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CN113939538A - 内皮素受体a结合力得以提高的抗体 - Google Patents

内皮素受体a结合力得以提高的抗体 Download PDF

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CN113939538A
CN113939538A CN202080040096.8A CN202080040096A CN113939538A CN 113939538 A CN113939538 A CN 113939538A CN 202080040096 A CN202080040096 A CN 202080040096A CN 113939538 A CN113939538 A CN 113939538A
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chain variable
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variable region
antigen
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金演宰
安惠美
高秉俊
李元揆
罗晶铉
朱满锡
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Heidegger Hogg Ltd
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Abstract

本发明涉及对于内皮素受体A的结合力得以提高的抗体或其抗原结合片段。并且，本发明涉及生产率得以提高的抗体或其抗原结合片段。与现有的抗体相比，本发明中发现的抗体对于抗原的结合力及生产率显著改善，从而可有用地用作用于治疗及诊断内皮素受体A相关疾病的抗体。

Description

内皮素受体A结合力得以提高的抗体
技术领域
本发明涉及抗体药物，涉及人内皮素受体活性控制抗体。
背景技术
G蛋白偶联受体(GPCR，G-protein coupled receptor)为具有7个跨膜结构域(transmembrane)的膜蛋白，通过细胞外配体结合解离G-蛋白的结合，由此，激活细胞内信号传导过程，并执行对于信号传导物质的反应，还执行认知和感觉等的生理学上非常重要的作用。G蛋白偶联受体不仅调节细胞的生长、增殖、迁移、凋亡等，还与癌症、心血管疾病等的诸多疾病直接相关，作为主要药物靶物质备受关注，占据当前市售中的新药靶生物体物质中的30％～50％。
已知内皮素受体A(endothelin receptor type A，ETA)主要在正常人的血管平滑肌中表达，通过作为配体的内皮素-1(endothelin-1)的结合引起的细胞内信号传导过程，导致血管收缩作用。因此，将如作为内皮素受体拮抗剂(endothelin receptorantagonist)的波生坦(Bosentan)的药物用作高血压治疗剂(Nature reviews drugdiscovery,2011,Vol.10,47)。近来，许多基础生物学及临床研究表明，内皮素受体A在膀胱癌、肺癌、卵巢癌、肾癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫癌、横纹肌肉瘤、胶质母细胞瘤等的各种癌症中过表达，直接参与癌症细胞的增殖、迁移、渗透、转移、血管生成等的主要癌症进展过程，从而降低患者的存活率，从而作为主要抗癌靶物质备受关注(Nature reviewcancer,2013,Vol.13,637)。
与低分子合成药物相比，抗体药物具有高特异性、低副作用、高血液半衰期、Fc区引起的缺陷细胞凋亡作用机制(ADCC、ADCP、CDC)等的优点，但是，现有的靶向内皮素受体A的药物有波生坦、Zibotentan、阿曲生坦(Atrasentan)等的低分子化合物，尚未报告抗体药物，并且，即使扩展到整个G蛋白偶联受体，获批上市的抗体药物也很少，靶向CCR4的KyowaHakko Kirin公司的Poteligeo(Mogamulizumab)在日本获批，Amgen公司于2018年5月研发的靶向降钙素基因相关肽(CGRP)受体的Aimovig(Erenumab)作为G蛋白偶联受体靶向抗体首次获得美国食品药品监督管理局(US FDA)的批准。因此，需要研发与内皮素受体A特异性结合并调节其活性的新型抗体。
通过如上所述的背景技术说明的事项仅用于提高对本发明的背景的理解，不应视为其与本技术领域的普通技术人员周知的现有技术相对应。
发明内容
技术问题
本发明人努力研发如下的抗体：保持具有对于以往研发的内皮素受体A的特异性结合力的抗体的抗原结合位点序列，同时，通过骨架区设计显著改善亲和力和生产率。结果，本发明人发现有效抑制稳定表达内皮素受体A的细胞株中的内皮素-1信号传导的抗体，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的在于，提供包含重链可变区及轻链可变区且与内皮素受体A(Endothelin receptor type A)特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明的再一目的在于，提供编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
本发明的另一目的在于，提供包含上述核酸分子的载体。
本发明的还有一目的在于，提供包含上述载体的宿主细胞。
本发明的又一目的在于，提供包含上述抗体、核酸分子或载体的组合物。
本发明的其他目的及优点通过发明的详细说明、发明要求保护范围及附图变得更加明确。
技术方案
根据本发明的一实施方式，本发明提供包含重链可变区及轻链可变区且与内皮素受体A特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段。
上述内皮素受体A负责借助作为配体的内皮素-1的结合的细胞内信号传导过程，作为高血压治疗剂及主要抗癌剂的靶物质受到关注，现有的靶向内皮素受体A的药物为波生坦、Zibotentan、阿曲生坦(Atrasentan)等的低分子化合物，尚未报告将内皮素受体A或其细胞外位点识别为抗原的单克隆抗体药物。
在本说明书中，术语“表位”是指可与抗体或其抗原结合片段特异性结合的抗原的定位(localized)位点。例如，作为抗原的多肽中的连续的氨基酸可成为表位，多肽中的非连续的两个或两个以上的位点可通过三维结构的折叠(folding)一同成为表位。表位在抗原的独特的三维结构中可包括2个以上、3个以上、4个以上、5个以上、6个以上、7个以上、8个以上、9个以上、10个以上、11个以上、12个以上、13个以上、14个以上或15个以上的连续或非连续的氨基酸。本发明的抗体或其抗原结合片段可将G蛋白偶联受体(例如，内皮素受体A)或其细胞外位点识别为抗原来与其特异性结合，G蛋白偶联受体的细胞外位点包括一个N-term和三个ECL(ECL1、ECL2及ECL3)，可将选自由上述N-term、ECL1、ECL2及ECL3组成的组中的一种以上的细胞外位点作为表位来特异性结合，上述表位可包括一种或一种以上的氨基酸。
所提出的确定与抗体结合的表位的方法(例如，表位作图)具有通过对于抗体的反应测试进行的免疫印迹(immunoblotting)及免疫沉淀(immunoprecipitation)测试等各种方法。确定表位的三维空间结构的方法可利用x-射线晶体学(x-ray crystallography)、二维核磁共振(2-dimensional nuclear magnetic resonance)及氢-氘交换质谱(HDX-MS)等各种方法来执行(Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66,G.E.Morris,Ed.(1996))。
根据本发明的优选实例，可与本发明的抗体或其抗原结合片段结合的表位可通过核磁共振(NMR)光谱学、X-射线衍射晶体学、酶联免疫吸附剂测定(ELISA)、氢-氘交换质谱(hydrogen/deuterium exchange coupled with mass spectrometry，HDX-MS)、基于阵列的寡肽扫描分析(array-based oligo-peptide scanning assays)和/或诱变作图(mutagenesis mapping)确定(Giege R et al.,(1994)Acta Crystallogr DBiolCrystallogr 50(Pt 4)：339-350；McPherson A(1990)Eur J Biochem189：1-23；Chayen NE(1997)Structure 5：1269-1274；McPherson A(1976)J Biol Chem 251：6300-6303)。
在本说明书中，术语“抗体”可以为免疫球蛋白分子中的任意类型的抗体(例如，免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白E(IgE)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)、免疫球蛋白A(IgA)或免疫球蛋白Y(IgY))，可以为任意亚型抗体(例如，对于人的免疫球蛋白G1(IgG1)、免疫球蛋白G2(IgG2)、免疫球蛋白G3(IgG3)及免疫球蛋白G4(IgG4)；以及对于小鼠的免疫球蛋白G1、免疫球蛋白G2a(IgG2a)、免疫球蛋白G2b(IgG2b)及免疫球蛋白G3)。免疫球蛋白(例如，免疫球蛋白G1)可存在各种同种异型(allotype)，在本说明书中，术语“抗体”包括通常周知的同种型(isotype)及同种异型。并且，在本说明书中，术语“抗体”可以为免疫球蛋白G1、免疫球蛋白G2、免疫球蛋白G3或免疫球蛋白G4，或者其杂交(hybrid)类型(例如，免疫球蛋白G2与免疫球蛋白G4的杂交)。
