CN1261896A - 诊断和预防莱姆病用的组合物的表面抗原和蛋白质 - Google Patents
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Abstract
一种新的分离的Borrielia burgdorferi(广义)表面抗原,其特征是相对分子量为39.5kDa。该抗原由广义的B.burgdorferi株螺旋体体外表达。该抗原诱导出的抗体在体外通过ADCK杀死B.burgdorferi(广义)株螺旋体。新的疏螺旋体弹夹串蛋白或其片段和P39.5蛋白一样也可用于诊断莱姆病并用于治疗或预防莱姆病的组合物中。
Description
本发明得到国立卫生研究院补助金No.ROI AI35027和RR/AE00164-32的部分资助。美国政府享有本发明的一些权利。
发明领域
本发明总地涉及用于诊断、治疗和预防莱姆疏螺旋体病(Lyme borreliosis)的药物和诊断组合物领域。更具体地说，本发明提供了用于诊断、治疗或预防莱姆病的分离的疏螺旋体天然表面抗原及其抗体。
发明背景
Borrelia burgdorferi(广义)是一个类属术语，它包括几个与莱姆疏螺旋体病(莱姆病)有关且认为是主要病因的疏螺旋体种属：B.burgdorferi(狭义的)、B.garinii、和B.afezlii。该疾病通过携带螺旋体的各种硬蜱属(Ixodes)蜱的叮咬而传播。在美国，感染的主要宿主是白腿小鼠(Peromyscus leucopus)，感染可传播给许多哺乳动物，包括狗、猫和人[J.G.Donahue等人，Am.J.Trop.Med.Hyg.，36：92-96(1987)；R.T.Green等人，J.Clin.Micro.，26：648-654(1988)]。尽管患者体内存在主动性免疫应答，但是该疾病仍在患者体内持续多年。推测这种持续存在(至少部分)是细菌蛋白抗原性变异的结果[J.R.Zhang等人，Cell，89：275-285(1997)]。
由于缺少能迅速准确测试的权威性血清学方法，诊断人和动物体内莱姆病存在困难。目前的诊断试验的缺点是灵敏度和特异性低，正如威斯康星州卫生实验室最近公布的实验室诊断调查中所描述的那样[L.Bakken等人，J.Clin.Microbiol.35：537(1997)]。本领域需要早期检测莱姆病的简单、灵敏和特异的诊断组合物和方法。
关于Borrelia burgdorferi蛋白和多肽的出版物提议，它们可用作诊断或药物制剂。这些蛋白和多肽包括外表面蛋白A和B(OspA和OspB)、鞭毛蛋白和根据估计分子量命名的其它蛋白P212、P39、P66和P83[A.G.Barbour等人，Infect.Immun.，45：94-100(1984)；W.J.Simpson等人，J.Clin.Microbiol.，28：1329-1337(1990)；K.Hansen等人，Infect.Immun.，56：2047-2053(1988)；K.Hansen等人，Infect.J.Clin.Microbiol.，26：338-346(1988)；B.Wilske等人，Zentral，Bakteriol Parasitenkd.Infektionshkr.Hyg.Abt.1 Orig.Reihe.A.，263：92-102(1986)；D.W.Dorward等人，J.Clin.Microbiol.，29：1162-1170(1991)；公开的NTIS美国专利申请号485,551；欧洲专利申请No.465,204，1992年1月8日公开；国际专利申请No.PCT/US91/01500，1991年9月19日公开；国际专利申请No.PCT/EP90/02282，1991年7月11日；国际专利申请No.PCT/DK89/00248，1990年5月3日公开；国际专利申请No.WO92/00055，1992年1月9日公开]。
一种用作疫苗的较佳的蛋白候选物是OspA[M.Philipp等人，J.Spirochetal andTich-bome Diseases，3：67-79(1996)]。在食血时，螺旋体在蜱中肠到唾液腺的途径中，OspA的表达停止或下调[A.DeSilva等人，J.Exp.Med.，183：271-275(1996)]。该现象可能会产生OspA疫苗效率降低的潜在问题。螺旋体损耗(attrition)可能只发生在蜱中肠内[A.DeSilva等人，上文所述]，而不发生在脊椎动物宿主感染时。由于肩突硬蜱(Ixodes scapularis)的唾液含有去补体因子[T.Mather等人，＂硬蜱属唾液：Borreliaburgdorferi的感受态载体和可能的疫苗策略＂，莱姆病第VII次国际议会，San Francisco，CA(1996)]，蜱中肠中螺旋体损耗可能通过仅有抗体参与而补体不参与的机制发生。
尽管对依赖抗体的杀伤作用方式还不完全了解，但是看来杀伤机制不如抗体和补体一起作用所介导的那样有效[M.Sole等人，Infect.Immunol.，66：2540-2546(1998)]。因此，可能让具有低表面密度OspA的那些螺旋体从中肠中逃脱。实际上，尽管OspA是一种丰富的B.burgdoferi蛋白，但是只有很少部分的OspA分子暴露在螺旋体的外表面上[D.Cox等人，Proc.Natl.Acad.Sci.93：7973-7978(1996)]。因此，OspA表面分子绝对数量的变化很少可能会导致螺旋体损耗率明显不同，并使残余的螺旋体有可能潜逃至唾液腺。
OspA逃逸突变体很容易避开被一起杀死，并且如果它们对脊椎宿主有感染性的话，它们甚至将更进一步降低OspA疫苗的效率。在允许体外生长的B.burgdorferi的克隆群体中，能抵抗OspA抗体杀伤作用的突变体的盛行度在10-5和10-2之间[A.Sadziene等人，J.Exp.Med.176：799-809(1992)]。如果该频率在摄食若虫中再现(螺旋体数量在附着15小时内可达到平均值7848)[A.Desilva等人，Am.J.Trop.Med.Hyg.，53：397-404(1995)]，那么在单个蜱内可能存在几种突变体。典型的突变表型包括不表达OspA和OspB的那些，和通常是OspA N端片段和OspB C端片段融合的嵌合分子的表达物。现已在多株B.burgdorferi[P.Rosa等人，Mol.Microbiol.，6：3031-3040(1992)]和加利福尼亚的几个蜱分离物[T.Schwan等人，J.Clin.Microbiol.，31：3096-3108(1993)]中发现了这些缺失型突变体。能抵抗OspA抗体单独杀伤作用的嵌合(缺失)突变体可被抗体和补体的联合作用杀死。由于在蜱体内补体看来没有功能[T.Mather等人，同上]，且在感染后短时间内脊椎动物宿主不表达OspA(可能是其嵌合形式)，嵌合性OspA逃逸型突变体能感染脊椎动物宿主。另外，估计多达20％的硬蜱属只是部分摄食，因此仍要继续调查[Y.Lobet，个人通讯]。如果这些蜱已经从感染B.burgdorferi的宿主摄取了部分食物，它们的唾液腺将含有不表达OspA并容易感染接种过OspA疫苗的宿主的螺旋体。
在螺旋体攻击接种过OspA疫苗的宿主时，没有观察到加强接种效应[M.Philipp等人，同上]，预计也不应有该效应。因此，可能需要反复给予OspA疫苗来维持有效的抗体滴度。
因此，本领域中还需要有一种改进的方法和组合物来预防和治疗人和动物的莱姆病。
发明概述
本发明通过提供预防莱姆病的方法和组合物满足了本领域中的需求，该方法根据的是螺旋体在寄生在脊椎动物宿主体内时所表达的螺旋体抗原。这些方法和组合物可用来治疗莱姆病。
一方面，本发明提供了分离的广义B.burgdorferi表面抗原，它由脊椎动物宿主中的螺旋体在体内表达。该抗原(本文称为P39.5)经进一步性质分析具有39.5kD的相对分子量。该抗原的片段也可用于本发明的组合物和方法。
另一方面，本发明提供了新的疏螺旋体弹夹串(cassette string)多肽/蛋白质。
本发明还有一个方面提供了编码P39.5或其片段(如P7-1)的核酸序列以及编码其它疏螺旋体弹夹串蛋白或其片段的核酸序列。这些核酸序列包括在严谨条件下和上述序列杂交的序列、它们的等位基因变体和缺失型突变体。
另一方面，本发明提供了新的蛋白，该蛋白含有的上述P39.5蛋白序列或弹夹串蛋白序列的片段任选地和第二种所选多肽或蛋白融合或混合，该第二多肽或蛋白的氨基酸序列与P39.5或其它疏螺旋体抗原(如OspA)以及衍生自其它微生物体的蛋白或多肽序列的相同性可高达大约90％。
还有一方面，本发明提供了新的蛋白组合物，该组合物所含的上述抗原的蛋白序列或其片段任选地和第二种所选的多肽或蛋白混合，该第二多肽或蛋白的氨基酸序列与P39.5或其它疏螺旋体抗原(如OspA)以及衍生自其它微生物的蛋白或多肽序列的相同性可高达大约90％。
还有一方面，本发明提供了重组生产上述P39.5蛋白、其片段或含有这些片段的融合蛋白的方法，该方法是在选定的宿主细胞中表达编码蛋白、片段或融合蛋白的DNA序列，从中分离出蛋白。本文还提供了用这些DNA序列转化的宿主细胞。
本发明还有一方面提供了针对上述P39.5抗原、其片段、弹夹串蛋白或片段、或含这些片段的融合蛋白的分离的抗体。这些抗体可以是多克隆抗体。本发明还提供了一种生产这些抗体的方法，该方法包括用上述分离的抗原、或用其一个或一个以上片段的混合物、或用含有本发明的一个或多个片段的融合蛋白免疫接种人或动物。从免疫动物中可以制得其它类型的抗体，例如重组抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人化抗体等。
另一方面，本发明提供了用于治疗患莱姆病的人和/或动物的治疗性组合物和方法。治疗性组合物含有上述抗体、蛋白或片段以及合适的药物载体。
另一方面，本发明提供了疫苗组合物以及用上述组合物接种人或动物抵抗莱姆病的方法。该组合物含有有效量的至少一种本发明的疏螺旋体抗原，例如由疏螺旋体属螺旋体体外表达的抗原(所述抗原的相对分子量为39500道尔顿)，或是该抗原的抗原性片段或含有此类片段或弹夹串蛋白的融合蛋白，以及药学上可接受的载体。疫苗组合物可含有上述的P39.5蛋白、其片段、融合蛋白或蛋白混合物。
本发明还有一个方面提供了用核酸组合物(如DNA疫苗)接种人或动物患者抵抗莱姆病的疫苗组合物和方法。该组合物含有有效量的DNA序列，该序列编码至少一种本发明疏螺旋体抗原或其抗原性片段、弹夹串抗原或含有此类片段的融合蛋白，以及任选的药学上可接受的载体。
在还有一方面，本发明提供了诊断人或动物莱姆疏螺旋体病的方法。该方法包括将本发明的抗原或抗体(最好用常规方法标记用于检测)和待诊断的人或动物的生物学液体样品培育的步骤。当人或动物患者存在B.burgdorferi感染时，形成抗原-抗体复合物。随后分析反应混合物以确定这些抗原-抗体复合物的存在与否。在另一个实例中，诊断试验采用抗原或其片段的DNA序列(较佳的是反义序列)，通过患者生物学液体中存在能与其杂交的序列来诊断感染。还可利用本发明确定的试剂进行其它常规试验。
本发明另一方面提供了一种用于诊断人或动物患者样品中B.burgdorferi感染的试剂盒，该试剂盒含有至少一种能结合至少一种本发明抗原或其抗原性片段的抗体，或是编码本发明的一种或多种抗原的DNA序列或其反义序列。抗体和序列可作任意标记以便检测，或者试剂盒中可包括一种检测系统。
在下列本发明较佳实例详细描述中将进一步描述本发明的其它方面和优点。
附图简述
图1表示通过蜱(叮咬)接种了JD1螺旋体的猕猴血清对B.burgdorferi JD1株(○)，B31株(△)和B.garinii IP90株(口)螺旋体的依赖抗体的、补体介导的杀伤(ADCK)滴度。
图2示出了新的编码一个开放读框的P39.5的DNA序列，它编码37.7kDa的推定蛋白。该DNA片段命名为7-1，推定的蛋白称为P7-1。黑色区域是唯一的跨越SEQID NO：1 bp769至bp854的区域。标为IA的区域跨越SEQ ID NO：1的bp1至bp309；IB跨越SEQ ID NO：1的bp855至bp1189。区域IA和IB具有70％的相同性。横跨SEQ ID NO：1的bp310至bp494的区域IIA和横跨SEQ ID NO：1的bp595至bp769的区域IIB具有91％的相同性。横跨SEQ ID NO：1的bp208至bp309的区域A和横跨SEQ ID NO：1的bp495至bp595的区域B具有84％的相同性。共同横跨SEQ ID NO：1的bp1090至bp1189的区域B和C具有90％的相同性。
图3的条状图描述了IP90螺旋体被下列物质体外杀伤的结果：条1：用JD1螺旋体感染的猴血浆和猴补体；条2：来自同一血浆、经天然P39.5亲和纯化的抗体和猴补体；条3：如条2所述的相同抗体但没有补体；条4：单用补体；条5：单用BSK-H培养基。误差条代表两次测定平均值的标准偏差。
图4的条状图表示用下列物质获得的对IP90株螺旋体的ADCK结果：感染B.burgdorferi JD1的猴血浆合并液(1∶10稀释)(条1、5)；用1∶10的重组型P7-1(rP7-1)和Ribi佐剂免疫接种的小鼠的血清合并液(条2、6)；用1∶50的重组型P7-1(rP7-1)和Ribi佐剂免疫接种的小鼠的血清合并液(条3)；和单用Ribi佐剂免疫接种的小鼠的血清合并液(条4、7)。在条1-4的ADCK试验中采用猴补体，而在条5-7的ADCK中采用豚鼠补体。误差条代表两次测定的平均值的标准误差。
图5描述了长约8kb的DNA序列中一串沉默的VLS弹夹(从J.R.Zhang等人，Cell，89：275-285(1997)复制得到)。
图6是B.burgdorferi JD1株和B31株以及B.garinii IP90株螺旋体裂解液的Western印迹，用JD1螺旋体通过针(头注射)接种(泳道1)和蜱(叮咬)接种(泳道2)的猴血清以及后一血清经亲和纯化除去全部活的JD1螺旋体后所得的抗体(泳道3)显象。
序列表命名
SEQ ID NO：1是克隆7-1的核酸序列。
SEQ ID NO：2是克隆7-1的推定蛋白质序列。
SEQ ID NO：3是克隆1-1的核酸序列的5′末端。
SEQ ID NO：4是在克隆1-1核酸序列中部发现的部分核酸序列。
SEQ ID NO：5是克隆1-1的核酸序列的3′末端。
