CN113999896B - 一种通用发夹引物及在检测microRNA中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种通用发夹引物，发夹结构的3’端连接有2‑6个碱基的随机序列，可有效结合各种DNA或RNA模板。本发明还提供了一种检测microRNA的方法，将通用发夹引物或者通用发夹引物组合物，作为microRNA特异性发夹引物的替代物，结合microRNA模板，启动逆转录反应，获得的cDNA模板由microRNA特异性正向引物和与部分茎环序列相同的通用反向引物扩增待测microRNA。本发明避免了针对待检测microRNA需要设计特异性发夹引物的问题，检测范围大，检测效率高，对于密切相关的microRNA家族成员的检测也具有高灵敏度和特异性；本发明简单方便，大大降低了引物设计成本，缩短了检测周期，并且节省RNA模板，通量高，适合各实验室推广应用。

Description

一种通用发夹引物及在检测microRNA中的应用

技术领域：

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种通用发夹引物，基于该通用发夹引物的组合物，基于该引物检测microRNA的方法和该引物的应用。

技术背景：

microRNA（microRNAs）是单链、约22个核苷酸（nt）的非编码RNA，是许多关键细胞过程的重要调节因子，包括凋亡、增殖或分化，microRNAs的失调可能导致人类疾病的发展，如癌症和其他慢性和代谢性疾病。鉴于microRNA在不同细胞和组织中的表达水平存在显著差异，准确的microRNA定量对于评估microRNA的生物学功能和可能的致病作用至关重要。

microRNA检测方法可分为以下几类：1）常规技术，如Northern印迹、微阵列、原位杂交和定量逆转录（RT）PCR（RT-qPCR）；2）生物传感器技术，如基于电化学的检测、基于光学的检测和基于纳米管的技术；3）其他新兴技术，包括下一代测序（NGS）和核酸扩增技术，如滚环扩增（RCA）、基于双链特异核酸酶（DSN）的扩增、环介导等温扩增（LAMP）、指数扩增反应（EXPAR）和链置换扩增（SDA）。尽管有许多microRNA定量技术可用，但对12个商业平台的分析显示，平台内和/或平台间的重复性、敏感性、准确性、特异性和一致性存在很大差异。

定量-逆转录PCR（quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR）是目前检测低表达水平microRNA的主要方法之一。该方法首先将microRNA逆转录成相应的cDNA，然后以cDNA为模板进行定量PCR（quantitative transcription PCR, qPCR），实时检测扩增产物的数量，间接实现microRNA的定量分析。qRT-PCR具有灵敏度高、特异性强、简便快速、成本低等突出优点，常用于microRNA表达谱分析以及Northern blotting和微列阵法等其他方法检测结果的进一步验证和确认。由于成熟microRNA序列短，缺少poly（A）尾，以及在microRNA样品制备过程中易夹杂少许pri-microRNA或pre-microRNA等，导致传统的qRT-PCR检测法无法满足microRNA定量分析的需求。为解决这些问题，传统RT-PCR方法被进行了多方面的升级改造：茎环引物RT-PCR、引物延伸RT-PCR、poly（A）加尾RT-PCR和探针法RT-PCR等。

茎环引物RT-PCR中的茎环引物的序列一般由3个功能部分组成，即与microRNA的3’端互补的单链部分、双链部分（茎）和通用引物结合序列的环结构部分。茎环引物有6个核苷酸（nt）与microRNA互补，结合的特异性强，一旦MsHP对靶向microRNA进行退火，进行逆转录反应，并将所得cDNA产物用作实时定量PCR的模板。使用与成熟microRNA匹配的正向引物和与发夹或茎环结构的3'端互补的反向引物进行分析。现有技术中茎环引物设计难度相对较大，茎环单链环状区较长，具有一个十几至几十nt，形成的条件较为苛刻，引物制作和检测费用高，茎环引物RT-PCR所需RNA样品用量大，检测时间长，效率低，无法实现高通量检测。

有报道在茎环引物的3′端引入八个简并碱基，采用该“通用茎环引物”进行逆转录，发现八聚体茎环引物对microRNA检测的灵敏度明显低于miRNA特异性发夹引物（YangLH et al. Universal stem-loop primer method for screening and quantificationof microRNA. PLoS One. 2014; 9, e115293）。专利201711433279.2公开了一种用于miRNA定量的改进型通用茎环引物及其定量方法，在之前报道的通用型茎环引物基础上改变了茎环结构的序列，提供了一种具有八个简并碱基的茎环引物，但未与miRNA特异性发夹引物进行比较，无法评估该方法对microRNA真实表达水平的检测效果。

