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CN113933364B - 一种基于硅纳米线场效应生化传感器的靶标物浓度检测方法 - Google Patents

一种基于硅纳米线场效应生化传感器的靶标物浓度检测方法 Download PDF

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CN113933364B CN202111031603.4A CN202111031603A CN113933364B CN 113933364 B CN113933364 B CN 113933364B CN 202111031603 A CN202111031603 A CN 202111031603A CN 113933364 B CN113933364 B CN 113933364B
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Abstract

本发明公开了一种基于硅纳米线场效应生化传感器的靶标物浓度检测方法，包括制备免疫磁珠‑靶标物‑免疫硅纳米颗粒；修饰硅纳米线场效应生化传感器，用于识别不同的所述三层结构催化所述pH酶的底物发生催化反应所产生的pH变化；使免疫磁珠‑靶标物‑免疫硅纳米颗粒与pH酶的底物发生催化反应，以改变待测溶液的pH；将待测溶液进行磁性分离，取上清液在硅纳米线场效应生化传感器上进行pH检测，根据浓度与pH的标准曲线，得到靶标物的浓度。本发明将靶标物浓度转化为pH变化，利用硅纳米线场效应生化传感器对该pH变化进行检测，根据其电流变化量，能够实现靶标物的定性与定量测定，简单稳定，灵敏度高，检测准确性好，通用性强。

Description

一种基于硅纳米线场效应生化传感器的靶标物浓度检测方法
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及一种基于硅纳米线场效应生化传感器的靶标物浓度检测方法。
背景技术
在生命系统检测中，对生物分子灵敏度高、特异性强的快速检测一直是生物医学检测的目标；现有的生物检测分析方法如聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)、酶联免疫吸附法(ELISA)、微生物培养等，经过长时间的发展已经建立起成熟的检测技术，并在医学、食品、环境、生化等领域样品分析与检测中应用广泛。
但是，现有生物检测方法存在检测对象单一、检测周期长、仪器设备复杂、操作人员专业技术要求高、检测成本高或检测结果出现假阳性等缺点；在测定DNA、蛋白质等生物分子浓度时，通常需要复杂的人工操作和人工计算才能得到其浓度，整个过程耗时长，成本高，还需要复杂的修饰过程，并且有的测定方法还易受平行物质的干扰等。
为了解决上述问题，各类型传感器应运而生，例如利用生化分子自发或激发产出光信号的光学传感器，该类传感器的光信号不可重复检出、易猝灭和复杂的处理后端限制了这类传感器的大范围应用；而电化学传感器利用检出目标本身较弱的氧化还原反应，很难具备高灵敏度，借助酶的催化过程又限制了电极的工作环境，同时增加了复杂的修饰过程；场效应传感器具有检出电路简单、信号直接读取、无需放大、无标记、信号损失小等优点，但针对不同的目标物均需要探索对应的修饰和检测流程，无法实现通用性的修饰和检测方法。