SEQ ID NO：6是克隆3-1的核酸序列的5′末端。
SEQ ID NO：7是克隆3-1的核酸序列的3′末端。
SEQ ID NO：8是克隆6-1的核酸序列的5′末端。
SEQ ID NO：9是克隆6-1的核酸序列的3′末端。
SEQ ID NO：10是克隆9-1的核酸序列的5′末端。
SEQ ID NO：11是克隆12-1的核酸序列的5′末端。
SEQ ID NO：12是克隆12-1的核酸序列的3′末端。
SEQ ID NO：13是从克隆14获得的部分核酸序列，当加到克隆7-1的5′端[SEQ IDNO：1]时，形成较大的P39.5片段，即P7-1。5′端前6个碱基来自质粒载体。
SEQIDNO：14是SEQIDNO：13的推定的蛋白质序列。
发明详述
本发明提供了一种新的疏螺旋体表面抗原P39.5，该抗原由螺旋体居留在脊椎动物宿主中(“体内”)时表达。该抗原是依赖抗体的、补体介导的体外杀伤作用(ADCK)针对的靶标。这种新的抗原、其片段、针对它们的抗体、编码它们的核酸序列、这些抗原、抗体和核酸序列在治疗或预防莱姆病的诊断、治疗和预防性组合物和方法中的用途提供了比用于此目的的已知组合物和方法中的其它疏螺旋体蛋白和抗体更好的优点。
I.本发明的P39.5抗原
在一个实例中，本发明提供了一种新的分离的疏螺旋体抗原，称为P39.5。该抗原由疏螺旋体属螺旋体(例如B.garinii IP90株螺旋体)在体外和体内表达。该抗原或其同源物也由B.burgdorferi(狭义)JD1株、B31株和NT1株螺旋体在体内表达。该抗原在IP90螺旋体中的表观分子量为39.5kDa，经功能上鉴定，能在疏螺旋体属螺旋体自然感染期间在动物体内诱导抗体。这些诱导的抗体通过体外ADCK能杀死IP90螺旋体。引发的抗体还杀死了B.burgdorferi广义)NT1株螺旋体(一种从美国患者脑脊髓液体中分离的株系，但是在广义的种属复合物中未作进一步鉴定)。该株系由纽约的纽约州立大学Patricia Coyle博士提供。
用插入pBluescript II质粒的B.burgdorferi广义株B.garinii IP90株)的基因片段(命名为7-1)转化大肠杆菌，并于1997年6月27日保藏在美国典型培养物保藏中心(12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland＂ATCC＂)中，保藏号为No.98478。当大肠杆菌表达该基因片段、分离纯蛋白并将该蛋白用作小鼠的免疫原时，这样产生的抗体能和IP90的P39.5反应。类似地，将Borrelia garinii IP90株的其它基因片段(命名为1-1、3-1、6-1、9-1和12-1)各自插入pBluescript II质粒中，转化大肠杆菌并保藏。后者的保藏日在1998年6月25日或之前，保藏号为No.＿(1-1)，＿＿(3-1)，＿＿(6-1)，＿ (9-1)，＿(12-1)。所有保藏均为了满足国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，并完全符合美国专利商标局用于专利目的的保藏要求。从这些保藏机构可以获得用于本发明的序列。
A.核酸序列
本发明提供了编码P39.5片段的哺乳动物核酸序列。本发明的核酸序列分离自与其天然伴随的细胞物质。如下文实施例所述，克隆编码疏螺旋体P39.5基因部分编码区的1190bp的节段并测序。它包括编码推定的37.7kDa蛋白的单个开放读框。SEQ ID NO：13和1中报道了该部分DNA序列。SEQ ID NO：13是紧靠SEQ ID NO：1第一个碱基5′的序列。这些序列总共形成了1189bp和约396个氨基酸的部分蛋白。测序的片段由主要是亲水性的结构域组成，结构域含有一些内部的重复区域以及唯一的跨越SEQ ID NO：1 bp627至bp712的区域。见图2，该图确定了重复序列并确定了这些序列的同源性和相同百分率。
在文章中，蛋白和/或DNA序列通过它们与确定序列的同源性或相同百分率来确定，计算相同百分率或相似性百分数的算法包括如下：Smith-Waterman算法[J.F.Collins等人，1988，Comput.Appl.Biosci.，4：67-72；J.F. Collins等人，MolecularSequence Comparison and Alignment，(M.J.Bishop等人编辑)＂实践方法系列：核酸和蛋白系列分析(Practical Approach Series：Nucleic Acid and Protein Sequence Analysis)XVIII，IRL Press：Oxford，England，UK(1987)417页]，以及BLAST和FASTA程序[E.G.Shpaer等人，1996，Genomics，38：179-191]。这些参考文献纳入本文作参考。
本发明还包括其它疏螺旋体核酸片段，例如弹夹串片段以及P39.5的片段。这些片段称为1-1(编码蛋白/肽P1-1)、3-1(编码蛋白/肽P3-1)、6-1(编码蛋白/肽P6-1)、9-1(编码蛋白/肽P9-1)和12-1(编码蛋白/肽P12-1)。较佳的，这些片段的特征是编码P39.5的生物学活性部分，例如一个表位。通常，这些寡核苷酸片段至少长15个核苷酸。然而，可以按需选择大小不同的寡核苷酸片段。这些片段可用于某些目的，例如在活检组织样品上进行聚合酶链反应(PCR)。例如，有用的P39.5DNA片段和对应的序列包含在SEQ ID NO：1 bp793-816之间以及在SEQ ID NO：13的bp59-85之间的序列。图2中鉴定了其它有用的片段。1-1的片段包括SEQ ID NO：3、4和5的序列。3-1的片段包括SEQ ID NO：6和7的序列；6-1的片段包括SEQ ID NO：8和9的序列。9-1的片段包括SEQ ID NO：10的序列。12-1的片段包括SEQ ID NO：11和12的序列。本领域技术人员很容易借助常规DNA测序技术应用于上述ATCC保藏的DNA来获得1-1、3-1、6-1、9-1和12-1的完整序列和其它有用的片段。
本领域技术人员利用SEQ ID NO：1和3-12的DNA序列以及上述保藏物很容易获得对应于这些DNA序列的反义链。另外，利用已知的技术，本领域技术人员容易获得侧接所述DNA序列或其对应RNA序列的其它所需的基因组和cDNA序列。类似地，在常规的技术(例如聚合酶链反应)中，将本发明的核酸序列作为探针，本领域技术人员能从已得到的本发明的SEQ ID NO：1和3-12以及保藏物中获得其它种类的P39.5类似物、B.garinii肽及其片段。凭借本发明提供的该序列信息，还很容易获得种属中这些序列的等位基因变体(即含有一些与种属中更常见序列有个别核苷酸差异的序列)(例如P39.5的其它变体，SEQ ID NO：2)。
本发明还包括能在严谨条件[见J.Sambrook等人，分子克隆实验指南，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)]下与SEQ ID NO：1的序列、它们的反义链或生物活性片段杂交的核酸序列。高度严谨杂交条件的一个例子是：在65℃、2×SSC下杂交，然后用65℃、0.1×SSC洗涤一小时。或者，典型的高度严谨杂交条件是在50％甲酰胺、4×SSC、42℃下。中等高度严谨条件也是适用的：如在55℃、4×SSC中杂交，然后在37℃、0.1×SSC中洗涤1小时。另一个典型的适中的高严谨性杂交条件是在30℃、50％甲酰胺、4×SSC下。
根据本发明，可对此核酸序列作修饰。利用SEQ ID NO：1和3-12的序列信息，本领域技术人员能获得或合成或重组制备编码本发明全长蛋白或有用片段的其它多核苷酸序列或经修饰的多核苷酸序列。在核酸水平上的这些修饰例如包括：修饰沉默的或改变氨基酸的核苷酸序列，来改进分泌或表达。修饰还包括由遗传密码天然简并引起的等位基因变化。
本发明还包括本文提供的P39.5片段以及弹夹串序列1-1、3-1、6-1、7-1、9-1和12-1的突变体。这些突变体包括基本上保留了全长P39.5或其它蛋白或片段抗原性的氨基端、羧基端或内部缺失。可表达这些截短的或缺失型突变体，以便达到影响全长或野生型基因或基因片段活性的目的。
这些核酸序列可用于各种诊断、预防和治疗用途。较佳的，核酸序列可用来开发诊断性探针和反义探针，以便利用各种已知的核酸试验(例如Northern和Southern印迹、聚合酶链反应(PCR)和本领域技术人员已知的其它测定技术)来检测和诊断莱姆病。本发明的核酸序列还可用于生产P39.5蛋白及其同源物以及B.garinii的其它蛋白。
用常规的聚合酶链反应或克隆技术(例如上述Sambrook等人的常规课本中所述的那些)可分离出本发明的核苷酸序列。例如，用DNA引物和探针和PCR技术，可从B.garinii DNA制备或分离出本发明抗原的核酸序列。另外，可从衍生自B.garinii全基因组DNA的基因库获得抗原。运用常规的基因工程方法或化学合成技术或PCR等利用本文提供的信息可以重组构建这些序列、其片段、修饰序列和全长序列。
B.蛋白序列
本发明还提供了B.burgdorferi(广义)蛋白，例如B.garinii蛋白和肽，包括P39.5多肽或蛋白以及用本发明名为P1-1、P3-1、P6-1、P7-1、P9-1和P12-1的肽/蛋白。这些蛋白和它们在自然状态时发现的其它污染性蛋白或物质不结合在一起。由于天然的P39.5在Triton-X114抽提时被全部抽提到洗涤剂相中，因此它可能是脂蛋白。经Western免疫印迹(见实施例2和图6)确定，P39.5抗原的相对分子量为39500道尔顿。在一个实例中，本发明提供了约354个氨基酸的部分P39.5多肽[SEQ ID NO：2]，它可能是脂蛋白，具有预计的大约37.7kDa的相对分子量(即“P7-1片段”)。该推定的氨基酸序列[SEQ ID NO：2]与Borrelia hermsii外表面脂蛋白的可变主要蛋白(variable major protein(Vmp))家族成员的相同性高达22％(见实施例6)。它和B.burgdorferi B31株的Vmp样序列(vls)VlsE[J.-R.Zhang等人，上文]、B.burgdorferi的其它vls序列[即Vls-6 Genbank No.U76406(190个氨基酸内的相同性为53％)；VlsEGenbank号U84553(210个氨基酸内的相同性为58％)和U84566(209个氨基酸内的相同性为58％)和U84555(210个氨基酸内的相同性为58％)]的相同性约为50％。
VlsE是B.burgdorferi抗原的一部分，它通过重组机制发生抗原性变化，表达的拷贝(VlsE)的中间片段和位于表达拷贝上游的一串15个“弹夹”的片段重组[J.Zhang，上文]。每个弹夹的平均长度为500bp，整个一串弹夹占据的DNA序列约为8kb。该弹夹串的一个显著特征是，在B.burgdorferi B31中，弹夹以几乎毗邻的开放读框排列，只是在弹夹vls11中间隔有终止密码子，在弹夹vls14和vls16中有两个读框移位。例如见图6，它是Zhang等人(上文)确定的相似结构的一个拷贝。
P39.5的较长部分的蛋白序列通过克隆14的部分序列[SEQ ID NO：14]和SEQ IDNO：2的5′端序列直接融合而形成。得到鉴定的克隆14的序列，是序列P7-1和克隆14这两个克隆之间重叠序列的5′序列。这些重叠序列证实它们是同一开放读框的一部分。因此，在较大的P39.5推定氨基酸序列中，Leu(SEQ ID NO：14的氨基酸47)后面紧跟了Lys(SEQ ID NO：2的氨基酸1)。
本发明提供了看来是B.garinii IP90弹夹串部分的几个片段的部分DNA和推定的氨基酸序列。这些片段命名为1-1、3-1、6-1、9-1和12-1(可能包括7-1)，长度在1-2kb之间。它们每一个均表达了大小和插入物相称并和受感染猴抗体反应的肽(除去pBluaescript的lacZ启动子)。这些片段[SEQ ID NO：1、3、6、8、10和11]的5′端均不含具有细菌脂蛋白特征的疏水性引导序列或信号肽酶II共有序列。因此，这些片段一定是IP90的弹夹串，象B31的弹夹串一样，它们是在读框内的。这些vls样蛋白通过部分5′和3′序列而得以确定[例如参见SEQ ID NO：1、3、5至12]。本领域技术人员能利用本文提供的部分5′和3′序列以及B.garinii的DNA序列(或DNA文库)或保藏在ATCC的上述各弹夹串蛋白材料，通过常规技术(如PCR)来鉴别其全部序列。这些方法是常规的，相信在给予本文所提供的信息后不需要作过多的试验。
本发明的抗原可通过免疫学试验来作性质分析，这些试验包括(但不局限于)Western印迹、通过生物物理学测定法作大分子量测定(例如SDS-PAGE/染色、HPLC等)、抗体识别试验、T细胞识别试验、MHC结合试验、通过细胞、蛋白或抗体过继性转递赋予免疫保护或免疫病理学的试验。
本发明的P39.5表面抗原蛋白(及其天然存在的变体或其它疏螺旋体中的类似物或本文确定的其它Vls-样蛋白)能以完整蛋白或其多肽或片段的形式分离。在一个实例中，P39.5根据其各自分子量通过免疫印迹程序分离获得(如下文实施例5所述)。这种分离提供了基本上不含微生物和蜱载体的其它蛋白和非蛋白物质的抗原。包含本发明的疏螺旋体多肽和抗原的分子可从螺旋体中分离获得，并用各种常规方法进一步纯化，这些纯化方法包括：液体层析(例如正相或反相)，用HPLC、FPLC等；亲和层析(例如用无机配体或单克隆抗体)；体积排阻层析；固定化金属螯合层析；凝胶电泳等。在不脱离本发明的范围下，本领域技术人员可选择最合适的分离和纯化技术。
另外，本发明的P39.5的氨基酸序列或其它疏螺旋体蛋白可按照常规基因工程技术[例如参见Sambrook等人，上文和下文制备蛋白的详细描述]用重组方法生产。
i.类似物/经修饰的抗原
本发明还包括本文提供的P39.5蛋白或vls样蛋白P1-1、P3-1、P6-1、P7-1、P9-1和P12-1的类似物或修饰版本。通常，这些类似物和具体确定的蛋白只有1至4个密码子变化的差异。例子包括所述部分氨基酸序列(例如P7-1[SEQ ID NO：2])具有少量氨基酸变化(特别是保守性氨基酸替代)的多肽。保守性替代发生在侧链和化学性质相关的氨基酸家族中。本发明还提供了本发明蛋白的同源物，其特征是和SEQ ID NO：2或vls样蛋白序列的相同性至少为85％。根据本文提供的序列信息，本领域技术人员很容易获得全长P7-1或P7-1同源物和类似物，以及其它细菌种属的全长vls样1-1、3-1、6-1、9-1和12-1蛋白同源物和类似物。
