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CN113925805A - 一种牡丹花细胞发酵液及其制备方法、应用 - Google Patents

一种牡丹花细胞发酵液及其制备方法、应用 Download PDF

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CN113925805A
CN113925805A CN202111073238.3A CN202111073238A CN113925805A CN 113925805 A CN113925805 A CN 113925805A CN 202111073238 A CN202111073238 A CN 202111073238A CN 113925805 A CN113925805 A CN 113925805A
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Hangzhou Huajingxiang Biotechnology Co ltd
Shanghai Zhina Biotechnology Co ltd
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Zhejiang Yige Enterprise Management Group Co ltd
Shanghai Zhina Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明公开了一种牡丹花细胞发酵液的制备方法，其包括下述步骤：牡丹花经微波灭酶灭菌、研磨或压榨、用双歧杆菌Bifidobacterium bifidum进行微生物转化即可；其中，所述微波灭酶灭菌的微波功率为300W～800W；所述微波灭酶灭菌的时间为0.5min～10min。制得的牡丹花细胞发酵液，细胞壁破裂完全、可有效防止酶促褐变、外观稳定性好、细胞液收集完全。该制备方法损耗小、原料来源广。将该牡丹花细胞发酵液应用于皮肤外用制剂中，其抗氧化效果和美白效果显著提高、稳定性更好。

Description

一种牡丹花细胞发酵液及其制备方法、应用
技术领域
本发明涉及中药技术领域，具体涉及一种牡丹花细胞发酵液及其制备方法、应用。
背景技术
随着科学的发展，给美容化妆品行业带来了新的发展，人们已不满足于精细化工美容，而转向更绿色安全及高效的植物美容和细胞基因美容。同时，目前市场上利用发酵技术生产的化妆品有很多，如雅诗兰黛小棕瓶、SK-Ⅱ神仙水等，因具有一些独特的优势，这类发酵化妆品已成为市场发展的新方向。
如Lee等研究发现(Lee H S,Kim M R,Park Y,et al.Fermenting Red GinsengEnhances Its Safety and Efficacy as a Novel Skin Care Anti-Aging Ingredient:In Vitro and Animal Stμdy[J].Joμrnal of medicinal food,2012,15(11):1015-1023.)，发酵红参对酪氨酸酶活性和弹性蛋白酶活性的抑制比未发酵的红参更有效。在皮肤致敏试验中，发酵红参的致敏率明显低于未发酵红参。
牡丹花为芍药科植物牡丹(Paeonia sμffrμticosa Andr.)的花，是重要的观赏植物，属于中国十大名花之一。牡丹曾被当作中国的国花，素有“花中之王”的美誉，因其花大而香，故又有“国色天香”之称。现代研究表明牡丹花提取物具有抗氧化以及美白等护肤功效。常用于化妆品的牡丹花提取物多为牡丹花纯露和牡丹花水提液。牡丹花水提液仅含有水溶性成分；牡丹花纯露为牡丹花加水蒸馏而得，其中仅含有少量牡丹花挥发性成分。而牡丹花细胞水通过牡丹花研磨制得，既包含水溶性成分，又保留了牡丹花的挥发性成分。
