Arg Ala Val Ala Val Phe Phe Ala Cys Val Leu Phe Cys Met Val1               5                  10                  15His Lys Ala Ala Leu Ala Asp Asp Lys Thr Cys Asn Pro Thr Asp Phe
         20                  25                  30Met Val Thr Gln Thr Ile Thr Gly Leu Thr Ile Gly Gly Lys Gln Glu
     35                  40                  45Phe Glu Val Asn Leu Ile Asn Asn Leu Tyr Cys Ala Gln Ser Asn Val
 50                  55                  60Lys Val Ser Cys Asp Gly Leu His Thr Thr Glu Pro Ile Asp Pro His65                  70                  75                  80Ile Ile Arg Pro Leu Ser Asp Gly Thr Asn Asn Cys Leu Val Asn Asn
             85                  90                  95Gly Ala Pro Ile Ser His Ala Thr Leu Val Ala Phe Lys Tyr Ala Trp
        100                 105                 110Asp Val Pro Pro Ser Phe Ser Ile Ile Ser Ser Asp Ile Asn Cys Ser OCH
(2)关于SEQ ID NO：5的信息
    (i)序列特征
       (A)长度：587个碱基对
       (B)类型：核酸
       (C)链型：单链
       (D)拓扑结构：线性
        (iii)分子类型：DNA
    (ix)特征：
       (C)名称/关键：CDS
       (D)位置：49..378
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：GAAAGTTGAA ACATCTCCAT CAAACTCTAG AGTCAGATTT CCCACAAG ATG ATT TCA       57
                                                 Met Ile Ser
                                                   1TCG GCA AAT AAC AAA GGC GCC GGC ACA AGC CGC CGC AAG CTC CGT TCT       105Ser Ala Asn Asn Lys Gly Ala Gly Thr Ser Arg Arg Lys Leu Arg Ser
  5                  10                  15GAG AAG GCT GCA CTC CAG TTC TCC GTC AGT CGC GTC GAA TAC TCC CTC       153Glu Lys Ala Ala Leu Gln Phe Ser Val Ser Arg Val Glu Tyr Ser Leu20                  25                  30                  35AAG AAG GGG CGC TAT TGC AGG CGC TTA GGC GCT ACG GCC CCC GTC TAC       201Lys Lys Gly Arg Tyr Cys Arg Arg Leu Gly Ala Thr Ala Pro Val Tyr
             40                  45                  50CTA GCC GCC GTC CTT GAA AAC CTC GTG GCC GAA GTG TTG GAC ATG GCG       249Leu Ala Ala Val Leu Glu Asn Leu Val Ala Glu Val Leu Asp Met Ala
         55                  60                  65GCG AAC GTG ACA GAA GAA ACA TCC CCC ATT GTT ATC AAA CCG AGG CAT       297Ala Asn Val Thr Glu Glu Thr Ser Pro Ile Val Ile Lys Pro Arg His
     70                  75                  80ATT ATG CTT GCC CCC AGG AAT GAT GTA GAA GTT GAA CAA GCT GTT TCA       345Ile Met Leu Ala Pro Arg Asn Asp Val Glu Val Glu Gln Ala Val Ser
 85                  90                  95CGG TGT CAC CAT CTC GGC ATC AGG TGT CGT CCC TAAAACACGC AAAGAGCTGG     398Arg Cys His His Leu Gly Ile Arg Cys Arg Pro100                 105                 110ACCGTCGCAA ACGCCGTTCC ACCTTTCAGC CGGATTAGTT CTTGATATTT CATTCTATCA     458ATCTTGGTTA TGTGACTGTG ATTTTTCGTT TTGTGTTGAA CTAAGCCCCC TAATCTGGAT     518TTCTCGTTTT ATGTTGAACT AAGTCTGTGC ACTCTTGAAG TAAAAAAAAA AAAAAAAAAA     578AAAAAAAAA                                                             587