还可对本发明的抗原进行修饰来提高其免疫原性。例如，抗原可以与化学化合物或免疫原性载体偶联，只要该偶联不干扰抗原或载体的所需的生物活性。关于偶联策略一些通用问题的综述可见“抗体：实验手册”(Cold Spring Harbor Laboratory，E.Harlow和D.Lane编辑，(1988))。本领域已知的有用的免疫原性载体包括(但不局限于)匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BAS)、卵白蛋白、PPD(纯化的结核菌素衍生物)、红血细胞、破伤风类毒素、霍乱类毒素、琼脂糖珠、活性炭、或膨润土。用于偶联的有用的化学化合物包括(但不局限于)二硝基酚基团和胂酸(arsonilic acid)。
抗原还可用其它技术(例如加热和/或SDS变性)来修饰。
ii.片段/缺失型突变体
本发明还包括本文鉴定的P39.5多肽、P7-1肽或其它vls-样蛋白的其它片段。这些片段的理想特征是具有类似于完全蛋白所展示的生物活性，例如包括诱导针对莱姆病病原体的抗体的能力。可设计或得到任何所需长度的这些片段，包括长度小至5-8个氨基酸的片段。该片段可代表该蛋白的一个表位。
P39.5的内部重复序列(见图2)表明，该蛋白象OspA一样，可能经历了疏螺旋体中的同源重组，该重组可能导致产生表达基因截短的、部分缺失的突变体。因此，可修饰本发明的P7-1蛋白[SEQ ID NO：2]以产生缺失型突变体，例如将氨基或羧基端截短，或除去一个或多个氨基酸。本发明还包括通过其重复序列同源重组产生的P7-1的缺失型突变体(图2)，以及编码它们的DNA序列。在某些缺失型突变体中，缺失了上文P39.5编码区的部分(例如区域IIA、IIB和B)。
P39.5抗原的缺失型突变体(象P39.5而不象OspA)在体内表达，在感染脊椎动物宿主时可能会被杀死。大多数OspA缺失型突变体在补体不存在时能逃脱抗OspA抗体的杀伤作用，但是会被该抗体和补体共同作用杀死。由于抗OspA抗体能在蜱中肠内杀死螺旋体(OspA在中肠内表达，但是补体可能没有活性)，OspA缺失型突变体可能避开了由OspA疫苗诱导的抗OspA抗体的作用。相反，因为P39.5在体内表达，而抗P-39.5抗体和补体均存在于体内，因此P39.5缺失型突变体不可能躲过P39.5为基础的疫苗的效力。
还有其它的P39.5、P1-1、P3-1、P6-1、P7-1、P9-1或P12-1的修饰片段可用现在的常规技术制得，以提高其产量、增强蛋白稳定性或其它特征(例如结合活性或生物利用率、或赋予蛋白其它一些所需的性质)。本领域技术人员很容易用已知的技术(例如缺失诱变和表达)制备这些多肽的其它有用的片段。
iii.融合或多聚(multimeric)蛋白和组合物
用常规的基因工程技术还可将本发明的P39.5蛋白或其片段以及vls样弹夹串蛋白或其片段构建成较大的和/或多聚蛋白或蛋白组合物的一部分。本发明的抗原可以和B.burgdorferi外表面蛋白(例如OspA，OspB，OspC)以及BmpA，B，C组合，或本文描述的抗原的各种片段可以相互组合。在这种组合情况下，抗原可以是融合蛋白形式。本发明的抗原可以任选地和选定的多肽或蛋白融合，这些多肽或蛋白例如是疏螺旋体抗原OspA，OspB，OspC，BmpA，BmpB，BmpC、其它疏螺旋体抗原以及衍生自其它微生物的蛋白或多肽。例如，本发明的抗原或多肽的N端或C端可以和OspA多肽、OspB多肽、OspC多肽、或非OspA非OspB多肽或其组合物融合。可用于此目的的OspA和OspB多肽包括现有技术(例如见PCT/US91/04056)确定的多肽及其变体。可用于此目的的非OspA、非OspB多肽包括本发明的多肽以及现有技术确定的那些多肽，包括B.burgdorferi OspC蛋白、鞭毛相关蛋白及其片段、其它B.burgdorferi蛋白及其片段以及非B.burgdorferi蛋白及其片段。
通过表达P39.5DNA序列或其片段和同源于P39.5的DNA片段(25-95％相同性)融合形成的DNA分子，提供了本发明的另一个融合蛋白。这种蛋白的一个例子包括使SEQ ID NO：2的氨基酸序列和与该序列相同性高达95％的氨基酸片段融合。这些片段可以任何次序插入，并可含有例如图2所示的重复序列。这些形成单个开放读框的长串DNA可从P39.5同源物(包括P39.5)构建获得，或衍生自天然存在的长的开放读框(例如一个或多个vls弹夹蛋白)。B.garinii的vls弹夹蛋白(例如命名为P1-1、P3-1、P6-1、P9-1和/或P12-1的蛋白)可以相互融合和/或插入到P39.5或P7-1的DNA序列中，从而产生大的DNA分子，该分子表达的蛋白质可能刺激各种抗体特异性。
构建包含本发明多个多肽的这些融合蛋白用于本发明的方法和组合物中。这些融合蛋白或多聚蛋白可用重组方法产生或用化学方法合成。它们还可包括和本发明的多肽与氨基酸以外的物质(包括脂质和糖类)融合或偶联。而且，本发明的抗原可以和现有技术描述的其它疏螺旋体疫苗制剂和衍生自其它病毒的其它种疫苗制剂组合使用。这些蛋白能有效地预防、治疗和诊断由广谱B.burgdorferi分离物引起的莱姆病。
可替换上述融合蛋白的较佳的蛋白组合物是含有不同P39.5蛋白或片段、或本发明弹夹串蛋白的不同混合物的＂鸡尾酒＂(即简单的混合物)。这些蛋白或其抗原性片段的这种混合物可用来产生针对B.garinii的所需抗体。
iv.盐
本发明的抗原还可以药学上可接受的盐的形式使用。能和本发明的多肽形成盐的合适的酸和碱是本领域技术人员所熟知的，它们包括无机和有机酸和碱。
II.制备本发明的抗原和核酸序列的方法
A.体外表达
为了生产本发明的重组体P7-1和/或其它弹夹串蛋白或P39.5的其它片段，将本发明的DNA序列插入合适的表达系统中。希望的是，构建重组分子或蛋白，其中编码选定蛋白(例如P7-1)的多核苷酸序列与允许该蛋白表达的异源表达控制序列操作性相连。本领域中已知有许多种合适的表达载体可通过标准分子生物学技术来表达蛋白。这些载体选自常规的载体类型，包括昆虫(例如杆状病毒表达系统)、或酵母、真菌、细菌或病毒表达系统。众多种本领域已知的表达载体中其它合适的载体也可用于此目的。获得这些表达载体的方法是众所周知的。参见Sambrook等人，“分子克隆实验指南”第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1989)；Miller等人，＂基因工程＂8：277-298(Plenum Press 1986)和其中引用的文献。
用该方法转染的合适的宿主细胞或细胞系包括细菌细胞。较佳的，至少对据信是脂蛋白(例如参见实施例5)的P39.5蛋白来说，此选定的蛋白宜在细菌中表达，因为它具有附着脂质的细胞机制。在所表达的蛋白用作疫苗或治疗药物时该表达系统是特别佳的。例如，各种大肠杆菌菌株(例如HB101、MC1061和下文实施例所用的菌株)是生物技术领域中众所周知的宿主细胞。枯草芽胞杆菌属、假单胞菌属、链霉菌属和其它菌属等的各种菌株也可用于该方法。
本领域技术人员已知的许多酵母细胞菌株也可用作宿主细胞来表达本发明的多肽。其它真菌细胞也可用作表达系统。尽管酵母也能脂化(lipidate)蛋白，但是该脂化方式可能和细菌不同，即与天然蛋白不同。
可采用的哺乳动物细胞例如是人293细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、猴COS-1细胞系或鼠3T3细胞(衍生自瑞士、Balb-C或NIH小鼠)。另一个合适的哺乳动物细胞系是CV-1细胞系。其它合适的哺乳动物细胞系以及转染、培养、扩增、筛选、生产和纯化方法是本领域已知的[例如参见Gething和Sambrook，Nature，293：620-625(1981)或Kaufman等人，Mol.Cell.Biol.5(7)：1750-1759(1985)或Howley等人，美国专利4,419,446]。
另外，可采用的昆虫细胞例如是草地夜蛾(Spodoptera frugipedera)(Sf9)细胞。
因此，本发明提供了生产重组疏螺旋体蛋白(如P7-1或其它弹夹串蛋白)的方法，该方法包括(例如)用至少一个表达载体通过常规手段(如电穿孔)转染宿主细胞，该表达载体所含本发明的多核苷酸在转录调控序列的控制下。然后在允许蛋白表达的条件下培养转染或转化的宿主细胞。用本领域技术人员已知的合适的手段从细胞(或培养基，如果是胞外表达的话)中回收、分离和任选地纯化表达的蛋白。
例如，在细胞裂解后，分离可溶形式蛋白或用已知技术(例如在盐酸胍中)抽提。如果需要，以融合蛋白形式产生本发明的蛋白或片段。这些融合蛋白是上述的那些。另外，例如，可能希望产生融合蛋白来增强该蛋白在所选宿主细胞中的表达、改善纯化或用来监测组织、细胞或细胞抽提物中所需蛋白(例如P7-1)的存在。本发明蛋白的合适的融合伙伴是本领域技术人员所熟知的，它们包括β半乳糖苷酶、谷胱苷肽-S-转移酶和多聚组氨酸。
B.体内表达
另外，当希望本发明的P7-1或其它弹夹串蛋白(无论是全长还是所需片段)在体内表达时(例如来诱导抗体或作为DNA疫苗)，本领域技术人员很容易选择用于输递的合适载体。用于体内基因输送的典型载体易从各学院和商业来源获得，例如包括腺伴随病毒[国际专利申请号PCT/US91/03440]、腺病毒载体[M.Kay等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：2352(1994)；S.Ishibashi等人，J.Clin.Invest.，92：883(1993)]或其它病毒载体(例如各种痘病毒、牛痘等)。插入所需基因(如P7-1)并获得编码蛋白体内表达的方法是本领域技术人员所知的。
III.本发明的抗体
本发明还提供能识别并结合本发明分离的、或修饰的、或多聚抗原的抗体，包括从这些抗原或其片段的混合物衍生获得的抗体。这些抗体可用来诊断莱姆病，和治疗性组合物来治疗测试阳性或在测试前表现出莱姆病症状的人和/或动物。抗体可单独或和针对本发明其它抗原的抗体以及针对其它已知的B.burgdoferi抗原的抗体联合用于诊断。这些抗体还可用于被动疫苗组合物。
利用本发明分离的、重组或修饰的抗原或这些抗原或抗原片段的混合物通过常规手段产生本发明的抗体。例如，可用常规方法产生多克隆抗体：用本发明的分离的抗原或抗原性蛋白或肽的混合物刺激选定动物或人的免疫系统，使免疫系统产生针对它们的天然抗体，并收集动物或人血液或其它生物学液体中的这些抗体。
例如，通过给予脊椎动物宿主本发明的抗原或抗原性组合物(如P7-1)，产生本发明的抗体。较佳的是，用重组型P7-1(rP7-1)作为免疫原。一种针对P7-1抗原的合适的多克隆抗体通过依赖抗体、补体介导杀伤(ADCK)作用体外杀死IP90螺旋体，不论该抗体是通过(1)亲和纯化(用IP90螺旋体的天然P39.5抗原作为免疫吸附剂(分离在Western印迹上，见图6)，用JD1螺旋体感染猕猴时产生的抗血清作为抗体来源)获得的，还是通过(2)用IP90的重组型P7-1(rP7-1)免疫接种小鼠获得的。
这样，以IP90的天然P39.5抗原或本文鉴定的一种或多种弹夹串蛋白作为免疫吸附剂亲和纯化JD1螺旋体感染脊椎动物(例如猕猴)产生的抗血清，就分离得到了本发明的抗体。类似的，用本发明的纯化的重组抗原或纯化分离天然来源的P39.5免疫接种小鼠，分离获得本发明的抗体。还可产生直接针对P39.5的单克隆抗体(MAb)。用众所周知的常规技术(例如Kohler和Milstein的方法及其许多已知的改进方法)产生表达所需单克隆抗体的杂交瘤细胞系。类似地，将已知的重组技术用于开发针对这些抗原的单克隆或多克隆抗体，可产生高滴度抗体[例如参见，PCT专利申请号PCT/GB85/00392；英国专利申请公开号GB2188638A；Amit等人，Science，233：747-753(1986)；Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；PCT专利申请号PCT/WO9007861；和Riechmann等人，Nature，332：323-327(1988)；Huse等人，Science，246：1275-1281(1988)a]。
在给出了本文所含内容后，本领域技术人员可借助已知的技术通过操作针对本发明抗原的人或动物抗体的互补决定区产生直接针对P39.5或弹夹蛋白、或其抗原性片段的嵌合性、人化抗体或完全的人抗体。例如参见，《实验药物学手册》第113卷＂单克隆抗体的药物学＂E.Mark和Padlin＂单克隆抗体的人化＂第4章，Springer-Verlag(1994年6月)。
另外，将抗原装配成多价抗原性复合物[例如参见欧洲专利申请0339695，1989年11月2日公开]或抗原性蛋白/肽的简单的混合物，并用来在抗原出现于受感染动物或人的生物学液体中时诱导高滴度的能结合所选抗原的抗体。
本发明还提供了抗独特型抗体(Ab2)和抗-抗-独特型抗体(Ab3)。Ab2对本发明的抗-P39.5抗体结合的靶有特异性，而Ab3与P39.5抗体(Ab1)在其结合特异性和生物活性上相似[例如参见，M.Wettendorff等人，＂用抗独特型抗体调节抗肿瘤免疫力＂，《独特型网络和疾病》J.Cemy和J.Hiemaux编辑，J.Am.Soc.Microbiol.，WashingtonDC：203-229页(1990)]。这些抗独特型和抗抗独特型抗体可用本领域技术人员熟知的技术产生。这些抗独特型抗体(Ab2)可携带P39.5、弹夹蛋白、或其片段的内部影像，因此可用于P39.5、弹夹蛋白或片段的相同目的。
通常，能结合所选抗原的多克隆抗血清、单克隆抗体和其它抗体(Ab1)可用来鉴定P39.5或弹夹蛋白的表位，以便将P39.5(或弹夹蛋白)及其类似物和活组织中的污染物分开(例如在层析柱等中)，通常可用作搜寻工具和开发上述其它类型抗体所必需的原料。抗独特型抗体(Ab2)可用来结合相同的靶，并可代替原来的抗原(例如P39.5)诱导免疫应答。Ab3抗体是有用的，其理由和Ab1有用的理由一样。例如，对于上述抗体，还考虑了用作搜寻工具和用于将P39.5或弹夹蛋白与其它污染物分离的组分等用途。