在本说明书中，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体(monoclonal antibody)”是指示出对于特定表位的单一结合特异性(single binding specificity)及亲和力(affinity)的抗体。
在本说明书中，上述单克隆抗体以包含其片段的含义使用，优选地，上述片段是指抗原结合片段(antigen binding fragment)。上述片段可利用本领域周知的各种方法来制备。例如，可利用如木瓜蛋白酶(Fab片段的生产)或胃蛋白酶(F(ab')2)的酶，通过免疫球蛋白分子的溶蛋白性裂解(proteolytic cleavage)制备Fab及F(ab')2片段。
在本说明书中，术语“片段”可以为Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv(单链Fv，singlechain Fv)、或者包含单体的重链可变区(VH，heavy chain variable region)或轻链可变区(VL，light chain variable region)的sdAb，上述片段是本领域周知的。
重链可变区或者一个或一个以上的互补决定区(CDR，complementarity-determining region)可为了形成重链(heavy chain)而与恒定区连接。并且，轻链可变区或者一个或一个以上的互补决定区可为了形成轻链(light chain)而与恒定区连接。全长(full length)重链与全长轻链结合来构成全长抗体。
在本说明书中，术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、生成或分离的所有人抗体，例如，(a)从对于人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体的动物(例如，小鼠)或利用其制备的杂交瘤分离的抗体，(b)从以表达抗体的方式转化的宿主细胞，例如从转染瘤分离的抗体，(c)从重组方式、组合方式人抗体文库分离的抗体，以及(d)伴随不同于人免疫球蛋白基因序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列的剪接的通过任意其他方法制备、表达、生成或分离的抗体。这种重组人抗体包括可变区及恒定区，它们利用被种系基因编码的特定人种系免疫球蛋白序列，例如，包括在抗体成熟过程中发生的后续重排及突变。如本领域公知的(例如，参照Lonberg(2005)Nature Biotech.23(9)：1117-1125)，可变区包含抗原结合域，被重排的各种基因编码，来形成对于外来抗原特异性的抗体。除了重排，为了增加对于外来抗原的抗体的亲和力，可变区可通过多个单一氨基酸取代进一步修饰。因此，通过与抗原进行反应来编码轻链及重链免疫球蛋白多肽、重排且体细胞突变的核酸分子无法与亲本核酸分子具有序列同一性，而是基本相同或相似(即，具有至少80％同一性)。
“人”抗体(HuMAb)是指骨架区和互补决定区两者均具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。并且，在抗体包含恒定区的情况下，恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。在本说明书中公开的抗体可包含不被人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过试管内随机或位点-特异性诱变或体内体细胞突变引入的突变)。但是，在本说明书中公开的“人抗体”不包含源自如小鼠的其他哺乳动物种系的互补决定区序列移植到人骨架序列的抗体。术语“人”抗体及“完全人”抗体同义使用。
“人源化”抗体是指位于非-人抗体的互补决定区结构域外的氨基酸的一部分、大部分或全部被源自人免疫球蛋白的相应的氨基酸取代的抗体。在抗体的人源化形态的一具体例中，位于互补决定区结构域外的氨基酸的一部分、大部分或全部被源自人免疫球蛋白的氨基酸取代，一个以上的互补决定区中的氨基酸的一部分、大部分或全部保持原样。只要不破坏抗体与特定抗原结合的能力，允许氨基酸的少量添加、缺失、插入、取代或修饰。“人源化”抗体拥有与亲本抗体相似的抗原特异性。
根据本发明的优选实例，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区包括三个互补决定区(重链可变区-互补决定区1(VH-CDR1)、重链可变区-互补决定区2(VH-CDR2)及重链可变区-互补决定区3(VH-CDR3))。
根据本发明的优选实例，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区包括SEQID NO：25的重链可变区-互补决定区1及SEQ ID NO：26的重链可变区-互补决定区2。
根据本发明的优选实例，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区包括SEQID NO：30的重链可变区-互补决定区3或者在SEQ ID NO：30中的选自由第4位氨基酸、第7位氨基酸、第9位氨基酸及第12位氨基酸组成的组中的位置包含突变的序列的重链可变区-互补决定区3。
根据本发明的优选实例，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的重链可变区-互补决定区3包含如下的突变：在SEQ ID NO：30中，第4位氨基酸被脯氨酸(P)取代；第7位氨基酸被亮氨酸(L)取代；第9位氨基酸被缬氨酸(V)取代；或者第12位氨基酸被谷氨酸(E)取代。
根据本发明的优选实例，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的重链可变区-互补决定区3为选自由SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：34组成的组中的氨基酸序列。
根据本发明的优选实例，本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包括三个互补决定区(轻链可变区-互补决定区1、轻链可变区-互补决定区2及轻链可变区-互补决定区3)。
根据本发明的优选实例，本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包括SEQID NO：27的轻链可变区-互补决定区1、SEQ ID NO：28的轻链可变区-互补决定区2及SEQ IDNO：29的轻链可变区-互补决定区3。
根据本发明的优选实例，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区包括四个骨架区(framework region：重链可变区骨架区1(VH-FR1)、重链可变区骨架区2(VH-FR2)、重链可变区骨架区3(VH-FR3)及重链可变区骨架区4(VH-FR4))。
根据本发明的优选实例，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区中的骨架区及互补决定区的排列如下，即，重链可变区骨架区1/重链可变区-互补决定区1/重链可变区骨架区2/重链可变区-互补决定区2/重链可变区骨架区3/重链可变区-互补决定区3/重链可变区骨架区4。
根据本发明的优选实例，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区包括SEQID NO：1的重链可变区骨架区1或者在SEQ ID NO：1中的选自由第16位氨基酸及第24位氨基酸组成的组中的一个以上的位置包含突变的序列的重链可变区骨架区1。
根据本发明的优选实例，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的重链可变区骨架区1包含如下的突变：在SEQ ID NO：1中，第16位氨基酸被精氨酸(R)取代；或者第24位氨基酸被缬氨酸(V)取代。
根据本发明的优选实例，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的重链可变区骨架区1为选自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3组成的组中的氨基酸序列。
根据本发明的优选实例，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区包括SEQID NO：4的重链可变区骨架区2或者在SEQ ID NO：4中的第1位氨基酸、第2位氨基酸、第4位氨基酸、第16位氨基酸及第17位氨基酸组成的组中的一个以上的位置包含突变的序列的重链可变区骨架区2。
根据本发明的优选实例，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的重链可变区骨架区2包含选自由如下的突变组成的组中的一种以上的突变：在SEQ ID NO：4中，第1位氨基酸被甲硫氨酸(M)取代；第2位氨基酸被天冬酰胺(N)取代；第4位氨基酸被异亮氨酸(I)取代；第16位氨基酸被丝氨酸(S)或甘氨酸(G)取代；以及第17位氨基酸被丙氨酸(A)、色氨酸(W)或丝氨酸取代。