因此，需要一种基于硅纳米线场效应生化传感器的靶标物浓度检测方法，提高场效应传感器检出的稳定性，简化修饰和测试过程，使得检测简单方便，同时提升通用性。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种基于硅纳米线场效应生化传感器的靶标物浓度检测方法，能够提高场效应传感器检出的稳定性，简化修饰和测试过程，使得检测简单方便，提升通用性。所述技术方案如下：
本发明提供了一种基于硅纳米线场效应生化传感器的靶标物浓度检测方法，包括：
制备免疫硅纳米颗粒：通过共价修饰试剂，同时将探针一和pH酶的混合液共价修饰到二氧化硅纳米颗粒上，得到所述免疫硅纳米颗粒；所述探针一包括能够识别靶标物的抗体或核酸适配体；
制备免疫磁珠：将配对探针二与磁珠孵育，得到所述免疫磁珠；
制备免疫磁珠-靶标物-免疫硅纳米颗粒：将所述免疫硅纳米颗粒、所述免疫磁珠与靶标物结合，形成免疫磁珠-靶标物-免疫硅纳米颗粒的三层结构；
修饰硅纳米线场效应生化传感器：在所述硅纳米线场效应生化传感器表面修饰上羟基基团，于基团修饰液中进行基团修饰，清洗后吹干备用；修饰后的所述硅纳米线场效应生化传感器用于识别不同的所述三层结构催化所述pH酶的底物发生催化反应所产生的pH变化；
pH催化：所述免疫磁珠-靶标物-免疫硅纳米颗粒与所述pH酶的底物发生催化反应，以改变待测溶液的pH；
pH检测：将所述待测溶液进行磁性分离，取上清液在所述硅纳米线场效应生化传感器上进行pH检测，根据浓度与pH的标准曲线，得到所述靶标物的浓度。
进一步地，所述制备免疫硅纳米颗粒包括：
采用缓冲液清洗经过化学基团修饰的所述二氧化硅纳米颗粒；
离心，将所述二氧化硅纳米颗粒重悬于所述缓冲液中；
加入K2CO3溶液，调节所述缓冲液pH值为5～9；
加入蛋白质交联剂摇晃孵育；
加入所述pH酶的溶液与所述探针一摇晃偶联；
加入乙醇胺与BSA分别进行封闭，得到所述免疫硅纳米颗粒。
优选地，所述二氧化硅纳米颗粒为氨基二氧化硅纳米颗粒或羧基二氧化硅纳米颗粒。
优选地，所述共价修饰试剂为具有至少两个针对特殊基团的反应性末端的小分子化合物；所述共价修饰试剂至少为戊二醛、NHS和马来酰亚胺中的一种。
优选地，所述pH酶的溶液为与所述pH酶的底物产生pH变化的化合物；
所述pH酶的溶液为脲酶、酯酶、青霉素酶或有机磷水解酶；
与所述pH酶的溶液对应的所述pH酶的底物为尿素溶液、低级脂肪酸酯溶液、青霉素溶液或有机磷水解酶。
进一步地，所述制备免疫磁珠包括：
在经过化学基团修饰的所述磁珠中加入所述配对探针二进行孵育；
修饰完成后依次进行清洗与磁性分离，获得所述免疫磁珠。
优选地，所述磁珠至少包括氨基磁珠、羧基磁珠、链酶亲和素磁珠和羟基磁珠中的一种。
进一步地，所述免疫磁珠-靶标物-免疫硅纳米颗粒与所述磁珠或者所述二氧化硅纳米颗粒的连接方式为共价键连接；
所述pH酶与所述磁珠或者所述二氧化硅纳米颗粒的连接方式为共价键连接。
优选地，所述基团修饰液为3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液(APTES)或邻羧基苯乙酸，所述基团修饰液对应修饰的基团为氨基或羧基。
优选地，所述方法还用于检测生物物质，所述生物物质包括离子、小分子、蛋白、核酸、激素、细胞、真菌、细菌和病毒。
实施本发明，具有如下有益效果：
1、本发明将靶标物浓度转化为pH变化，利用硅纳米线场效应生化传感器对该pH变化进行检测，根据其电流变化量，能够实现靶标物的定性与定量测定，灵敏度高，检测准确性好；并且，本发明能够在硅纳米线场效应生化传感器表面直接修饰上羟基基团，大大简化修饰过程，提升场效应传感器检出的稳定性。