为了用于诊断性试验，将抗体和单独或和其它组合物或化合物一起能提供可检测信号的常规标记相结合。当一个诊断方法中采用了多个抗体时，希望标记相互作用产生可检测信号。更有利的是，标记可通过视觉(例如用比色计)检测到。本领域中已经描述了各种酶系统，这些酶系统会在试验中运作并显示比色信号。一个例子是，葡萄糖氧化酶(用葡萄糖作为底物)释放过氧化物作为产物。和过氧化物以及氢供体(例如四甲基联苯胺)(TMB)反应的过氧化物酶，产生了氧化的呈蓝色的TMB。其它例子包括辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)、以及己糖激酶结合葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与ATP、葡萄糖和NAD+反应，产生的产物中的NADH在340nm波长下检测到吸收值增加。可用于本发明方法的其它标记系统可用其它手段来检测，例如着色的胶乳微粒[Bangs Laboratories，Indiana]，其中包埋的染料可用来代替和抗体形成偶联物的酶，并提供视觉信号，此信号表示实施的试验中存在产生的复合物。还有其它标记包括荧光化合物、放射性化合物或元素。可连接用于本发明诊断试验的抗体的可检测标记易从已知的且诊断试验领域技术人员容易获得的众多组合物中选出。本发明的方法和抗体不局限于所用的具体可检测标记或标记系统。
IV.诊断方法和试验
本发明还提供了诊断莱姆病的方法。这些诊断方法可用来诊断呈现出莱姆病临床症状或怀疑患有莱姆病的人或动物。
在一个实例中，该诊断方法涉及检测天然抗-P39.5抗体的存在，该抗体由受感染的人或动物的免疫系统产生，存在其生物学液体中，它能结合本发明的抗原或其组合。该方法包括将本发明的P39.5抗原或弹夹串抗原和患者的生物学液体样品一起培育的步骤。因B.burgdorferi感染而存在于液体中的抗体会和抗原一起形成抗体-抗原复合物。随后分析反应混合物来测定这些抗原-抗体复合物的存在或不存在。分析反应混合物的步骤包括使反应混合物和标记的抗体特异性结合伙伴接触。
在一个相似的实例中，诊断方法涉及检测天然存在的抗P1-1、抗P3-1、抗P6-1、抗P7-1、抗P9-1和/或抗P12-1抗体的存在，这些抗体由受感染人或动物的免疫系统产生，存在其生物学液体中，能结合本发明的抗原或其组合。该方法包括使本发明的这些抗原中的一个或最好是混合物和患者的生物学液体样品一起培育的步骤。因B.burgdorferi感染而存在于液体中的抗体将和抗原一起形成抗体-抗原复合物。随后分析反应混合物以确定这些抗原-抗体复合物的存在或不存在。分析反应混合物的步骤包括使反应混合物和标记的抗体特异性结合伙伴接触。
在该方法的一个例子中，将纯化的抗原、片段或抗原混合物电泳印迹或斑点印迹到硝酸纤维素纸上。随后，使生物学液体(例如血清或血浆)和印迹的抗原一起培育，使生物学液体中的抗体结合抗原。然后用标准免疫酶促方法检测结合的抗体。
在该方法的另一个例子中，使胶乳珠和本发明的抗原偶联。随后，培育生物学液体和珠粒/蛋白偶联物，从而形成反应混合物。然后分析该反应混合物以确定抗体的存在。
在另一个实例中，本发明的诊断方法涉及检测受病原体感染的动物或人的生物学液体中天然存在的本身结合于疏螺旋体属病原体的P39.5抗原或弹夹串抗原的存在。该方法包括一起培育本发明的抗体(例如，通过给予合适的人和/或动物本发明的抗原而产生，较佳的是用常规方法作标记以便检测)和待诊断的人或动物的生物学液体的步骤。当人或动物患者存在疏螺旋体感染时，形成了抗原-抗体复合物(发生特异性结合)。随后，任选地除去过量标记抗体，分析反应混合物以确定抗原-抗体复合物的存在与否以及其结合的标记量。
采用本发明蛋白抗原的试验可以是异质的(heterogenous)(即需要分离步骤)或同质的。如果试验是异质的，则可采用各种分离手段，包括离心、过滤、层析或磁力。
筛选血制品或其它生理学或生物学液体的一种较佳的试验是酶联免疫吸附试验，即ELISA。通常在ELISA中，将本发明的分离的抗原直接或通过捕获基质(即抗体)吸附在微量滴定孔表面。然后用合适的试剂(例如牛血清白蛋白(BAS)、热灭活的正常山羊血清(NGS)或BLOTTO(脱脂干奶缓冲液，还含有防腐剂、盐和消泡剂))封闭表面上残余的蛋白结合部位。然后使孔和怀疑含有特异性抗B.burgdoferi抗体的生物学样品一起培育。样品可以原液使用，或更经常的是，可作稀释，通常是以含有少量(0.1-5.0％(重量))蛋白(如BSA、NGS或BLOTTO)的缓冲液稀释。在培育足够长时间来产生特异性结合后，洗涤孔除去未结合的蛋白，然后和标记的抗人免疫球蛋白(αHuIg)或针对其它种类(如狗)的标记抗体一起培育。标记可以选自各种酶，包括如上所述的辣根过氧化物酶(HRP)、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶。再次使特异性结合进行足够长时间，然后再次洗涤孔除去未结合的偶联物，加入酶底物。使其显色，用肉眼或仪器测定孔内物质的光密度。
另外，可将能结合抗原的本发明的单克隆抗体或其它抗体结合到ELISA板上。在另一个诊断方法中，在抗体结合的板上培育生物学液体并洗涤。如上所述用常规方法检测抗原-抗体复合物并定量测定标记的单克隆抗体。
其它有用的试验方式包括滤杯和测深尺。在前一个试验中，将本发明的抗体固定在小盖开口上的烧结玻璃滤膜上。使生物学液体或样品(5毫升)通过滤膜。如果存在抗原(即有B.burgdorferi感染)，它会与滤膜结合，然后通过第二个抗体/检测物来显示。测深尺试验涉及将抗原或抗体固定在滤膜上，然后将其浸入生物学液体中，干燥并用检测物分子筛选。
其它诊断试验可采用编码本发明抗原或片段的DNA作为核酸探针或反义序列，它们能通过和生物学液体中病原体产生的互补序列杂交来鉴定生物学液体中感染的存在。这些技术，例如PCR、Northern或Southern杂交等，是本领域中熟知的。
本领域技术人员应当理解，可以设计出任意数量的常规蛋白试验方式，尤其是免疫试验方式或核酸试验方式，通过利用本发明的分离的抗原和抗体或其核酸序列或反义序列来检测动物和人体内的疏螺旋体感染。因此，本发明不局限于特定试验方式的选自，并且认为本发明包括了本领域技术人员已知的所有试验方式。
V.诊断试剂盒
为了方便起见，本发明的ELISA或其它测定的试剂可以试剂盒形式提供。这些试剂盒可用来诊断人或动物样品中的疏螺旋体感染。这种诊断试剂盒含有本发明的抗原和/或能结合本发明抗原的至少一种抗体、或编码它们的核酸序列、或它们的反义序列。或者，这些试剂盒可含有这些抗原或序列的简单混合物，或是制备该简单混合物的方法。
这些试剂盒可包括已经预先吸附了本发明的疏螺旋体抗原蛋白或抗体或核酸序列的微量滴定板、各种稀释剂和缓冲液、用来检测特异性结合的抗原、抗体或核酸的标记偶联物，以及其它产生信号的试剂，例如酶底物、辅因子和色素原。这些试剂盒的其它组分很容易由本领域技术人员来确定。这些组分可包括多克隆或单克隆捕获抗体、本发明的抗原、或两种或多种抗体的简单混合物、这些抗原的纯化的或半纯化的抽提物作为标准、单克隆抗体检测抗体、偶联了指示分子的抗小鼠或抗人抗体、准备用于吸附的ELISA板、色度比较用指示剂图表、一次性手套、去污染说明书、施涂棒或容器、样品备用杯。这些试剂盒为临床实验室诊断疏螺旋体感染提供了方便有效的手段。
VI.治疗性组合物
本发明的抗原、抗体、核酸序列或反义序列还能单独用于或和其它抗原、抗体、核酸序列或反义序列组合用于治疗患莱姆病的人和/或动物的治疗性组合物以及方法中。例如，可配制这样一种治疗性组合物，它含有载体或稀释剂以及一种或多种本发明的抗P7-1或其它抗弹夹串蛋白抗体。合适的药学上可接受的载体有助于蛋白给药，但是在生理学上是惰性的和/或无害的。
载体可由本领域技术人员来选择。典型的载体包括无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、橄榄油、芝麻油和水。另外，载体或稀释剂可包括时间延迟物质，例如单用甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯或和石蜡一起使用。另外，可采用缓释聚合物配方。
该组合物还可任选地含有常规的药物组分，例如防腐剂或化学稳定剂。可与抗体结合用于治疗性组合物的合适组分包括(例如)酪蛋白氨基酸、蔗糖、明胶、酚红、N-Z胺、磷酸二氢钾、乳糖、乳白蛋白水解物和干奶。
另外，或是除了本发明的抗体外，用于治疗莱姆病的其它试剂，例如抗生素或免疫刺激剂和细胞因子调节元件，预计可用来减少或消除疾病症状。能用来抑制或抵消蜱载体或螺旋体释放的免疫阻遏物的试剂应发挥帮助受感染人或动物自然免疫力的作用。因此，这些试剂可以和本发明的治疗性组合物共同作用。开发出含有这些试剂的治疗性化合物是本领域技术人员在看了本发明的教导后力所能及的。
根据本发明的方法，可通过给予有效量的此种治疗性组合物来治疗人或动物的莱姆病。“有效量”可能在约0.05至1000微克/毫升本发明抗体之间。合适的剂量可能约为1.0毫升的该有效量。这种组合物可在1天至12周期间每日给予1-3次。然而，主治医师或兽医可以根据人或动物患者的年龄、性别、体重和总体健康状况来作适当的剂量调整。较佳的，这种组合物可通过肠胃外给药，较佳的是肌内或皮下给药。然而，也可配制成通过其它合适途径(包括口服或局部外用)给药。
VII.疫苗组合物
使用以脊椎动物宿主中表达的抗原为基础的疫苗没有产生现有技术的潜在问题。通过包括加入本发明的P39.5抗原以及药学上可接受的载体或稀释剂，提供了一种用于预防人和其它动物中莱姆病的改进的以表面抗原为基础的疫苗。该疫苗组合物可含有一种或多种分离的、重组的、修饰的或多聚形式的本发明P39.5抗原或其混合物。类似地，这些组合物中可采用抗原性蛋白的盐。
本发明组合物的另一个实例的基础是其它弹夹串抗原，即P1-1、P3-1、P6-1、P7-1、P9-1和P12-1。本发明者指出，vlsE抗原经受的抗原性变异的机制表明，该抗原对螺旋体在脊椎动物宿主中的存活非常关键。根据本发明，一种新的疫苗接种方法涉及通过用弹夹串上表达的大组分表位(正是变异来源)免疫接种宿主来避开螺旋体的防御机制。可能这样做的唯一事实是该弹夹串大部分在读框内。本发明者已经通过以弹夹串抗原P7-1免疫接种宿主并诱导杀死螺旋体的抗体证实了这一概念(如下文实施例所述)。因此，根据本发明，一种接种方法涉及给予宿主上述的几种或全部克隆的和纯化的蛋白，这些蛋白由IP90弹夹串的抗原性不相似的片段衍生获得。尽管从这些蛋白可以制得各种免疫原性组合物，但是目前较佳的是将两个或多个弹夹串蛋白或其肽片段简单混合用于此目的。
本发明抗原和B.burgdorferi的其它抗原(如OspA、OspB和OspC蛋白、BmpA，B，C或D蛋白或它们的片段)的组合也包括在本发明内。
典型的载体如上文治疗性组合物所述。疫苗组合物还可任选地含有佐剂、防腐剂、化学稳定剂或其它抗原性蛋白。通常，对稳定剂、佐剂和防腐剂进行优化以确定在人或动物目标上效率最佳的配方。合适的典型防腐剂包括氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟苯甲酸酯、乙基香草醛、甘油、苯酚和对氯苯酚。
上述一种或多种疫苗组分可用常规佐剂混合或吸附。佐剂用来吸引白细胞或增强免疫应答。这些佐剂包括Ribi、矿物油和水、氢氧化铝、白榴石(Amphigen)、阿利啶(Avridine)、L121/鲨烯、D-丙交酯-聚丙交酯/糖苷、复合多元醇(pluronic plyois)、胞壁酰二肽，杀死的Bordetella和皂苷(如Quil A)。另外，本发明的疫苗组合物还可包含其它非B.burgdorferi抗原，包括Bordetella bronchiseptica、犬细小病毒、犬瘟热病、狂犬病、Leptosporidia、犬冠状病毒和犬腺病毒。这些组合物中还可包括源自其它种类的其它疫苗抗原，如猫冠状病毒等。
本发明还包括一种预防方法，该方法需要给予动物或人有效量的这种组合物。P39.5和/或弹夹串蛋白抗原性组合物以“有效量”给予，也就是说，抗原的量在给药途径途径中有效地提供了疫苗效果(即保护性免疫力)。合适量的抗原可由本领域技术人员根据所需的免疫应答水平来决定。然而，疫苗组合物通常含有1毫微克至1000毫克抗原，更佳的，是0.05微克到1毫克/毫升抗原。本领域技术人员很容易确定本发明疫苗组合物的合适剂量。通常，合适的剂量在0.1至5毫升疫苗组合物之间。另外，根据待治疗的人患者或动物种类(即它的体重、年龄和总体健康水平)，本领域技术人员也容易确定剂量。
通常，疫苗每一季节给予一次。在每个蜱生长季节(通常在春季)应给予强化接种。疫苗可通过任何合适的途径给予。然而，肠胃外给药、尤其是肌内和皮下给药是较佳的途径。口服给药途径也是较佳的。如果需要，给药途径可以联合使用或作调节。
另外，疫苗可以是DNA疫苗，它包括P7-1 DNA序列或其片段、另一种弹夹串蛋白或其片段，任选地在调控序列的控制下。因此，编码抗原的DNA可携带于载体(如病毒载体)内。通常，合适的载体为基础的治疗每剂含有1×10-3pfu至1×1012pfu。然而，给予这些组合物的剂量、时间和方式可由本领域技术人员确定。在确定给予本发明的免疫原性或疫苗组合物的剂量、时间和方式时，可能要考虑诸如受接种者的年龄、身体条件之类的因素。
VIII.药物筛选和开发
本发明的蛋白、抗体和多核苷酸序列还可用来筛选和开发可用作治疗性药物的化学化合物或蛋白或治疗或诊断或预防莱姆病的疫苗。一个例子是，能结合P39.5并防止其生物活性的化合物可能是一种治疗或预防莱姆病的有用药物成分。本文描述的方法也适用于P39.5的片段。类似地，能结合弹夹串蛋白或其片段并防止其生物活性的化合物可能是一种治疗或预防莱姆病的有用药物成分。