根据本发明的优选实例，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的重链可变区骨架区2为选自由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：7组成的组中的氨基酸序列。
根据本发明的优选实例，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区包括SEQID NO：8的重链可变区骨架区3或者在SEQ ID NO：8中的选自由第1位氨基酸、第4位氨基酸、第5位氨基酸、第6位氨基酸、第7位氨基酸、第8位氨基酸、第12位氨基酸、第14位氨基酸、第16位氨基酸、第17位氨基酸、第19位氨基酸、第20位氨基酸及第21位氨基酸组成的组中的一个以上的位置包含突变的序列的重链可变区骨架区3。
根据本发明的优选实例，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的重链可变区骨架区3包含选自由如下的突变组成的组中的一种以上的突变：在SEQ ID NO：8中，第1位氨基酸被天冬氨酸、苏氨酸或天冬酰胺取代；第4位氨基酸被丙氨酸取代；第5位氨基酸被天冬氨酸取代；第6位氨基酸被苯丙氨酸取代；第7位氨基酸被谷氨酸取代；第8位氨基酸被精氨酸取代；第12位氨基酸被苯丙氨酸取代；第14位氨基酸被精氨酸或亮氨酸取代；第16位氨基酸被天冬酰胺或天冬氨酸取代；第17位氨基酸被丙氨酸取代；第19位氨基酸被丝氨酸取代；第20位氨基酸被丝氨酸取代；以及第21位氨基酸被亮氨酸或苯丙氨酸取代。
根据本发明的优选实例，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的重链可变区骨架区3为选自由SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：11组成的组中的氨基酸序列。
根据本发明的优选实例，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区包括SEQID NO：12的重链可变区骨架区4。
根据本发明的优选实例，本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包括四个骨架区(轻链可变区骨架区1、轻链可变区骨架区2、轻链可变区骨架区3及轻链可变区骨架区4)。
根据本发明的优选实例，本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区中的骨架区及互补决定区的排列如下，即，轻链可变区骨架区1/轻链可变区-互补决定区1/轻链可变区骨架区2/轻链可变区-互补决定区2/轻链可变区骨架区3/轻链可变区-互补决定区3/轻链可变区骨架区4。
根据本发明的优选实例，本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包括SEQID NO：13的轻链可变区骨架区1或者在SEQ ID NO：13中的选自由第4位氨基酸及第24位氨基酸组成的组中的一个以上的位置包含突变的序列的轻链可变区骨架区1。
根据本发明的优选实例，本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的轻链可变区骨架区1包含如下的突变：在SEQ ID NO：13中，第4位氨基酸被亮氨酸取代；或者第24位氨基酸被丝氨酸取代。
根据本发明的优选实例，本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的轻链可变区骨架区1为选自由SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15组成的组中的氨基酸序列。
根据本发明的优选实例，本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包括SEQID NO：16的轻链可变区骨架区2或者在SEQ ID NO：16中的选自由第1位氨基酸、第2位氨基酸及第14位氨基酸组成的组中的一个以上的位置包含突变的序列的轻链可变区骨架区2。
根据本发明的优选实例，本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的轻链可变区骨架区2包含选自由如下的突变组成的组中的一种以上的突变：在SEQ ID NO：16中，第1位氨基酸被亮氨酸或甲硫氨酸取代；第2位氨基酸被天冬酰胺取代；以及第14位氨基酸被缬氨酸取代。
根据本发明的优选实例，本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的轻链可变区骨架区2为选自由SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：19组成的组中的氨基酸序列。
根据本发明的优选实例，本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包括SEQID NO：20的轻链可变区骨架区3或者在SEQ ID NO：20中的选自由第1位氨基酸、第3位氨基酸、第14位氨基酸及第31位氨基酸组成的组中的一个以上的位置包含突变的序列的轻链可变区骨架区3。
根据本发明的优选实例，本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的轻链可变区骨架区3包含选自由如下的突变组成的组中的一种以上的突变：在SEQ ID NO：20中，第1位氨基酸被苏氨酸、丝氨酸或酪氨酸取代；第3位氨基酸被谷氨酰胺、组氨酸或谷氨酸取代；第14位氨基酸被甘氨酸取代；以及第31位氨基酸被缬氨酸取代。
根据本发明的优选实例，本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的轻链可变区骨架区3为选自由SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：23组成的组中的氨基酸序列。
根据本发明的优选实例，本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包括SEQID NO：24的轻链可变区骨架区4。
根据本发明的再一实施方式，本发明提供编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子、包含上述核酸分子的载体或包含上述载体的宿主细胞。
本发明的核酸分子可以是单离或重组的，不仅包括单链及双链形态的脱氧核糖核酸及核糖核酸(RNA)，还包括相应的互补序列。“单离的核酸”是指如下的核酸，即，在单离自天然来源的核酸的情况下，从存在于单离核酸的个体的基因组的周围基因序列分离的核酸。在从模板以酶促或化学合成的核酸，例如，聚合酶链式反应(PCR)产物、互补脱氧核糖核酸(cDNA)分子或寡核苷酸的情况下，可将通过这种步骤生成的核酸理解为单离的核酸分子。单离的核酸分子表示单独片段的形态或作为更大的核酸构建体的成分的核酸分子。当以与其他核酸序列的功能关系配置时，核酸“可操作地连接”。例如，在多肽作为分泌之前的形态的前蛋白(preprotein)表达的情况下，前序列或分泌前导序列(leader)的脱氧核糖核酸与多肽的脱氧核糖核酸可操作地连接，在启动子或增强子影像多肽序列的转录的情况下，启动子或增强子与编码序列可操作地连接，或者，当核糖体结合位点以促进翻译的方式配置时，核糖体结合位点与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”是指将要连接的脱氧核糖核酸序列相邻设置，在分泌前导序列的情况下，是指相邻而存在于相同的读取骨架内。但是，增强子无需相邻设置。连接通过便利的限制酶位点中的结扎实现。在不存在这种位点的情况下，根据通常的方法使用合成寡核苷酸衔接头或衔接物。
在本说明书中，术语“载体”是指为了向能够复制核酸序列的细胞引入而能够插入核酸序列的载体。核酸序列可以为外源的(exogenous)或异源的(heterologous)。作为载体可例举质粒、粘粒及病毒(例如，噬菌体)，但并不局限于此。普通技术人员可通过标准的重组技术构建载体(Maniatis,et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988；及Ausubel et al.,In：CurrentProtocols in Molecular Biology,John,Wiley&Sons,Inc,NY,1994等)。
在本说明书中，术语“表达载体”是指包含编码转录的基因产物中的至少一部分的核酸序列的载体。在一部分情况下，之后将核糖核酸分子翻译为蛋白质、多肽或肽。表达载体可包含各种调节序列。除了调节转录及翻译的调节序列，载体及表达载体中还可包含提供其他功能的核酸序列。
在本说明书中，术语“宿主细胞”包括真核生物及原核生物，是指能够复制上述载体或者能够表达被载体编码的基因的任意能够转化的生物。宿主细胞可被上述载体转染(transfected)或转化(transformed)，这是指外源核酸分子传递或引入到宿主细胞的过程。
优选地，本发明的宿主细胞可例举细菌(bacteria)细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、HEK293细胞、BHK-21细胞、COS7细胞、COP5细胞、A549细胞、NIH3T3细胞等，但并不局限于此。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供包含上述抗体或其抗原结合片段、上述核酸分子或上述载体的组合物。
根据本发明的优选实例，本发明的组合物为用于预防或治疗高血压或癌症的药剂学组合物。
本发明的药剂学组合物可包含：(a)上述抗体或其抗原结合片段、上述核酸分子或包含上述核酸分子的载体；以及(b)药剂学上可接受的载体。
