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CN113825530B - 双模式18f-标记的热化合物及其用途 - Google Patents

双模式18f-标记的热化合物及其用途 Download PDF

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CN113825530B CN201980084175.6A CN201980084175A CN113825530B CN 113825530 B CN113825530 B CN 113825530B CN 201980084175 A CN201980084175 A CN 201980084175A CN 113825530 B CN113825530 B CN 113825530B
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Abstract

一种化合物或分子复合物。该化合物或分子复合物包含：被配置为与放射性同位素或非放射性同位素螯合的金属螯合剂；以及被配置为19F/18F交换的含三氟硼酸盐(BF3)的部分或其前体；以及任选地细胞靶向结构域。

Description

双模式18F-标记的热化合物及其用途
技术领域
本发明涉及用于成像和/或治疗的化合物/复合物。具体地，本发明涉及双模式化合物/复合物，这些双模式化合物/复合物被配置为当18F-标记时进行成像并且当与放射性金属螯合时进行治疗。
背景技术
PET成像在无创临床诊断中发挥着越来越重要的作用1-7。与MRI或SPECT相比，PET将非常高的灵敏性10与动态时空分辨率组合以检查生物分布和清除11,12。18F-脱氧葡萄糖(FDG)和18F-胸苷(FLT)13提供基于大多数但不是所有癌症代谢特征增强的图像4。癌症亚型越来越多地通过肽区分4,14-19，该肽区分病理学上不同的细胞类型并且评估特定分子靶标的存在，这是FDG无法实现的一项壮举20-23。临床上的肽示踪剂和药物包括奥曲肽(octreotate)24-28、蛙皮素(bombesin)29、RGD30-32、LupronTM、以及SandostatinTM 33,34。
放射性金属(例如，68Ga、64Cu、99mTc)螯合易于标记，但18F-氟化物以较低成本提供可扩展性。因此，18F-氟化物是优选的：它干净地衰减(>97％β+)，可以以高同位素纯度并且以比68Ga(>1Ci，对于$400)35低得多的成本生产36,37。其短半衰期使辐射剂量最小化，而高比活性确保示踪剂满足微剂量要求38。然而，其短半衰期(109.8分钟)也对标记肽提出了挑战。先前对18F-标记的有机三氟硼酸盐(RBF3)的工作现在使18F-标记与放射性金属螯合一样容易39。虽然某些18F-RBF3-肽显示出高肿瘤摄取40，但是放射性金属化的肽的明显优势通常是更高的肿瘤摄取41。
然而，在存在极少治疗选项的情况下，放射性毒性金属肽被用于来治疗某些癌症。例如，将奥曲酸螯合剂与90Y复合以治疗胰腺癌42。若干肽作为用于放射疗法的靶向剂出现43,44。然而，并非所有患者都对此类疗法有反应。理想地，患者应该在治疗之前用相同的肽成像。放射治疗肽的PET成像限于具有同位素对(例如86Y/90Y、64Cu/67Cu、203Pb/212Pb)的金属，一种用于成像，另一种用于治疗45,46。遗憾的是，PET诊断金属的生产有限且昂贵。更糟糕的是，对于一些放射性金属(例如177Lu)，对于PET不存在容易获得或有用的同位素(存在具有β+发射167Lu的PET的报告)。典型地，不同的金属用于成像。
因此，当一种辐射测量用于成像并且一种不同的辐射测量用于治疗时，当前的实践提出显著的问题。例如，TATE用111In(用于成像)和90Y(用于治疗)标记。摄取的显著差异导致如下结论：应该用相同同位素评估TATE，即，β+发射86Y45,46。遗憾的是，86Y非常昂贵，并且分辨率低于18F 47。类似的问题扩展到SPECT成像：111In、67Ga、177Lu和90Y的DOTA-TATE螯合物均显示不同的亲和力，使得难以关联不同金属肽之间的图像，因为放射测量影响亲和力和成像信号两者43,48。类似的差异也见于蛙皮素NOTA；68Ga-螯合物显示出比111In-螯合物低得多的亲和力：分别为1.2nM和23pM49。亲和力的变化阻碍图像相关性和放射疗法摄取的预测。此外，仅存在几个实例，其中两种金属同位素可以被识别以提供治疗诊断性的同位素对。因此，在本领域中对于治疗诊断双功能PET成像示踪剂/放射疗法存在未满足的需要，这些治疗诊断双功能PET成像示踪剂/放射疗法促进基于PET成像结果的改进的治疗计划。
不一定意图承认，也不应解释为任何前述信息构成针对本发明的现有技术。
发明内容
各种实施方式涉及一种化合物或分子复合物，该化合物或分子复合物包含：被配置为与放射性金属同位素或非放射性金属同位素螯合的金属螯合剂；以及被配置为19F/18F交换的含三氟硼酸盐(BF3)的部分、或能够转化为18F-标记的三氟硼酸盐的硼酸盐前体。
各种实施方式涉及一种化合物或分子复合物，该化合物或分子复合物包含：细胞靶向结构域；被配置为与金属放射性同位素或非放射性金属同位素螯合的金属螯合剂；以及被配置为19F/18F交换的含三氟硼酸盐(BF3)的部分、或能够转化为18F-标记的三氟硼酸盐的硼酸盐前体。在一些此类实施方式中，细胞靶向结构域可以包括肽、多肽或蛋白质、肽模拟物、或核酸适体、大环、类固醇、或小分子，其中，细胞靶向结构域特异性结合细胞标记物。在其他此类实施方式中，细胞靶向结构域包括LLP2A、PSMA-617、TATE、或肽D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2。在其他此类实施方式中，细胞靶向结构域包括(i)特异性结合靶细胞的抗原的抗体或抗体衍生物或片段，或(ii)与特异性结合抗原的抗体或抗体衍生物或片段特异性结合的蛋白质结构域。
在一些实施方式中，可以由包含含BF3的部分的接头连接至细胞靶向结构域。接头可以含有多个含BF3的部分。接头可以是肽接头。接头可以包含Lys(AMBF3)。
在一些实施方式中，在化合物或分子复合物中，金属螯合剂是未螯合的或与非放射性金属同位素螯合的，并且含BF3部分是18F-标记的。
在一些实施方式中，金属螯合剂与放射性金属同位素螯合，并且含BF3的部分是19F-标记的。
在一些实施方式中，金属螯合剂与放射性金属同位素螯合，并且含BF3的部分是18F-标记的。
在一些实施方式中，放射性金属同位素是α发射体、β发射体、或螺旋发射体。
在一些实施方式中，金属螯合剂选自多种螯合剂，该多种螯合剂选自由以下组成的组：DOTA和衍生物；DOTAGA；NOTA；NODAGA；NODASA；CB-DO2A；3p-C-DEPA；TCMC；DO3A；DTPA、以及任选地选自CHX-A”-DTPA和1B4M-DTPA的DTPA类似物；TETA；NOPO；Me-3,2-HOPO；CB-TE1A1P；CB-TE2P；MM-TE2A；DM-TE2A；任选地选自SarAr、SarAr-NCS、diamSar、AmBaSar和BaBaSar的sarcophagine和sarcophagine衍生物；TRAP；AAZTA；DATA和DATA衍生物；H2-macropa或其衍生物；H2dedpa、H4octapa、H4py4pa、H4Pypa、H2azapa、H5decapa、以及其他吡啶甲酸衍生物；CP256；PCTA；DOTP；HEHA；C-NETA；C-NE3TA；HBED；SHBED；BCPA；CP256；YM103；cyclam；DiamSar；去铁胺(DFO)和DFO衍生物；H6phospa；三硫醇螯合物；巯基乙酰基；肼基烟酰胺；二巯基琥珀酸；1,2-亚乙基二基双-L-半胱氨酸二乙基酯；亚甲基二膦酸酯；六甲基丙烯胺肟；和六(甲氧基异丁基异腈)；卟啉、二氢卟酚、特沙弗林(texaphrin)、酞菁。在一些实施方式中，金属螯合剂选自DOTA和DOTA衍生物。在一些实施方式中，金属螯合剂是DOTA。