本领域技术人员很容易确定合适的试验方法。当需要时，根据所选的试验，可将所选抗原(例如P39.5)直接或间接(例如通过抗P39.5抗体)固定在合适的表面上(例如在ELISA方式中)。这些固定化表面是熟知的。例如，可采用可润湿的惰性珠粒。或者，所选抗原(例如P39.5)可用于不需要固定化的筛选试验(例如筛选组合文库)。筛选和开发能结合本发明抗原(如P39.5)的药物的试验和技术是现成的。它们包括用噬菌体展示系统来表达抗原性蛋白，用转染的大肠杆菌或其它微生物的培养物来产生蛋白用于潜在的结合化合物的结合研究。例如参见G.Cesarini，FEBS Letters307(1)：66-70(1992年7月)；H.Gram等人，J.Immunol.Meth.，161：169-176(1993)；C.Summer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3756-3760(1992年5月)中描述的技术，这些文献均纳入本文作参考。
用本发明的蛋白、抗体或多核苷酸序列可进行其它常规药物筛选技术。一个例子是，鉴别特异性结合本发明蛋白(如P39.5)的化合物的方法可简单地包括下列步骤：使所选P39.5蛋白和测试化合物接触，以允许测试化合物与P39.5结合；测定结合P39.5蛋白的测试化合物的量(如果有的话)。该方法可能涉及培育测试化合物和固定在固体载体上的P39.5蛋白。对于一种或多种弹夹串蛋白可采用类似的方法。
通常，使含有固定配体的表面和含有蛋白的溶液接触，并用合适的检测系统测定结合。合适的检测系统包括链霉亲和素辣根过氧化物酶偶联物，直接偶联标记如荧光素。其它系统是本领域技术人员所熟知的。本发明不局限于所用的检测系统。
鉴别特异性结合本发明的P39.5或其它蛋白的化合物的另一个方法可包括下列步骤：使固定在固体载体上的蛋白(如P39.5)和测试化合物以及一蛋白序列(它是P39.5的受体，允许该受体和P39.5蛋白结合)接触；测定结合P39.5蛋白的受体的量。因此，测试化合物对正常蛋白结合的抑制表明测试化合物和P39.5蛋白有结合。对于一种或多种弹夹串蛋白可采用类似的方法。
因此，通过采用这些方法，预计本发明将提供能与P39.5或其部分和/或弹夹串蛋白或其部分相互作用并能按需增强或减少蛋白生物活性的化合物。相信这些化合物均包括在本发明内。另外，无论在上文还是下文提到P39.5蛋白时，它均可被P7-1或一种或多种其它弹夹串蛋白代替。
下列实施例描述了获得本发明的抗原蛋白以及准备本发明的试验和组合物的较佳方法。这些实施例明显表明，本发明的P39.5抗原可用来诊断和预防莱姆病并可能改善莱姆病血清学。这些实施例仅仅起描述作用，并没有限制本发明的范围。
实施例1 疏螺旋体菌株和抗体
A.细菌菌株
从疾病控制和预防中心(Center for Disease Control and Prevention)获得B.burgdorferi(狭义)JD1菌株[J.Piesman等人，J.Clin.Microbiol.，25：557-558(1987)和T.G.Schwan等人，J.Clin.Microbiol.，27：1734-1738(1989)]并保藏低传代(＜7)冷冻原种。B31也是一株B.burgdorferi(狭义)，购自CDC并如上所述方式保藏。IP90是一株B.garinii，它也由CDC提供。
B.burgdorferi生物在34℃ BSK-H培养基(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo)中培育。
B.猴抗体
使猕猴血清抗体和活的螺旋体一起培育，该猕猴已经肩突硬蜱蛹叮咬而感染了B.burgdorferi株JD1。从螺旋体上洗涤除去未结合的抗体，用低pH缓冲液除去结合的抗体。猴抗体得自三个来源：
a)通过针头接种感染B.burgdorferi JD1株的猕猴，
b)通过使动物和感染JD1的肩突硬蜱蛹接触而感染了B.burgdorferi JD1株的猕猴，
c)用通过蜱接种的动物收集得到的抗血清作为原料，通过在活的螺旋体上亲和纯化得到，方法如下：将3个蜱接种动物合并的体积为800微升的稀释(1/40，用BSK-H培养基)热灭活血清样品和总共1×109活菌室温培育30分钟。培育后，4℃、13000xg离心样品15分钟。然后，如上所述再重新吸附上清液两次。用BSK-H洗涤第一次吸附后回收的细菌沉淀三次，以除去未结合的抗体。在最后一次洗涤后，将沉淀重悬于400-500微升0.2M甘氨酸-HCl，pH2.2，0.5M NaCl中并离心。回收上清液，加入2.0M Tris碱使pH回到7.00。
实施例2 IP90的P39.5的初步鉴定
使实施例1部分B的抗体和JD1、B31以及IP90螺旋体的全抽提物的Western印迹反应。Western印迹如下进行：使抗原制备物在15％丙烯酰胺微型凝胶(10×10×0.1cm)和5％丙烯酰胺浓缩胶上作电泳。每条泳道中分配20微升含有7×108细菌裂解液或25微克蛋白(测定280nm OD)(整个制备型泳道有16个单泳道；因此每一制备型凝胶上加了400微克蛋白)。在23mA恒压下用U.Laemmli，Nature，227：680-685(1970)中的缓冲液用微型胶装置(Integrated Separation Systems，Hyde Park，MA)进行电泳。为进行免疫印迹，如H.Towbin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：4350-4354(1979)所述的，在Mighty Small转移单元(Hoeffer Scientific Instruments，SanFrancisco，CA)中22伏恒压下过夜将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白电泳转移到硝酸纤维素纸上(Schleicher和Schuell，Keene，NH)。用胶体金(Integrated Separation Systems)对部分硝酸纤维素染色，评价转移效率。在室温下用含0.05％吐温-20(Integrated SeparationSystems)的PBS(PBS-T)配制的3％脱脂奶粉(Carnation)封闭硝酸纤维素膜2小时。
在封闭步骤后，按照生产商说明书将膜固定在Miniblotter 45(Immunetics，Cambridge，MA)上，将110微升各血清样品(用PBS-T 1/50稀释)加入Miniblotter通道中，使其在振动平台上室温下和硝酸纤维素膜相互作用1小时。培育后，用多头管系统以PBS-T洗涤膜。此时拆开Miniblotter，取出印迹。其余的培育步骤在小碟中进行。洗涤后，使膜和生物素化的抗人IgM(μ-链特异性)和IgG(γ-链特异性)抗体(Vector Laboratories，Burlingame，CA)(1/200稀释在PBS-T中)培育1小时。用按照生产商说明书制备的亲和素/生物素化的辣根过氧化物酶复合物(Vector)探测生物素化的抗体。用试剂4-氯-1-萘酚(Sigma)作为色原。用蒸馏水洗涤膜终止颜色反应。
从B.burgdorferi株JD1和B31以及B.garinii IP90株螺旋体裂解液制得Western印迹(图6)，该印迹用经JD1螺旋体针头接种和蜱接种的猴血清以及后一血清经亲和纯化除去全部活JD1螺旋体后获得的抗体来显影。亲和纯化的抗体识别B.burgdorferiJD1螺旋体全裂解液的Western印迹上的四种抗原。这些抗原被命名为P1(相对分子量(Mr)39-40,000)、P2(Mr35-37,000)、P3(Mr22-24,000)和P4(Mr18-19,000)。如所预计的那样，这些抗原还被针头接种动物的血清样品以及蜱接种的猴血清识别。另外，该Western印迹表明，亲和纯化的抗体识别B31螺旋体上看来是P1、P2和P4的抗原、和B.garinii中看来是P1(相对分子量稍高)的抗原、以及一个相对分子量较高的额外抗原。这后两种抗原也被针头接种和蜱接种动物的血清专门识别。P1最后被鉴定为P39，也称为BmpA。存在于IP90螺旋体上的相似抗原被暂时确定为P39.5，它显示在上述Western印迹中。
实施例3 依赖抗体的补体介导的JD1、B31和IP90螺旋体杀伤
如下所述将蜱接种的猴血清用于ADCK试验。37℃迅速融化冷冻的B.burgdorferi样品，培育直至它们达到对数中期(大约3天，1-2×107螺旋体/毫升)，8000Xg离心2分钟，重悬于BSK-H培养基中并固定。在96孔组织培养平板(Costar)中进行一式两份的ADCK试验。将25微升BSK-H培养基中总共5-6×105个螺旋体加入每个孔中，每个孔内含有50微升热灭活的(56℃、30分钟)血清样品(用相同的培养基1∶10稀释)。在加入25微升补体(正常猴血清)之前，在3％CO2、5％O2及平衡量N2的气体混合物中，34℃培育平板20分钟。在相同条件下培育18-24小时后，在暗视野显微镜下定量测定死亡的(不动的)和活的(能动的)细菌的总数。以前已经在类似试验中确定了不运动和死亡之间的等效性[M.Aydintug等人，上文]。如果死亡螺旋体的平均百分数超过在正常血清存在时观察到的杀伤平均百分数值的3倍，则认为杀伤作用是显著的。
用JD1螺旋体蜱接种的动物的血清对B.burgdorferi株JD1和B31以及B.gariniiIP90株螺旋体进行ADCK。如实施例2所示，该血清仅仅识别IP90印迹上的两个抗原，一个抗原的相对分子量与P1相似，另一个的相对分子量较高。如图1所示，所有三种螺旋体株均被该血清杀死，这表明IP90 Western印迹中显示的至少一种抗原是ADCK的靶。
实施例4 P39.5的鉴定
调查在IP90 Western印迹上看到的推定的BmpA(P39)条带的身份。JD1和IP90裂解液的Western印迹用抗鞭毛蛋白单克隆抗体(Mab)、抗-P39单克隆抗体、抗-P39多克隆抗体、抗-P35单克隆抗体、抗BmpD多克隆抗体和用JD1螺旋体蜱接种的两只猴子的血清显象。在同一凝胶上进行的JD1和IP90抗原的比较性Western印迹分析中，两种抗原抽提物和抗鞭毛蛋白单克隆抗体H9724反应。然而，抗BmpA单克隆抗体只和JD1 BmpA反应，用JD1的重组BmpA免疫接种的猴血清如所预计的那样和JD1印迹强烈反应，但是和IP90的BmpA抗原的反应非常弱。而且，从两只JD1感染猴获得的血清样品和前面一样与IP90印迹上两个相同的抗原反应，并且有时产生另一(更微弱)较高分子量条带。两者中分子量最低的条带实际上对应于比IP90的BmpA更大的分子(用抗BmpA多克隆抗体鉴定)。此较高分子量条带可能对应于鞭毛蛋白，因为它的分子量与和单克隆抗体H9724反应的IP-90的条带相同。
产生的针对JD1 P35的单克隆抗体与JD1印迹上的该分子反应，但是不与IP90印迹上的该分子反应，而产生的针对JD1 BmpD的小鼠多克隆抗血清和JD1以及IP90两者的BmpD反应(尽管IP90的BmpD条带非常微弱)。因此，可能是ADCK的靶的IP90抗原的身份不是BmpA、BmpD或P35。它在后文被称为P39.5。
然后使与下列物质一起培育的JD1以及IP90螺旋体裂解液的Western印迹显象：蜱接种JD1的猴血清；针对P39的猴多克隆抗血清；针对鞭毛蛋白的小鼠单克隆抗体H9724；蜱接种JD1的猴血清样品亲和纯化获得的猴抗-P39.5抗体；和小鼠抗重组体P7-1(rP7-1)抗体。为了在JD1裂解液的Western印迹上鉴定P39.5，用附着IP90P39.5的硝酸纤维素条亲和纯化JD1感染猴中引发的抗-P39.5抗体。如所预计的那样，该抗体和IP90裂解液的Western印迹上的P39.5抗原反应，但是令人惊奇的是，该抗体不能和JD1印迹反应。该结果暗示，JD1的P39.5或是不能在体外表达，或是表达稀疏而不能被亲和纯化的抗P39.5抗体在JD1印迹上检测到，或是JD1体外表达的方式与经亲和纯化除去IP90 P39.5的抗体不发生抗原性交叉反应。
显然，JD1螺旋体必定在体内表达P39.5，且表达量高得足以具有免疫原性，不然首先就不会诱导出经亲和纯化的抗-P39.5抗体。在上述Western印迹中，BmpA的位置通过其和抗BmpA多克隆抗血清反应而得到表明，鞭毛蛋白的位置通过该分子和单克隆抗体H9724反应来表明。
因此，鉴定出一种由B.garinii IP90株丰富地体外表达和B.burgdorferi(狭义)株JD1体内丰富表达的新的疏螺旋体抗原。该抗原P39.5是IP90螺旋体的ADCK试验中的靶。
实施例5 P39.5的克隆
A.在噬菌体中克隆
用λZAPII噬菌体载体[Stratagene，La Jolla，CA]构建B.burgdorferi IP90的随机切割的总DNA文库，并用感染B.burgdorferi JD1株的猕猴收集的混合血浆筛选。选出用与混合的血浆样品，使得它们所含的抗体只识别某些IP90 Western印迹上所见的P39.5、假定的鞭毛蛋白和1或2个其它未鉴定的较高分子量的微弱条带。
几轮筛选后，将11个克隆拯救到pBluescript噬菌粒[Stratagene]中，纯化重组质粒并用来转化大肠杆菌SURE株的细胞。从每个原始克隆选出几个转化子，确认插入物的存在，使每个克隆的这样一个转化子生长，诱导表达，裂解并用原始的混合血浆作Western印迹分析。11个克隆的片段在斑点印迹杂交中相互杂交。
根据表达的蛋白和血浆抗体的强反应性，从11个克隆中选出1个(命名为7-1)进行过量表达和纯化。7-1插入物的长度为950bp。
由于原始血浆样品中的抗体用克隆作为免疫吸附剂作亲和纯化后所得抗体显示能与B.garinii裂解液Western印迹上的P39.5反应，因此确认了所表达蛋白的身份是在抗原性上和P39.5相同或和P39.5交叉反应。使IP90螺旋体的Western印迹和感染了JD1螺旋体的猴血浆反应而显影、该血浆经B.garinii克隆1-1和克隆7-1表达的重组抗原亲和纯化获得了抗体。在印迹中证实了IP90裂解液和合并猴血浆具有反应性。IP90裂解液显示和重组1-1蛋白亲和纯化的抗体有反应性，并和重组7-1蛋白亲和纯化的抗体有反应性。
获得P7-1的部分DNA序列[SEQ ID NO：1]。从克隆7-1衍生获得约950bp。另外，从克隆14获得约140kb的上游区域[SEQ ID NO：13]。5′SEQ ID NO：13序列和SEQ ID NO：1序列形成的DNA片段长1189bp，如图2所示。它包括编码37.7kDa的推定蛋白的一个开放读框。其丙氨酸高含量导致了这一相当低的分子量。由于该蛋白氨基酸的平均分子量为95，因此丢失完整编码区的约57个bp。由于没有观察到疏水性引导序列且P39.5具有脂蛋白的溶解性(见下文)，因此P7-1与P39.5在抗原性上有交叉，但是它不是完整的P39.5本身。