发明内容：

为了解决检测microRNA的现有技术中茎环引物需要针对待检测的microRNA设计特异性发夹引物、费时费力、成本效率低，以及通用茎环引物检测效率低的问题，本发明提供了一种通用发夹引物及在检测microRNA中的应用。

本发明的目的是通过以下措施实现的：本发明提供的通用发夹引物（universalhairpin primer, UHP），包含从5’到3’依次的成发夹序列、环序列、互补发夹序列，其特征在于：互补发夹序列的3’端连接有2-6个随机碱基序列。所述随机碱基序列可以为（A/C/G/T）（A/C/G/T）或（A/C/G/T）（A/C/G/T）（A/C/G/T）或（A/C/G/T）（A/C/G/T）（A/C/G/T）（A/C/G/T）或（A/C/G/T）（A/C/G/T）（A/C/G/T）（A/C/G/T）（A/C/G/T）或（A/C/G/T）（A/C/G/T）（A/C/G/T）（A/C/G/T）（A/C/G/T）（A/C/G/T），所述随机碱基序列用于与DNA或RNA模板结合，所述模板包括但不限于基因组DNA、cDNA、质粒DNA、mRNA、microRNA、LncRNA、CircRNA。3’端连接2个、3个、4个、5个、6个随机碱基序列的通用发夹引物分别命名为UHP2、UHP3、UHP4、UHP5、UHP6。

优选的，上述通用发夹引物，从5’到3’依次的成发夹序列、环序列、互补发夹序列，为SEQ No.1。

优选的，上述通用发夹引物为包含至少两种UHP的通用发夹引物组合物组合物。

优选的，上述通用发夹引物组合物为UHP2：UHP4：UHP6以摩尔比8：1：1混合。

本发明还提供了上述通用发夹引物或通用发夹引物组合物在检测microRNA中的应用。

本发明还提供了一种检测microRNA的方法，包含以下步骤：

一种检测microRNA的方法，包含以下步骤：

步骤1，获得RNA模板：细胞中提取总RNA，纯化获得<200nt的小RNA，进行定量及纯度检测；

步骤2，获得RNA/通用发夹引物混合物：将总RNA与上述通用发夹引物混合于ddH₂O中，或者，将纯化小RNA 与上述通用发夹引物混合于ddH₂O中，或者，将总RNA与上述通用发夹引物组合物混合于ddH₂O中，或者，将纯化小RNA与上述通用发夹引物组合物混合于ddH₂O中，并在70°C下退火5分钟，在冰上冷却；

步骤3，逆转录RNA：在RNA/通用发夹引物混合物中添加 RNase抑制剂，10× RT缓冲液，dNTPs， 逆转录酶；反应条件：25°C×10'，37°C×30'；将逆转录产物稀释3-5倍，作为定量PCR模板，-80°C备用。

步骤4，在2×荧光定量PCR反应液中加入步骤3所述定量PCR模板，microRNA qPCR正向引物及通用反向引物，补充不含RNase的ddH₂O；反应条件： 95°C×3'；95°C×20''，66°C×10''，每循环降低3°C，持续4个循环；95°C×20''，55°C×10''，70°C×1''，进行荧光读数，持续40个循环；获得循环定量（Quantification cycle, Cq）值。

步骤5，采用2-ΔΔCt法计算microRNA的表达倍数。

优选的，上述用于microRNA扩增的正向引物的序列与待测microRNA互补，且3‘端添加AGCC。

优选的，上述通用发夹引物含有SEQ No1时，用于microRNA扩增的反向引物的序列为SEQ No2：5’-GTGCAGGGTCCGAGGTATTCG-3’，与SEQ No1部分序列相同。

本发明还提供了一种包含上述通用发夹引物的RNA检测试剂盒。

本发明还提供了一种包含上述通用发夹引物的microRNA检测试剂盒。

有益效果：

1. 本发明提供了一种通用发夹引物，发夹结构的3’端连接有2-6个碱基的随机序列，两种及以上的通用发夹引物混合获得通用发夹引物组合物，可有效结合各种DNA或RNA模板；

2. 本发明还提供了上述通用发夹引物或通用发夹引物组合物在检测microRNA中的应用，将通用发夹引物或通用发夹引物组合物结合microRNA，可同时结合多个microRNA，启动逆转录反应，缩短实验时间，降低实验难度；