在一些实施方式中，含BF3的部分是：
或表3或表4所示的基团，其中，每个R独立地是C1-C5直链或支链烷基。
在一些实施方式中，化合物选自由以下组成的组：DOTA-AMBF3-PEG2-LLP2A；PSMA-617-LysAMBF3-DOTA；DOTA-Lys(AMBF3)-TATE；以及DOTA-Lys-AMBF3-Pip-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2。
在一些实施方式中，化合物或分子复合物还包含荧光团或其他发光部分。
在一些实施方式中，化合物或分子复合物包含Lys(AMBF3)。
在一些实施方式中，化合物包括DOTA-Bn-NH-Lys-(AMBF3)。
在其中化合物或分子复合物包括含BF3的部分和细胞靶向结构域的一些实施方式中，化合物或分子复合物用于在以下使用：使用标记有18F的化合物或分子复合物对受试者成像以确认疾病或病症的细胞标记物的存在；并且使用与治疗性放射性同位素螯合的化合物或分子复合物治疗疾病或病症。
在其中化合物或分子复合物是包含含BF3部分并且不包含细胞靶向结构域的化合物的一些实施方式中，化合物或分子复合物用于与双特异性抗体组合使用以成像和/或治疗受试者的疾病或病症，其中，双特异性抗体对(i)疾病或病症的细胞标记物和(ii)金属螯合剂具有特异性。在一些此类实施方式中，化合物或分子复合物可以作为与双特异性抗体的复合物给予受试者。在其他此类实施方式中，双特异性抗体可以用于在预靶向步骤中向受试者给予化合物或分子复合物之前给予受试者，在预靶向步骤过程中，双特异性抗体结合至细胞标记物。
附图说明
根据参考附图的以下描述，本发明的特征将变得显而易见，其中：
图1示出某些双模式PET成像放射疗法的功能结构域的不同相对构型的示意性图示。
图2示出DOTA-AMBF3-PEG2-LLP2A(也称为LLP2A-LysAMBF3-DOTA)和PSMA-617-LysAMBF3-DOTA的化学结构。
图3示出在携带B16F10黑色素瘤异种移植物的小鼠中F-18标记的LLP2A-Lys-AMBF3-DOTA的最大强度投影图像(注射后1小时)，(A)未注射和(B)共注射非放射性LLP2A-Lys-AMBF3-DOTA(100μg)。
图4示出F-18标记的PSMA-617-Lys-AMBF3-DOTA在携带LNCaP前列腺癌异种移植物的小鼠中的最大强度投影图像(注射后1小时)，(A)未注射和(B)共注射DCFPyL(0.5mg)。
图5示出在(1:9)EtOH:0.9％盐水(v/v)中配制的纯化的18F-放射性示踪剂7(制备HPLC纯化和C18 Sep-Pak洗脱后)的代表性HPLC色谱图，使用HPLC方法B示出a)在tR＝14.97min时7的放射色谱图，示出98.5％的放射化学纯度、1.1％的18F-(tR＝2.30min)和0.4％的杂质(tR＝8.26min)，以及b)单独注射7(tR＝14.44min)和与0.1nmol冷前体共注射6(tR＝14.49min)的吸光度色谱图。
图6示出在携带B16-F10肿瘤(箭头)的小鼠中单独注射7(a和b；注射4-6MBq)和来自具有阻断剂1(200μg)(注射4-6MBq)(c和d)的共注射7在1h p.i.下的PET图像，比例尺是0-20％ID/g。
图7示出[18F]6(注射5MBq)在携带B16-F10肿瘤的小鼠中的动态PET扫描(5sec至52.5min p.i.，28个时间点)。
图8示出1的1HNMR(丙酮-d6，300MHz，室温)光谱。
图9示出LLP2A-PEG2-AMBF3-Fmoc(3)的ESI-MS(+)光谱：计算为C76H98BF3N14O13，1483.5m/z；实测为，[M+Na]+＝1506.8m/z，[M+K]+＝1520.9m/z。
图10示出AMBF3-PEG2-LLP2A-NH2(4)的ESI-MS(+)光谱：计算为C61H88BF3N14O11，1261.3m/z；实测为，[M+H]+＝1262.6m/z，[M+Na]+＝1284.6m/z。
图11示出DOTA-AMBF3-PEG2-LLP2A(6)的ESI-MS(+)光谱：计算为C77H114BF3N18O18，计算为1647.6m/z；实测为，[M+H]+＝1648.9m/z，[M+Na]+＝1670.9m/z，[M+K]+＝1687.0m/z。
图12示出在使用HPLC方法A进行半制备型HPLC纯化(>95％纯度)后6(tR＝8.9min)的分析型HPLC色谱图(λAbs＝241nm)。
图13示出基于6的UV-vis吸收(λ＝257nm)用于表征[18F]6(HPLC纯化和配制后)的标准曲线，并且使用HPLC方法C获得。
图14示出18F-放射性示踪剂[18F]6与表达VLA-4的B16-F10细胞的体外结合饱和测定(每个重复进行，误差条示出±SD)，给出计算的Kd值为6.9±0.59nM(n＝3)。
图15示出1的13C{1H}NMR(丙酮-d6，75MHz，室温)光谱。
图16示出1的ESI-MS(+)光谱：计算为，C12H23BNO2 +＝224.1m/z；实测为，[M]+＝224.6m/z。
图17示出2的1H NMR(丙酮-d6，300MHz，室温)。
图18示出2的13C{1H}NMR(丙酮-d6，75MHz，室温)光谱。
图19示出2的19F{1H}NMR(丙酮-d6，282MHz，室温)光谱。
图20示出2的ESI-MS(+)光谱：计算为，C6H11BF3N，165.0m/z；实测为，[M+Na]+＝188.4m/z。
图21示出3的1H NMR(CDCl3，300MHz，室温)光谱。
图22示出3的13C{1H}NMR(CDCl3，75MHz，室温)光谱。
图23示出3的ESI-MS(-)光谱：计算为，C21H22N4O4，394.4m/z；实测为，[M-H]-＝393.4m/z，并且[2M-H]-＝787.7m/z。
图24示出4的1H NMR(CD3CN，300MHz，室温)光谱。
图25示出4的13C{1H}NMR(CD3CN，75MHz，室温)光谱。
图26示出4的19F{1H}NMR(CD3CN，282MHz，室温)光谱。
图27示出4的ESI-MS(-)光谱：计算为C27H33BF3N5O4，559.4m/z；实测为，[M-H]-＝558.5m/z，并且[M+I]-＝686.4m/z。
图28示出5的1H NMR(CD3CN，300MHz，室温)光谱。
图29示出5的13C{1H}NMR(CD3CN，75MHz，室温)光谱。
图30示出5的13C DEPT-135NMR(CD3CN，75MHz，室温)光谱。
图31示出5的19F{1H}NMR(CD3CN，282MHz，室温)光谱。
图32示出5的ESI-MS(+)光谱：计算为，C31H36BF3N6O6，656.5m/z；实测为，[M+Na]+＝679.8m/z。
图33示出5的HRMS光谱：计算为，C31H36BF3N6O6，656.4702m/z；实测为，[M+Na]+＝679.2618m/z。
图34示出Fmoc-LysAMBF3-OH的1H NMR(CD3CN，300MHz，室温)光谱。
图35示出Fmoc-LysAMBF3-OH的13C{1H}NMR(CD3CN，75MHz，室温)光谱。
图36示出Fmoc-LysAMBF3-OH的19F{1H}NMR(CD3CN，282MHz，室温)光谱。
图37示出Fmoc-Lys(AMBF3)-OH的ESI-MS(-)光谱：计算为，C27H33BF3N5O4，559.4m/z；实测为，[M-H]-＝558.5m/z，并且[M+I]-＝686.4m/z。
图38示出通过1H NMR(CD3CN，300MHz，室温)的Fmoc-LysAMBF3-O-NHS的结构表征。