2、在磁珠与硅纳米粒子功能化的过程中，所修饰的偶联物与脲酶均通过共价键与磁珠或硅纳米粒子连接，相较于静电吸附的连接方式，共价键连接方式的功能化磁珠与功能化硅纳米粒子更加稳定，从而使检测结果更加可靠。
3、采用能够识别靶标物的探针，特异性强，灵敏度高，检测快速稳定；同时，不同的探针能够特异性识别不同靶标物，只需要在磁珠与硅纳米粒子功能化过程中将抗体或偶联物更换，即可实现不同抗原或分子的检测，通用性高，应用范围广泛。
4、免疫磁珠-靶标物-免疫硅纳米颗粒的三层结构体系简化了场效应传感器接触的溶液成分，能够实现检测血清、尿液、粪便甚至更复杂的环境污水等样本中的目标物，进一步使利用硅纳米线场效应生化传感器的检测方法成为一种生物分子简单、通用性强的检测技术。
5、本发明的硅纳米线场效应生化传感器体积小、成本低廉、检测快速，无需依赖大型仪器，即可快速实现定性与定量检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例中所使用的附图作简单的介绍，其中相同的零部件用相同的附图标记表示。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它附图。
图1为本发明提供的一种基于硅纳米线场效应生化传感器的靶标物浓度检测方法的原理示意图；
图2为本发明提供的一种基于硅纳米线场效应生化传感器的靶标物浓度检测方法的逻辑结构图；
图3为本发明的一个实施例中DNA目标浓度与传感器电流变化量之间的关系示意图；
图4为本发明的一个实施例中尿素催化时间对pH变化量的影响示意图；
图5为偶联pH酶的硅纳米线场效应生化传感器的特异性检测结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例，因此不能理解为对本发明的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便本发明的实施例能够以除了下述图示或下述描述以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或服务器不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
实施例1
本发明提供一种基于硅纳米线场效应生化传感器的靶标物浓度检测方法，能够用于检测多种靶标物的浓度，还可以用于检测离子、小分子、蛋白、核酸、激素、细胞、真菌、细菌和病毒等多种特定生物物质，适用范围广泛；如说明书附图1所示，该方法利用了硅纳米线场效应生化传感器作为信号识别单元，利用磁珠、二氧化硅纳米颗粒和靶标物形成偶联物免疫磁珠-靶标物-免疫硅纳米颗粒，组成捕获-洗脱-催化的信号产生单元，使其产生的信号能够被硅纳米线场效应生化传感器识别，并输出为电流变化量，通过电流变化量与浓度之间的关系，能够实现靶标物的定性与定量，检测效率高，灵敏度好；并且，其中作为信号识别单元的还可以包括pH酶催化后的底物，使得硅纳米线场效应生化传感器能够识别不同的靶标物形成的三层结构催化pH酶底物所产生的pH变化，也即是将靶标物浓度转化为pH变化，根据输出的电流变化量与pH变化之间的关系，进一步获得浓度的定量检测结果，保证高灵敏度，以及硅纳米线场效应生化传感器检出的稳定性。
下面对本发明实施例的技术方案进行详细介绍，参考说明书附图1-2，该方法包括：
S1，制备免疫硅纳米颗粒：通过共价修饰试剂，同时将探针一和pH酶的混合液共价修饰到二氧化硅纳米颗粒上，得到所述免疫硅纳米颗粒；所述探针一包括能够识别靶标物的抗体或核酸适配体。