根据本发明的还有一实施方式，本发明提供包括给药上述药剂学组合物的步骤的高血压或癌症的预防或治疗方法。
本发明所要预防或治疗的癌症的种类并不受限，包括白血病(leukemias)及急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia)、急性非淋巴细胞白血病(acutenonlymphocytic leukemias)、慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia)、慢性骨髓白血病(chronic myelogenous leukemia)、霍奇金病(Hodgkin's Disease)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphomas)及多发性骨髓瘤(multiple myeloma)等的淋巴瘤(lymphomas)、脑肿瘤(brain tumors)、胶质母细胞瘤(glioblastoma)、成神经细胞瘤(neuroblastoma)、横纹肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma)、成视网膜细胞瘤(retinoblastoma)、威尔姆氏瘤(Wilms Tumor)、骨肿瘤(bone tumors)及软组织肉瘤(soft-tissue sarcomas)等的儿童实体瘤(childhood solid tumors)、肺癌(lung cancer)、乳腺癌(breastcancer)、前列腺癌(prostate cancer)、泌尿系肿瘤(urinary cancers)、子宫癌(uterinecancers)、口腔癌(oral cancers)、胰腺癌(pancreatic cancer)、黑色素瘤(melanoma)及其他皮肤癌(skin cancers)、胃癌(stomach cancer)、结肠癌(colon cancer)、卵巢癌(ovarian cancer)、脑肿瘤(brain tumors)、肝癌(liver cancer)、喉癌(laryngealcancer)、甲状腺癌(thyroid cancer)、食道癌(esophageal cancer)及睾丸癌(testicularcancer)等的成人常见的实体瘤(common solid tumors)，能够以治疗多个癌症的方式给药。
本发明的药剂学组合物中包含的药剂学上可接受的载体通常用于制剂，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁及矿物油等，但并不限定于此。除上述成分之外，本发明的药剂学组合物还可包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、保鲜剂等。适合的药剂学上可接受的载体及制剂详细记载于雷明登氏药学全书(Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed.,1995))中。
本发明的药剂学组合物可口服给药或肠胃外给药，优选为肠胃外给药，例如，可通过静脉内注射、局部注射及腹腔注射等给药。
本发明的药剂学组合物的适合剂量根据如剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病理状况、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应敏感性的因素不同，普通熟练的医生可容易确定及处方对于所期望的治疗或预防有效的剂量。根据本发明的优选实例，本发明的药剂学组合物的1日剂量为0.0001mg/kg～100mg/kg。
本发明的药剂学组合物通过本发明所属技术领域的普通技术人员容易实时的方法利用药剂学上可接受的载体和/或赋形剂来制剂化，从而，能够以单位容量形态制备或者加入至多容量容器内来制备。在此情况下，剂型可以为油性或水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态，或者，可以为浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂形态，还可包括分散剂或稳定剂。
本发明的药剂学组合物可通过单独疗法使用，还可与其他通常的化学疗法或放射疗法一同使用，在实施这种联合疗法的情况下，可更加有效地治疗癌症。可与本发明的组合物一同利用的化学疗剂包括顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、甲基苄肼(procarbazine)、氮芥(mechlorethamine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、白消安(bisulfan)、亚硝基脲(nitrosourea)、更生霉素(dactinomycin)、柔毛霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、博来霉素(bleomycin)、嘌呤霉素(plicomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、他莫昔芬(tamoxifen)、紫杉醇(taxol)、反铂(transplatinum)、氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、长春新碱(vincristin)、长春花碱(vinblastin)及甲氨蝶呤(methotrexate)等。可与本发明的组合物一同使用的放射疗法为X-射线照射及γ-射线照射等。
根据本发明的又一实施方式，本发明提供包括处理上述抗体或其抗原结合片段的步骤的样品中包含的内皮素受体A的定量方法。
本发明的抗体或其抗原结合片段与内皮素受体A特异性结合，因此，若利用其，则可准确测量样品中包含的内皮素受体A的量。
根据本发明的又一实施方式，提供用于诊断由内皮素受体A的过表达引起的疾病的信息提供方法，其包括：步骤(a)，从受试者获取体外分离的样品；步骤(b)，使用上述抗体或其抗原结合片段处理上述样品；以及步骤(c)，判断上述受试者的样品中包含的内皮素受体A的表达量是否高于正常组样品中包含的内皮素受体A的表达量。
内皮素受体A通过与作为配体的内皮素-1的结合起到血管收缩作用(Naturereviews drug discovery,2011,Vol.10,47)，在膀胱癌、肺癌、卵巢癌、肾癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫癌、横纹肌肉瘤、胶质母细胞瘤等的各种癌症中过表达而直接参与癌症细胞的增殖、迁移、渗透、转移、血管生成等的主要癌症进展过程(Nature review cancer,2013,Vol.13,637)，因此，与正常人比较上述内皮素受体A的表达量，由此可提供用于诊断由内皮素受体A的过表达引起的疾病的信息。
根据本发明的优选实例，上述由内皮素受体A的过表达引起的疾病为癌症或高血压。
根据本发明的又一实施方式，本发明提供包含上述抗体或其抗原结合片段的内皮素受体A定量试剂盒。
本发明的定量试剂盒可通过抗原抗体结合反应对上述抗体的抗原进行分析来定量内皮素受体A的量，优选地，上述抗原抗体结合反应选自由通常的酶联免疫吸附剂测定(ELISA，Enzyme-linked immunosorbent assay)、放射免疫测定(RIA，Radioimmnoassay)、夹心测定(Sandwich assay)、聚丙烯酰胺胶状的蛋白质印迹法(Western Blot)、免疫印迹法(Immunoblot assay)及免疫组织化学着色方法(Immnohistochemical staining)组成的组中，但并不局限于此。
用于抗原-抗体结合反应的固定物可使用选自由硝酸纤维素膜、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、聚乙烯(Polyvinyl)树脂或聚苯乙烯(Polystyrene)树脂合成的孔板(Wellplate)及由玻璃制成的载玻片(Slide glass)组成的组中，但并不局限于此。
优选地，上述二抗被进行显色反应的通常的显色剂标记，可使用选自由辣根过氧化物酶(HRP，Horseradish peroxidase)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase)、胶体金(Coloid gold)、异硫氰酸荧光素(FITC，Poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate)、罗丹明-B-异硫氰酸酯(RITC，Rhodamine-B-isothiocyanate)等的荧光物质(Fluorescein)及色素(Dye)组成的组中的一种标记物。优选地，诱导显色的底物根据进行显色反应的标记物使用，优选地，使用选自由3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB，3,3',5,5'-tetramethylbezidine)、2,2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS，2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid))及邻苯二胺(OPD，ophenylenediamine)组成的组中的一种，但并不局限于此。
发明的效果
本发明的特征及优点如下。
(i)本发明提供对于内皮素受体A的结合力得以提高的抗体或其抗原结合片段。
(ii)并且，本发明提供生产率得以提高的与内皮素受体A结合的抗体或其抗原结合片段。
