CN113897435B - 一种用于评估黑色素瘤转移风险的miRNA及其应用 - Google Patents
一种用于评估黑色素瘤转移风险的miRNA及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种用于评估黑色素瘤转移风险的miRNA及其应用。通过检测黑色素瘤中所述miR‑182‑5p的表达水平，分析获知所述miR‑182‑5p与黑色素瘤转移的相关性，在此基础上，向黑色素瘤细胞系中转入可以提高miR‑182‑5p表达的模拟物如miR‑182‑5p mimic时，细胞的迁移能力会增强，抑制miR‑182‑5p表达的抑制物如miR‑182‑5p inhibitor时，细胞的迁移能力会降低，该结果对于黑色素瘤的诊疗具有重要的指导意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种用于评估黑色素瘤转移风险的miRNA及其应用。
背景技术
黑色素瘤是由黑素细胞失控且大量增殖引起的一种肿瘤疾病，多数由正常的痣和色素斑演变而来。该病多发于皮肤，临床表现主要为皮肤出血、瘙痒、压痛、溃疡等。在黑色素瘤早期，90％以上的病人可以通过手术切除的治疗手段被治愈，但是如果黑色素瘤进入迅速生长期，则极难治愈。主要是该时期的黑色素瘤转移率较高，可以在短时期内转移至淋巴、心、肝、肺、肾等多种器官。因此该病治疗困难极大且致死率极高，仅次于胰腺癌。
检测miRNA的表达水平可以为癌症的临床诊断提供参考依据。miRNA的异常表达直接导致了与癌症发生和转移相关的基因的表达异常，进而诱发癌症的发生。在未来的临床中，miRNA不仅可以作为黑色素瘤早期诊断和癌症进程的相关标记物，还可以作为黑色素瘤治疗的靶位点。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的之一是提供一种用于评估黑色素瘤转移风险的miRNA，所述miRNA为miR-182-5p，序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明目的之二是提供所述miRNA在制备评估黑色素瘤转移风险的诊断产品中的应用。
本发明的目的之三是提供检测所述miRNA的表达水平的试剂在制备评估黑色素瘤转移风险的诊断产品中的应用。
本发明的目的之四是提供一种评估黑色素瘤转移风险的诊断产品，其包含检测所述miRNA的表达的相关试剂。
进一步的，所述诊断产品为体外诊断产品的形式。
更进一步的，所述诊断产品为诊断试剂盒的形式。
更进一步的，所述诊断试剂盒为qRT-PCR检测试剂盒，包含qRT-PCR检测miR-182-5p的引物。
更进一步的，用于qRT-PCR检测miR-182-5p的上游引物序列如SEQ ID NO.10所示。
本发明的目的之五是提供一种非诊断目的的评估黑色素瘤转移风险的方法，使用上述的诊断产品检测黑色素瘤中所述miR-182-5p的表达水平，若黑色素瘤中所述miR-182-5p的表达水平显著升高，则判断该受试者的黑色素瘤发生迁移的风险高。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明研究结果证明了miR-182-5p与黑色素瘤的发展相关，通过检测miR-182-5p的表达水平，可以判断会否存在黑色素瘤转移的风险。
2、本发明验证了向黑色素瘤细胞系中转入可以降低miR-182-5p的抑制剂如miR-182-5p inhibitor时，细胞的迁移能力会显著降低，该结果对于黑色素瘤的治疗具有重要的指导意义。
附图说明
图1A为miR-182-5p在细胞各个处理组分中的表达量，***表示P<0.001。B为靶基因和下游基因在转染miR-182-5p成熟体mimic和inhibitor抑制剂后表达量的变化。*表示P<0.05，***表示P<0.001。
图2为细胞划痕实验，图中，A列为空白组；B列为转染miR-182-5p mimic组；C列为转染miR-182-5p inhibitor组，每列三组重复，每组重复中上图为处理前细胞划痕状态，下图为细胞处理后愈合状态。
图3为细胞划痕结果，图中：**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
在黑色素瘤细胞转染miR-182-5p mimic和inhibitor后用qRT-PCR检测miR-182-5p和目的基因的表达。
1、材料及细胞培养
1)B16F10黑色素瘤细胞是第10代细胞(山西农业大学生命科学学院113实验室提供)。液氮中取出黑色素细胞于37℃水浴锅中复苏，加入等量的DMEM+10％胎牛血清，1000r/mim低速离心10min，弃上清，使用黑色素细胞完全培养基(DMEM+10％胎牛血清+1％双抗)悬浮黑色素细胞并分装于6孔细胞培养板中于37℃，5％CO2培养箱中进行培养。
2、转染试剂转染前准备：稀释miR-182-5p与miR-182-5p inhibitor浓度为300xng/mL，稀释转染试剂100倍，稀释剂使用DMEM，分别稀释所用试剂后，室温静置20min，miR-182-5p与miR-182-5p inhibitor稀释液于稀释转染试剂混匀放置5min，作为转染溶液。