P7-1的推定氨基酸序列[SEQ ID NO：14和2]以外的数据表明P39.5是脂蛋白。首先，在IP90全细胞抽提物中存在的天然形式的P39.5是完全可以抽提的，即它在Triton-X114相分离试验中分配到洗涤剂相中。第二，其大部分序列由亲水性结构域组成，非常类似于OspA，但是它必定是表达在外表面上的，因为它是抗体的靶标。第三，它和Borrelia hermsii脂蛋白Vmp家族几个成员的相同百分率非常高，例如和Vmp4为22％，和Vmp23为19％，和Vmp17为18％，和Vmp21为17％。这些序列从GENBANK数据库获得。
其核苷酸序列的一个令人感兴趣的特征是存在几个内部重复区域(如图2所示)。方块IA和IB有70％相同。方块IIA和IIB的相同性高达91％，方块A、B和C的相同性在84-90％之间。内部仅有的唯一片段用黑色方块表示。显然，这种分子易经历在具有同源区域的OspA和OspB基因之间和内部发生[P.Rosa等人，上文]的相同类型的同源重组。然而，如同参照OspA情况所证明的那样[Sole等人，上文]，这些潜在的逃逸型突变体可能不能逃脱抗体和补体的联合作用。
B.用QIAEXPRESSTM系统表达和纯化重组P7-1
Qiagen，Inc.(Chatsworth，CA)的QiaexpressTM系统利用了6连串组氨酸残基对二价阳离子(如Ni)的高亲和力。将后者偶联于氮川三乙酸(NTA)，再和琼脂糖连接。因为亲和尾非常小(最小为6个残基)，它可留在融合蛋白中而对蛋白的抗原性质不会有严重后果。6个His的亲和尾可以插入N端或C端。很多载体(pQE载体)均可用来构建两种类型的融合。
首先筛选重组体以确定质粒中预计插入物的存在。然后用Western印迹确认这些重组体中的蛋白表达。Western印迹用感染了对应株螺旋体的对照小鼠血清、或是特异性检测MGRS(His)6表位(Qiagen)(是一些pQE载体[N端融合]中的亲和标记序列)的小鼠抗体显影。同样灵敏的备选方案是用购自Qiagen的Ni-NTA-碱性磷酸酶偶联物。
使含有融合构建物的大肠杆菌细胞生长至对数中期，用0.3mM IPTG诱导3小时，沉淀，用超声处理缓冲液[50mM NaPO4，pH8.0，300mM NaCl]洗涤一次，-20℃贮藏过夜。第二天，将细胞重悬于超声破碎缓冲液，于冰上用15秒脉冲超声破碎共2分钟。超声破碎后立即加入丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF(苯基-甲基-磺酰氟(sulfonidefluoride))以防止该蛋白酶的降解作用。离心沉淀细胞碎片，将上清液转移到新鲜试管内。同时，用10倍柱体积(cv)的超声破碎缓冲液洗涤Ni-NTA树脂一次。使融合蛋白在试管内和Ni-NTA树脂结合1小时。离心沉淀树脂，弃去上清。将树脂重悬于10倍柱体积的超声破碎缓冲液中，倒入柱中，用10倍柱体积相同缓冲液洗涤3次，然后用10倍柱体积洗涤缓冲液[50mM NaPO4，pH6.3，300mM NaCl]洗涤3次。最后，用10倍柱体积洗脱缓冲液[50mM NaPO4，pH4.5，300mM NaCl]洗脱融合蛋白，并收集各级分。测定各级分中的蛋白含量，合并含有最高蛋白浓度的级分并用磷酸氢二钠中和至pH7.0。计算合并样品中的蛋白浓度，取一等份在SAS-PA凝胶上跑电泳，银染检查纯度。典型的得率为4-5毫克/升培养物。
实施例6 P7-1在猴中的体外保护性潜力
通过吸收并从克隆7-1表达的含有重组P7-1蛋白(rP7-1)的硝酸纤维素条上酸洗脱下，从同一猴血浆合并物纯化获得抗P7-1抗体并用来筛选DNA文库。如实施例2和4所述，在Western印迹上确认抗体的单特异性，如实施例3所述将该抗体用于ADCK。
已死IP90螺旋体的级分在和亲和纯化的抗P7-1抗体培育24小时后有55％(图3，条2)。重建抗体其浓度等价于其血浆浓度的1∶10稀释液。该杀伤率与1∶10稀释的同一血浆观察到的(67％，图3，条1)相当。补体是实现杀伤作用所必需的，因为没有补体时只有12％的螺旋体被杀死(图3，条3)。在猴补体单独存在时的杀伤作用稍高于平时，其值为25％(图3，条4)，而最通常获得的数值是10-15％，尽管用的是JD1螺旋体[M.Aydintug等人，Infect.Immun.，62：4929-4937(1994)]。在单用BSK-H培养基时，有12％的螺旋体死亡(条5)。
这些结果表明，在JD1螺旋体天然感染期间在猴体内引发的针对IP90重组P7-1(P39.5的一个片段)抗原的抗体，能通过ADCK杀死IP90螺旋体。
这些试验证明了P7-1的保护性潜力，并形成了选择该抗原作为疫苗候选物的基础。
实施例7 P7-1在小鼠体内的保护性潜力
本实施例表明小鼠可用重组P7-1直接免疫接种。用rP7-1和Ribi佐剂免疫接种产生的小鼠抗体能通过依赖于抗体的补体介导的杀伤作用(ADCK)在体外杀死高达60％的IP90螺旋体。为了更直接地评价P7-1的保护性潜力，如实施例5所述将克隆7-1的DNA片段亚克隆到pQE中，纯化毫克量的表达蛋白并用来免疫接种C3H/HeJ小鼠。对小鼠注射4次各含30微克重组P7-1的0.2毫升Ribi R-700佐剂(RibiImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，MT)。R-700配方包括0.25毫克/毫升MPLTM、0.25毫克/毫升合成的海藻糖二棒杆菌分枝菌酸、20微升/毫升鲨烯(六甲基二十四烷六烯)和2微升/毫升单油酸(吐温80)。每隔三周腹膜内注射。末次免疫后两周，将小鼠放血，用IP90螺旋体全细胞抽提物作为抗原通过Western印迹确认引发抗体的特异性，合并血清样品。
单用Ribi佐剂免疫接种的小鼠血清不能识别IP90印迹上的抗原。用rP7-1和Ribi免疫接种的小鼠血清如所预计的那样识别了IP90裂解液的P39.5条带，但是还识别在41kDa鞭毛蛋白条带稍稍上方的较弱的条带以及较高分子量的条带。令人感兴趣的是，该同一小鼠抗体识别JD1裂解液Western印迹上的41kDa条带，还有稍高分子量的抗原。
该结果与前述实施例中用亲和纯化的抗-rP7-1猴抗体获得的结果不同，这可能是由于小鼠抗体亲和力的成熟时间(12周)比猴抗体(4-5周)长得多。因此，其结合亲和力更高，但其特异性更低，并且它能结合交叉反应的但不相同的表位。
在额外的强化注射后，在相同类型的试验中，产生杀死60％IP90螺旋体的抗-P7-1抗体的小鼠，产生了杀死100％这些螺旋体的抗血清。另外，此同一抗血清能杀死50％的NT1株螺旋体(一种还未归类的菌株，但可能是狭义的，因为它从美国东北部患者的脑脊髓液分离出)。相反，在蜱攻击以rP7-1和Ribi佐剂免疫接种的小鼠的试验中，没有JD1株螺旋体能在体外(通过ADCK)或体内被杀死。
用猴和豚鼠补体评价ADCK。用正常豚鼠血清(购自Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)作为后一种情况时的补体来源。用感染了B.burgdorferi JD1的动物的同一合并猴血浆作为阳性对照。在1∶10的稀释度下，该合并血浆在培育24小时后杀死了57％的IP90螺旋体(图3，条1)。针对rP39.5的小鼠抗血清在1∶10的稀释度下杀死了73.5％的螺旋体，在1∶50的稀释度下杀死了60.5％的螺旋体(分别是条2和3)。单用Ribi佐剂免疫接种的小鼠血清杀死21％的螺旋体(条4)。豚鼠补体在ADCK试验中的效果较差。在1∶10的稀释度下，阳性对照血浆杀死了37％的螺旋体(条5)，而在同一稀释度下，小鼠抗P39.5抗血清在豚鼠补体存在时杀死了48％的螺旋体(条6)。存在1∶10稀释仅注射Ribi的小鼠血清时，12％的螺旋体被杀死(条7)。令人感兴趣的是，当和1∶10稀释的小鼠抗rP39.5抗血清培育时，只有6％的JD1螺旋体被杀死，该数值与只用对照血清杀死的数值没有不同(未显示)。因此，JD1印迹上被识别的条带可能代表了乱真的交叉反应性，但不是JD1 P39.5。
实施例8 P7-1在人类的诊断用途
从疾病控制和预防中心(CDC)获得19份人血清样品。四份样品来自没有莱姆病史且从未居住在该疾病流行区域的献血者。其它15份样品来自生活在莱姆病流行地区、具有该疾病体征和/或症状的患者，除一位患者外，根据CDC建议的标准，这些患者的血清呈阳性。该标准提出，患者对灵敏的莱姆病ELISA测试呈阳性，另外还对IgM或IgG Western印迹呈阳性，因此阳性IgM印迹中存在下列三条条带(24、39或41kDa)中的至少两条，阳性IgG印迹中存在下列10条条带(18、21、28、30、39、41、45、58、66和93kDa)中的至少5条。
根据IgG抗体检测为基础的测试，方法是将1∶200稀释的血清样品和电泳印迹了纯化的P39.5抗原的硝酸纤维素条一起培育，随后用实施例2所述的免疫酶促方法检测结合的抗体，产生了以下结果。来自没有莱姆病史且从未居住在该疾病流行区域的献血者的四份血清样品没有可检测的抗-P39.5抗体。在其余15份样品中，14份呈阳性。仅有的一份阴性样品在CDC建议的标准下也未显示出抗体。因此，通过这种初步评价，本文描述的根据P39.5抗原作为抗B.burgdorferi抗体的诊断性探针的简单步骤和CDC目前建议的更复杂的两步骤方法一样灵敏和特异。
在另一个诊断试验中，测试了7-1DNA片段表达的抗原性蛋白rP7-1作为探针用于猕猴莱姆病早期血清学诊断。从经B.burgdorferi三种不同株B31、JD1和NT1分别感染的三对猕猴获得的血清样品，经Western印迹检测，至感染2周含有针对纯化的rP7-1的可检测抗体。同时测试IgM和IgG抗体。结果表明，针对P7-1的抗体于感染早期出现，不论引发抗体应答的B.burgdorferi是什么株。
再次用从CDC获得的一组43份人血清样品通过上述Western印迹评价抗体检测的灵敏度。试验以盲试验方式进行。临床诊断为莱姆病的患者的CDC样品符合CDC定义该病的严格标准。在43份临床阳性患者的样品中，CDC通过MarDx Diagnostics.Inc.(莱姆病MarBlot)的Western印迹测试用Dressler标准[Dresslar，F.等人，1993 J.Infect.Dis.，167：392-40]判断，报道说有34位呈阳性。利用P7-1抗原的诊断性Western印迹，相同数量的样品(34)呈阳性，但是两个试验中的阴性或阳性结果并不始终相符。因此，在以P7-1为基础的Western中检测到单条带(或未检测到)，这是一种便于解释的试验，其灵敏度和目前市场上最好的但是难以解释的莱姆病诊断测试的灵敏度相同。
在抗原特异性测试中，12份梅毒患者血清样品中11份试验呈阴性，尽管事实是所有样品所含抗体和Western印迹上的全B.burgdorferi抗原的多种抗原有交叉反应。提供阳性结果的单份血清样品来自还患有HIV感染以及几种AIDS相关感染的患者。
实施例9 弹夹串蛋白
如上所述，从7-1片段的核苷酸序列预计的氨基酸序列与B.burgdorferi B31株的VlsE有大约50％的相同性。它是经历了抗原性变异的B.burgdorferi抗原的一部分，该抗原性变异的重组机制是表达拷贝的中心片段(VlsE)和位于表达拷贝上游的一串15个“弹夹”的片段重组而致[J.Zhang，上文]。
已克隆了看来是B.garinii IP90弹夹串一部分的几个DNA片段。除了7-1外，这些片段(命名为1-1、3-1、6-1、9-1和12-1)的长度在1至2kb间。当以重组形式表达时(基本上如上文P7-1所述那样(除去pBluescript的lacZ启动子))，各弹夹串片段表达的肽的大小和插入物相称，并和受感染猴的抗体反应。这些片段的5′端均不含疏水性前导序列或具有细菌脂蛋白特征的信号肽酶II共有序列。因此，这些片段必定是IP90的弹夹串的一部分，并且和B31的弹夹串一样，它们在读框内。SEQ ID NO：3至12描述了每个片段的5′和3′端DNA序列(在约100-500bp间)。注意，在SEQ ID NO：10中只描述了片段9-1的5′端。
已通过两种方式分析了这些片段的抗原性。首先，在蜱接种B.burgdorferi JD1后48周内研究这些片段的Western印迹和从猕猴纵向(longitudinally)收集的血清样品的反应性。片段9-1和7-1表达的蛋白主要与感染后(IP)2和24周之间收集的血清样品反应(早期反应物)，片段3-1和6-1表达的蛋白主要与感染后24和48周之间收集的血清样品反应(晚期反应物)，而片段1-1和12-1的蛋白在调查的长达48周长的时间范围内表现出相当一致的反应性。这一结果提示，每个克隆片段含有唯一的表位。
为了证实这一想法，用上述Western印迹分析中采用的样品构建血清库，使该“时间”库等份预先和过量的7-1表达的纯化的抗原(rP7-1)培育。这样，存在于血清库中的抗P7-1抗体不再和Western印迹上的P7-1抗原反应。尽管如此，该血清库仍然能和其它DNA片段表达的蛋白反应(12-1除外)。由于后者是“晚期”反应物，因此针对推定的12-1唯一的表位的抗体，可能已经在血清库中被稀释。如上文P7-1所述的那样，将所有上述片段亚克隆到pQE载体中，用常规方法进行表达。
本发明者提出这样一个理论：IP90 P39.5抗原凭借其与B31的vls E抗原的同源性而经历的抗原性变异的机制，表明该抗原对于脊椎动物宿主中螺旋体的存活非常关键。因此，将本发明的方法和组合物设计成通过用弹夹串上表达的、正是变异来源的大组分表位免疫接种宿主，来避开螺旋体的防御机制。这成为可能的唯一事实是大部分该弹夹串在读框内。因此，如上所述，一种疫苗接种方法涉及给予宿主上述几种或全部克隆和纯化的蛋白，这些蛋白由IP90弹夹串的抗原性不相似片段衍生获得。例如参见当将P7-1导入宿主中并诱导杀死螺旋体的抗体时所获得的结果。
所有上述文献和优先权文本均纳入本文作参考。对本发明的众多改进和变化也包括在上述确定的说明书中，并且是本领域技术人员显然能预计到的。对本发明的组合物和方法所作的修饰和变化被认为包括在本文所附权利要求的范围内。
序列表(1)一般信息：
(i)申请人：Adminis.of Tulane Educational，Fund
Philipp，Mario T.