(2)关于SEQ ID NO：6的信息
    (i)序列特征
       (A)长度：110个氨基酸
       (B)类型：氨基酸
       (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：蛋白
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：Met Ile Ser Ser Ala Asn Asn Lys Gly Ala Gly Thr Ser Arg Arg Lys1               5                  10                  15Leu Arg Ser Glu Lys Ala Ala Leu Gln Phe Ser Val Ser Arg Val Glu
         20                  25                  30Tyr Ser Leu Lys Lys Gly Arg Tyr Cys Arg Arg Leu Gly Ala Thr Ala
     35                  40                  45Pro Val Tyr Leu Ala Ala Val Leu Glu Asn Leu Val Ala Glu Val Leu
 50                  55                  60Asp Met Ala Ala Asn Val Thr Glu Glu Thr Ser Pro Ile Val Ile Lys65                  70                  75                  80Pro Arg His Ile Met Leu Ala Pro Arg Asn Asp Val Glu Val Glu Gln
             85                  90                  95Ala Val Ser Arg Cys His His Leu Gly Ile Arg Cys Arg Pro
        100                 105                 110
(2)关于SEQ ID NO：7的信息
    (i)序列特征
       (A)长度：485个碱基对
       (B)类型：核酸
       (C)链型：单链
       (D)拓扑结构：线性
        (iv)分子类型：DNA
    (ix)特征：
       (E)名称/关键：CDS
       (F)位置：16..348
(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：GATCCCAAAT CATCA ATG ACG ATC CCC GAA AAG AAA TCC GTC GCT CCG ATG       51
             Met Thr Ile Pro Glu Lys Lys Ser Val Ala Pro Met
               1               5                  10GCC CGT ATG AAG CAT ACA GCC CGC ATG TCT ACC GGC GGT AAG GCT CCA        99Ala Arg Met Lys His Thr Ala Arg Met Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro
     15                  20                  25CGC AAG CAG CTC GCC TCT AAG GCT CTT CGC AAG GCG CCA CCA CCA CCG       147Arg Lys Gln Leu Ala Ser Lys Ala Leu Arg Lys Ala Pro Pro Pro Pro
 30                  35                  40ACC AAA GGA GTG AAG CAG CCC ACC ACT ACC ACC TCC GGA AAA TGG CGC       195Thr Lys Gly Val Lys Gln Pro Thr Thr Thr Thr Ser Gly Lys Trp Arg45                  50                  55                  60TTC GCG AGA TTT CAC AGG AAA CTG CCA TTC CAA GGG CTG GTG AGG AAA       243Phe Ala Arg Phe His Arg Lys Leu Pro Phe Gln Gly Leu Val Arg Lys
             65                  70                  75ATC TGG CAG GAC TTG AAG ACA CAT CTG CGC TTC AAG AAC CAC TCG GTT       291Ile Trp Gln Asp Leu Lys Thr His Leu Arg Phe Lys Asn His Ser Val
         80                  85                  90CCT CCA CTT GAG GAG GTA ACT GAG GTT TAT CCT TGC CAA ACT ATT GGA       339Pro Pro Leu Glu Glu Val Thr Glu Val Tyr Pro Cys Gln Thr Ile Gly