通常提取植物中细胞液的方法有压榨法、真空干馏法、磨浆法等。压榨法是指通过压力，将植物的细胞壁压破从而挤出细胞液，此方法在加工过程中不受热，可以提取植物中易挥发的成分。压榨法虽然工艺简单，但是损耗大。真空干馏法是指通过减压干燥来收集物料中的液体及挥发性成分，此方法并不能完全收集植物中的细胞液。磨浆法是指物料通过高速相对连动的定齿与动齿之间，使物料受到强大的剪切力，摩擦力及高频振动等作用，进行粉碎，其优点是提取为冷提取，大分子及色素溶出少，保护热敏物质，提取效率高。虽然磨浆法可以较方便快捷的获取植物中的细胞液，但是，磨浆法仅是物理破壁法，并不能完全促使细胞壁破裂，同时由于多酚氧化酶和过氧化物酶的存在，会引起细胞液的褐变。因此，为使细胞壁完全破裂以及避免或降低酶促褐变的发生，必须采取有效的方法使细胞壁完全破裂，同时杀灭或抑制多酚氧化酶和过氧化物酶的活性。
中国专利文献CN112111324A中披露了一种低成本、提取效率高的牡丹花原液的提取方法，该方法按下述步骤进行：(1)采收花期初期的丹凤牡丹花瓣；(2)将花瓣于-10℃～-2℃下冷冻保存；(3)利用微波杀菌设备对(2)中冷冻后的花瓣进行高温灭酶灭菌，冷冻后的花瓣依次通过升温区(40～60℃)、高温区(90～100℃)、降温区(70～85℃)直至输送至75～80℃环境下微波灭酶；(4)将(3)中所获得的物料进行压榨，获得牡丹花瓣压榨液；(5)将(4)中的牡丹花瓣压榨液进行静置1～3小时，取上层液体获得牡丹花瓣原液第一粗液；(6)在(5)中的牡丹花瓣原液第一粗液过滤时，压榨液加入2％活性炭，加热搅拌后的牡丹花原液第二粗液；(7)将牡丹鲜花原液第二粗液二次过滤，获得牡丹鲜花原液，过滤后加入防腐剂。该方法所得牡丹花原液需经过高温处理，采用活性炭吸附，可能会破坏牡丹中的热敏性成分以及吸附部分活性成分。
中国专利文献CN109730948A公开了从牡丹鲜花中提取牡丹鲜花细胞水的方法，其步骤如下：(1)采摘牡丹初开两天的鲜花，保留牡丹花蕊；(2)将(1)中采摘的牡丹鲜花冲洗干净，晾干并压榨，过滤得牡丹汁液和牡丹花渣Ⅰ；(3)将步骤(2)中的牡丹花渣、芍药和辅料经超声旋转蒸发仪旋蒸，将干馏牡丹花渣Ⅰ中的细胞液析出的蒸汽抽取冷凝，得冷凝液Ⅰ，保留剩下的牡丹花渣Ⅱ；(4)在牡丹花渣Ⅱ中加入6～10倍的水，再加入纤维素酶和果胶酶，灭酶后将酶解液旋转蒸发，蒸汽抽取并冷凝，得冷凝液Ⅱ；(5)将牡丹花汁液、冷凝液Ⅰ、冷凝液Ⅱ合并，得牡丹鲜花细胞水。该方法仅对牡丹花渣Ⅱ进行灭酶，并未对压榨液进行灭酶处理，此牡丹鲜花细胞水中仍然存在大量的多酚氧化酶和过氧化物酶，会影响其外观和功效。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中提取植物中细胞液的方法细胞壁破裂不完全、存在酶促褐变、细胞液收集不完全、外观稳定性差、损耗大的缺陷，而提供一种牡丹花细胞发酵液及其制备方法、应用。
该牡丹花细胞发酵液，细胞壁破裂完全、可有效防止酶促褐变、外观稳定性好、细胞液收集完全。该制备方法损耗小、原料来源广。将该牡丹花细胞发酵液应用于皮肤外用制剂中，其抗氧化效果和美白效果显著提高、稳定性更好。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种牡丹花细胞发酵液的制备方法，其包括下述步骤：牡丹花经微波灭酶灭菌、研磨或压榨、用双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)进行微生物转化即可；
其中，所述微波灭酶灭菌的微波功率为300W～800W；
所述微波灭酶灭菌的时间为0.5min～10min。
本发明中，所述微波灭酶灭菌的微波功率优选为350W～800W，例如400W、450W、500W、550W、600W、650W、700W或750W。
本发明中，所述微波灭酶灭菌的时间优选为0.5min～9min，例如2min、3min、5min、7min或9min。
本发明中，所述研磨得到的牡丹花研磨粉的粒径为≥5μm，优选为5～120μm，更优选为10～100μm，例如10μm、50μm、80μm或100μm。
本发明中，所述压榨操作可为本领域常规，优选为采用静压式冷榨机(CarverLaboratory Press，美国FREDS.CARVER.NC公司)，压榨压力为4～6MPa，例如5MPa。