(iii)与现有的抗体相比，在本发明中发现的抗体显著改善对于抗原的结合力及生产率，从而可有用地用作用于治疗及诊断内皮素受体A相关疾病的抗体。
附图说明
图1示出用于动物细胞的制备的表达载体。
图2示出通过骨架区设计制备的四种抗体的氨基酸序列。
图3示出通过骨架区设计制备的四种抗体的动物细胞中的纯化分析结果。
图4示出对于通过骨架区设计与具有曲妥单抗(Trastzumab)骨架序列的内皮素受体A选择性结合的MJ-F1抗体，动物细胞中的抗体生产收率分析结果。
图5示出通过人内皮素受体A的骨架区设计制备的四种抗体地抗体的抗原-抗体之间的酶联免疫吸附剂测定结果。
图6示出对于通过骨架区设计与具有曲妥单抗骨架序列的五种人内皮素受体A选择性结合的抗体，动物细胞中的抗体生产分析结果。
图7示出与具有曲妥单抗骨架序列的五种人内皮素受体A选择性结合的抗体的抗原-抗体之间的酶联免疫吸附剂测定(ELISA)结果。
图8示出利用与具有曲妥单抗骨架序列的五种人内皮素受体A选择性结合的抗体的与pH-依赖性人FcRn的酶联免疫吸附剂测定结果(图8的(a)部分：pH 7.4，图8的(b)部分：pH 6.0)。
图9示出利用与具有曲妥单抗骨架序列的五种人内皮素受体A选择性结合的抗体的与人FcγRIIa变体的酶联免疫吸附剂测定结果(图9的(a)部分：FcγRIIa-131R，图9的(b)部分：FcγRIIa-131H，图9的(c)部分：FcγRIIa-158V，图9的(d)部分：FcγRIIa-158F)。
图10示出利用与具有曲妥单抗骨架序列的五种人内皮素受体A选择性结合的抗体的与人C1q的酶联免疫吸附剂测定结果。
图11示出利用与具有曲妥单抗骨架序列的四种人内皮素受体A选择性结合的抗体的对于结肠癌细胞株HT-29(图11的(a)部分)、HCT-116(图11的(b)部分)的细胞增殖抑制功效分析结果。
图12示出向结肠癌异种移植模型给药与具有曲妥单抗骨架序列的四种人内皮素受体A选择性结合的抗体的抗癌有效性分析结果(图12的(a)部分)、从给药的结肠癌异种移植模型中摘除的结肠癌组织分析结果(图12的(b)部分)。
图13示出利用与具有曲妥单抗骨架序列的四种人内皮素受体A选择性结合的抗体的胰腺癌细胞株AsPC-1(图13的(a)部分)、对于Panc-1(图13的(b)部分)的细胞增殖抑制功效分析结果。
图14示出利用与具有曲妥单抗骨架序列的四种人内皮素受体A选择性结合的抗体的胃癌细胞株SNU-216(图14的(a)部分)、对于SNU-668(图14的(b)部分)的细胞增殖抑制功效分析结果。
图15示出与具有曲妥单抗骨架序列的四种人内皮素受体A选择性结合的抗体的分子排阻色谱-高效液相色谱法(SEC-HPLC)分析结果。
图16示出与具有曲妥单抗骨架序列的四种人内皮素受体A选择性结合的抗体的糖链结构分析结果。
图17示出与具有曲妥单抗骨架序列的四种人内皮素受体A选择性结合的抗体的反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析结果。
图18a、图18b、图18c、图18d示出与具有曲妥单抗骨架序列的四种人内皮素受体A选择性结合的抗体的热稳定性测试分析结果(图18a：MJ-F1-WT，图18b：MJ-F1-pFc29，图18c：GG12-pFc29，图18d：FG12-pFc29)。
图19为示出在韩国专利申请号第10-2017-0075129号中记载的抗体的200nM浓度中，在作为内皮素受体A过表达的结肠癌细胞株的HT-29细胞由10nM的内皮素-1诱发的信号传导的抑制能力的图表。
具体实施方式
以下，通过实施例更详细地说明本发明。这些实施例仅用于更加具体说明本发明，根据本发明的主旨，本发明的范围并不局限于这些实施例，这对普通技术人员而言是显而易见的。
实施例
实施例1：利用与内皮素受体A特异性结合的抗体的互补决定区(CDRs，complementarity-determining regions)序列的抗体骨架区设计
为了基于之前专利申请(申请号：第10-2017-0075129号)的内皮素受体A特异性结合抗体(AG8、EF12、GG12、FG12、AB9)(图19)的序列提高抗体稳定性及生产率，尝试制备由各种抗体药物骨架区序列与上述抗体互补决定区序列的最优组合组成的抗体。为此，在以在抗原-抗体结合中起到重要作用而周知的上述抗体的可变区重链(he avy chain)和轻链(light chain)的互补决定区，以聚合酶链式反应技术重叠(overlapping)四种用于治疗治疗的抗体(曲妥单抗、贝伐单抗(bevacizumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、阿达木单抗(adalimu mab))的骨架区。对扩增的四种可变区重链和四种可变区轻链基因进行XbaI/BssHII限制酶处理，并插入于利用相同的限制酶切割的动物细胞用表达载体(pMAZ)(图1)。将接合的抗体表达载体转化在大肠杆菌Jude1(F-mcrA△(mrr-hsdRMS-mcrBC)
Figure GDA0003417622310000181
80lacZ△M15△la cX74 recA1 endA1 araD139△(ara,leu)7697galU galKλ-rpsL nu pG)，利用桑格测序(Sanger sequencing)验证制备的表达载体的脱氧核糖核酸序列。在图2示出制备的四种抗体(MJ-F1、MJ-F2、MJ-F3、MJ-F4)序列。
实施例2：完成骨架区设计的四种抗体在动物细胞中的表达及纯化
为了利用包含聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI；Polysciences，美国)的150mM的NaCl溶液在Expi293细胞中对通过大肠杆菌转化扩增并回收的表达载体进行瞬时转染(transient transfection)，进行基因转染(transfection)，在Freestyle293表达培养基(Life Technologies，美国)中，以37℃的温度培养7天。以6000rpm将表达的细胞培养液离心分离20分钟后，取上清液并通过0.22μm的过滤器(filter)过滤。在4℃的温度下，诱导过滤的上清液与1ml的蛋白A(protein A)(Amicogen，韩国)树脂结合16小时。利用10CV(柱体积(column vol ume))的磷酸盐缓冲液洗涤结合的树脂后，利用100mM的甘氨酸(glycine)(pH 2.7)溶液洗脱后，利用1M的Tris-HCl(pH 8.0)中和。利用磷酸盐缓冲液更换缓冲液(buffer change)后，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在还原条件和非还原条件下分别分析纯化的四种抗体的轻链和重链的大小和纯度(图3)。比较分析AG8与纯化后的四种制备的抗体(MJ-F1、MJ-F2、MJ-F3、MJ-F4)的抗体收率，其中，与AG8抗体相比，在MJ-F1的情况下，可获得增加15倍的收率(图4)。
实施例3：分析暴露在细胞外区域的内皮素受体A抗原区与制备的抗体的结合力
通过酶联免疫吸附剂测定分析AG8抗体与制备的四种抗体(MJ-F1、MJ-F2、MJ-F3、MJ-F4)的内皮素受体结合力。利用0.05M的Na2CO3(pH 9.6)缓冲液稀释人Gαi3，在4℃的温度下，以5μg/孔的浓度在96孔板(96well plate)(Costar)结合16小时。将其放入含有4％的脱脂乳(skim milk)的包含0.05％的吐温20(Tween-20)的磷酸盐缓冲液(PBST)，使其变为w/v5％，之后，在常温条件下，将各个96孔板封闭(bloking)1小时。丢弃上述溶液后，以150μl/孔利用包含0.05％的吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤4次后，在大肠杆菌中表达纯化，利用肌氨酰(Sarkosyl)结合5μg/ml的重构(reconstitution)的内皮素受体，从而，固定抗原来使细胞外区域暴露。对在动物细胞中表达纯化的AG8和四种制备的抗体(MJ-F1、MJ-F2、MJ-F3、MJ-F4)进行4倍连续稀释(serial dilution)，并在常温条件下，以50μl/孔在96孔板结合1小时。之后，以150μl/孔利用0.05％的包含0.05％的吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤4次后，在磷酸盐缓冲液以1∶5000的比例稀释人免疫球蛋白G(H+L)-辣根过氧化物酶缀合物(conjugate)，并在常温条件下，在各个96孔板结合1小时。丢弃上述溶液后，以150μl/孔利用0.05％的包含0.05％的吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤4次后，以50μl/孔利用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB，Thermo Scientific)进行反应，20分钟后，利用4N的H2SO4终止反应，在450nm处测定吸光度。酶联免疫吸附剂测定信号分析结果，作为对照组的曲妥单抗、MJ-F3、MJ-F4的结合力非常低而无法测量，相反，MJ-F2平衡解离常数为132.8nM，MJ-F1的可见平衡解离常数为1.41nM，与在现有专利中发现的AG8抗体相比，示出约提高19倍(26.1/1.41)的结果(图5，表1)。
表1
MJ-F1 MJ-F2 AG8 MJ-F3 MJ-F4 赫赛汀(Herceptin)
K<sub>D</sub>(nM) 1.41 132.8 26.1 n.d. n.d. n.d.