3. 本发明提供了一组由microRNA特异性正向引物和与部分茎环序列相同的通用反向引物组成的microRNA qPCR引物对，提供了合理的动态检测范围，扩增效率高；microRNA特异性正向引物添加AGCC，增加反应 qPCR的退火温度，提高特定microRNA序列检测的特异性；

4. 本发明提供了一种检测microRNA的方法，将通用发夹引物UHP作为microRNA特异性发夹引物的最佳替代物，启动用于microRNA检测的逆转录反应方面有效且特异，该方法简单方便，成本低，效果好，通量高，节省RNA模板，适合各实验室推广应用，避免了传统方法需要针对待检测microRNA设计特异性发夹引物的缺点，减少了引物制作成本和检测费用，且该方法对于密切相关的microRNA家族成员的检测具有较好的灵敏度和特异性；

5. 本发明可用于各种DNA和RNA的检测，在医药、林农业、食品、环境等领域有广泛的应用前景。

说明书附图：

图1 、通用发夹引物系统示意图 （A microRNA特异性发夹引物及通用发夹引物；B. 发夹引物检测microRNA流程图）

图2 、RNA纯化

图3、与MsHPs相比，通用发夹引物对于microRNA检测的敏感性和特异性（A. 扩增曲线；B 溶解曲线）

图4、 MsHPs与四种通用发夹引物对14种microRNA检测的Cq值、聚类分析及风琴图

图5 、总RNA和纯化小RNA作为模板检测microRNA的Cq值及相关系数（ΔCq=以总RNA为模板的Cq值-以纯化小RNA 为模板的Cq值）

图6 、不同通用发夹引物组合物检测microRNA的Cq值和聚类分析（ΔCq=平均Cq值（MsHP）- 平均Cq值（Mix））

图7 、针对microRNA LET-7家族的microRNA检测的Cq值和扩增曲线（LET7specific：LET7各成员的特异性发夹引物；LET-7 FSP：LET7各成员的特异性发夹引物混合物；OUHP：优化通用发夹引物）

具体实施方式：

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

实施例1. 一种基于通用发夹引物检测microRNA的方法，步骤如下。

1）细胞培养：将待测细胞分别培养于含有10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100µg/ml链霉素的DMEM或F12等常规细胞培养基中，放置于37°C，5%CO₂培养箱中，培养至细胞融合度90%以上。按实验要求给予不同的处理，实验终点进行检测。

2）总RNA分离和小RNA纯化：使用NucleoZOL RNA分离试剂盒（Takara Bio）从指数生长的各组待测细胞中分离总RNA。将5µg总RNA溶解于20µl无核糖核酸酶的ddH2O中，并与20µl Mag Bind®TotalPure NGS磁珠（Omega Bio-tek）结合，RNA:珠的体积/体积比为1:1）混合。RNA/磁珠混合物在室温下孵育10分钟。将混合物置于磁铁中，收集含有小RNA（<200nt）的上清液，丢弃大转录本（>200nt）与珠子结合的沉淀物。收集的小RNA进行PC8苯酚/氯仿萃取，然后进行乙醇沉淀。回收的小RNA溶解在20µl无RNase的ddH2O中进行逆转录反应，或于-80°C保存。

3）总RNA及纯化小RNA的特性和定量：将与磁珠结合的小RNA回收后，对其进行评估，将纯化小RNA或总RNA样品（各1.0µl）加载到RNA纳米芯片上（Agilent 2100Bioanalyzer，Santa Clara），对芯片进行凝胶电泳，RNA样本的完整性好，呈现清晰的三条带，而纯化小RNA聚集于200nt以下（图2）。

4）发夹引物合成：设计通用发夹引物（universal hairpin primer, UHP），序列为SEQ No1，在其3’端连接2个或3个或4个或6个随机碱基序列，以上通用发夹引物分别命名为UHP2、UHP3、UHP4、UHP6；另合成14个microRNA特异性发夹引物（MicroRNA specifichairpin primers, MsHPs），通过在SEQ No1的3’端加入与相应microRNA反向互补的序列获得。