本发明中，所述的用双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)进行微生物转化的方式一般为将双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)接种至牡丹花浆料发酵培养即可。
所述双歧杆菌的接种量优选为0.5～20％，例如0.5％、8％或20％，上述百分比为双歧杆菌的用量占所述牡丹花浆料的总用量的质量百分比。
所述发酵培养可为25℃～40℃发酵培养3～24h，优选为30℃～40℃发酵培养5～10h，更优选为35℃～38℃发酵培养5～10h。
本发明较佳实施方案中，采用的双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)购自ATCC，编号29521。
本发明中，所述用双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)进行微生物转化后，优选地还包括离心、过滤、灭菌、过水膜和与防腐剂混合步骤。
其中，所述离心操作、所述过滤操作可为本领域常规，得到澄清滤液即可。
所述灭菌操作可为本领域常规，优选为90℃～100℃水浴灭菌20min～60min，更优选为95℃水浴灭菌30min。
所述过水膜操作可为本领域常规。所述水膜厚度优选为0.22μm～5μm，更优选为0.45μm。
所述防腐剂可为本领域常规防腐剂，优选为1,2-己二醇、对羟基苯乙酮、苯甲酸钠、山梨酸钾、羟苯甲酯、甲基异噻唑啉酮、苯氧乙醇、乙基己基甘油、辛酰羟肟酸和辛甘醇中的一种或多种，更优选为1,2-己二醇和对羟基苯乙酮、苯甲酸钠和山梨酸钾、羟苯甲酯和甲基异噻唑啉酮、苯氧乙醇和羟苯甲酯、苯氧乙醇和乙基己基甘油、辛酰羟肟酸和1,2-己二醇，或，辛甘醇和1,2-己二醇，例如1,2-己二醇和对羟基苯乙酮。
当所述防腐剂为己二醇和对羟基苯乙酮的混合物时，己二醇的用量为0.5％，对羟基苯乙酮的用量为0.5％；
当所述防腐剂为苯甲酸钠和山梨酸钾的混合物时，苯甲酸钠的用量为0.5％，山梨酸钾的用量为0.2％；
当所述防腐剂为羟苯甲酯和甲基异噻唑啉酮的混合物时，羟苯甲酯的用量为0.1％，甲基异噻唑啉酮的用量为0.095％；
当所述防腐剂为苯氧乙醇和羟苯甲酯的混合物时，苯氧乙醇的用量为0.9％，羟苯甲酯的用量为0.1％；
当所述防腐剂为苯氧乙醇和乙基己基甘油的混合物时，苯氧乙醇的用量为0.63％，乙基己基甘油的用量为0.07％；
当所述防腐剂为辛酰羟肟酸和己二醇的混合物时，辛酰羟肟酸的用量为0.1％，己二醇的用量为0.4％；
当所述防腐剂为辛甘醇和己二醇的混合物时，辛甘醇的用量为0.8％，己二醇的用量为0.1％；
所述防腐剂优选为己二醇和对羟基苯乙酮的混合物，己二醇的用量为0.5％，对羟基苯乙酮的用量为0.5％；上述百分比为所述防腐剂各组分的用量占所述牡丹花细胞发酵液的总用量的质量百分比。
本发明中，所述牡丹花可为任何时间采摘的牡丹鲜花花瓣，例如早晨10点之前采摘的牡丹鲜花花瓣，或，早晨10点之后采摘的牡丹鲜花花瓣；优选为早晨10点之前采摘的牡丹鲜花花瓣。
本发明中，所述牡丹花优选经冷冻保存处理的牡丹花。
所述冷冻保存处理的条件可为本领域常规。
本发明一较佳实施例中，所述牡丹花细胞发酵液的制备方法可包括以下步骤：
步骤1、收取牡丹花，清洗牡丹花，将牡丹花擦干，冷冻保存；
步骤2、取出牡丹花，进行灭菌灭酶处理，微波功率设置为300W～800W，时间设置为0.5min～10min；
步骤3、取出牡丹花，用胶体磨制得5～120μm牡丹花浆料；
步骤4、取活化后的双歧杆菌，接种于牡丹花浆料，接种量为0.5～20％，在25℃～40℃发酵培养3～24h；
步骤5、离心过滤至澄清后，灭菌，过0.45μm水膜，与防腐剂混合即得牡丹花细胞发酵液。
本发明还提供了一种如前所述的制备方法制得的牡丹花细胞发酵液。
本发明还提供了一种如前所述的牡丹花细胞发酵液作为抗氧化活性成分或者美白活性成分在制备皮肤外用剂中的应用。
本发明中，所述皮肤外用剂可为本领域常规的精华、面膜、面霜等外用制剂。
本发明中，所述皮肤外用剂中，所述的牡丹花细胞发酵液的用量可为0.5～10wt％，优选为1～10％wt％，上述百分比为牡丹花细胞发酵液占皮肤外用剂原料总量的重量百分比。