图39示出通过13C{1H}NMR(CD3CN，75MHz，室温)的Fmoc-LysAMBF3-O-NHS的结构表征。
图40示出Fmoc-LysAMBF3-NHS的19F{1H}NMR(CD3CN，282MHz，室温)光谱。
图41示出Fmoc-LysAMBF3-O-NHS的ESI-MS(+)光谱：计算为，C31H36BF3N6O6，656.5m/z；实测为，[M+Na]+＝679.8m/z。
图42示出PSMA-617-NH2的ESI-MS(+)光谱：计算为，C41H61N5O9，767.97m/z；实测为，[M+H]+＝768.7m/z。
图43示出PSMA-617-LysAMBF3-Fmoc的ESI-MS(+)光谱：计算为，C68H92BF3N10O12，1309.35m/z；实测为，[M-F]+＝1290.1m/z，[M+Na]+＝1332.0m/z。
图44示出PSMA-617-LysAMBF3-NH2的ESI-MS(+)光谱：计算为，C53H82BF3N10O10，1087.10m/z；实测为，[M-F]+＝1068.1m/z，[M+H]+＝1088.1m/z，[M+Na]+＝1110.1m/z。
图45示出PSMA-617-LysAMBF3-DOTA的ESI-MS(+)光谱：计算为C61H93BF3N13O17，1360.31m/z；实测为，[M-3F-2H]+＝1302.1m/z，[M+H]+＝1362.1m/z。
图46示出PSMA-617-LysAMBF3-DOTA(Cu)的ESI-MS(+)光谱：计算为C61H90BF3N10O10，1422.8m/z；实测为，[M-3F-2H]+＝1362.8m/z，[M-F]+＝1402.8m/z，[M+H]+＝1423.8m/z，[M+Na]+＝1444.8m/z。
图47示出DOTA/AMBF3-轭合的RM2肽(11)。
图48示出DOTA/AMBF3-轭合的BK肽(9)。
图49示出用于固相肽合成的常见保护基团。
图50示出在229nm处的DOTA-Lys(AMBF3)-BK(化合物9)的HPLC迹线。
图51示出对于分解的肽(10)的MALDI-TOF。
图52示出分解的肽(10)的特征同位素模式。
图53示出DOTA-Lys(AMBF3)-BK(9)的MALDI-TOF。
图54示出DOTA-Lys(AMBF3)-BK(9)的特征同位素模式。
图55示出DOTA-Lys(AMBF3)-BK(10)的提出的脱甲酰化产物，该产物被预测是在切割程序(方案6v)过程中肽9的脱甲酰化的结果。确切的质量是1784.03。图52提供肽10的MALDI-TOF，描绘了在[M+Na+]+＝1807.02处的预测的同位素模式。
图56示出DOTA-Lys(AMBF3)-RM2(11)的MALDI-TOF。
图57示出DOTA-((L)-Lys-ε-1,2,3-三唑-N,N-二甲基-氨甲基-三氟硼酸盐)-4-氨基-1-羧甲基-哌啶-Lys-Arg-Pro-Hyp-Gly-Cha-Ser-Pro-Leu-COOH的结构。
图58示出粗化合物9的HPLC迹线(229nm)。
图59示出化合物9的MALD1-TOF光谱。
图60示出Fmoc-Lys(AMBF3)-TATE的ESI-MS(+)光谱：计算为，C79H114BF3N20O21，559.4m/z；实测为，[M+2Na]+＝1855.1m/z。
具体实施方式
如在本文使用的，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”及其语法变体是包括性或开放性的并且不排除另外的、未引用的要素和/或方法步骤，即使被定义为其一部分的特征/组分由或基本上由指定的一种或多种特征/组分组成。如果在本文结合化合物、组合物、用途或方法使用，术语“基本上由…组成”表示可以存在另外的元素和/或方法步骤，但是这些添加实质上不影响所列举的化合物、组合物、方法或用途的方式。如果在本文结合化合物、组合物、用途或方法的特征使用，术语“由…组成”排除在该特征中另外的元素和/或方法步骤的存在。在本文描述的包括某些元素和/或步骤的化合物、组合物、用途或方法还可以在某些实施方式中基本上由那些元素和/或步骤组成，并且在其他实施方式中由那些元素和/或步骤组成，无论这些实施方式是否被具体提及。在本文描述的包括某些元素和/或步骤的用途或方法还可以在某些实施方式中基本上由那些元素和/或步骤组成，并且在其他实施方式中由那些元素和/或步骤组成，无论这些实施方式是否被具体提及。
通过不定冠词“一”提及一个元素不排除存在多个要素的可能性，除非上下文清楚地要求存在一个并且仅存在一个元素。单数形式“一”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非上下文另外清楚地指示。当在本文中与术语“包含”结合使用时，词语“一”或“一种”的使用可以意指“一个”，但是它也与“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”的含义一致。
在本公开中，通过端点对数值范围的叙述包括包含在该范围内的所有数字，包括全部整数、所有整数以及在适合的情况下所有分数中间数(例如，1至5可以包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、以及5等)。
除非另外指明，“某些实施方式”、“各种实施方式”、“实施方式”以及类似术语包括针对该实施方式描述的单独的或与在此描述的任何其他实施方式或多个实施方式组合的一个或多个具体特征，是否直接或间接引用其他实施方式，并且不管特征或实施方式是否在方法、产品、用途、组合物、化合物等的上下文中描述。
如在本文中使用的，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”、“治疗性(therapeutic)”等包括改善症状、减少疾病进展、改善预后和减少复发。
如在本文中使用的，术语“诊断剂”包括“显像剂”。因此，“诊断性放射性核素”包括适合用于成像剂中的放射性核素。
术语“受试者”是指动物(例如，哺乳动物或非哺乳动物动物)。受试者可以是人类或非人类灵长动物。受试者可以是实验室哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、仓鼠等)。受试者可以是农业动物(例如，马、绵羊、牛、猪、骆驼等)或家畜(例如，犬、猫等)。在一些实施方式中，受试者是人。
在本文中公开的化合物还可以包括其无碱形式、溶剂化物、盐或药学上可接受的盐。除非另外确定或指明，在本文要求并描述的化合物意在包括所有外消旋混合物和所有单独的对映异构体或其组合，无论它们是否在此明确表示。
本文公开的化合物可以显示为具有一个或多个带电基团，可以显示为具有不带电(例如质子化)状态的可电离基团，或者可以显示为没有指定形式电荷。本领域技术人员会理解，化合物中某些基团(例如但不限于CO2H、PO3H2、SO2H、SO3H、SO4H、OPO3H2等)的离子化状态除其他之外取决于该基团的pKa和在该位置处的pH。例如，但不限于，羧酸基团(即，COOH)应理解为通常在中性pH和至多生理pH值下去质子化(并且带负电)，除非质子化状态是稳定的。同样，OSO3H(即，SO4H)基团、SO2H基团、SO3H基团、OPO3H2(即，PO4H2)基团和PO3H基团通常在中性和生理pH值下去质子化(带负电)。
如在本文使用的，术语“盐”和“溶剂化物”具有它们在化学中的通常含义。因此，当化合物是盐或溶剂化物时，其与合适的抗衡离子结合。如何制备盐或交换抗衡离子是本领域熟知的。通常，此类盐可以通过使这些化合物的游离酸形式与化学计算量的合适碱(例如但不限于Na、Ca、Mg或K氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等)反应，或通过使这些化合物的游离碱形式与化学计算量的合适酸反应来制备。此类反应通常在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中进行。抗衡离子可以例如通过离子交换技术(诸如，离子交换色谱法)改变。所有两性离子、盐、溶剂化物和抗衡离子都是预期的，除非特别指出特定的形式。