     95                 100                 105GGA TGC TAT TAGGATATTG AATTTGGATA ATGGTTTAAT TATCTGTTCT               388Gly Cys Tyr
110ACCTTTATGA TCAAATTTCT GTGGCTCAGC GTTGTGTAAT TTGGGCAATC GAATTCTTAG     448CTATATTGCC TCAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA                              485
(2)关于SEQ ID NO：8的信息
    (i)序列特征
       (A)长度：111个氨基酸
       (B)类型：氨基酸
       (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：蛋白
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：Met Thr Ile Pro Glu Lys Lys Ser Val Ala Pro Met Ala Arg Met Lys1               5                  10                  15His Thr Ala Arg Met Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro Arg Lys Gln Leu
         20                  25                  30Ala Ser Lys Ala Leu Arg Lys Ala Pro Pro Pro Pro Thr Lys Gly Val
     35                  40                  45Lys Gln Pro Thr Thr Thr Thr Ser Gly Lys Trp Arg Phe Ala Arg Phe
 50                  55                  60His Arg Lys Leu Pro Phe Gln Gly Leu Val Arg Lys Ile Trp Gln Asp65                  70                  75                  80Leu Lys Thr His Leu Arg Phe Lys Asn His Ser Val Pro Pro Leu Glu
             85                  90                  95Glu Val Thr Glu Val Tyr Pro Cys Gln Thr Ile Gly Gly Cys Tyr
        100                 105                 110
(2)关于SEQ ID NO：9的信息
    (i)序列特征
       (A)长度：945个碱基对
       (B)类型：核酸
       (C)链型：单链
       (D)拓扑结构：线性
        (v)分子类型：DNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：GGAGGGTGTT GGAATTAGGT TTGCCTAGGG TTTGCCTAGG TTTAGAGAAA TAGTCAAAAT      60TGTCCTATTC TATAGGCATG ATTTAGTAGT GAGTTAATTA TCCTATAATT TCTCTTCTTG     120TATGCTCAAA TAACTGGTTC TTTAATGAAT AGATAATTAA GTTTTGTAGC AATTTCTTCC     180TCAAATTGAG TATCAACAAT TGTTAGATTG CTTTGGTGAT TATATTTGAT ATAATTGTTT     240GTAAGAATGT GTAGTGAAAA GATTGTGATT ATTCATTTCG TTGTTGGACG AATTGTTAGA     300GCCCCATCGC TAATGCCTTA TAGTACTCGA AATATGTTGG GAATAGAAGA TGAAAAATCC     360CATTCTTTGT AGTAGGAGTA AAAATTTGTC TTTTCATTAT TCCATTGAAT GTTAACCACT     420TGCCATTCAT CTGACGGGGA TGGCAGAGTT CCGACCATCT AGTGATCCGT GGGATATTGA     480TTTTGGTGTG TCAATGAAAT TGTGAGAACG GGCTTCTGGG AGAGAAAAGC CCTCTTGCCT     540CTGATATGAA CACTGAGGCT GATTATGTTA ACGGATGGAG ATTTATCAGT GGCTGAATTT     600GGGTGCTGTA GAGACAGAAT TTGAAAGTTC TAACAATAAA CCCTAATTCT GAACTTGGGC     660GGGGCTGGGA TTTTACTCTT AACGTGAAGA GAGGCAAGAT GAATTGACAG CTTGGAAGTC     720GATCCAGTAT TTGCAGCAGT CGTGACGAAT TGGTTGGACA GTTACATCGG TCAGAGAATG     780CGTTCTATAA ATTCCCCCAA TGCGGCAGTG AAAATCCCAT CCCATCAACA GAAGTTTTAA     840GTGGAAACCC ATTCCAATAG AGAAGATCGA ACAAAGGGTA TTTAAACATA CAAATGGGGG     900CAGTGGTGTT TCTTTTTGCT TGCGTTCTCT TCTGTATGGT TCACA                     945