本发明中，所述的牡丹花细胞发酵液在制备皮肤外用剂时优选地作为自由基清除剂或者酪氨酸酶抑制剂。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
(1)本发明的牡丹花细胞发酵液制备方法，可使牡丹花细胞壁完全破裂，除去牡丹花中过氧化物酶和多酚氧化酶，可有效防止牡丹花细胞发酵液的褐变，与未进行灭酶、发酵处理的牡丹花提取液相比，其抗氧化、美白效果显著提高，稳定性、安全性更高。
(2)本发明制得的牡丹花细胞发酵液添加在皮肤外用剂中，可起到抗氧化和美白效果。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述各实施例中，采用的双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)购自ATCC，编号29521；
双歧杆菌的接种量用百分比表示，其含义为双歧杆菌的用量占牡丹花浆料的总用量的质量百分比；
防腐剂为0.5％1,2-己二醇和0.5％对羟基苯乙酮的混合物，0.5％1,2-己二醇为1,2-己二醇的用量占牡丹花细胞发酵液的总用量的质量百分比；0.5％对羟基苯乙酮为对羟基苯乙酮的用量占牡丹花细胞发酵液的总用量的质量百分比；
灭菌灭酶处理的设备：巩义科瑞FCMCR-3S微波化学反应器。
压榨处理设备：设备静压式冷榨机(Carver Laboratory Press，美国FREDS.CARVER.NC公司)
实施例1
步骤1、收取牡丹花，清洗牡丹花，将牡丹花擦干，冷冻保存；
步骤2、取出牡丹花，进行灭菌灭酶处理，微波功率设置为450W，时间设置为3min；
步骤3、取出牡丹花，用胶体磨制得10μm的牡丹花浆料；
步骤4、取活化后的双歧杆菌，接种于牡丹花浆料，接种量为8％，在37℃发酵培养5h；
步骤5、离心过滤至澄清后，95℃水浴灭菌30min，过0.45μm水膜，加入0.5％1,2-己二醇和0.5％对羟基苯乙酮即得牡丹花细胞发酵液。
实施例2
步骤1、收取牡丹花，清洗牡丹花，将牡丹花擦干，冷冻保存；
步骤2、取出牡丹花，进行灭菌灭酶处理，微波功率设置为300W，时间设置为10min；
步骤3、取出牡丹花，用胶体磨制得50μm的牡丹花浆料；
步骤4、取活化后的双歧杆菌，接种于牡丹花浆料，接种量为0.5％，在25℃发酵培养24h；
步骤5、离心过滤至澄清后，95℃水浴灭菌30min，过0.45μm水膜，加入0.5％1,2-己二醇和0.5％对羟基苯乙酮即得牡丹花细胞发酵液。
实施例3
步骤1、收取牡丹花，清洗牡丹花，将牡丹花擦干，冷冻保存；
步骤2、取出牡丹花，进行灭菌灭酶处理，微波功率设置为800W，时间设置为0.5min；
步骤3、取出牡丹花，用胶体磨制得100μm的牡丹花研浆料；
步骤4、取活化后的双歧杆菌，接种于牡丹花浆料，接种量为20％，在40℃发酵培养3h；
步骤5、离心过滤至澄清后，95℃水浴灭菌30min，过0.45μm水膜，加入0.5％1,2-己二醇和0.5％对羟基苯乙酮即得牡丹花细胞发酵液。
实施例4
步骤1、收取牡丹花，清洗牡丹花，将牡丹花擦干，冷冻保存；
步骤2、取出牡丹花，进行灭菌灭酶处理，微波功率设置为450W，时间设置为3min；
步骤3、取出牡丹花，用胶体磨制得5μm的牡丹花浆料；
步骤4、取活化后的双歧杆菌，接种于牡丹花压榨液，接种量为8％，在37℃发酵培养5h；
步骤5、离心过滤至澄清后，95℃水浴灭菌30min，过0.45μm水膜，加入0.5％1,2-己二醇和0.5％对羟基苯乙酮即得牡丹花细胞发酵液。
实施例5
步骤1、收取牡丹花，清洗牡丹花，将牡丹花擦干，冷冻保存；
步骤2、取出牡丹花，进行灭菌灭酶处理，微波功率设置为450W，时间设置为3min；
步骤3、取出牡丹花，用胶体磨制得150μm的牡丹花浆料；
步骤4、取活化后的双歧杆菌，接种于牡丹花压榨液，接种量为8％，在37℃发酵培养5h；
步骤5、离心过滤至澄清后，95℃水浴灭菌30min，过0.45μm水膜，加入0.5％1,2-己二醇和0.5％对羟基苯乙酮即得牡丹花细胞发酵液。
实施例6