在某些实施方式中，盐或抗衡离子可以是药学上可接受的，用于给予受试者。如在本文使用的，“药学上可接受的”意指适合于在受试者体内使用，并且不一定限于治疗用途，而且还包括诊断用途。更一般地，关于本文公开的任何药物组合物，合适赋形剂的非限制性实施例包括任何合适的缓冲剂、稳定剂、盐、抗氧化剂、络合剂、张力剂、冷冻保护剂、冻干保护剂、悬浮剂、乳化剂、抗微生物剂、防腐剂、螯合剂、粘合剂、表面活性剂、润湿剂、非水性载体(诸如，固定油或用于持续释放或控制释放的聚合物)。参见例如Berge等人1977(J.PharmSci.66：1-19)，或《雷明顿-药学科学与实践》(Remington-The Science and Practice ofPharmacy)，第21版(Gennaro等人编辑，Lippincott Williams&Wilkins Philadelphia)，将其各自通过引用以其全文结合。
如在本文使用的，表述“Cy-Cz”，其中y和z是整数(例如，C1-C15、C1-C30、C1-C100等)，指化合物、R-基团或取代基中碳的数目(例如，在烷基、烯基或炔基基团中)，或指碳加上杂原子的数目，其中，表述进一步被定义为具有或任选地具有一个或多个杂原子。在后一种情况下，可以使用表述“Xy-Xz”(例如，X3-X15等)，其中y和z是指碳加上杂原子的数目的整数。杂原子可以包括任何、一些或所有可能的杂原子。例如，在一些实施方式中，杂原子选自N、O、S、P和Se。在一些实施方式中，杂原子选自N、O、S和P。这样实施方式是非限制性的。
除非另有明确说明，否则术语“烷基”是指缺少氢原子的烷烃，并且包括以下中的任何一种或多种：直链烷基、支链烷基、非环烷基、包括单环和多环环烷基(例如，稠环、多个非稠环或其组合)的环烷基、和/或未取代或取代的。例如，烷基可以是支链和环状的。如果未指明，烷基的大小是本领域技术人员认为合理的。例如但不限于，如果未指定，受制于本领域技术人员的公知常识，则烷基的大小可以是长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76，77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或多于100个碳。如在本文使用的，术语“亚烷基”是指烷基的二价类似物。
如本文在化合物的烷基的背景下使用的，术语“直链”可以如本领域技术人员通常所理解的那样使用，并且通常是指包含不分裂成多于一个连续链的骨架或主链的化学实体。直链烷基的非限制性实施例包括甲基、乙基、正丙基、以及正丁基。
如在本文使用的，术语“支链”可以如本领域技术人员通常理解的那样使用，并且通常是指包含分裂成多于一个连续链的骨架或主链的化学实体。在多于一个方向上分裂开的骨架或主链的部分可以是线性的、环状的或其任何组合。支链烷基的非限制性实施例包括叔丁基和异丙基。
C1-C20烷基的非限制性实施例可以包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、仲丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、叔戊基、正己基、异己基、1,2-二甲基丙基、2-乙基丙基、1-甲基-2-乙基丙基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1,2-三乙基丙基、1,1-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2-乙基丁基、1,3-二甲基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、仲己基、叔己基、正庚基、异庚基、仲庚基、叔庚基、正辛基、异辛基、仲辛基、叔辛基、正壬基、异壬基、仲壬基、叔壬基、正癸基、异癸基、仲癸基、叔癸基、环丙烷基、环丁烷基、环戊烷基、环己烷基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基等。除非另有说明，C1-C20亚烷基因此包括但不限于上面列出的饱和烷基的所有二价类似物。
如在本文使用的，术语“烯基”和“炔基”分别是指缺少氢原子的烯烃和炔，并且可以包括直链的、支链的和/或环状的基团，并且可以是未取代的或取代的。C2-C20烯基的非限制性实施例可以包括乙烯基、烯丙基、异丙烯基、1-丙烯-2-基、1-丁烯-1-基、1-丁烯-2-基、1-丁烯-3-基、2-丁烯-1-基、2-丁烯-2-基、辛烯基、癸烯基、环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环辛烯基、环壬烯基、环癸烯基等。除非另有说明，C1-C20烯基因此包括但不限于上述烯基的所有二价类似物。C2-C20炔基的非限制性实施例可以包括乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基、壬炔基、癸炔基等。除非另有说明，C1-C20炔基因此包括但不限于上述炔基的所有二价类似物。
非芳族杂环基团的非限制性实施例包括氮丙啶基、氮杂环丁烷基、二氮杂环丁烷基、吡咯烷基、吡咯啉基、哌啶基、哌嗪基、咪唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、邻苯二甲酰亚胺基、琥珀酰亚胺基、环氧乙烷基、四氢吡喃基、氧杂环丁烷基、二噁烷基、硫杂环丁基、硫杂环庚基、吗啉基、氧硫杂环戊烷基等。除非进一步说明，“芳基”基团包括单个芳环以及包含至少一个芳环的稠环。C3-C20芳基的非限制性实施例包括苯基(Ph)、并环戊烯基、茚基、萘基、以及奧基。C3-C20芳族杂环基的非限制性实施例包括吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基、异喹啉基、吖啶基、吲哚基、异吲哚基、中氮茚基、嘌呤基、咔唑基、吲唑基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、菲啶基、吩嗪基、菲咯啉基、萘啶基、呋喃基、二苯并呋喃基、呫吨基、苯并呋喃基、苯硫基、噻蒽基、苯并噻吩基、膦酰基、膦酰基、氧吲哚基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基等。
如在本文使用的，术语“取代”如本领域的普通技术人员将通常理解的那样使用，并且通常是指一个化学基团被一个不同的化学基团替代的化合物或化学实体。除非另有说明，取代的烷基是其中一个或多个氢原子各自独立地被不是氢的原子替代的烷基。例如，氯甲基是取代的烷基的非限制性实施例，更特别是取代的甲基的实施例。氨乙基是取代的烷基的另一非限制性实施例，更特别是取代的乙基的实施例。除非另有说明，取代的化合物或基团(例如烷基、芳基等)可以被本领域技术人员合理的任何化学基团取代。例如，但不限于，键合至碳或杂原子上的氢(例如，N)可以被卤化物(例如，F、I、Br、Cl)、胺、酰胺、氧代、羟基、硫醇、磷酸酯、膦酸酯、硫酸酯、SO2H、SO3H、烷基、芳基、酮、羧醛、羧酸酯、羧酰胺、腈、单卤代甲基、二卤代甲基、或三卤代甲基取代。
如在本文使用的，术语“未取代”被使用，如本领域的普通技术人员将通常理解的。未取代的烷基的非限制性实施例包括甲基、乙基、叔丁基、戊基等。表述“任选地取代”与表述“未取代或取代”可互换地使用。
在本文提供的结构中，可以示出或可以不示出氢。在一些实施方式中，氢(无论示出或暗示)可以是氕(即，1H)、氘(即，2H)、或1H和2H的组合。将1H与2H交换的方法是本领域熟知的。对于溶剂可交换的氢，在没有任何催化剂的情况下，1H与2H的交换在适合的氘源存在下容易发生。酸、碱或金属催化剂的使用、结合增加的温度和压力的条件可以促进不可交换的氢原子的交换，通常导致分子中所有1H至2H的交换。