具体地，在该步骤中，首先需要将二氧化硅纳米颗粒进行化学基团修饰，之后用缓冲液进行清洗，离心，使得二氧化硅纳米颗粒重悬于缓冲液中；再加入K2CO3溶液，调节具有二氧化硅纳米颗粒的缓冲液pH值为5～9；之后加入蛋白质交联剂进行摇晃孵育，并在反应完成后，进一步利用缓冲液进行清洗，离心；然后，加入pH酶的溶液与探针一(即能够识别靶标物的抗体或核酸适配体)摇晃偶联，在反应完成后，同样利用缓冲液进行清洗，并在清洗后离心；最后，加入乙醇胺与BSA分别进行封闭，封闭完成后，继续用缓冲液清洗离心，保证重悬于缓冲液中，得到所需要的免疫硅纳米颗粒。
优选地，在本说明书的一个可能的实施方式中，二氧化硅纳米颗粒的粒径小于50nm，而上述K2CO3溶液的浓度可选为0.1～0.8M，乙醇胺溶液的浓度可选为10～90mM，BSA溶液的浓度可选为1％～10％。
优选地，在本说明书的一个可能的实施方式中，S1～S5步骤均可以在室温下进行，而在S1步骤中，进行孵育的孵育时间为1～4h，而加入乙醇胺与BSA分别进行封闭的封闭时间分别为15min～4h。
优选地，在本说明书的一个可能的实施方式中，二氧化硅纳米颗粒可以选择为氨基二氧化硅纳米颗粒或羧基二氧化硅纳米颗粒；而在其他实施方式中，根据实际检测的需要，也可以选择其他基团修饰的二氧化硅纳米颗粒，保证检测的灵敏性与准确性。
具体地，共价修饰试剂为具有至少两个针对特殊基团反应性末端的小分子化合物；优选地，在本说明书的一个可能的实施方式中，共价修饰试剂至少可以包括戊二醛、NHS和马来酰亚胺中的一种；优选地，在本说明书的一个可能的实施方式中，戊二醛作为共价修饰试剂，该戊二醛溶液的质量分数可选为20～50％。
S2，制备免疫磁珠：将配对探针二与磁珠孵育，得到所述免疫磁珠。
具体地，在使用磁珠进行孵育之前，首先将磁珠进行化学基团修饰，之后将修饰过的磁珠用缓冲液清洗，得到磁珠悬浮液；之后，在磁珠悬浮液中加入配对探针二进行孵育；并在反应完成后再次进行清洗，对清洗液体进行磁性分离，使得磁珠重悬于缓冲液中，获得免疫磁珠。
其中，配对探针二也包括能够识别靶标物的抗体或核酸适配体；而S1步骤和S2步骤可以分别同时进行，以缩短检测时间，进一步提升效率，也可以先后进行，但本发明对S1步骤和S2步骤的先后顺序不做限定，可以根据实际需求任选其一先进行制备。
优选地，在本说明书的一个可能的实施方式中，磁珠可以为氨基磁珠、羧基磁珠、链酶亲和素磁珠或羟基磁珠；优选地，在S2步骤中所使用的是磁珠的溶液，溶液浓度为3～10mg/mL，磁珠粒径为100nm～5μm。
优选地，将配对探针二与磁珠孵育的孵育时间为1～2h。
S3，制备免疫磁珠-靶标物-免疫硅纳米颗粒：将所述免疫硅纳米颗粒、所述免疫磁珠与靶标物结合，形成免疫磁珠-靶标物-免疫硅纳米颗粒的三层结构。
具体地，在S3步骤将免疫硅纳米颗粒、免疫磁珠和靶标物混匀孵育完成后，仍旧用缓冲液进行清洗，之后再加入pH酶的底物溶液摇晃进行催化反应。
S4，修饰硅纳米线场效应生化传感器：在所述硅纳米线场效应生化传感器表面修饰上羟基基团，于基团修饰液中进行基团修饰，清洗后吹干备用；修饰后的所述硅纳米线场效应生化传感器用于识别不同的所述三层结构催化所述pH酶的底物发生催化反应所产生的pH变化。
其中，修饰上羟基基团具体为将硅纳米线场效应生化传感器放入等离子清洗机中进行氧等离子体清洗，使其表面修饰上羟基基团后，将其浸泡于基团修饰液中进行基团修饰，在用缓冲液清洗后吹干，置于氮气柜备用。
S5，pH催化：所述免疫磁珠-靶标物-免疫硅纳米颗粒与所述pH酶的底物发生催化反应，以改变待测溶液的pH。