步骤1、收取上午10点后的牡丹花，清洗牡丹花，将牡丹花擦干，冷冻保存；
步骤2、取出牡丹花，进行灭菌灭酶处理，微波功率设置为450W，时间设置为3min；
步骤3、取出牡丹花，用胶体磨制得50μm的牡丹花浆料；
步骤4、取活化后的双歧杆菌，接种于牡丹花压榨液，接种量为8％，在37℃发酵培养5h；
步骤5、离心过滤至澄清后，95℃水浴灭菌30min，过0.45μm水膜，加入0.5％1,2-己二醇和0.5％对羟基苯乙酮即得牡丹花细胞发酵液。
实施例7
步骤1、收取牡丹花，清洗牡丹花，将牡丹花擦干，冷冻保存；
步骤2、取出牡丹花，进行灭菌灭酶处理，微波功率设置为450W，时间设置为3min；
步骤3、取出牡丹花，进行压榨处理；
步骤4、取活化后的双歧杆菌，接种于牡丹花压榨液，接种量为8％，在37℃发酵培养5h；
步骤5、离心过滤至澄清后，95℃水浴灭菌30min，过0.45μm水膜，加入0.5％1,2-己二醇和0.5％对羟基苯乙酮即得牡丹花细胞发酵液。
对比例1
步骤1、收取牡丹花，清洗牡丹花，将牡丹花擦干，冷冻保存；
步骤2、取出牡丹花，进行灭菌灭酶处理，微波功率设置为200W，时间设置为0.3min；
步骤3、取出牡丹花，用胶体磨制得50μm的牡丹花浆料；
步骤4、取活化后的双歧杆菌，接种于牡丹花浆料，接种量为0.1％，在10℃发酵培养3h；
步骤5、离心过滤至澄清后，95℃水浴灭菌30min，过0.45μm水膜，加入0.5％1,2-己二醇和0.5％对羟基苯乙酮即得牡丹花细胞发酵液。
对比例2
步骤1、收取牡丹花，清洗牡丹花，将牡丹花擦干，冷冻保存；步骤2、取出牡丹花，进行灭菌灭酶处理，微波功率设置为900W，时间设置为15min；
步骤3、取出牡丹花，用胶体磨制得50μm的牡丹花浆料；
步骤4、取活化后的双歧杆菌，接种于牡丹花浆料，接种量为25％，在45℃发酵培养30h；
步骤5、离心过滤至澄清后，95℃水浴灭菌30min，过0.45μm水膜，加入0.5％1,2-己二醇和0.5％对羟基苯乙酮即得牡丹花细胞发酵液。
对比例3
步骤1、收取牡丹花，清洗牡丹花，将牡丹花擦干，冷冻保存；
步骤2、取出牡丹花，进行灭菌灭酶处理，微波功率设置为450W，时间设置为3min；
步骤3、取出牡丹花，用胶体磨制得50μm的牡丹花浆料；
步骤4、取灭活的双歧杆菌，接种于牡丹花浆料，接种量为8％，在37℃发酵培养5h；
步骤5、离心过滤至澄清后，95℃水浴灭菌30min，过0.45μm水膜，加入0.5％1,2-己二醇和0.5％对羟基苯乙酮即得牡丹花细胞发酵液。
对比例4
步骤1、收取牡丹花，清洗牡丹花，将牡丹花擦干，冷冻保存；
步骤2、取出牡丹花，进行灭菌灭酶处理，微波功率设置为200W，时间设置为15min；
步骤3、取出牡丹花，用胶体磨制得50μm的牡丹花浆料；
步骤4、取活化后的双歧杆菌，接种于牡丹花压榨液，接种量为8％，在37℃发酵培养5h；
步骤5、离心过滤至澄清后，95℃水浴灭菌30min，过0.45μm水膜，加入0.5％1,2-己二醇和0.5％对羟基苯乙酮即得牡丹花细胞发酵液。
对比例5
步骤1、收取牡丹花，清洗牡丹花，将牡丹花擦干，冷冻保存；
步骤2、取出牡丹花，用胶体磨制得50μm的牡丹花浆料；
步骤3、取活化后的双歧杆菌，接种于牡丹花浆料，接种量为8％，在37℃发酵培养5h；
步骤4、离心过滤至澄清后，95℃水浴灭菌30min，过0.45μm水膜，加入0.5％1,2-己二醇和0.5％对羟基苯乙酮即得牡丹花细胞发酵液。
对比例6
步骤1、收取牡丹花，清洗牡丹花，将牡丹花擦干，冷冻保存；
步骤2、取出牡丹花，进行灭菌灭酶处理，微波功率设置为450W，时间设置为3min；
步骤3、取出牡丹花，进行压榨处理；
步骤5、离心过滤至澄清后，95℃水浴灭菌30min，过0.45μm水膜，加入0.5％1,2-己二醇和0.5％对羟基苯乙酮即得牡丹花压榨液。
对比例7
步骤1、收取牡丹花，清洗牡丹花，将牡丹花擦干，冷冻保存；
步骤2、取出牡丹花，用胶体磨制得50μm的牡丹花浆料；
步骤3、将牡丹花浆料与去离子水按1：3比例混合，进行循环回流式蒸馏4h，收集蒸馏液；
步骤4、95℃水浴灭菌30min，过0.45μm水膜，加入0.5％1,2-己二醇和0.5％对羟基苯乙酮即得牡丹花蒸馏液。