(ii)发明名称：诊断和预防莱姆病用的组合物的表面抗原和蛋白质
(iii)序列数目：14
(iv)通信地址：
(A)地址：Howson and Howson
(B)街道：Spring House Corporate Cntr.，P.O.Box 457
(C)城市：Spring House
(D)STATE：Pennsylvania
(E)国家：USA
(F)邮编：19477
(v)计算机可读形式：
(A)记录介质类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容型
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30
(vi)本申请资料：
(A)申请号：WO
(B)申请日：
(C)分类：
(vii)在先申请信息：
(A)申请号：US60/051,271
(B)申请日：1997年6月30日
(viii)律师/代理人信息：
(A)姓名：Bak，Mary E.
(B)登记号：31,215
(C)文献/案卷号：TUL2APCT
(ix)电讯信息：
(A)电话：215-540-9200
(B)电传：215-540-5818(2)SEQ ID NO：1的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：1047碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：未知
(ii)分子类型：cDNA
(ix)特征：
(A)名称/关键字：CDS
(B)位置：1.1047
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：AAG AAT AAT GAT CAT GAT AAT CAT AAG GGG ACT GTT AAG AAT GCT GTT 48Lys Asn Asn Asp His Asp Asn His Lys Gly Thr Val Lys Asn Ala Val1 5 10 15GAT ATG GCA AAG GCC GCT GAG GAA GCT GCA AGT GCT GCA AGT GCT GCT 96Asp Met Ala Lys Ala Ala Glu Glu Ala Ala Ser Ala Ala Ser Ala Ala
20 25 30ACT GGT AAT GCA GCG ATT GGG GAT GTT GTT AAG AAT AGT GGG GCA GCA 144Thr Gly Asn Ala Ala Ile Gly Asp Val Val Lys Asn Ser Gly Ala Ala
35 40 45GCA AAA GGT GGT GAG GCG GCG AGT GTT AAT GGG ATT GCT AAG GGG ATA 192Ala Lys Gly Gly Glu Ala Ala Ser Val Asn Gly Ile Ala Lys Gly Ile
50 55 60AAG GGG ATT GTT GAT GCT GCT GGA AAG GCT GAT GCG AAG GAA GGG AAG 240Lys Gly Ile Val Asp Ala Ala Gly Lys Ala Asp Ala Lys Glu Gly Lys65 70 75 80TTG GAT GCT ACT GGT GCT GAG GGT ACG ACT AAC GTG AAT GCT GGG AAG 288Leu Asp Ala Thr Gly Ala Glu Gly Thr Thr Asn Val Asn Ala Gly Lys
85 90 95TTG TTT GTG AAG AGG GCG GCT GAT GAT GGT GGT GAT GCA GAT GAT GCT 336Leu Phe Val Lys Arg Ala Ala Asp Asp Gly Gly Asp Ala Asp Asp Ala
100 105 110GGG AAG GCT GCT GCT GCG GTT GCT GCA AGT GCT GCT ACT GGT AAT GCA 384Gly Lys Ala Ala Ala Ala Val Ala Ala Ser Ala Ala Thr Gly Asn Ala
115 120 125GCG ATT GGA GAT GTT GTT AAT GGT GAT GTG GCA AAA GCA AAA GGT GGT 432Ala Ile Gly Asp Val Val Asn Gly Asp Val Ala Lys Ala Lys Gly Gly
130 135 140GAT GCG GCG AGT GTT AAT GGG ATT GCT AAG GGT ATA AAG GGG ATT GTT 480Asp Ala Ala Ser Val Asn Gly Ile Ala Lys Gly Ile Lys Gly Ile Val145 150 155 160GAT GCT GCT GAG AAG GCT GAT GCG AAG GAA GGG AAG TTG AAT GCT GCT 528Asp Ala Ala Glu Lys Ala Asp Ala Lys Glu Gly Lys Leu Asn Ala Ala
165 170 175GGT GCT GAG GGT ACG ACT AAC GCG GAT GCT GGG AAG TTG TTT GTG AAG 576Gly Ala Glu Gly Thr Thr Asn Ala Asp Ala Gly Lys Leu Phe Val Lys
180 185 190AAT GCT GGT AAT GTG GGT GGT GAA GCA GGT GAT GCT GGG AAG GCT GCT 624Asn Ala Gly Asn Val Gly Gly Glu Ala Gly Asp Ala Gly Lys Ala Ala
195 200 205GCT GCG GTT GCT GCT GTT AGT GGG GAG CAG ATA TTA AAA GCG ATT GTT 672Ala Ala Val Ala Ala Val Ser Gly Glu Gln Ile Leu Lys Ala Ile Val
210 215 220CAT GCT GCT AAG GAT GGT GGT GAG AAG CAG GGT AAG AAG GCT GCG GAT 720His Ala Ala Lys Asp Gly Gly Glu Lys Gln Gly Lys Lys Ala Ala Asp225 230 235 240CGT ACA AAT CCC ATT GAC GCG GCT ATT GGG GGT GCG GGT GAT AAT GAT 768Arg Thr Asn Pro Ile Asp Ala Ala Ile Gly Gly Ala Gly Asp Asn Asp
245 250 255GCT GCT GCG GCG TTT GCT ACT ATG AAG AAG GAT GAT CAG ATT GCT GCT 816Ala Ala Ala Ala Phe Ala Thr Met Lys Lys Asp Asp Gln Ile Ala Ala
260 265 270GCT ATG GTT CTG AGG GGA ATG GCT AAG GAT GGG CAA TTT GCT TTG AAG 864Ala Met Val Leu Arg Gly Met Ala Lys Asp Gly Gln Phe Ala Leu Lys
275 280 285GAT GCT GCT GCT GCT CAT GAA GGG ACT GTT AAG AAT GCT GTT GAT ATA 912Asp Ala Ala Ala Ala His Glu Gly Thr Val Lys Asn Ala Val Asp Ile
290 295 300ATA AAG GCT GCT GCG GAA GCT GCA AGT GCT GCA AGT GCT GCT ACT GGT 960Ile Lys Ala Ala Ala Glu Ala Ala Ser Ala Ala Ser Ala Ala Thr Gly305 310 315 320AGT GCA GCA ATT GGG GAT GTT GTT AAT GGT AAT GGA GCA ACA GCA AAA 1008Ser Ala Ala Ile Gly Asp Val Val Asn Gly Asn Gly Ala Thr Ala Lys
325 330 335GGT GGT GAT GCG AAG AGT GTT AAT GGC ATT GCT AAG GGA 1047Gly Gly Asp Ala Lys Ser Val Asn Gly Ile Ala Lys Gly
340 345(2)SEQ ID NO：2的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：349氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID N0：2：Lys Asn Asn Asp His Asp Asn His Lys Gly Thr Val Lys Asn Ala Val1 5 10 15Asp Met Ala Lys Ala Ala Glu Glu Ala Ala Ser Ala Ala Ser Ala Ala
20 25 30Thr Gly Asn Ala Ala Ile Gly Asp Val Val Lys Asn Ser Gly Ala Ala
35 40 45Ala Lys Gly Gly Glu Ala Ala Ser Val Asn Gly Ile Ala Lys Gly Ile
50 55 60Lys Gly Ile Val Asp Ala Ala Gly Lys Ala Asp Ala Lys Glu Gly Lys65 70 75 80Leu Asp Ala Thr Gly Ala Glu Gly Thr Thr Asn Val Asn Ala Gly Lys
85 90 95Leu Phe Val Lys Arg Ala Ala Asp Asp Gly Gly Asp Ala Asp Asp Ala
100 105 110Gly Lys Ala Ala Ala Ala Val Ala Ala Ser Ala Ala Thr Gly Asn Ala
115 120 125Ala Ile Gly Asp Val Val Asn Gly Asp Val Ala Lys Ala Lys Gly Gly
130 135 140Asp Ala Ala Ser Val Asn Gly Ile Ala Lys Gly Ile Lys Gly Ile Val145 150 155 160Asp Ala Ala Glu Lys Ala Asp Ala Lys Glu Gly Lys Leu Asn Ala Ala
165 170 175Gly Ala Glu Gly Thr Thr Asn Ala Asp Ala Gly Lys Leu Phe Val Lys
180 185 190Asn Ala Gly Asn Val Gly Gly Glu Ala Gly Asp Ala Gly Lys Ala Ala
195 200 205Ala Ala Val Ala Ala Val Ser Gly Glu Gln Ile Leu Lys Ala Ile Val
210 215 220His Ala Ala Lys Asp Gly Gly Glu Lys Gln Gly Lys Lys Ala Ala Asp225 230 235 240Arg Thr Asn Pro Ile Asp Ala Ala Ile Gly Gly Ala Gly Asp Asn Asp
245 250 255Ala Ala Ala Ala Phe Ala Thr Met Lys Lys Asp Asp Gln Ile Ala Ala
260 265 270Ala Met Val Leu Arg Gly Met Ala Lys Asp Gly Gln Phe Ala Leu Lys
275 280 285Asp Ala Ala Ala Ala His Glu Gly Thr Val Lys Asn Ala Val Asp Ile
290 295 300Ile Lys Ala Ala Ala Glu Ala Ala Ser Ala Ala Ser Ala Ala Thr Gly305 310 315 320Ser Ala Ala Ile Gly Asp Val Val Asn Gly Asn Gly Ala Thr Ala Lys
325 330 335Gly Gly Asp Ala Lys Ser Val Asn Gly Ile Ala Lys Gly
340 345(2)SEQ ID NO：3的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：283碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：未知
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：GCCGCTGGAT GGTGGTGAGA AGCAGGGTAA GAAGGCTGCG GATCGTACAA ATCCCATTGA 60CGCGGCTATT GGGGGTGCGG GTGATAATGA TGCTGCTGCG GCGTTTGCTA CTATGAAGAA 120GGATGATCAG ATTGCTGCTG CTATGGTTCT GAGGGGAATG GCTAAGGATG GGCAATTTGC 180TTTGAAGGAT GCTGCTGCTG CTCATGAAGG GACTGTTAAG AATGCTGTTG ATATAATAAA 240GGCTGCTGCG GAAGCTGCAA GTGCTGCAAG TGCTGCTACT GGT 283(2)SEQ ID NO：4的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：233碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：未知
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：TTTATTATAT CAACAGATTC TTAACAGTCC CTTCATGAGC AGCAGCAGCA TCCTTCAAAG 60CAAATTGCCC ATCCTTAGCC ATTCCCCTCA GAACCATAGC AGCAGCAATC TGATCATCCT 120TCTTCATAGT AGCAAACGCC GCAGCAGCAT CATTATCACC CGCACCCCCA ATAGCCGCGT 180CAATCGGATT TGTACGATCC GCAGCCTTCT TACCCTGCTT CTCACCACCA TCC 233(2)SEQ ID NO：5的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：194碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：未知
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：CCGTGCAAGC TGGGTTGAAG AAGGTTGGGG ATGTTGTTAA GAATAGTGAG GCAAAAGATG 60GTGATGCGGC GAGTGTTAAT GGGATTGCTA AGGGGATAAA GGGGATTGTT GATGCTGCTG 120AGAAGGCTGA TGCGAAGGAA GGGAAGTTGG TATGTGGCTG GTGCTGCTGG TGAAACTAAC 180AAGGAAGCGG CCGC 194(2)SEQ ID NO：6的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：369碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：未知
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：GCGGCCGCTT GAGGAAGCTG CAAGTGCTGC AAGTGCTGCT ACTGGTAATG CAGCGATTGG 60GGATGTTGTT AAGAATAGTG GGGCAGCAGC AAAAGGTGGT GAGGCGGCGA GTGTTAATGG 120GATTGCTAAG GGGATAAAGG GGATTGTTGA TGCTGCTGGA AAGGCTGATG CGAAGGAAGG 180GAAGTTGGAT GCTACTGGTG CTGAGGGTAC GACTAACGTG AATGCTGGGA AGTTGTTTGT 240GAAGAGGGCG GCTGATGATG GTGGTGATGC AGATGATGCT GGGAAGGCTG CTGCTGCGGT 300TGCTGCAAGT GCTGCTACTG GTAATGCAGC GATTGGAGAT GTTGTTAATG GTGATGTGGC 360AAAACAAAA 369(2)SEQ ID NO：7的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：142碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：未知
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：AAGGATGGTG ATGATAAGCA GGGTAAGAAG GCTGAGGATG CTACAAATCC GATTGACGCG 60GCTATTGGGG GTGCAGGTGC GGGTGCTAAT GCTGCTGCGG CGTTTAATAA TATGAAGAAG 120GATGATCAGA TTGAGCGGCC GC 142(2)SEQ ID NO：8的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：210碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：未知