在S1步骤中，其中的pH酶实质上也为pH酶的溶液，是与本步骤中的pH酶的底物反应产生pH变化的化合物；优选地，pH酶的溶液为脲酶、酯酶、青霉素酶或有机磷水解酶；而与上述pH酶的溶液对应的pH酶的底物为尿素溶液、低级脂肪酸酯溶液、青霉素溶液或有机磷水解酶；优选地，在本说明书的一个可能的实施方式中，pH酶溶液的浓度为1～50mg/mL，pH酶底物溶液的浓度为10～200mM；优选地，S5步骤中进行催化反应的催化时间为30min～2h。
S6，pH检测：将所述待测溶液进行磁性分离，取上清液在所述硅纳米线场效应生化传感器上进行pH检测，根据浓度与pH的标准曲线，得到所述靶标物的浓度。
实施例2不同的目标DNA靶标物浓度对电流变化量的影响
步骤一：免疫磁珠的制备
将免疫磁珠与不同浓度待检测DNA进行结合与洗脱；分别取6次50μL链酶亲和素化磁珠至6支1.5mL离心管中，并在磁架上用1×PBS缓冲液清洗三遍后分散于100μLPBS缓冲液中得到磁珠悬浮液；之后，根据表1所示，将30μL修饰生物素的DNA1分别加到磁珠悬浮液中，室温下摇晃1h，使用PBS缓冲液清洗三遍；之后在6支离心管中分别加入100μL PBS、100μL10pM Target DNA2、100μL 100pM Target DNA2、100μL 1nM Target DNA2、100μL 10nMTarget DNA2与100μL 100nM Target DNA2，室温下摇晃1h，再使用PBS缓冲液清洗三遍；然后分别加入100μL PBS缓冲液与15μL修饰地高辛的DNA3，室温下摇晃1h；反应完成后，继续使用PBS缓冲液清洗三遍，将液体进行磁性分离，并将得到的6份免疫磁珠分别分散在100μLPBS缓冲液中。
步骤二：免疫硅纳米粒子的制备
分别取6次10μL氨基化的二氧化硅纳米颗粒至6支1.5mL离心管中，加入1mL 1×PBS缓冲液清洗离心一遍，使二氧化硅纳米颗粒重悬于100μL PBS缓冲液中，分别加入2μL0.2M K2CO3溶液使硅纳米粒子溶液pH接近7，然后分别加入100μL质量分数为25％的戊二醛溶液，室温下摇晃2h；反应完成后，PBS缓冲液清洗离心三遍，分别加入8μL 0.1g/L抗地高辛溶液与100μL 10mg/mL脲酶溶液，室温下摇晃2h；反应完成后，PBS缓冲液清洗离心一遍，加入100μL乙醇胺与100μL 10％BSA分别反应30min与1h进行封闭；封闭完成后，PBS缓冲液清洗离心三遍，将得到的6份免疫硅纳米颗粒分别重悬于1mL PBS缓冲液中。
步骤三：硅纳米线场效应生化传感器的修饰
将硅纳米线场效应生化传感器放入等离子清洗机中进行氧等离子体清洗2min，清洗完成后放入2％的APTES中孵育一夜，用乙醇冲洗后放入120℃烘箱15min，烘完后将其置于氮气柜备用。
步骤四：不同浓度的目标DNA的pH测试
在6支1.5mL离心管中分别加入上述结合不同浓度目标DNA免疫磁珠与免疫硅纳米颗粒，并作标记，室温下摇晃1h；反应完成后，使用PBS缓冲液清洗五遍，分别加入1mL 100mM尿素溶液在室温下摇晃进行15min催化反应；反应完成后，将液体进行磁性分离，取磁性分离上清液在修饰氨基的硅纳米线场效应生化传感器上进行pH的检测。
如说明书附图3所示，检测结果显示，检测的电流信号随着Target DNA2溶液浓度的增加而增大；Target DNA2的检测浓度可低至10pM，并且这一低浓度监测到的电流信号也与空白信号差异较大，说明该基于硅纳米线场效应生化传感器的靶标物浓度检测方法对靶标物具有高灵敏度的检测能力。
实施例3催化最优时间探究