对比例8
步骤1、收集4月中下旬的上午6点～10点的丹凤牡丹花瓣，将花瓣于-10～-2℃下冷冻保存；
步骤2、将冷冻后的花瓣进行灭酶灭菌，微波功率60KW，温度为80℃，输送时间为3min，依次通过升温区(40～60℃)、高温区(90～100℃)、降温区(70～85℃)直至输送至75～80℃条件下灭酶灭菌；
步骤3、将步骤2所得物料进行压榨；
步骤4、将牡丹鲜花压榨液静置澄清后，取上层牡丹花瓣原液第一粗虑液，加热至90℃进行加热保温，将加热后的牡丹花瓣原液粗第一虑液通过纱布进行过滤；
步骤5、将步骤4中物料加入3％的活性炭，搅拌均匀，然后置于80℃水浴锅，加热至溶液冒沫，温度计测量溶液温度70～80℃即可；
步骤6、将步骤5溶液进行真空过滤，得牡丹鲜花原液第二粗液；
步骤7、将处理后的牡丹鲜花原液存放至灭菌的10kg塑料桶内(桶内加入3.3kg蒸馏水，然后加入牡丹鲜花原液至半桶位置，快速加入防腐剂后再陆续加入牡丹花水)，密封保存，即得牡丹鲜花原液。
对比例9
步骤1、采摘5月中下旬的上午8～10点的初开两天的牡丹鲜花，保留牡丹花蕊；
步骤2、将牡丹鲜花冲洗干净、晾干后压榨，得汁液和渣的混合物，过滤，得牡丹汁液与牡丹花渣Ⅰ；
步骤3、将步骤2中的牡丹花渣经低温超声旋转蒸发仪旋转，于37℃、超声频率25kHz、真空度40Pa，旋转转速25r/min，旋转干馏80min，将干馏析出的蒸汽冷凝后得冷凝液Ⅰ，保留剩下的牡丹花渣Ⅱ备用；
步骤4、将牡丹花渣Ⅱ中加入其重量8倍的水，再加入纤维素酶和果胶酶，于45℃下酶解30min，纤维素酶和果胶酶分别为花渣Ⅱ重量的2.5％和1.5％；灭酶后将酶解液旋转蒸发(48℃、真空度0.06MPa、干馏20min)，将酶解液中蒸汽冷凝，得冷凝液Ⅱ，保留酶解液中残留成分；
步骤5、将牡丹花汁液、冷凝液Ⅰ、冷凝液Ⅱ合并，获得牡丹鲜花细胞水。
上述各实施例及对比例的工艺步骤对比如表1所示。
表1工艺步骤对比
Figure BDA0003261219790000131
Figure BDA0003261219790000141
Figure BDA0003261219790000151
效果实施例
1.DPPH·法测定抗氧化活性
1.1、实验试剂：2,2-联苯基-1-苦基肼基(DPPH·)(Sigma公司，分子量：394.32g/moL)、乙醇(AR)、去离子水等。
1.2、实验器材：MD190酶标仪、96孔板(若干)、移液器、排枪及枪头(200μL，300μL，1mL，若干)、离心管(1.5mL，5mL，10mL，若干)、电子天平(精度0.0001g)、容量瓶(10mL，50mL，100mL，若干)等。
1.3试液的制备
1.3.1 DPPH·溶液的配制
准确称量19.7mg DPPH·，乙醇定容至500mL容量瓶中，终浓度为2×10-4mol/L，4℃避光放置备用。
1.3.2供试液的制备
将实施例1～7和对比例1～9制得的牡丹花细胞发酵液用去离子水配制成7组不同系列浓度，浓度为1％、5％、10％、20％、50％、80、100％。
1.4测定
按照表2依次加入下述反应液：用移液器取30μL不同浓度的供试液加入到96孔板中，每个浓度设置三个平行；再分别加入50μL 2×10-4mol/L DPPH·或乙醇，按照下表依次加入反应液；室温避光反应30min，反应后迅速在MD酶标仪517nm下测定吸光度。
表2 DPPH·试验加样表
Figure BDA0003261219790000152
Figure BDA0003261219790000161
1.5计算
按下列公式计算结果：
S＝[1-(Ai-Aj)/A0]×100％
式中：
S——样品对DPPH·自由基的清除率；
A0——空白组的吸光度；
Ai——样品组的吸光度；
Aj——对照组的吸光度。
2.酪氨酸酶活性测试
2.1实验器材：MD190酶标仪、96孔板(若干)、移液器、排枪及枪头(200μL，300μL，1mL，若干)、离心管(1.5mL，5mL，10mL，若干)、电子天平(精度0.0001g)容量瓶(10mL，50mL，100mL，若干)。