对于人内皮素受体A制备的四种抗体的抗原-抗体之间的酶联免疫吸附剂测定中的抗原-抗体的计算的平衡解离常数
实施例4：设计为曲妥单抗骨架区的抗内皮素受体A抗体的动物细胞中的表达及纯化
为了利用包含聚乙烯亚胺(Polysciences，美国)的150mM的NaCl溶液在Expi293细胞中对通过大肠杆菌转化扩增并回收的表达载体进行瞬时转染，进行基因转染，在Freestyle293表达培养基(Life Technologies，美国)中，以37℃的温度培养7天。以6000rpm将表达的细胞培养液离心分离20分钟后，取上清液并通过0.22μm的过滤器过滤。在4℃的温度下，诱导过滤到上清液与1ml的蛋白A(Amicogen，韩国)树脂结合16小时。利用10CV(柱体积)的磷酸盐缓冲液洗涤结合的树脂后，利用100mM的甘氨酸(pH 2.7)溶液洗脱后，利用1M的Tris-HCl(pH 8.0)中和。利用磷酸盐缓冲液更换缓冲液后，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳在还原条件和非还原条件下分别分析设计为纯化的曲妥单抗骨架区的抗内皮素受体A抗体(Fc区利用野生型或作为SEQ ID NO：35的Fc变体的PFc29)(MJF1-WT、MJF1-pFc29、FG12-pFc29、GG12-pFc29)的轻链和重链的大小和纯度。设计为曲妥单抗骨架区的抗内皮素受体A抗体(MJF1-WT、MJF1-pFc29、FG12-pFc29、GG12-pFc29)纯化后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析确认(图6)。
实施例5：分析设计为内皮素受体A抗原区和曲妥单抗骨架区的抗内皮素受体A抗体的结合力
通过酶联免疫吸附剂测定分析设计为在实施例1选定的曲妥单抗骨架区来制备的五种抗体(MJF1-WT、MJF1-pFc29、FG12-pFc29、GG12-pFc29、EF12-pFc29)的内皮素受体结合力。利用0.05M的Na2CO3(pH 9.6)缓冲液稀释人Gαi3，在4℃温度下，以5μg/孔的浓度在96孔板(Costar)结合16小时。将其放入含有4％的脱脂乳的磷酸盐缓冲液，使其变为w/v 5％，之后，在常温条件下，将各个96孔板封闭1小时。丢弃上述溶液后，以150μl/孔利用包含0.05％的吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤4次后，在大肠杆菌表达纯化，利用肌氨酰结合5μg/ml的重构的内皮素受体，从而，固定抗原来使细胞外区域暴露。对在动物细胞中表达纯化的五种抗体进行4倍连续稀释，并在常温条件下，以50μl/孔在96孔板结合1小时。之后，以150μl/孔利用0.5％的包含0.05％的吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤4次后，在磷酸盐缓冲液以1∶5000的比例稀释人免疫球蛋白G(H+L)-辣根过氧化物酶缀合物，并在常温条件下，在各个96孔板结合1小时。丢弃上述溶液后，以150μl/孔利用0.5％的包含0.05％的吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤4次后，以50μl/孔利用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(Thermo Scientific)进行反应，20分钟后，利用4N的H2SO4终止反应，在450nm处测定吸光度。酶联免疫吸附剂测定信号分析结果，作为对照组的曲妥单抗的结合力非常低而无法测量，相反，MJF1-WT的平衡解离常数为0.4873nM，MJF1-pFc29的平衡解离常数为0.3637nM，AB9-pFc29的平衡解离常数为0.7706nM，FG12-pFc29的平衡解离常数为0.4809nM，EF12-pFc29的平衡解离常数为0.6044nM，GG12-pFc29的平衡解离常数为0.2875nM(图7，表2)。
表2
Figure GDA0003417622310000211
在具有上述骨架序列的六种酶联免疫吸附剂测定中的内皮素受体A抗原-抗体之间计算的平衡解离常数
实施例6：分析设计为曲妥单抗骨架区的抗内皮素受体A抗体与pH-依赖性FcRn的结合力
通过酶联免疫吸附剂测定分析设计为在实施例1选定的曲妥单抗骨架区来制备的五种抗体(MJF1-WT、MJF1-pFc29、FG12-pFc29、GG12-pFc29、EF12-pFc29)与人FcRn的结合力。利用0.05M的Na2CO3(pH 9.6)缓冲液稀释设计为曲妥单抗骨架区来制备的五种抗体，在4℃的温度下，以4μg/孔的浓度在96孔板(Costar)结合16小时。将其放入含有4％的脱脂乳的磷酸盐缓冲液，使其变为w/v 5％，之后，在常温条件下，将各个96孔板封闭1小时。丢弃上述溶液后，以150μl/孔利用包含0.05％的吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤4次后，对人FcRn与谷胱甘肽(Glutathione)(GST)融合的蛋白质进行4倍连续稀释，并在常温条件下，以50μl/孔在96孔板分别以pH 7.4和pH 6.0的条件结合1小时。之后，以150μl/孔利用0.5％的包含0.05％的吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤4次后，在包含0.05％的吐温20的磷酸盐缓冲液以1∶5000的比例稀释抗谷胱甘肽-辣根过氧化物酶缀合物，并在常温条件下，在各个96孔板结合1小时。丢弃上述溶液后，以150μl/孔利用0.5％的包含0.05％的吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤4次后，以50μl/孔利用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(Thermo Scientific)进行反应，20分钟后，利用4N的H2SO4终止反应，在450nm处测定吸光度，从而获得如图8的结果。经确认，酶联免疫吸附剂测定信号分析结果，在动物细胞中表达纯化的五种抗体的pH-依赖性人FcRn结合与在血液半衰期中优秀的曲妥单抗对照组抗体非常相似(图8)。
实施例7：分析设计为曲妥单抗骨架区的抗内皮素受体A抗体与人FcγRIIa变体之间的结合力
通过酶联免疫吸附剂测定分析设计为在实施例1选定的曲妥单抗骨架区来制备的四种抗体(MJF1-WT、MJF1-pFc29、FG12-pFc29、GG12-pFc29)与人FcγRIIa变体(FcγRIIa-131R、FcγRIIa-131H、FcγRIIa-158V、FcγRIIa-158F)之间的结合力。利用0.05M的Na2CO3(pH 9.6)缓冲液稀释设计为曲妥单抗骨架区来制备的四种抗体，在4℃的温度下，以4μg/孔的浓度在96孔板(Costar)结合16小时。将其放入含有4％的脱脂乳的磷酸盐缓冲液，使其变为w/v 5％，之后，在常温条件下，将各个96孔板封闭1小时。丢弃上述溶液后，以150μl/孔利用包含0.05％的吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤4次后，对融合有人FcγRIIa变体的谷胱甘肽蛋白质进行4倍连续稀释，并在常温条件下，以50μl/孔在96孔板结合1小时。之后，以150μl/孔利用0.5％的包含0.05％的吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤4次后，在包含0.05％的吐温20的磷酸盐缓冲液以1∶5000的比例稀释抗-谷胱甘肽-辣根过氧化物酶缀合物，并在常温条件下，在各个96孔板结合1小时。丢弃上述溶液后，以150μl/孔利用0.5％的包含0.05％的吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤4次后，以50μl/孔利用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(ThermoScientific)进行反应，20分钟后，利用4N的H2SO4终止反应，在450nm处测定吸光度，从而获得如图9的结果。酶联免疫吸附剂测定信号分析结果，在动物细胞中表达纯化的四种抗体与人FcγRIIa变体之间的结合和曲妥单抗对照组抗体非常相似(图9)。
实施例8：分析设计为曲妥单抗骨架区的抗内皮素受体A抗体与人C1q的结合力
通过酶联免疫吸附剂测定分析设计为在实施例1选定的曲妥单抗骨架区来制备的四种抗体(MJF1-WT、MJF1-pFc29、FG12-pFc29、GG12-pFc29)与人C1q之间的结合力。利用0.05M的Na2CO3(pH 9.6)缓冲液稀释设计为曲妥单抗骨架区来制备的四种抗体，在4℃的温度下，以4μg/孔的浓度在96孔板(Costar)结合16小时。将其放入含有4％的脱脂乳的磷酸盐缓冲液，使其变为w/v 5％，之后，在常温条件下，将各个96孔板封闭1小时。丢弃上述溶液后，以150μl/孔利用包含0.05％的吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤4次后，对人C1q进行4倍连续稀释，并在常温条件下，以50μl/孔在96孔板结合1小时。之后，以150μl/孔利用0.5％的包含0.05％的吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤4次后，在包含0.05％的吐温20的磷酸盐缓冲液以1∶400的比例稀释抗-人C1q-辣根过氧化物酶缀合物，并在常温条件下，在各个96孔板结合1小时。丢弃上述溶液后，以150μl/孔利用0.5％的包含0.05％的吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤4次后，以50μl/孔利用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(Thermo Scientific)进行反应，20分钟后，利用4N的H2SO4终止反应，在450nm处测定吸光度，从而获得如图10的结果。酶联免疫吸附剂测定信号分析结果，在动物细胞中表达纯化的四种抗体与人C1q之间的结合力和曲妥单抗对照组抗体非常相似(图10)。
实施例9：确认设计为曲妥单抗骨架区的抗内皮素受体A抗体在结肠癌细胞中的增殖抑制功效