(2)关于SEQ ID NO：10的信息
    (i)序列特征
       (A)长度：14个碱基对
       (B)类型：核酸
       (C)链型：单链
       (D)拓扑结构：线性
        (vi)分子类型：DNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：
      CAGGCATACT TGAATGCTAC AAGA
(2)关于SEQ ID NO：11的信息
    (i)序列特征
       (A)长度：24个碱基对
       (B)类型：核酸
       (C)链型：单链
       (D)拓扑结构：线性
        (vii)分子类型：DNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：
    TGTGAACCAT ACAGAAGAGA ACGC

Claims (21)

1.一种包含对应于一基因或其衍生物或上述基因中利于其表达的区域的核苷酸序列或互补序列的分离的核酸分子，其中上述基因在植物的生殖细胞和精细胞中特异性表达。
2.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中上述植物选自豆科植物、作物植物、谷类植物、草、水果植物和开花植物。
3.根据权利要求2所述的分离的核酸分子，其中植物是百合或相关的植物。
4.根据权利要求3所述的分离的核酸分子，其中包含编码选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8的氨基酸序列或与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8中任一者至少有40％相同的氨基酸序列的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的分离的核酸分子，其中包含选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7的核苷酸序列或与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7中任一者至少有50％相同的核苷酸序列或能与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7中任一者于42℃在低严紧性条件下进行杂交的核苷酸序列。
6.根据权利要求1或3所述的分离的核酸分子，其中上述核酸分子是启动子或可引导植物生殖细胞和精细胞特异性表达的功能性衍生物。
7.根据权利要求6所述的分离的核酸分子，其中包含能于42℃在低严紧性条件下与包括至少约2Kb的对应于SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7中任一者的核苷酸序列的上游的基因组区进行杂交的核苷酸序列或互补序列。
8.根据权利要求6所述的分离的核酸分子，其中包含基本上与SEQ ID NO：9相同的核苷酸序列或互补序列或能与其于42℃在低严紧性条件下进行杂交的核苷酸序列或与SEQ ID NO：9至少有50％相同的核苷酸序列。
9.包含基本上与SEQ ID NO：9相同的核苷酸序列或互补序列或能与其于42℃在低严紧性条件下进行杂交的核苷酸序列或与SEQ ID NO：9至少有50％相同的核苷酸序列的分离的核酸分子，其中上述核酸分子能引导与其可操作地连接的核苷酸序列的植物生殖细胞和精细胞特异性表达。
10.根据权利要求9所述的分离的核酸分子，其中与核酸分子可操作地连接的核苷酸序列编码或定义GUS、GFP、核糖核酸酶、DTA、反义分子、转座子或致命基因。
10.一种在植物中诱导或促进雄性不育的方法，该方法包括使毒害细胞的核酸分子与在上述植物中引导植物生殖细胞和精细胞特异性表达的启动子可操作地连接，从而在上述启动子的引导下，毒害细胞的核酸分子表达产生钝化、杀死或致使上述植物中的生殖细胞和/或精子细胞基本上无功能的产物。
11.根据权利要求11所述的方法，其中上述植物是豆科植物、作物植物、谷类植物、草、水果植物和开花植物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中毒害细胞的分子编码或包含具有细胞毒性的蛋白、特定基因的反义分子、核酶或plantabody。
13.根据权利要求11所述的方法，其中启动子对应于在低严紧性条件下与包括至少约2Kb的对应于SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：7中任一者的基因的上游的基因组区进行杂交的核苷酸序列。
14.根据权利要求14所述的方法，其中启动子包含基本上与SEQ ID NO：9相同的核苷酸序列或能与其于42℃在低严紧性条件下进行杂交的核苷酸序列或与SEQ ID NO：9至少有50％相同的核苷酸序列。
15.根据权利要求14所述的方法，其中启动子包含基本上与SEQ ID NO：9相同的核苷酸序列或能与其于42℃在低严紧性条件下进行杂交的核苷酸序列或与SEQ ID NO：9至少有50％相同的核苷酸序列。
16.一种包含与转座酶基因可操作地连接的生殖细胞和精细胞特异性的启动子的遗传构建体，上述转座酶基因能诱导转座因子的转座从而在在上述启动子的表达下，转座酶基因的表达有利于上述转座因子的转座。
17.根据权利要求16所述的遗传构建体，其中启动子包含基本上与SEQ ID NO：9相同的核苷酸序列或能与其于42℃在低严紧性条件下进行杂交的核苷酸序列或与SEQ ID NO：9至少有50％相同的核苷酸序列。
18.根据权利要求16或17所述的遗传构建体，其中转座酶基因是激体(Ac)转座酶。
19.通过权利要求11到15中任一项所述的方法产生的雄性不育植物。
20.根据权利要求19所述的雄性不育植物，提供无种子果实或种子量减少的果实。
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