2.2实验试剂：蘑菇酪氨酸酶(Sigma，Cat.#T3824)、L-酪氨酸(Sigma，Cat.#T8566)、磷酸二氢钠(AR)、磷酸氢二钠(AR)。
2.3试液的制备
2.3.1磷酸缓冲液的配制
称取NaH2PO4·2H2O 2.65g，Na2HPO4·12H2O 5.85g，用去离子水定容至500mL。
2.3.2 L-酪氨酸的配制
称取L-酪氨酸45.3mg溶于2mL 1mol/L盐酸溶液中，再用1/15磷酸缓冲液定容至50mL，终浓度为5mmol/L，4℃保存。
2.3.3蘑菇酪氨酸酶的配制
用1/15磷酸缓冲液为溶剂，将蘑菇酪氨酸酶稀释至3000IU/mL，分装后-20℃保存，临用时用1/15磷酸缓冲液1:10稀释至300IU/mL。
2.3.4供试液的制备
将实施例1～7和对比例1～9制得的牡丹花细胞发酵液用去离子水配制成7组不同系列浓度，浓度为1％、5％、10％、20％、50％、80、100％。
2.4测定
按照表3向96孔板中依次加入下述反应液：40μL浓度为5mmol/Ld L-酪氨酸，40μL不同浓度的供试液，40μL 1/15磷酸缓冲液，37℃孵育5min，最后加40μL酪氨酸酶，37℃孵育10min，迅速在MD酶标仪中测定482nm处吸光度。每个浓度设置3个复孔，设置空白组和对照组，空白组不加酪氨酸酶，以磷酸缓冲液补足体积，对照组不加待测样品，以磷酸缓冲液补足体积。
表3酪氨酸酶活性试验加样表
Figure BDA0003261219790000171
2.5计算
按下列公式计算结果：
S＝[1-(AS-AB)/(AC-AB)]×100％
式中：
S——样品对酪氨酸活性的抑制率；
AB——空白组的吸光度；
AC——对照组的吸光度；
AS——样品孔的吸光度。
3.实验结果
上述各实施例及对比例的DPPH自由基的清除率及酪氨酸酶的抑制率如表4、5所示。
表4
Figure BDA0003261219790000181
Figure BDA0003261219790000191
表5
Figure BDA0003261219790000192
Figure BDA0003261219790000201
Figure BDA0003261219790000211
根据表4、5可知，实施例1～7和对比例1～9对DPPH自由基的清除率随着浓度的增加而增加。同时，根据实验结果可以看出实施例1～7对DPPH清除率整体高于对比例1～9。实施例1～7和对比例1～9对酪氨酸酶的抑制率随着浓度的增加而增加。同时根据结果可以看出实施例1～7对酪氨酸酶的清除率整体高于对比例1～9。
另外说明的是，本发明仅将牡丹花经微波灭酶灭菌、研磨、用双歧杆菌进行微生物转化所得产品的DPPH自由基清除率、酪氨酸酶清除率与上述实施例1～7得到的产品的效果相当。例如，实施例1中，步骤1-4制得的产品与步骤1-5制得的产品效果相当。其它实施例同理。
4.外观稳定性试验
4.1试验方法
考察产品放置在4℃、48℃、常温避光和常温光照(光照强度：300Lux)条件下，30天后的颜色、澄清度和气味的变化。
4.2实验结果
上述各实施例及对比例的外观稳定性试验结果如表6所示。
表6外观稳定性试验结果
Figure BDA0003261219790000212
Figure BDA0003261219790000221
Figure BDA0003261219790000231
根据表6可知，实施例1～7和对比例7放置30天后颜色、澄清度和气味没有变化；而对比例1、2、4、5、9澄清度和颜色均不合格，产生沉淀及颜色加深；对比例1、2、4、5的气味在48℃和常温光照条件下均变淡；对比例3、6、8的气味除在4℃条件下，均有变淡；对比例9的气味在4个条件下均变淡。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种牡丹花细胞发酵液的制备方法，其特征在于，其包括下述步骤：
牡丹花经微波灭酶灭菌、研磨或压榨、用双歧杆菌Bifidobacterium bifidum进行微生物转化即可；
其中，所述微波灭酶灭菌的微波功率为300W～800W；
所述微波灭酶灭菌的时间为0.5min～10min。