步骤一：功能化磁珠与相同浓度检测DNA的结合与洗脱
分别取5次50μL链酶亲和素化磁珠至5支1.5mL离心管中，并在磁架上用1×PBS缓冲液清洗三遍后分散于100μL PBS缓冲液中得到磁珠悬浮液；将30μL修饰生物素的DNA1分别加到磁珠悬浮液中，室温下摇晃1h，PBS缓冲液清洗三遍；在5支离心管中分别加入100μL1μM Target DNA2，室温下摇晃1h，PBS缓冲液清洗三遍；分别加入100μL PBS缓冲液与15μL修饰地高辛的DNA3，室温下摇晃1h；反应完成后，PBS缓冲液清洗三遍，将液体进行磁性分离，并将得到的5份免疫磁珠分别分散在100μL PBS缓冲液中。
步骤二：免疫硅纳米颗粒的制备
分别取5次10μL氨基化的二氧化硅纳米颗粒至5支1.5mL离心管中，加入1mL 1×PBS缓冲液清洗离心一遍，使二氧化硅纳米颗粒重悬于100μL PBS缓冲液中，分别加入2μL0.2M K2CO3溶液使二氧化硅纳米颗粒溶液pH接近7，然后分别加入100μL质量分数为25％的戊二醛溶液，室温下摇晃2h；反应完成后，PBS缓冲液清洗离心三遍，分别加入8μL 0.1g/L抗地高辛溶液与100μL 10mg/mL脲酶溶液，室温下摇晃2h；反应完成后，PBS缓冲液清洗离心一遍，加入100μL乙醇胺与100μL 10％BSA分别反应30min与1h进行封闭；封闭完成后，PBS缓冲液清洗离心三遍，将得到的5份免疫硅纳米颗粒分别重悬于1mL PBS缓冲液中。
步骤三：硅纳米线场效应生化传感器的修饰
将硅纳米线场效应生化传感器放入等离子清洗机中进行氧等离子体清洗2min，清洗完成后放入2％的APTES中孵育一夜，用乙醇冲洗后放入120℃烘箱15min，烘完后将其置于氮气柜备用；
步骤四：不同脲酶催化时间的pH测试
在5支1.5mL离心管中分别加入结合相同浓度目标DNA的免疫磁珠与免疫硅纳米颗粒溶液，并作标记，室温下摇晃1h；反应完成后，PBS缓冲液清洗五遍，分别加入1mL 100mM尿素溶液在室温下摇晃3min、5min、10min、15min、20min进行催化反应；反应完成后，将液体进行磁性分离，取上清液在修饰氨基的硅纳米线场效应生化传感器上进行pH的检测。
如说明书附图4所示，实验结果显示，检测的电流变化量随着脲酶催化时间的增加而增大，并且在催化时间为15min时，电流变化量不再出现明显增大，即可认为催化15min左右反应完全。
实施例4目标DNA特异性分析
特异性的好坏是决定检测方法是否可行的必要因素，本发明考察了该基于硅纳米线场效应生化传感器的靶标物浓度检测方法检测DNA的选择性。
步骤一：免疫磁珠与检测DNA的结合与洗脱
分别取4次50μL链酶亲和素化磁珠至4支1.5mL离心管中，并在磁架上用1×PBS缓冲液清洗三遍后分散于100μL PBS缓冲液中得到磁珠悬浮液；将30μL修饰生物素的DNA1分别加到磁珠悬浮液中，室温下摇晃1h，PBS缓冲液清洗三遍；根据表1所示，在4支离心管中分别加入100μL 1μM PBS、100μL 1μM双错配DNA4、100μL 1μM非互补DNA5、100μL1μM TargetDNA2，室温下摇晃1h，PBS缓冲液清洗三遍；分别加入100μL PBS缓冲液与15μL修饰地高辛的DNA3，室温下摇晃1h；反应完成后，PBS缓冲液清洗三遍，将液体进行磁性分离，并将得到的4份分别分散在100μL PBS缓冲液中的免疫磁珠；
步骤二：免疫硅纳米颗粒的制备