在不修改波浪线的相对侧上的结构的定义的情况下，在化学式(例如，在表3和表4中列出的组中)中通过键或在键的末端处示出的波浪线符号旨在定义波浪线的一侧上的R基团。其中R基团键合在两个或更多个侧面上(例如，R2)，在波浪线外部显示的任何原子旨在澄清R基团的取向。因此，仅两条波浪线之间的原子构成R基团的定义。当原子未示出在波浪线之外时，或对于没有波浪线但在多个侧面上具有键的化学基团(例如，-C(O)NH-等)，应该从左到右读取与基团相关的式中的取向相匹配的化学基团(例如，对于式-Ra-Rb-Rc-，Rb作为-C(O)NH-的定义将作为-Ra-C(O)NH-Rc-而不是作为Ra-NHC(O)-Rc-结合到式中)，除非明确预期另一取向。
本公开涉及放射性同位素和非放射性同位素，以及为同位素的化合物、复合物或分子组合物。当同位素被识别为含有特定同位素时，将理解化合物/复合物/组合物在实际中可以以高度有利于所识别的同位素的同位素的混合物获得。例如，识别为热F或18F同位素的化合物/复合物/组合物的制备物实际上可以含有最小量的相应的19F同位素。反之亦然，识别为热M或放射性配体化同位素(例如，177Lu)的化合物/复合物/组合物的制备物可以含有最小量的相应的非放射性同位素(例如，174Lu、natLu)。
术语“Xaa”是指肽链中的氨基酸残基或另外作为化合物的一部分的氨基酸。氨基酸具有氨基和羧酸基团，其中任一者或两者可以用于共价附接。在附接至化合物的剩余部分时，氨基和/或羧酸基团可以转化为酰胺或其他结构；例如，当与第二氨基酸的氨基键合时，第一氨基酸的羧酸基团被转化为酰胺(即，肽键)。因此，Xaa可以具有式-N(Ra)RbC(O)-，其中Ra和Rb是R-基团。Ra将典型地是氢或甲基，或Ra和Rb可以形成环状结构。肽的氨基酸残基可以包含典型的肽(酰胺)键并且还可以包含侧链官能团与另一氨基酸的侧链或主链官能团之间的键。例如，肽中的一个氨基酸残基的侧链羧酸盐(例如，Asp、Glu等)可以键合至肽中的另一氨基酸残基的胺(例如，Dap、Dab、Orn、Lys)。下面提供进一步的细节。除非另外指明，“Xaa”可以是任何氨基酸，包括蛋白源性或非蛋白源性氨基酸。非蛋白源性氨基酸的非限制性实施例示于表1中并且包括：D-氨基酸(包括但不限于以下氨基酸的任何D-形式)、鸟氨酸(Orn)、3-(1-萘基)丙氨酸(Nal)、3-(2-萘基)丙氨酸(2-Nal)、α-氨基丁酸、正缬氨酸、正亮氨酸(Nle)、同正亮氨酸、β-(1,2,3-三唑-4-基)-L-丙氨酸、1,2,4-三唑-3-丙氨酸、Phe(4-F)、Phe(4-Cl)、Phe(4-Br)、Phe(4-I)、Phe(4-NH2)、Phe(4-NO2)、高精氨酸(hArg)、2-氨基-4-胍基丁酸(Agb)、2-氨基-3-胍基丙酸(Agp)、Β-丙氨酸、4-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸、7-氨基庚酸、8-氨基辛酸，9-氨基壬酸、10-氨基癸酸、2-氨基辛酸、2-氨基-3-(蒽-2-基)丙酸、2-氨基-3-(蒽-9-基)丙酸、2-氨基-3-(吡喃-1-基)丙酸、Trp(5-Br)、Trp(5-OCH3)、Trp(6-F)、Trp(5-OH)或Trp(CHO)、氨基己二酸(2-Aad)、3-氨基己二酸(3-Aad)、炔丙基甘氨酸(Pra)、高炔丙基甘氨酸(Hpg)、β-高炔丙基甘氨酸(Bpg)、2,3-二氨基丙酸(Dap)、2,4-二氨基丁酸(Dab)、叠氮基赖氨酸(Lys(N3))、叠氮基-鸟氨酸(Orn(N3))、2-氨基-4-叠氮基丁酸Dab(N3)、Dap(N3)、2-(5’-叠氮基戊基)丙氨酸、2-(6’-叠氮基己基)丙氨酸、4-氨基-1-羧甲基-哌啶(Pip)、4-(2-氨基乙基)-1-羧甲基-哌嗪(Acp)、以及氨甲环酸。如果没有规定为L-或D-氨基酸，则氨基酸应理解为L-氨基酸。
表1.非蛋白源性氨基酸的非限制性实施例的列表。
如在本文使用的，术语“分子组合物”将被理解为是指分子复合物，其中两个或更多个分子通过非共价相互作用(例如，疏水的、离子的、静电的等)保持在一起，诸如，在多链蛋白中。
本发明的各个方面涉及化合物或分子复合物，该化合物或分子复合物包含：
-被配置为任选地与放射性同位素或非放射性同位素或没有金属螯合的金属螯合剂；
-被配置为由19F/18F交换进行放射性氟化的含三氟硼酸盐(BF3)的部分或能够转化为18F-标记的三氟硼酸盐的硼酸盐前体；和任选地
-细胞靶向结构域。
此类化合物/复合物是双模式，因为它们适合于成像或放射疗法，或可以用于两种应用。例如，当18F-标记的(“热F”)时，这些化合物/复合物可以用作显像/诊断剂，或者当与一种治疗性放射性金属同位素(“热M”)螯合时，这些化合物/复合物可以用作治疗剂。这提供了使用相同的化合物用于成像和治疗的优点；即，提供了18F-标记的伴随诊断(针对使用热F的成像进行优化)，该伴随诊断与放射治疗剂(针对使用热M的治疗进行优化)在化学上是相同的。
在一些实施方式中，金属螯合剂是未螯合的或与非放射性金属同位素(“冷M”)螯合。如在本文使用的，未螯合的并且与非放射性金属同位素螯合两者都被认为是“冷M”。在不引起来自放射性金属同位素的任何负面效应的情况下，当此类实施方式的含BF3的部分是18F-标记时，热F/冷M化合物/复合物可用作成像剂或诊断剂。
如果成像揭示受试者是用于治疗性治疗的候选者，则可以给予相同的化合物/复合物(作为冷F/热M或热F/热M)。因此，热F/冷M化合物/复合物作为热M治疗剂的伴随诊断是有用的。在其他情况下，可想到的是未螯合的化合物/复合物可以同样良好地使用并且在其他实施方式中认识到替代金属阳离子可以代替热金属阳离子使用。例如，在一些实施方式中，可以使用与非放射性Zn2+螯合的热F化合物，即使放射性Zn2+不是通常在治疗或诊断上使用的。因此，在一些实施方式中，金属螯合剂与放射性同位素螯合并且含BF3的部分是19F-标记的，并且在其他实施方式中，金属螯合剂与放射性同位素螯合并且含BF3的部分也是18F-标记的。
术语“BF3”和“BF3”(即，下标“3”)具有相同的含义并且在本申请中可互换地使用。
术语“细胞靶向结构域”(也称为“细胞抗原靶向模块”)具有广泛的含义，并且包括特异性地结合至细胞标记的物任何化合物或复合物，例如但不限于：肽、多肽、蛋白质、肽模拟物、核酸、类固醇、适体、亲和体、微抗体、维生素、小分子、大环等。术语“细胞标记物”包括但不限于细胞表面抗原，诸如，分化(CD)分子的簇。除非另外指明，如在本文使用的术语“抗原”将被理解为不一定需要通过细胞靶向结构域与细胞标记物(或抗原)的结合引发的免疫应答；各种实施方式仅需在生理条件(例如，体内)下特异性结合至细胞标记物。在一些实施方式中，细胞靶向结构域靶向人类细胞标记物或人类CD分子。已经产生以上列出的类别各自的不同细胞靶向结构域，并且许多是可商购的。例如，已经为广泛的人CD分子生成抗体。
如在本文使用的，短语“特异性结合”指与蛋白质和/或其他大分子的异质群体的背景缔合相反的优选缔合(例如，非共价复合物的形成)。因此，在指定条件(例如，免疫测定条件)下，当细胞靶向结构域与样品(体外)或生物体(体内)中存在的其他大分子缔合的背景水平的至少两倍时，它们与细胞标记物“特异性结合”。可以使用多种免疫测定形式或其他结合测定来选择与特定靶标记物特异性结合的细胞靶向结构域。例如，常规地使用固相ELISA免疫测定法来选择与蛋白质特异性结合的抗体。在一些实施方式中，细胞靶向结构域将在背景信号上产生至少两次的结合信号，并且在一些情况下在背景上产生至少10至100次的结合信号。除非另有说明，细胞靶向结构域与靶向标记物的结合通常将具有约10-4M至10-15M的平衡解离常数(KD)。在一些实施方式中，缔合小于约10-4M。在一些实施方式中，缔合小于约10-5M。在一些实施方式中，缔合小于约10-6M。在一些实施方式中，缔合小于约10-7M。在一些实施方式中，缔合小于约10-8M。在一些实施方式中，缔合小于约10-9M。在一些实施方式中，缔合小于约10-10M。在一些实施方式中，缔合小于约10-11M。在一些实施方式中，缔合小于约10-12M。在一些实施方式中，缔合小于约10-13M。在一些实施方式中，缔合小于约10-14M。平衡解离常数可以使用本领域任何已知方法测量。