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：GGTGAAACTA ACAAGGATGC TGGGAAGTTG TTTGTGAAGA AGAATGGTGA TGATGGTGGT 60GATGCAGGTG ATGCTGGGAA GGCTGCTGCT GCGGTTGCTG CTGTTAGTGG GGAGCAGATA 120TTAAAAGCGA TTGTTGATGC TGCTAAAGAT GGTGATAAGA CGGGGGTTAC TGATGTAAAG 180GATGCTACAA ATCCGATTGA CGCGGCTATT 210(2)SEQ ID NO：9的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：236碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：未知
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：TATATAATAA AGGCTGCTGC GAAGCTGCAA GTGCTGCAAG TGCTGCTACT GGTAGTGCAG 60CAATTGGGGA TGTTGTTAAT GGTAATGGAG CAACAGCAAA AGGTGGTGAT GCGAAGTGTT 120AATGGGATTG CTAAGGGGAT AAAGGGGATT GTTGATGCTG CTGAGAAGGC TGATGCGAAG 180GAAGGGAAGT TGGATGTGGC TGGTGATGCT GGTGAAACTA ACAAGGAAGC GGCCGC 236(2)SEQ ID NO：10的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：199碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：未知
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：ATGAGAGGAT CTCATCACCA TCACCATCAC ACGGATCCCC CGGGCTGCAG GAATTCGCGG 60CCGCTGAAGG CTGATGCGAA GGAAGGGAAG TTGGATGTGG CTGGTGCTGC TGGTGAAACT 120AACAAGGATG CTGGGAAGTT GTTTGTGAAG AAGAATAATG AGGGTGGTGA AGCAAATGAT 180GCTGGGAAGG CTGCTGCTG 199(2)SEQ ID NO：11的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：272碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：未知
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：GCCGCTGGAT GATCAGATTG CTGCTGCTAT GGTTGTGAGG GGAATGGCTA AGGATGGGCA 60GTTTGCTTTG AAGGATGATG CTGCTAAGGA TGGAGATAAA ACGGGGGTTG CTGCGGATGT 120GAAAATCCGA TTGACGCGGC TATTGGGGGT GCGGATGCTG ATGCTGCGGC GTTTAATAAG 180GAGGGGATGA AGAAGGATGA TCAGATTGCT GCTGCTATGG TTCTGAGGGG AATGGCTAAG 240GATGGGCAGT TTGCTTTGAC GAATAATGCT GC 272(2)SEQ ID NO：12的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：289碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：未知
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：ACTGTTAAGA ATGCTGTTGA TATAATAAAG GCTGCTGCGG AAGCTGCAAG TGCTGCAAGT 60GCTGCTACTG GTAGTGCAGC AATTGGGGAT GTTGTTAATG GTAATGGAGC AACAGCAAAA 120GGTGGTGATG CGAAGAGTGT TAATGGGATT GCTAAGGGGA TAAAGGGGAT TGTTGATGCT 180GCTGAGAAGG CTGATGCGAA GGAAGGGAAG TTGGATGTGG CTGGTGATGC TGGTGAAACT 240AACAAGGATG CTGGGAAGTT GTTTGTGAAG AACAATGGTA ATGAGGGTA 289(2)SEQ ID NO：13的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：142碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：未知
(ii)分子类型：cDNA
(ix)特征：
(A)名称/关键字：CDS
(B)位置：2..142
(ix)特征：
(A)名称/关键字：mat_肽
(B)位置：2
(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：G CCG CTT ACA AAT CCG ATT GAC GCG GCT ATT GGG GGG AGT GCG GAT 46Pro Leu Thr Asn Pro Ile Asp Ala Ala Ile Gly Gly Ser Ala Asp
1 5 10 15CGT AAT GCT GAG GCG TTT GAT AAG ATG AAG AAG GAT GAT CAG ATT GCT 94Arg Asn Ala Glu Ala Phe Asp Lys Met Lys Lys Asp Asp Gln Ile Ala
20 25 30GCT GCT ATG GTT CTG AGG GGA ATG GCT AAG GAT GGG CAG TTT GCT TTG 142Ala Ala Met Val Leu Arg Gly Met Ala Lys Asp Gly Gln Phe Ala Leu
35 40 45(2)SEQ ID NO：14的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：47氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：Pro Leu Thr Asn Pro Ile Asp Ala Ala Ile Gly Gly Ser Ala Asp Arg1 5 10 15Asn Ala Glu Ala Phe Asp Lys Met Lys Lys Asp Asp Gln Ile Ala Ala
20 25 30Ala Met Val Leu Arg Gly Met Ala Lys Asp Gly Gln Phe Ala Leu
35 40 45
PCT/RO/134表(1992年7月) PCT/RO/134表(1992年7月)
PCT/RO/134表(1992年7月) PCT/RO/134表(1992年7月) PCT/RO/134表(1992年7月) 
PCT/RO/134表(1992年7月)
Claims (65)
1.一种编码和天然伴随细胞物质分离的P39.5或其片段的核酸序列。
2.根据权利要求1所述的组合物，其ATCC保藏号为No.98478。
3.一种编码P39.5或其片段的核酸序列，它选自：
(a)SEQ ID NO：1；
(b)SEQ ID NO：3；
(c)SEQ ID NO：4；
(d)SEQ ID NO：5；
(e)SEQ ID NO：6；
(f)SEQ ID NO：7；
(g)SEQ ID NO：8；
(h)SEQ ID NO：9；
(i)SEQ ID NO：10；
(j)SEQ ID NO：11；
(k)SEQ ID NO：12；
(1)SEQ ID NO：13；
(m)在严谨条件下和(a)至(l)任一序列杂交的序列；
(n)(a)至(m)任一序列的等位基因变体；
(o)(a)至(m)任一序列的片段；
(p)(a)的缺失型突变体。
4.一种分离的P39.5蛋白，它由疏螺旋体属螺旋体体外表达，具有39,500道尔顿的相对分子量。
5.根据权利要求4所述的蛋白，它包含选自下列的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：2；
(b)SEQ ID NO：14；
(c)(a)或(b)的片段；
(d)(a)或(b)的类似物，其特征在于和SEQ ID NO：2或14的同源性至少为80％；和
(e)(a)或(b)的同源物，其特征在于和SEQ ID NO：2或14的同源性至少为80％。
6.一种重组蛋白，它选自：
(a)含有SEQ ID NO：2或14的氨基酸序列的蛋白质或其类似物、同源物或片段；
(b)一种融合蛋白，它包含SEQ ID NO：2或14的氨基酸序列，或其类似物、同源物或片段和第二蛋白融合；
(c)一种融合蛋白，它包含SEQ ID NO：2或14的氨基酸序列，其中加入了与SEQID NO：2或14相同性高达95％的片段；
(d)一种缺失蛋白，它包含其中缺失了一个或多个氨基酸SEQ ID NO：2或14的氨基酸序列。
7.一种载体，它包含在合适的调控序列控制下的编码P39.5或其片段的核酸序列。
8.一种用权利要求7所述的载体转化的宿主细胞。
9.一种重组表达P39.5基因或其片段的方法，该方法包括在允许该基因表达的条件下培养经P39.5核酸序列或其片段转化的重组宿主细胞的步骤。
10.一种重组表达P39.5蛋白或其多肽或肽片段的方法，该方法包括在允许所述蛋白或肽表达的条件下培养经编码所述蛋白或片段的核酸序列转化的重组宿主细胞的步骤。
11.根据权利要求10所述的方法，它还包括从所述细胞或细胞培养基分离所述表达蛋白的方法。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述P39.5蛋白是融合蛋白。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述P39.5蛋白是缺失突变型蛋白。
14.一种制备P39.5蛋白或其片段的方法，该方法包含化学合成所述蛋白或片段。
15.一种诊断试剂，该试剂包含选自下列的核酸序列：
(a)编码和天然伴随细胞物质分离的P39.5的核酸序列；
(b)SEQ ID NO：1或其互补序列；
(c)SEQ ID NO：3或其互补序列；
(d)SEQ ID NO：4或其互补序列；
(e)SEQ ID NO：5或其互补序列；
(f)SEQ ID NO：6或其互补序列；
(g)SEQ ID NO：7或其互补序列；
(h)SEQ ID NO：8或其互补序列；
(i)SEQ ID NO：9或其互补序列；
(j)SEQ ID NO：10或其互补序列；
(l)SEQ ID NO：11或其互补序列；
(m)SEQ ID NO：12或其互补序列；
(n)SEQ ID NO：13或其互补序列；
(o)在严谨条件下和(a)至(n)任一序列杂交的序列；
(p)(a)至(o)任一序列的等位基因变体；
(q)包含至少15个核苷酸长度的(a)至(o)任一序列的片段；
(r)(a)，(b)或(n)的缺失型突变体；和
(s)编码P39.5或其片段并与编码第二蛋白的序列融合的序列；
以及与所述序列相连的可检测标记。
16.一种分离的抗体，它针对P39.5或其片段。
17.根据权利要求16所述的抗体，它通过给予脊椎动物宿主选自P39.5、P7-1、P1-1、P3-1、P6-1、P9-1和P12-1的蛋白或片段而产生，所述抗体能通过依赖于抗体的补体介导的杀伤作用在体外杀死IP90螺旋体。
18.根据权利要求16所述的抗体，它通过用权利要求6所述的蛋白免疫接种所述宿主分离获得。
19.根据权利要求16所述的抗体，它选自嵌合抗体、人化抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。
20.一种抗体，它通过用疏螺旋体P39.5蛋白或其片段作为免疫吸附剂，亲和纯化JD1螺旋体感染猕猴所产生的抗血清分离获得。
21.一种对权利要求16所述的抗体有特异性的抗独特型抗体。
22.一种诊断性试剂，它包含权利要求16所述的抗体以及可检测的标记。
23.一种疫苗组合物，它包含有效量的P39.5蛋白、其融合蛋白或其片段以及药学上可接受的载体。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述片段选自P7-1、P1-1、P3-1、P6-1、P9-1和P12-1。
25.根据权利要求23所述的组合物，其中所述组合物包含至少一种其它B.burgdoferi抗原或其片段。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述其它抗原选自OspA、OspB、OspC、BmpA、BmpB、BmpC、BmpD及其片段或变体。
27.根据权利要求23所述的组合物，其中所述组合物包含具有与P39.5或其片段同源序列的至少一种其它蛋白或其片段。
28.根据权利要求23所述的组合物，它包含各个蛋白的混合物。
29.根据权利要求25所述的组合物，其中所述P39.5蛋白或片段以及所述其它抗原是融合蛋白形式。
30.一种对人或动物接种疫苗抵抗莱姆病的方法，该方法包括给予所述人或动物一种组合物，该组合物包含有效量的权利要求23所述的组合物。
31.一种诊断人或动物莱姆疏螺旋体病的方法，该方法包括下列步骤：将抗P7-1或抗39.5抗原或其同源物和待诊断的人或动物的生物学液体样品一起培育，其中在B.burgdorferi存在下形成抗原-抗体复合物，随后分析所述液体样品中所述复合物的存在。
32.一种用来治疗人或动物莱姆病的治疗性组合物，该组合物包含至少一种抗P39.5或抗P7-1抗体以及合适的药学载体。
33.一种治疗脊椎动物宿主莱姆病的方法，该方法包括给予有效量的权利要求32所述的组合物。
34.一种用于诊断人或动物感染B.burgdorferi的试剂盒，该试剂盒包含P39.5蛋白或其片段或权利要求16所述的抗P39.5抗体。
35.一种用于预防莱姆病的疫苗，该疫苗包含由螺旋体在脊椎动物宿主体内时表达的表面抗原。
36.一种鉴别特异性结合P39.5或其片段的化合物的方法，该方法包括下列步骤：使所述P39.5蛋白或片段和测试化合物接触，以使测试化合物与P39.5结合；和测定结合于P39.5的测试化合物的量。
37.一种用权利要求36所述的方法鉴定出的化合物。
38.一种核酸序列，它编码从天然伴随的细胞物质分离出来的以及选自1-1、3-1、6-1、9-1和12-1的疏螺旋体弹夹串的蛋白或其片段。
39.一种疏螺旋体弹夹串的蛋白或其片段，它与其天然伴随的细胞物质分离，并选自P1-1、P3-1、P6-1、P7-1、P9-1和P12-1。
40.一种载体，它包含在合适调控序列控制下的编码疏螺旋体弹夹串蛋白或其片段的核酸序列。
41.一种用权利要求40所述的载体转化的宿主细胞。
42.一种重组表达B.garinii弹夹串蛋白或其片段的方法，该方法包括在允许所述序列表达的条件下培养经B.garinii弹夹串核酸序列或其片段转化的重组宿主细胞的步骤。
43.一种重组表达B.garinii弹夹串蛋白或其肽片段的方法，该方法包括在允许所述蛋白或肽表达的条件下培养经编码所述蛋白或片段的核酸序列转化的重组宿主细胞的步骤。
44.根据权利要求43所述的方法，该方法还包括从所述细胞或所述细胞培养基分离所述表达的蛋白的步骤。
45.根据权利要求43所述的方法，其中所述疏螺旋体弹夹串蛋白或肽片段是融合蛋白或缺失突变型蛋白。
46.一种制备B.garinii弹夹串蛋白或肽片段的方法，该方法包括用化学方法合成所述蛋白或片段。
47.一种分离的抗B.garinii弹夹串蛋白的抗体。
48.根据权利要求47所述的抗体，它通过给予脊椎动物宿主B.garinii弹夹串蛋白或片段来产生。
49.根据权利要求48所述的抗体，它通过用疏螺旋体弹夹串蛋白作为免疫吸附剂亲和纯化JD1螺旋体感染猕猴产生的抗血清分离获得。
50.根据权利要求47所述的抗体，它通过用权利要求39所述的蛋白或所述弹夹串蛋白的混合物免疫接种所述宿主来分离获得。
51.根据权利要求47所述的抗体，它选自嵌合抗体、人化抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。
52.一种对权利要求47所述的抗体有特异性的抗独特型抗体。
53.一种诊断性试剂，它包含权利要求47所述的抗体以及可检测标记。
54.一种疫苗组合物，它包含有效量的至少一种疏螺旋体弹夹串蛋白、融合蛋白或其片段和药学上可接受的载体。
55.根据权利要求54所述的组合物，它包含不同疏螺旋体弹夹串蛋白或片段的混合物。
56.根据权利要求54所述的组合物，它包含至少一种其它的B.burgdorferi抗原或其片段。
57.根据权利要求56所述的组合物，其中所述其它抗原选自OspA、OspB、OspC、BmpA、BmpB、BmpC、BmpD及其片段或变体。
58.根据权利要求54所述的组合物，该组合物包含P39.5或具有与P39.5同源的序列的至少一种其它蛋白或其片段。
59.一种对人或动物接种疫苗抵抗莱姆病的方法，该方法包括给予所述人或动物一种组合物，该组合物包含有效量的权利要求54所述的组合物。
60.一种诊断人或动物莱姆疏螺旋体病的方法，该方法包括下列步骤：将抗疏螺旋体弹夹串蛋白的抗体和待诊断的人或动物的生物学液体样品一起培育，其中在B.burgdorferi存在下形成抗原-抗体复合物，随后分析所述液体样品中所述复合物的存在。
61.一种用来治疗人或动物莱姆病的治疗性组合物，该组合物包含至少一种疏螺旋体弹夹串蛋白的抗体或其片段的抗体，以及合适的药学载体。
62.一种治疗脊椎动物宿主莱姆病的方法，该方法包括给予有效量的权利要求61所述的组合物。
63.一种用于诊断人或动物感染B.burgdorfei的试剂盒，该试剂盒包含疏螺旋体弹夹串蛋白或其片段或针对它们的抗体。
64.一种鉴定特异性结合疏螺旋体弹夹串蛋白或其片段的化合物的方法，该方法包括下列步骤：使所述蛋白或片段和测试化合物接触，以使测试化合物与所述弹夹串蛋白或片段结合；和测定结合于所述蛋白或片段的测试化合物的量。
65.一种用权利要求64所述的方法鉴定的化合物。
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