分别取4次10μL氨基化的二氧化硅纳米颗粒至4支1.5mL离心管中，加入1mL 1×PBS缓冲液清洗离心一遍，使二氧化硅纳米颗粒重悬于100μL PBS缓冲液中，分别加入2μL0.2M K2CO3溶液使硅纳米粒子溶液pH接近7，然后分别加入100μL质量分数为25％的戊二醛溶液，室温下摇晃2h；反应完成后，PBS缓冲液清洗离心三遍，分别加入8μL 0.1g/L抗地高辛溶液与100μL 10mg/mL脲酶溶液，室温下摇晃2h；反应完成后，PBS缓冲液清洗离心一遍，加入100μL乙醇胺与100μL 10％BSA分别反应30min与1h进行封闭；封闭完成后，PBS缓冲液清洗离心三遍，将得到的4份分别重悬于1mL PBS缓冲液中的免疫硅纳米颗粒。
步骤三：硅纳米线场效应生化传感器的修饰
将硅纳米线场效应生化传感器放入等离子清洗机中进行氧等离子体清洗2min，清洗完成后放入2％的APTES中孵育一夜，用乙醇冲洗后放入120℃烘箱15min，烘完后将其置于氮气柜备用。
步骤四：不同错配的目标DNA的pH测试
在4支1.5mL离心管中分别加入结合不同DNA的免疫磁珠与免疫硅纳米颗粒，并作标记，室温下摇晃1h；反应完成后，PBS缓冲液清洗五遍，分别加入1mL 100mM尿素溶液在室温下摇晃15min进行催化反应；反应完成后，将液体进行磁性分离，取磁性分离上清液在修饰氨基的硅纳米线场效应生化传感器上进行pH的检测。
如说明书附图5所示，实验结果显示，Target DNA2检测的电流变化量较双错配DNA4与非互补DNA5检测的电流变化量都大，能够较好地区分出目标DNA与错配DNA，说明该基于硅纳米线场效应生化传感器的靶标物浓度检测方法对靶标物检测具有较高的特异性。
表1实施例2～4所使用的不同DNA的序列
Figure BDA0003245522850000121
通过上述的几个实施例可以看出，本发明具有以下有益效果：
1、本发明将靶标物浓度转化为pH变化，利用硅纳米线场效应生化传感器对该pH变化进行检测，根据其电流变化量，能够实现靶标物的定性与定量测定，灵敏度高，检测准确性好；并且，本发明能够在硅纳米线场效应生化传感器表面直接修饰上羟基基团，大大简化修饰过程，提升场效应传感器检出的稳定性。
2、在磁珠与硅纳米粒子功能化的过程中，所修饰的偶联物与脲酶均通过共价键与磁珠或硅纳米粒子连接，相较于静电吸附的连接方式，共价键连接方式的功能化磁珠与功能化硅纳米粒子更加稳定，从而使检测结果更加可靠。
3、采用能够识别靶标物的探针，特异性强，灵敏度高，检测快速稳定；同时，不同的探针能够特异性识别不同靶标物，只需要在磁珠与硅纳米粒子功能化过程中将抗体或偶联物更换，即可实现不同抗原或分子的检测，通用性高，应用范围广泛。
4、免疫磁珠-靶标物-免疫硅纳米颗粒的三层结构体系简化了场效应传感器接触的溶液成分，能够实现检测血清、尿液、粪便甚至更复杂的环境污水等样本中的目标物，进一步使利用硅纳米线场效应生化传感器的检测方法成为一种生物分子简单、通用性强的检测技术。
5、本发明的硅纳米线场效应生化传感器体积小、成本低廉、检测快速，无需依赖大型仪器，即可快速实现定性与定量检测。
以上所描述的仅为本发明的一些实施例而已，并不用于限制本发明，本行业的技术人员应当了解，本发明还会有各种变化和改进，任何依照本发明所做的修改、等同替换和改进都落入本发明所要求的保护的范围内。

Claims (10)

1.一种基于硅纳米线场效应生化传感器的靶标物浓度检测方法，其特征在于，由以下步骤组成：
制备免疫硅纳米颗粒：通过共价修饰试剂，同时将探针一和pH酶的混合液共价修饰到二氧化硅纳米颗粒上，得到所述免疫硅纳米颗粒；所述探针一包括能够识别靶标物的抗体或核酸适配体；