在一些实施方式中，细胞靶向结构域是肽、多肽、或蛋白质。可以使用标准方法合成肽和多肽，其非限制性实施例在下文进一步详细描述。可以使用标准分子生物学方法制备蛋白质。
已知特异性结合靶细胞标记的各种肽、多肽、以及肽模拟物。非限制性实施例包括：LLP2A、PSMA-617、TATE、蛙皮素或衍生物(例如，D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2等)、RGD、胆囊素。LLP2A靶向跨细胞极晚抗原4(VLA-4)。PSMA-617靶向前列腺特异性膜抗原(PSMA)。TATE靶向生长抑素受体。蛙皮素和衍生物靶向胃泌素释放肽受体(GRPR)。缓激肽(BK)和衍生物靶向缓激肽-1-受体。可以使用受体的任何其他肽配体。
在一些实施方式中，细胞靶向结构域是肽模拟物。肽模拟物可以通过用非肽基团取代肽/多肽基团来产生。例如但不限于，肽键酰胺(-C(O)-NH-)可以被假肽键(-CH2-NH-)、碳-碳键(-CH2-CH2-)或脲键(-NH-C(O)-NH-)替换，以增加体内肽半衰期。
已知能够特异性靶向细胞标记物的各种类型的多肽/蛋白质结构域。在一些实施方式中，细胞靶向结构域是或包含特异性结合细胞标记物的抗体或包含抗体可变结构域的抗体衍生物/片段。对于抗体和抗体衍生物，细胞标记物将被认为是包含由抗体可变结构域特异性结合的表位的抗原。通常，“表位”可以是与抗体可变结构域形成接触的肽、蛋白质、核酸、碳水化合物、多糖、脂质、有机化合物等、以及其复合物。表位可以是连续的或不连续的。与抗体可变结构域接触的表位的面积通常在约4与10nm2之间。用于将抗体或抗体衍生物/片段附接至化合物/复合物的其余部分(具有或不具有接头)的方法是已知的。例如，化合物已经通过化学或酶促轭合在抗体的N末端、C末端、半胱氨酸残基、赖氨酸残基或其他地方与抗体连接(例如，如对于抗体-药物轭合物充分记载的)。
抗体的重链由可变结构域(VH)和多个恒定结构域(例如，对于IgG1：CH 1、CH 2和CH 3)组成。抗体的轻链由可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)组成。每个VL和VH包括三个互补决定区(CDR)末端以及构架区。六个CDR都可以有助于表位结合，但是它们的相对贡献不同，并且在某些情况下，并非所有六个CDR都是结合所必需的。例如，重链的CDR3倾向于不成比例地更多地有助于表位结合。此外，已知仅具有三个CDR的单域抗体、纳米抗体等(例如，从单峰骆驼、骆驼、美洲驼、羊驼、鲨鱼或类似动物的重链可变域获得或衍生的单域抗体，或从常规抗体(包括但不限于人和鼠类抗体)的重链工程化的单域抗体)。除非另外说明，否则如在本文使用的短语“抗体可变结构域”是指包含VH、VH和VL两者的任何蛋白质、单结构域抗体、纳米抗体、或任何合适地定位所需的CDR(例如1、2、3、4、5或6个CDR)的抗体衍生的蛋白质，用于抗原表位部分的特异性结合。用于产生包含结合靶向表位的抗体可变结构域的蛋白质的方法是已知的，包括(但不限于)：从免疫动物中分离抗体、从完整抗体的修饰、从使用重组DNA方法从头合成或固相肽/多肽合成、或选自显示文库等。
在一些实施方式中，细胞靶向结构域包含抗体。抗体可以是任何物种的或可以是嵌合的或人工的或基因工程化的。例如但不限于，该抗体可以是非人类的(例如：骆驼科动物，诸如，骆驼、单峰骆驼、羊驼、美洲驼等；软骨鱼，诸如，鲨鱼等；小鼠、大鼠、猴子或其他)、灵长类动物的、人源化的或完全人类的。嵌合抗体含有来自多个物种的氨基酸序列，例如来自人类和非人类或来自两个非人类物种。用于人源化或灵长类化的非人抗体的方法是本领域熟知的，例如，通过用非人(或非灵长类)恒定结构域取代人抗体的恒定结构域(产生嵌合抗体)或通过用非人抗体取代人(或灵长类)抗体的一个或多个(例如1、2、3、4、5或6个)CDR。抗体可以由两条重链和两条轻链组成。抗体可以是重链和轻链由接头分开的单链抗体。抗体可以是仅重链的抗体(例如，缺乏轻链的骆驼、单峰骆驼、羊驼、美洲驼或鲨鱼抗体，或人重链)。抗体可以是单域抗体(sdAb)。
在一些实施方式中，细胞靶向结构域包含抗体衍生物。如在本文使用的，术语“抗体衍生物”包括保留抗原结合功能的抗体片段，连同人工抗体。抗体衍生物包含抗体可变结构域。抗原结合片段可以包含VL和VH两者、或不含VL的VH。在一些实施方式中，抗体衍生物包括：Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv(即，单链Fv)、scFv-Fc、sdAb、微型抗体、纳米抗体、双抗体或三抗体。
在一些实施方式中，该抗体或抗体衍生物是IgA、IgM、IgG、IgE、IgD、sdAb、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、scFv-Fc、微抗体、纳米抗体、双抗体或三抗体。在一些实施方式中，抗体是IgG抗体。
许多抗体具有低微摩尔至纳摩尔范围的KD值，高亲和力抗体具有低纳摩尔KD值，非常高亲和力抗体具有皮摩尔KD值。在一些实施方式中，抗体或抗体衍生物以小于500nM、小于400nM、小于300nM、小于200nM、小于100nM、小于50nM、小于10nM、小于5nM或小于1nM的KD结合细胞抗原。在一些实施方式中，抗体或抗体衍生物可以用皮摩尔KD(10-10M至10-12M)结合结合底物。此类结合亲和力是使用已知的显示技术(诸如，mRNA展示、噬菌体显示、核糖体显示和酵母显示)可获得的，以通过选择所期望的靶标的特异性和高亲和力来筛选文库，并且在一些情况下是亲和力成熟方法。
在一些具体实施方式中，细胞靶向结构域是特异性结合细胞标记物的核酸适体。适体是可以结合广泛范围的细胞靶向的单链寡核苷酸(DNA或RNA)。使用各种方法(诸如，从随机文库中选择和序列优化)可以产生适体，从而以高亲和力结合所期望的靶标，例如，亚纳摩尔KD。适体可以通过标准寡核苷酸合成方法/仪器合成并且使用化学轭合(具有或不具有接头)附接至化合物/复合物的其余部分。
在一些实施方式中，细胞靶向结构域可以用于预靶向背景，其中它在注射之前或之后首先轭合至与螯合剂-BF3反应的反应性基团。例如但不限于，抗体或适体与环辛烯轭合。可以将其注射，允许与靶标缔合，并且然后将连接至四嗪的螯合剂-BF3注射到同一动物或患者，使得它在体内经由N2-挤出环加成反应与环辛烯共轭物反应。在其他情况下，在注入之前进行N2-挤出环加成反应。
金属螯合剂可以是适合于结合放射性金属的任何螯合剂。许多合适的放射活性螯合剂是已知的(例如如Price和Orvig，Chem.Soc.Rev.，2014，43，260-290)，并且广泛种类的金属螯合剂是可商购的(例如从MacrocyclicsTM)，或描述于文献中并且太多而不能在此列出。
在一些实施方式中，但不限于此，金属螯合剂选自：DOTA和衍生物；DOTAGA；NOTA；NODAGA；NODASA；CB-DO2A；3p-C-DEPA；TCMC；DO3A；DTPA、以及任选地选自CHX-A”-DTPA和1B4M-DTPA的DTPA类似物；TETA；NOPO；Me-3,2-HOPO；CB-TE1A1P；CB-TE2P；MM-TE2A；DM-TE2A；任选地选自SarAr、SarAr-NCS、diamSar、AmBaSar和BaBaSar的sarcophagine和sarcophagine衍生物；TRAP；AAZTA；DATA和DATA衍生物；H2-macropa或其衍生物；H2dedpa、H4octapa、H4py4pa、H4Pypa、H2azapa、H5decapa、以及其他吡啶甲酸衍生物；CP256；PCTA；DOTP；HEHA；C-NETA；C-NE3TA；HBED；SHBED；BCPA；CP256；YM103；cyclam；DiamSar；去铁胺(DFO)和DFO衍生物；H6phospa；三硫醇螯合物；巯基乙酰基；肼基烟酰胺；二巯基琥珀酸；1,2-亚乙基二基双-L-半胱氨酸二乙基酯；亚甲基二膦酸酯；六甲基丙烯胺肟；和六(甲氧基异丁基异腈)；卟啉、二氢卟酚、特沙弗林、酞菁。在一些实施方式中，金属螯合剂是DOTA或DOTA衍生物。值得注意的是，本领域的普通技术人员可以用本领域中的另一种螯合剂替代在此列出的任何螯合剂。