3、取出培养好的细胞，弃去培养液，使用无血清细胞培养液(DMEM+1％双抗)作为细胞培养液，向每孔细胞中加入对应的转染溶液后，将细胞培养板放置于细胞培养箱中培养4h后，细胞重新换黑色素细胞完全培养基继续培养。
4、48h后从培养箱中将细胞取出并收集，以未转染的B16F10细胞作为对照，进行上述实验，作为空白对照。
5、RNA提取
采用Trizol-氯仿提取法提取RNA并用核酸检测仪对RNA质量及浓度进行检测。
6、RNA反转录
a.RNA反转录体系如下(表1)，混合反应液，瞬时离心；PCR仪中反应，设置条件为：37℃，60min；85℃，5min；4℃保存。反应体系完成后，加RNase-Free ddH2O至100μL得到miRNA反转录产物。反转录产物存于-20℃备用。
表1 miRNA第一链合成反应体系
b.总RNA的反转录合成cDNA
表2为总RNA反转录去DNA酶反应体系，体系按照表3添加后用移液器吹打混匀，42℃保温2min，4℃保存。按照表3的反转录反应体系加入相应的试剂(Takara的DNA反转录试剂盒，反转录引物对由试剂盒中提供)，37℃反应1h。反应产物于负20℃条件下保存备用。
表2 RNA去除基因组反应体系
表3 RNA反转录体系
7、qRT-PCR反应及检测
在NCBI网站下载Mitf、Tyr、Tyrp2基因序列并在Premier 3.0网站设计这些基因引物。其中miR-182-5p的内参选择U6，miR-182-5p和U6的下游引物由反转录试剂盒统一提供。而Mitf、Tyr、Tyrp2等的内参基因选择18S，实验组分为空白组、转染miR-182-5p mimic组、转染miR-182-5p inhibitor组，反应体系和扩增程序按照表5和表6。其中，所有基因退火温度均设置为60℃。
表4 目的基因引物序列
表5 目的基因的qRT-PCR反应体系
表6 目的基因的qRT-PCR的反应程序
定量数据用SPASS16.0进行分析，目的基因的相对表达水平相对表达量＝2-ΔΔCT。结果如图1所示，转染miR-182-5p mimic和抑制剂后黑色素瘤中的miR-182-5p靶基因表达变化不大，但关键的下游基因表达受到抑制。
实施例2
miR-182-5p对黑色素瘤细胞迁移能力的影响
1、细胞培养及转染
本试验设置分组包括空白组、转染miR-182-5p mimic组、转染miR-182-5pinhibitor组，细胞培养及转染方法同实施例1。
2、细胞划痕
对细胞各组进行划痕试验，吸弃原有培养液，用200μL的无菌枪头在细胞中心划垂直线(沿直尺)，划好线后用PBS冲洗细胞两次(操作轻缓)，再加入新的细胞培养基置于显微镜下拍照记录，继续培养24h后，再次取出于显微镜下拍照记录。通过划痕之间的愈合程度判断各组分对细胞迁移的影响。
3、细胞划痕结果
将划痕试验结果整合，见图2，对图中数据进行量化得到图3，图2中A列为空白组，B列为转染miR-182-5p mimic组，C列为转染miR-182-5p inhibitor组。A组有愈合，且愈合度很高，其中B列的迁移率略高于A列，但不显著。而C组中的细胞愈合度极低甚至不愈合。即A组、B组愈合程度显著高于C组的愈合程度。结果显示，当向B16F10细胞系中转入可以降低miR-182-5p的抑制剂如miR-182-5p inhibitor时，细胞的迁移能力会显著降低。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 山西农业大学
<120> 一种用于评估黑色素瘤转移风险的miRNA及其应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
aacggaatcc caaagcagct 20
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
atggactatc atatgcttac cgta 24
Claims (1)
1.一种miRNA在黑色素瘤细胞中调控Tyr和Tyrp2基因的应用，其特征在于，所述miRNA为miR-182-5p，所述miR-182-5p由SEQ ID NO.1所示的DNA编码；
体外环境下，所述黑色素瘤细胞中，miR-182-5p的表达水平升高，Tyr和Tyrp2基因表达水平降低，miR-182-5p的表达水平降低，Tyr和Tyrp2基因表达升高。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (2)
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| miR-182 增强黑色素瘤细胞增殖和侵袭的作用研究;李旭文等;中华全科医学;第19卷(第9期);1474-1476、1548 * |
| ｍｉＲ－１８２受ＴＥＡＤ１转录调控参与黑素瘤细胞转移;陈诚等;中国临床医学;第26卷(第1期);89-92 * |
Also Published As
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