5）使用发夹引物进行逆转录反应：将14个MsHP和4个UHP（前述UHP2、UHP3、UHP4、UHP6）分别以1.0µg/µl的浓度溶解在无RNase的ddH2O中。将14种MsHP各10µl混合获得MsHP池（MsHPs），四种UHP中至少两种按10µl混合获得不同UHP组合物（UHPs）。将RNA（溶于10µlddH2O中的1µg总RNA或0.1µg纯化sRNA）与发夹引物（2.0µgMsHP池或UHP2或UHP3或UHP4或UHP6或不同UHPs组合物）混合，70℃，退火5分钟获得RNA/发夹引物混合物。在冰上冷却后，每种RNA/发夹引物混合物添加0.5µl RNase抑制剂（New England Biolabs, 或NEB），2µl10×RT缓冲液（NEB），2µl 10mM dNTPs，0.5µl M-MuLV逆转录酶（NEB）和3µl无RNase的ddH₂O。反应条件：25°C×10'；37°C×30'。向RT产品中添加80µl ddH₂O，作为进一步稀释的qPCR模板，-80°C备用。

6）实时定量PCR（qPCR）检测microRNA：合成特异性扩增14个成熟microRNA的正向引物，正向引物与成熟microRNA的17nt序列相同，并在5’端添加AGCC序列，用于增高退火温度，检测特异性更高。与通用发夹引物SEQ1的部分碱基序列相同的SEQ2序列（5'-GTGCAGGGTCCGAGGTATTCG-3'），作为microRNA-qPCR的通用反向引物。

7）在10µl 2×qPCR反应体系 （Forget-Me-Not™ EvaGreen qPCR Master Mix,Biotium, Fremont, CA）中加入3µl qPCR模板 ，2µl正向引物、2µl反向引物 和3µl无RNase的ddH₂O。在CFX Connect PCR反应仪（Bio-Rad）中进行降落PCR反应，循环程序如下：95°C×3'为一个循环；95°C×20''，66°C×10''，每循环降低3°C，持续4个循环；95°C×20''，55°C×10''，70°C×1''，进行荧光读数，持续40个循环，获得每个检测孔的Cq值。

8）采用2-^ΔΔCt法计算microRNA在不同处理组相对于对照组的表达倍数。

实施例2. 不同通用发夹引物检测microRNA的有效性评估

待测细胞采用人胚肾HEK-293细胞、人骨肉瘤143B细胞和人黑色素瘤A375。按实施例1的步骤获得qPCR模板，将模板进行五倍系列稀释以确定每个qPCR引物对的扩增效率。未使用模板对照（NTC）作为阴性对照。为了定量评估与microRNA特异性发夹引物（MsHP）组的Cq偏差，UHP组的ΔCq=平均Cq（MsHP）- 平均Cq（UHP）。所有的qPCR反应设置3复孔，并进行三个独立批次的实验。

数据分析：限制性极大似然法拟合线性混合效应模型，与MsHP产生的Cq值进行比较，以确定最合适的UHP。采用非参数Kruskal-Wallis检验，并使用Wilcoxon秩和精确检验进行两两比较，以评估各MsHP组与四种UHP的Cq值之间是否有统计学差异。线性回归和相关系数分析用于评估核糖体RNA和长转录本RNA对microRNA定量的影响。

来源于MsHPs和四种UHP的RT产物，均以模板浓度依赖的方式显示了适当的microRNA扩增曲线，扩增效率高，与MsHP组相比，UHP2组的扩增曲线右移，而UHP6组的扩增曲线左移（见图3中A部分）。由microRNA特异性正向引物和来自发夹结构的通过反向引物组成的microRNA qPCR引物对提供了合理的动态检测范围，溶解曲线为单峰，microRNA检测特异性好（见图3中B部分）。因此，四种UHP在启动用于microRNA定量的RT反应方面具有高灵敏度和特异性。

对于来源于MsHPs和四种UHP的RT产物，14种microRNA中有5种显示出相对接近于各自MsHPs的Cq值，包括HSAMIR-122-5p、HSAMIR-192-3p、HSAMIR-221-5p、HSAMIR-4425和HSAMIR-1268A，其余九个microRNA的Cq值与相应的MsHPs的Cq值存在统计学差异，UHP2组的Cq值高于相应MsHPs的Cq值，UHP6组的Cq值低于相应MsHPs的Cq值，而UHP4组的Cq值最接近相应MsHPs的Cq值，代表了待测microRNA的实际表达水平（见图4）。

总RNA 和纯化小RNA作为RT模板的两个组间，各microRNA的Cq值无统计学差异，因此，核糖体RNA和长转录本RNA的存在不会影响基于UHP检测方法中microRNA表达的qPCR定量结果（见图5）。