金属螯合剂的示例性非限制性实施例以及可以被这些螯合剂螯合的示例性放射性金属示于表2中。在替代性实施方式中，金属螯合剂是或包含选自表2的金属螯合剂。
表2：示例性金属螯合剂和结合螯合剂的示例性放射性核素
在一些实施方式中，金属螯合剂是未螯合的(即，未金属化的)。
在一些实施方式中，金属螯合剂与金属、或放射性金属同位素(放射性同位素)或非放射性金属同位素螯合/轭合。在一些实施方式中，螯合金属是非放射性的。在一些实施方式中，螯合金属是放射性金属。在一些实施方式中，放射性金属是治疗性放射金，意味着它是放射性毒性的(在此也称为“放射性毒素”)。在一些实施方式中，放射性金属是治疗性α发射体。在一些实施方式中，放射性金属是β发射体。在一些实施方式中，放射性金属是螺旋发射体。在一些实施方式中，治疗性放射性金属是64Cu、67Ga、111In、177Lu、117mSn、165Er、90Y、227Th、225Ac、213Bi、212Bi、211As、212Pb、47Sc、166Ho、188Re、186Re、149Pm、159Gd、105Rh、109Pd、198Au、199Au、175Yb、142Pr、或114mIn。
在一些实施方式中，放射性金属是68Ga、61Cu、64Cu、67Cu、67Ga、111In、44Sc、86Y、89Zr、90Nb、177Lu、117mSn、165Er、90Y、227Th、225Ac、213Bi、212Bi、72As、77As、211At、203Pb、212Pb、47Sc、166Ho、188Re、186Re、149Pm、159Gd、105Rh、109Pd、198Au、199Au、175Yb、142Pr、114mIn、94mTc、99mTc、149Tb、152Tb、155Tb、或161Tb。在其他实施方式中，放射性金属、放射性核素结合的金属或包含放射性核素结合的金属的部分或辅基是：68Ga、61Cu、64Cu、67Cu、67Ga、111In、44Sc、86Y、177Lu、90Y、225Ac、213Bi、或212Bi。在一些实施方式中，螯合剂是来自表2的螯合剂，并且螯合的放射性金属/放射性核素是作为螯合剂的结合剂在表2中指示的放射性核素。
在一些实施方式中，螯合剂是：与177Lu、111In、213Bi、68Ga、67Ga、203Pb、212Pb、44Sc、47Sc、90Y、86Y、225Ac、117mSn、153Sm、149Tb、152Tb、155Tb、161Tb、165Er、213Bi、224Ra、212Bi、212Pb、225Ac、227Th、223Ra、47Sc、64Cu或67Cu螯合的DOTA或其衍生物；与225Ac轭合的H2-MACROPA；与227Th螯合的Me-3,2-HOPO；与225Ac、227Th或177Lu螯合的H4py4pa；与177Lu螯合的H4pypa；与68Ga螯合的NODAGA；与111In螯合的DTPA；或与89Zr螯合的DFO。
在一些实施方式中，螯合剂是TETA(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸)、SarAr(1-N-(4-氨基苄基)-3,6,10,13,16,19-六氮杂双环[6.6.6]-二十烷-1,8-二胺)、NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸)、TRAP(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三[甲基(2-羧乙基)次膦酸)、HBED(N,N0-双(2-羟基苄基)-乙二胺-N,N0-二乙酸)、2,3-HOPO(3-羟基吡啶-2-酮)、PCTA(3,6,9,15-四氮杂二环[9.3.1]-十五-1(15),11,13-三烯-3,6,9,-三乙酸)、DFO(去铁胺)、DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)、OCTAPA(N,N0-双(6-羧基-2-吡啶基甲基)-乙二胺-N,N0-二乙酸)、或另一种吡啶甲酸衍生物。
在一些实施方式中，螯合剂是用于用99mTc、94mTc、186Re、或188Re放射性标记的螯合剂，诸如，巯基乙酰基、肼基烟酰胺、二巯基丁二酸、1,2-亚乙基二基-L-半胱氨酸二乙基酯、亚甲基二膦酸酯、六甲基亚丙基胺肟、以及六(甲氧基异丁基异腈)等。在一些实施方式中，螯合剂是巯基乙酰基、肼基烟酰胺、二巯基琥珀酸、1,2-亚乙基二基-L-半胱氨酸二乙基酯、亚甲基二膦酸酯、六甲基亚丙基胺肟、或六(甲氧基异丁基异腈)。在这些实施方式的一些中，螯合剂由放射性金属结合。在一些这样实施方式中，放射性金属是99mTc、94mTc、186Re、或188Re。
在一些实施方式中，螯合剂是能够结合72As或77As的螯合剂，诸如，三硫醇螯合物等。在一些实施方式中，螯合剂是三硫醇螯合物。在一些实施方式中，螯合剂轭合至72As。在一些实施方式中，螯合剂轭合至77As。
适合于螯合至上述金属螯合剂的非放射性金属是熟知的，例如89Y、174Lu、208Pb等，包括已知的稳定或亚稳定同位素，这些同位素在过渡金属、镧系元素和锕系元素中是公知的，通常由熟悉金属螯合技术的人使用。
含BF3的部分(也称为“含BF3的辅基”)可以是能够18F/19F交换放射性标记的任何这样的基团。
在一些实施方式中，含BF3的部分是其中，Ra和Rb各自独立地是C1-C5直链或支链烷基。在一些实施方式中，Ra是甲基。在一些实施方式中，Ra是乙基。在一些实施方式中，Ra是丙基。在一些实施方式中，Ra是异丙基。在一些实施方式中，Ra是正丁基。在一些实施方式中，Rb是甲基。在一些实施方式中，Rb是乙基。在一些实施方式中，Rb是丙基。在一些实施方式中，Rb是异丙基。在一些实施方式中，Rb是正丁基。在一些实施方式中，Ra和Rb是相同的。在一些实施方式中，Ra和Rb是不同的。
在一些实施方式中，含BF3的部分是表3(下文)中所示的基团，其中，每个R(当存在时)，例如在被-OR、-SR、-NR-、-NHR或-NR2基团取代的吡啶中，独立地是C1-C5直链或支链烷基。在一些实施方式中，R是甲基。在一些实施方式中，R是乙基。在一些实施方式中，R是丙基。在一些实施方式中，R是异丙基。在一些实施方式中，R是正丁基。在一些实施方式中，含BF3的部分是
表3：含BF3基团的非限制性实施例。
在一些实施方式中，含BF3的部分是表4(下文)中所示的基团，其中，每个R(当存在时)，例如在被-OR、-SR、-NR-、-NHR或-NR2基团取代的吡啶中，独立地是C1-C5直链或支链烷基。在一些实施方式中，R是甲基。在一些实施方式中，R是乙基。在一些实施方式中，R是丙基。在一些实施方式中，R是异丙基。
表4：含BF3的基团的进一步非限制性实施例。
在一些实施方式中，含BF3的部分包含18F。在一些实施方式中，含BF3的部分中的一个氟是18F。在一些实施方式中，所有三种氟都是18F。在一些实施方式中，含BF3的部分中的所有三种氟都是19F。
在一些实施方式中，化合物或复合物包含多个含BF3的部分，每个可以相同或不同或其组合。一些实施方式包含两个含BF3的部分，其每一个独立地选自上面列出的那些。一些实施方式包含三个含BF3的部分，其每一个独立地选自上面列出的那些。一些实施方式包含四个含BF3的部分，其每一个独立地选自上面列出的那些。在一些实施方式中，含BF3的部分连接至位于金属螯合剂和细胞靶向结构域之间的接头。