在结肠癌细胞研究中通常使用的HT-29细胞株和HCT-116细胞株中，确认设计为骨架区的抗内皮素受体A抗体是否具有结肠癌细胞增殖力抑制功效。利用CyQUANT NF荧光颜料(Invitrogen，美国)，通过测定细胞中的脱氧核糖核酸地量来确认细胞的增殖程度。
在HT-29细胞株和HCT-116细胞株分别处理设计为曲妥单抗骨架区的抗内皮素受体A四种抗体(MJF1-WT、MJF1-pFc29、FG12-pFc29、GG12-pFc29)，在37℃的细胞培养箱中一同培养1小时后接种，72小时后，利用CyQUANT NF荧光颜料进行处理，利用荧光分光光度计(TECAN，Switzerland)测定由取决于在细胞中存在的脱氧核糖核酸水平的485nm的激发波长释放的荧光之比(Emission by 485nm excitation)，从而确认骨架区设计的抗内皮素受体A抗体抑制结肠癌细胞的增殖力(图11)。如图11所示，确认本申请的抗体有效抑制HT-29和HCT-116结肠癌细胞株的增殖。
实施例10：确认结肠癌动物模型中的设计为曲妥单抗骨架区的抗内皮素受体A抗体的抗癌有效性
利用BALB/c裸鼠(nude mouse)，以成为每只2×106细胞数的方式根据100μl的磷酸盐缓冲液向侧腹区(flanks region)皮下注射(subcutaneous injection)结肠癌HT-29细胞株来制备异种移植(xenograft)模型，从注射后第5天起，以200μg的浓度每隔2天向生成的结肠癌组织直接注射本申请发现的抗体，由此，进行用于验证抗癌有效性的实验，在注射21天后，摘除结肠癌组织来导出如图12的结果。Vehicle对照组为单独注射与抗体相同量的磷酸盐缓冲液的组。
如图12所示，确认了本申请的设计为曲妥单抗骨架区的抗内皮素受体A四种抗体(MJF1-WT、MJF1-pFc29、FG12-pFc29、GG12-pFc29)在HT-29结肠癌细胞株的异种移植模型中抑制结肠癌的生长的效果。通过上述结果，在本申请的设计为曲妥单抗骨架区的抗内皮素受体A四种抗体具有在动物模型中也有效抑制结肠癌细胞的增殖的活性，并确认了具有作为治疗剂的功效。
实施例11：确认设计为曲妥单抗骨架区的抗内皮素受体A抗体在胰腺癌细胞中的增殖抑制功效
为了确认在胰腺癌细胞研究中通常使用的AsPC-1和Panc-1细胞株中设计为骨架区的抗内皮素受体A抗体(MJF1-WT、MJF1-pFc29、FG12-pFc29、GG12-pFc29)的癌症细胞增殖抑制功效，通过使用如实施例9的方法来导出如图13的结果。
如图13所示，确认在本申请的设计为骨架区的抗内皮素受体A抗体(MJF1-WT、MJF1-pFc29、FG12-pFc29、GG12-pFc29)在胰腺癌细胞株中也有效抑制癌症细胞的增殖的效果。通过上述结果，确认本申请的设计为骨架区的抗内皮素受体A抗体(MJF1-WT、MJF1-pFc29、FG12-pFc29、GG12-pFc29)具有有效抑制胰腺癌细胞的增殖的活性。
实施例12：确认设计为曲妥单抗骨架区的抗内皮素受体A抗体的胃癌细胞中的增殖抑制功效
为了确认在胃癌细胞研究中通常使用的SNU-216和SNU-668细胞株中设计为骨架区的抗内皮素受体A抗体(MJF1-WT、MJF1-pFc29、FG12-pFc29、GG12-pFc29)的癌症细胞增殖抑制功效，使用如实施例9的方法，并导出如图14的结果。
如图14所示，确认本申请的设计为骨架区的抗内皮素受体A抗体(MJF1-WT、MJF1-pFc29、FG12-pFc29、GG12-pFc29)在胃癌细胞株中也有效抑制癌症细胞的增殖的效果。通过上述结果，确认本申请的设计为骨架区的抗内皮素受体A抗体(MJF1-WT、MJF1-pFc29、FG12-pFc29、GG12-pFc29)具有有效抑制胃癌细胞的增殖的活性。
实施例13：确认设计为曲妥单抗骨架区的抗内皮素受体A抗体的物性及特性
通过分子排阻色谱-高效液相色谱法分离设计为曲妥单抗骨架区的抗内皮素受体A抗体(MJF1-WT、MJF1-pFc29、GG12-pFc29、FG12-pFc29)及对照组抗体曲妥单抗，结果确认了图15所示的凝聚的百分比为10％以下。如图16所示，分析糖链结构的结果，发现的抗体的糖链结构与人免疫球蛋白G标准(standard)没有显著差异。图17为通过反相高效液相色谱判断是否具有杂质的结果，示出在三种抗体中的杂质为8％以下。在发现的抗体的热稳定性试验(nanoDSC)中，确认了抗体的Tm值为70℃以上(图18)。
以上，详细记述了本发明的特定部分，对本领域的普通技术人员而言这种具体记述仅为优选实例，明确的是本发明的范围并不局限于此。因此，本发明的实质范围由发明要求保护范围和其等同技术方案定义。
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Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 21
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL-FR3 No.2
<400> 21
Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 22
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL-FR3 No.3
<400> 22
Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 23
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL-FR3 No.4
<400> 23
Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL-FR4 No.1, 2, 3 or 4
<400> 24
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
1 5 10
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH-CDR1
<400> 25
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser Asp
1 5
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH-CDR2
<400> 26
Met Asn Pro Lys Asn Gly Asn Thr
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL-CDR1
<400> 27
Gln Gly Ile Asn Asn Tyr
1 5
<210> 28
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL-CDR2
<400> 28
Val Gly Ser
1
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VL-CDR3
<400> 29
Leu Gln His Asn Thr Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 30
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH-CDR3-AG8
<400> 30
Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Ser Gly Thr Tyr Gly Phe Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 31
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH-CDR3-EF12
<400> 31
Ala Lys Asp Pro Tyr Gly Ser Gly Thr Tyr Gly Phe Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 32
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH-CDR3-GG12
<400> 32
Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Ser Gly Val Tyr Gly Phe Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 33
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH-CDR3-FG12
<400> 33
Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Leu Gly Thr Tyr Gly Phe Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 34
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH-CDR3-AB9
<400> 34
Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Ser Gly Thr Tyr Gly Glu Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 35
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PFc29
<400> 35
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Arg Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225

Claims (32)

1.一种单克隆抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区及轻链可变区，与内皮素受体A特异性结合，其特征在于，包括：
(a)，上述重链可变区包括SEQ ID NO：25的重链可变区-互补决定区1及SEQ ID NO：26的重链可变区-互补决定区2；
(b)，上述轻链可变区包括SEQ ID NO：27的轻链可变区-互补决定区1、SEQ ID NO：28的轻链可变区-互补决定区2及SEQ ID NO：29的轻链可变区-互补决定区3；以及