基于通用发夹引物检测microRNA的方法较特异性microRNA发夹引物更加方便，有效，具有成本效益高，高通量检测的优势；其中，简并的四聚体UHP4在microRNA鉴定中很好地再现了MsHP池对于特异性microRNA的检测结果。

实施例3. UHP组合物的优选方案：

将UHP2、UHP4和/或UHP6以不同摩尔百分比组成混合，获得15种UHP组合物，即Mix1到Mix15（见表1）。基于以上15种UHPs组合物进行microRNA检测，获得14个microRNA的各Cq值，并将其与相应MsHP的Cq值进行比较。

表1. 15种UHP组合物中各组分的摩尔百分比

对4个受测microRNA的Cq值的热图聚类分析显示，Mix3与MsHP聚集在一起，而Mix4和Mix12与UHP4紧密聚集在一起。在所有15个组中，Mix3组相对于MsHPs组的偏差最小，而包括UHP4在内的大多数其他组倾向于Cq值较MsHPs组降低，即高估microRNA表达水平。通过箱线图分析显示Mix3和UHP4之间的Cq值有统计学差异（见图6），表明Mix3（UHP2:UHP4:UHP6=8:1:1）比UHP4更理想，是一种优化通用发夹引物（optimized universal hairpin primer,OUHP），可以作为MsHP定量检测microRNA的最佳替代物。

实施例4. 基于OUHP的microRNA检测灵敏度和特异性

OUHP引物检测microRNA LET7家族中8个成员的表达，与LET7各成员的特异性发夹引物（LET7 specific）及其混合物（LET-7 FSP）相比，具有类似的检测效率。OUHP引物检测成熟的LET7d和LET7i，Cq值在21-33之间，具有广泛的动态范围。LET7E、LET7G和LET7I的qPCR引物对在检测各自的microRNA成员具有特异性（见图7，表2）。基于OUHP的microRNA检测方法，对于密切相关的microRNA家族成员的检测具有较好的灵敏度和特异性。

表2 LET7E、LET7G和LET7I引物对检测8个LET7家族成员的相对表达量

序列表

<110> 重庆医科大学附属儿童医院

<120> 一种通用发夹引物及在检测microRNA中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial(人工序列)

<400> 1

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgac 44

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial(人工序列)

<400> 2

gtgcagggtc cgaggtattc g 21

Claims (6)

1.一种通用发夹引物组合物，通用发夹引物包含从5’到3’依次的成发夹序列、环序列、互补发夹序列，所述从5’到3’依次的成发夹序列、环序列、互补发夹序列为SEQ ID No1，其中互补发夹序列的3’端连接有2个、4个和6个随机碱基序列，随机碱基序列用于与模板结合，其特征在于：所述组合物由互补发夹序列的3’端分别连接有2个、4个和6个随机碱基序列的三种通用发夹引物组成, 其摩尔比为8：1：1。

2. 如权利要求1 所述通用发夹引物组合物在检测microRNA中的应用，包含以下步骤：

步骤1，获得RNA模板：细胞中提取总RNA，纯化获得<200nt的小RNA，进行定量及纯度检测；

步骤2，获得RNA/通用发夹引物混合物：将总RNA或纯化小RNA与权利要求1所述通用发夹引物组合物混合于ddH₂O中，并在70°C下退火5分钟，在冰上冷却；

步骤3，逆转录RNA：在RNA/通用发夹引物混合物中添加 RNase抑制剂、10×反应缓冲液、dNTPs、逆转录酶、补充不含RNase的ddH₂O；反应条件：25°C×10'，37°C×30'；将逆转录产物稀释3-5倍，作为定量PCR模板，-80°C备用；

步骤4，在荧光定量PCR反应液中加入步骤3所述定量PCR模板，microRNA qPCR正向引物及通用反向引物，补充不含RNase的ddH₂O；反应条件：95°C×3'；95°C×20''，66°C×10''，每循环降低3°C，持续4个循环；95°C×20''，55°C×10''，70°C×1''，进行荧光读数，持续40个循环；获得Cq值；

步骤5，采用2^-ΔΔCt法计算microRNA的表达倍数；所述应用为非疾病诊断目的。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述microRNA qPCR正向引物序列与待测microRNA序列相同，且5’端添加AGCC。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述microRNA qPCR通用反向引物的序列，与权利要求1所述通用发夹引物中的17-25个碱基序列相同。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述microRNA qPCR通用反向引物的序列为SEQ ID No2。

6. 一种microRNA检测试剂盒，其特征在于：包含权利要求1 所述的通用发夹引物组合物。