2.如权利要求1所述的牡丹花细胞发酵液的制备方法，其特征在于，所述微波灭酶灭菌的微波功率为350W～800W，例如400W、450W、500W、550W、600W、650W、700W或750W；
和/或，所述微波灭酶灭菌的时间为0.5min～9min，例如2min、3min、5min、7min或9min。
3.如权利要求1所述的牡丹花细胞发酵液的制备方法，其特征在于，所述研磨得到的牡丹花研磨粉的粒径为≥5μm，优选为5～120μm，更优选为10～100μm，例如10μm、50μm、80μm或100μm。
4.如权利要求1所述的牡丹花细胞发酵液的制备方法，其特征在于，所述压榨操作的压榨压力为4～6MPa，例如5MPa。
5.如权利要求1所述的牡丹花细胞发酵液的制备方法，其特征在于，所述的用双歧杆菌Bifidobacterium bifidum进行微生物转化的方式为将双歧杆菌Bifidobacteriumbifidum接种至牡丹花浆料发酵培养即可；
其中，所述双歧杆菌的接种量为0.5～20％，例如0.5％、8％或20％，上述百分比为所述双歧杆菌的用量占所述牡丹花浆料的总用量的质量百分比；
所述发酵培养为25℃～40℃发酵培养3～24h，优选为30℃～40℃发酵培养5～10h，更优选为35℃～38℃发酵培养5～10h。
6.如权利要求1所述的牡丹花细胞发酵液的制备方法，其特征在于，所述双歧杆菌Bifidobacterium bifidum进行微生物转化后，还包括离心、过滤、灭菌、过水膜和与防腐剂混合步骤；
所述灭菌操作为90℃～100℃水浴灭菌20min～60min，优选为95℃水浴灭菌30min；
所述过水膜操作中，采用的水膜厚度为0.22μm～5μm，优选为0.45μm；
所述防腐剂为1,2-己二醇、对羟基苯乙酮、苯甲酸钠、山梨酸钾、羟苯甲酯、甲基异噻唑啉酮、苯氧乙醇、乙基己基甘油、辛酰羟肟酸和辛甘醇中的一种或多种，优选为1,2-己二醇和对羟基苯乙酮、苯甲酸钠和山梨酸钾、羟苯甲酯和甲基异噻唑啉酮、苯氧乙醇和羟苯甲酯、苯氧乙醇和乙基己基甘油、辛酰羟肟酸和1,2-己二醇，或，辛甘醇和1,2-己二醇，例如1,2-己二醇和对羟基苯乙酮；
当所述防腐剂为己二醇和对羟基苯乙酮的混合物时，己二醇的用量为0.5％，对羟基苯乙酮的用量为0.5％；
当所述防腐剂为苯甲酸钠和山梨酸钾的混合物时，苯甲酸钠的用量为0.5％，山梨酸钾的用量为0.2％；
当所述防腐剂为羟苯甲酯和甲基异噻唑啉酮的混合物时，羟苯甲酯的用量为0.1％，甲基异噻唑啉酮的用量为0.095％；
当所述防腐剂为苯氧乙醇和羟苯甲酯的混合物时，苯氧乙醇的用量为0.9％，羟苯甲酯的用量为0.1％；
当所述防腐剂为苯氧乙醇和乙基己基甘油的混合物时，苯氧乙醇的用量为0.63％，乙基己基甘油的用量为0.07％；
当所述防腐剂为辛酰羟肟酸和己二醇的混合物时，辛酰羟肟酸的用量为0.1％，己二醇的用量为0.4％；
当所述防腐剂为辛甘醇和己二醇的混合物时，辛甘醇的用量为0.8％，己二醇的用量为0.1％；
所述防腐剂优选为己二醇和对羟基苯乙酮的混合物，己二醇的用量为0.5％，对羟基苯乙酮的用量为0.5％；上述百分比为所述防腐剂各组分的用量占所述牡丹花细胞发酵液的总用量的质量百分比。
7.如权利要求1所述的牡丹花细胞发酵液的制备方法，其特征在于，所述牡丹花为早晨10点之前采摘的牡丹鲜花花瓣，或，早晨10点之后采摘的牡丹鲜花花瓣；优选为早晨10点之前采摘的牡丹鲜花花瓣；
和/或，所述牡丹花为经冷冻保存处理的牡丹花。
8.一种如权利要求1～7任一项所述的制备方法制得的牡丹花细胞发酵液。
9.一种如权利要求8所述的牡丹花细胞发酵液作为抗氧化活性成分或者美白活性成分在制备皮肤外用剂中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述皮肤外用剂中，所述的牡丹花细胞发酵液的用量为0.5～10wt％，优选为1～10％wt％，上述百分比为牡丹花细胞发酵液占皮肤外用剂原料总量的重量百分比；
和/或，所述的牡丹花细胞发酵液在制备皮肤外用剂时作为自由基清除剂或者酪氨酸酶抑制剂。
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