(c)，上述重链可变区包括SEQ ID NO：30的重链可变区-互补决定区3或者在SEQ IDNO：30中的选自由第4位氨基酸、第7位氨基酸、第9位氨基酸及第12位氨基酸组成的组中的位置包含突变的序列的重链可变区-互补决定区3。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述重链可变区的重链可变区-互补决定区3包含如下的突变：在SEQ ID NO：30中，第4位氨基酸被脯氨酸取代；第7位氨基酸被亮氨酸取代；第9位氨基酸被缬氨酸取代；或者第12位氨基酸被谷氨酸取代。
3.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述重链可变区的重链可变区-互补决定区3为选自由SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ IDNO：33及SEQ ID NO：34组成的组中的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述重链可变区包括SEQ ID NO：1的重链可变区骨架区1或者在SEQ ID NO：1中的选自由第16位氨基酸及第24位氨基酸组成的组中的一个以上的位置包含突变的序列的重链可变区骨架区1。
5.根据权利要求4所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述重链可变区的重链可变区骨架区1包含如下的突变：在SEQ ID NO：1中，第16位氨基酸被精氨酸取代；或者第24位氨基酸被缬氨酸取代。
6.根据权利要求4所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述重链可变区的重链可变区骨架区1为选自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3组成的组中的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述重链可变区包括SEQ ID NO：4的重链可变区骨架区2或者在SEQ ID NO：4中的选自由第1位氨基酸、第2位氨基酸、第4位氨基酸、第16位氨基酸及第17位氨基酸组成的组中的一个以上的位置包含突变的序列的重链可变区骨架区2。
8.根据权利要求7所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述重链可变区的重链可变区骨架区2包含选自由如下的突变组成的组中的一种以上的突变：在SEQ IDNO：4中，第1位氨基酸被甲硫氨酸取代；第2位氨基酸被天冬酰胺取代；第4位氨基酸被异亮氨酸取代；第16位氨基酸被丝氨酸或甘氨酸取代；以及第17位氨基酸被丙氨酸、色氨酸或丝氨酸取代。
9.根据权利要求7所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述重链可变区的重链可变区骨架区2为选自由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：7组成的组中的氨基酸序列。
10.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述重链可变区包括SEQ ID NO：8的重链可变区骨架区3或者在SEQ ID NO：8中的选自由第1位氨基酸、第4位氨基酸、第5位氨基酸、第6位氨基酸、第7位氨基酸、第8位氨基酸、第12位氨基酸、第14位氨基酸、第16位氨基酸、第17位氨基酸、第19位氨基酸、第20位氨基酸及第21位氨基酸组成的组中的一个以上的位置包含突变的序列的重链可变区骨架区3。
11.根据权利要求10所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述重链可变区的重链可变区骨架区3包含选自由如下的突变组成的组中的一种以上的突变：在SEQ IDNO：8中，第1位氨基酸被天冬氨酸、苏氨酸或天冬酰胺取代；第4位氨基酸被丙氨酸取代；第5位氨基酸被天冬氨酸取代；第6位氨基酸被苯丙氨酸取代；第7位氨基酸被谷氨酸取代；第8位氨基酸被精氨酸取代；第12位氨基酸被苯丙氨酸取代；第14位氨基酸被精氨酸或亮氨酸取代；第16位氨基酸被天冬酰胺或天冬氨酸取代；第17位氨基酸被丙氨酸取代；第19位氨基酸被丝氨酸取代；第20位氨基酸被丝氨酸取代；以及第21位氨基酸被亮氨酸或苯丙氨酸取代。
12.根据权利要求10所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述重链可变区的重链可变区骨架区3为选自由SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：11组成的组中的氨基酸序列。
13.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述重链可变区包括SEQ ID NO：12的重链可变区骨架区4。
14.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述轻链可变区包括SEQ ID NO：13的轻链可变区骨架区1或者在SEQ ID NO：13中的选自由第4位氨基酸及第24位氨基酸组成的组中的一个以上的位置包含突变的序列的轻链可变区骨架区1。
15.根据权利要求14所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述轻链可变区的轻链可变区骨架区1包含如下的突变：在SEQ ID NO：13中，第4位氨基酸被亮氨酸取代；或者第24位氨基酸被丝氨酸取代。
16.根据权利要求14所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述轻链可变区的轻链可变区骨架区1为选自由SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15组成的组中的氨基酸序列。
17.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述轻链可变区包括SEQ ID NO：16的轻链可变区骨架区2或者在SEQ ID NO：16中的选自由第1位氨基酸、第2位氨基酸及第14位氨基酸组成的组中的一个以上的位置包含突变的序列的轻链可变区骨架区2。
18.根据权利要求17所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述轻链可变区的轻链可变区骨架区2包含选自由如下的突变组成的组中的一种以上的突变：在SEQ IDNO：16中，第1位氨基酸被亮氨酸或甲硫氨酸取代；第2位氨基酸被天冬酰胺取代；以及第14位氨基酸被缬氨酸取代。
19.根据权利要求17所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述轻链可变区的轻链可变区骨架区2为选自由SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18及SEQ IDNO：19组成的组中的氨基酸序列。
20.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述轻链可变区包括SEQ ID NO：20的轻链可变区骨架区3或者在SEQ ID NO：20中的选自由第1位氨基酸、第3位氨基酸、第14位氨基酸及第31位氨基酸组成的组中的一个以上的位置包含突变的序列的轻链可变区骨架区3。
21.根据权利要求20所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述轻链可变区的轻链可变区骨架区3包含选自由如下的突变组成的组中的一种以上的突变：在SEQ IDNO：20中，第1位氨基酸被苏氨酸、丝氨酸或酪氨酸取代；第3位氨基酸被谷氨酰胺、组氨酸或谷氨酸取代；第14位氨基酸被甘氨酸取代；以及第31位氨基酸被缬氨酸取代。
22.根据权利要求20所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述轻链可变区的轻链可变区骨架区3为选自由SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22及SEQ IDNO：23组成的组中的氨基酸序列。
23.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述轻链可变区包括SEQ ID NO：24的轻链可变区骨架区4。
24.一种核酸分子，其特征在于，编码权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
25.一种载体，其特征在于，包含权利要求24所述的核酸分子。
26.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求25所述的载体。
27.一种用于预防或治疗癌症的药剂学组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、权利要求24所述的核酸分子或权利要求25所述的载体。
28.一种用于预防或治疗高血压的药剂学组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、权利要求24所述的核酸分子或权利要求25所述的载体。
29.一种样品中包含的内皮素受体A的定量方法，其特征在于，包括处理权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的步骤。
30.一种用于诊断由内皮素受体A的过表达引起的疾病的信息提供方法，其特征在于，包括：
步骤(a)，从受试者获取体外分离的样品；
步骤(b)，使用权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段处理上述样品；以及
步骤(c)，判断上述受试者的样品中包含的内皮素受体A的表达量是否高于正常组样品中包含的内皮素受体A的表达量。
31.根据权利要求30所述的用于诊断由内皮素受体A的过表达引起的疾病的信息提供方法，其特征在于，上述由内皮素受体A的过表达引起的疾病为癌症或高血压。
32.一种内皮素受体A定量试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
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