制备免疫磁珠：将配对探针二与磁珠孵育，得到所述免疫磁珠；
制备免疫磁珠-靶标物-免疫硅纳米颗粒：将所述免疫硅纳米颗粒、所述免疫磁珠与靶标物结合，形成免疫磁珠-靶标物-免疫硅纳米颗粒的三层结构；
修饰硅纳米线场效应生化传感器：在所述硅纳米线场效应生化传感器表面修饰上羟基基团，于基团修饰液中进行基团修饰，清洗后吹干备用；修饰后的所述硅纳米线场效应生化传感器用于识别不同的所述三层结构催化所述pH酶的底物发生催化反应所产生的pH变化，所述pH酶为与所述pH酶的底物产生pH变化的化合物；
pH催化：所述免疫磁珠-靶标物-免疫硅纳米颗粒与所述pH酶的底物发生催化反应，以改变待测溶液的pH；
pH检测：将所述待测溶液进行磁性分离，取上清液在所述硅纳米线场效应生化传感器上进行pH检测，根据浓度与pH的标准曲线，得到所述靶标物的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种基于硅纳米线场效应生化传感器的靶标物浓度检测方法，其特征在于，所述制备免疫硅纳米颗粒包括：
采用缓冲液清洗经过化学基团修饰的所述二氧化硅纳米颗粒；
离心，将所述二氧化硅纳米颗粒重悬于所述缓冲液中；
加入K2CO3溶液，调节所述缓冲液pH值为5～9；
加入蛋白质交联剂摇晃孵育；
加入所述pH酶的溶液与所述探针一摇晃偶联；
加入乙醇胺与BSA分别进行封闭，得到所述免疫硅纳米颗粒。
3.根据权利要求1所述的一种基于硅纳米线场效应生化传感器的靶标物浓度检测方法，其特征在于，所述二氧化硅纳米颗粒为氨基二氧化硅纳米颗粒或羧基二氧化硅纳米颗粒。
4.根据权利要求1所述的一种基于硅纳米线场效应生化传感器的靶标物浓度检测方法，其特征在于，所述共价修饰试剂为具有至少两个针对特殊基团的反应性末端的小分子化合物；所述共价修饰试剂至少为戊二醛、NHS和马来酰亚胺中的一种。
5.根据权利要求1所述的一种基于硅纳米线场效应生化传感器的靶标物浓度检测方法，其特征在于，所述pH酶为脲酶、酯酶、青霉素酶或有机磷水解酶；
与所述pH酶的溶液对应的所述pH酶的底物为尿素溶液、低级脂肪酸酯溶液、青霉素溶液或有机磷化合物。
6.根据权利要求1所述的一种基于硅纳米线场效应生化传感器的靶标物浓度检测方法，其特征在于，所述制备免疫磁珠包括：
在经过化学基团修饰的所述磁珠中加入所述配对探针二进行孵育；
修饰完成后依次进行清洗与磁性分离，获得所述免疫磁珠。
7.根据权利要求1所述的一种基于硅纳米线场效应生化传感器的靶标物浓度检测方法，其特征在于，所述磁珠至少包括氨基磁珠、羧基磁珠、链酶亲和素磁珠和羟基磁珠中的一种。
8.根据权利要求1所述的一种基于硅纳米线场效应生化传感器的靶标物浓度检测方法，其特征在于，所述免疫磁珠-靶标物-免疫硅纳米颗粒与所述磁珠或者所述二氧化硅纳米颗粒的连接方式为共价键连接；
所述pH酶与所述磁珠或者所述二氧化硅纳米颗粒的连接方式为共价键连接。
9.根据权利要求1所述的一种基于硅纳米线场效应生化传感器的靶标物浓度检测方法，其特征在于，所述基团修饰液为3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液(APTES)或邻羧基苯乙酸，所述基团修饰液对应修饰的基团为氨基或羧基。
10.根据权利要求1所述的一种基于硅纳米线场效应生化传感器的靶标物浓度检测方法，其特征在于，所述方法还用于检测生物物质，所述生物物质包括离子、小分子、蛋白、核酸、激素、细胞、真菌、细菌和病毒。
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