应当理解，虽然通过同位素交换进行的18F-标记可以是优选的标记方法，但是在某些情况下，其他sp2/sp3杂化的硼酸盐物种的转化可能是有利的。此类硼酸盐的实施例包括频哪醇盐、二-，三-，四-芳基化的频哪醇盐、新戊基二醇盐、儿茶酚盐、通常的二醇盐、MIDA-硼酸盐、基于邻氨基苯甲酰胺的复合物，甚至可能的硼氢化物。此类硼酸盐复合物是有机硼化学领域中的技术人员已知的或容易已知的，并且当此类复合物可以容易地转化为相应的三氟硼酸盐时，它们是任选地令人感兴趣的。因此，在一些实施方式中，化合物/复合物包含能够转化为18F-标记的三氟硼酸盐而不是含BF3的部分的硼酸盐前体。
化合物或分子复合物还可以包含接头。例如，但不限于，金属螯合剂可以通过含有含BF3部分的接头连接至靶向细胞的结构域。在一些实施方式中，接头包含两个(或更多个)含BF3的部分。然而，化合物/复合物的组分可以具有任何构型。例如，含BF3的部分(或多个部分)可以直接附接至金属螯合剂和/或靶向细胞的结构域。接头的非限制性实施例是肽接头。
接头可以是任何接头，包括例如但不限于氨基酸接头、肽接头、聚乙二醇(PEG)接头、亚烷基(例如，C1-C30)接头、醚、酯、硫醚、二硫化物、硫酯、酰胺、氨基甲酸酯、脲基、磷酸二酯。在一些实施方式中，接头是或包含N(H)(CH2)nC(O)，其中，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、或大于15。
在一些实施方式中，接头是直链或支链肽接头(Xaa1)n，其中，n是1至8，并且每个Xaa1是相同或不同的或是其组合。在一些实施方式中，肽接头是直链肽接头。在一些实施方式中，肽接头是支链肽接头。在一些实施方式中，n是1。在一些实施方式中，n是2。在一些实施方式中，n是3。在一些实施方式中，n是4。在一些实施方式中，n是5。在一些实施方式中，n是6。在一些实施方式中，n是7。在一些实施方式中，n是8。在一些实施方式中，每个Xaa1独立地选自表1中列出的蛋白源性氨基酸和非蛋白源性氨基酸。在一些实施方式中，接头中的每个肽主链氨基任选地被甲基化。
在一些实施方式中，接头包含Lys(AMBF3)。在一些实施方式中，包括例如(但不限于)在包含PEG接头或肽接头(Xaa1)1-8的实施方式中，接头包含定义为-N(H)-C(R1R2R3)(H)-C(O)-的氨基酸残基Xaa2，其中，R1是C1-C5亚烷基，R2是并且R3是或表1或表2中所示的基团，其中，每个R独立地是C1-C5直链或支链烷基。在一些实施方式中，R1是-CH2-。在一些实施方式中，R1是-(CH2)2-。在一些实施方式中，R1是-(CH2)3-。在一些实施方式中，R1是-(CH2)4-。在一些实施方式中，R1是-(CH2)5-。在一些实施方式中，R2是在一些实施方式中，R2是在一些实施方式中，R3是其中，Ra和Rb各自独立地是C1-C5直链或支链烷基。在一些实施方式中，Ra是甲基。在一些实施方式中，Ra是乙基。在一些实施方式中，Ra是丙基。在一些实施方式中，Ra是异丙基。在一些实施方式中，Ra是正丁基。在一些实施方式中，Rb是甲基。在一些实施方式中，Rb是乙基。在一些实施方式中，Rb是丙基。在一些实施方式中，Rb是异丙基。在一些实施方式中，Rb是正丁基。在一些实施方式中，Ra和Rb是相同的。在一些实施方式中，Ra和Rb是不同的。在一些实施方式中，R3是在一些实施方式中，R3是在一些实施方式中，接头包含两个Xaa2残基，Xaa2残基中的每一个独立地如上所定义(即，相同或不同)。
在一些实施方式中，金属螯合剂通过形成酰胺键(在氨基与羧酸基团之间)或1,2,3-三唑(在叠氮化物与炔烃之间的反应)或通过马来酰亚胺与硫醇基之间的反应附接至接头或靶向细胞的结构域。
在一些实施方式中，螯合剂附接(具有或不具有接头)至肽/多肽/蛋白质细胞靶向结构域的N末端，并且含BF3的部分(或前体)附接(具有或不具有接头)至细胞靶向结构域的C末端。在一些实施方式中，螯合剂附接(具有或不具有接头)至肽/多肽/蛋白质细胞靶向结构域的C末端，并且含BF3的部分(或前体)附接(具有或不具有接头)至细胞靶向结构域的N末端。在一些实施方式中，螯合剂附接(具有或不具有接头)至肽/多肽/蛋白质细胞靶向结构域的N末端，并且含BF3的部分(或前体)附接(具有或不具有接头)至细胞靶向结构域的侧链。在一些实施方式中，螯合剂附接(具有或不具有接头)至肽/多肽/蛋白质细胞靶向结构域的C末端，并且含BF3的部分(或前体)附接(具有或不具有接头)至细胞靶向结构域的侧链。在一些实施方式中，螯合剂和含BF3的部分均附接(具有或不具有接头)到肽/多肽/蛋白质细胞靶向结构域的分开的侧链。在一些实施方式中，螯合剂经由接头附接至肽/多肽/蛋白质细胞靶向结构域的N末端或C末端，并且含BF3的部分(或前体)附接至接头。在一些实施方式中，螯合剂经由接头连接至肽/多肽/蛋白质细胞靶向结构域的侧链，并且含BF3的部分(或前体)附接至接头。出于说明性目的，图1示出化合物或复合物的不同非限制性构型。
在一些实施方式中，化合物或分子复合物具有式I或是式I的盐或溶剂化物：
[螯合剂]-[接头]-[细胞靶向结构域] (I)，
其中：螯合剂是上述任何螯合剂；细胞靶向结构域是以上描述的任何细胞靶向结构域；并且接头包含一个或多个独立地选自上述那些的任何含BF3的部分。在一些实施方式中，接头是以上定义的任何肽接头。
在一些实施方式中，化合物或分子复合物是或包含DOTA-AMBF3-PEG2-LLP2A。
在一些实施方式中，化合物或分子复合物是或包含PSMA-617-LysAMBF3-DOTA。
在一些实施方式中，化合物或分子复合物是或包含DOTA-Lys(AMBF3)-TATE。
在一些实施方式中，化合物或分子复合物是或包含DOTA-Lys-AMBF3-Pip-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2。
在一些实施方式中，组合物包含[螯合剂]-[接头]-BF3。
在一些实施方式中，化合物或分子复合物还包含荧光团或其他发光部分，诸如(但不限于)Cy3、Cy5、Cy7、其他近IR染料、或荧光素。
化合物或分子复合物的各种实施方式涉及适用于成像和放射疗法的双模式化合物或分子组合物，该双模式化合物或分子组合物包含：a)细胞抗原靶向模块；b)容易用18F标记的含BF3的部分/辅基；以及c)易于与放射性治疗同位素或非放射性同位素一起配制的含有放射性毒素的部分。如上所描述，在诊断成像模式/形式中，BF3部分含有至少一个“热”放射性氟(即，18F)，而含放射性毒素的部分含有非放射性(“冷”)同位素/金属原子(或者根本没有)。因此，在一些实施方式中，含BF3的部分/辅基用18F标记，并且含放射性毒素的部分含有放射性治疗同位素。在靶向放射疗法模式/形式中，BF3部分可以含有“冷”氟(即，19F)，而含放射性毒物的部分含有放射性/放射性毒性“热”同位素/金属原子(对于放射疗法适当有效)。因此，在一些实施方式中，含BF3的部分/辅基用19F标记，并且含放射性毒素的部分含有非放射性同位素或不含有放射性同位素。因此，此类化合物包括有用的治疗诊断对，由此通过在诊断成像模式中使用组合物(即，具有18F)来实现疾病检测/诊断，并且通过随后在靶向放射疗法模式中使用相同组合物(即，不具有18F并且具有放射疗法同位素)来实现疾病治疗/疗法。然后，前者构成后者的“伴随诊断”。
如以上指出的，在各种实施方式中，本发明的双模式(成像/放射疗法)化合物的功能结构域可以通过本领域技术人员熟知的不同大小/长度的各种接头/插入基团分开。在一些实施方式中，细胞抗原结合模块、含BF3的辅基和含放射性毒素的部分可以相对于彼此以多种不同的构型定位，以获得治疗诊断学对的所期望的特性(用于相同化学组合物的成像和靶向放射疗法的伴随诊断)。图1示出双模式PET显像剂/放射疗法的一些构型的非限制性图示。
在一些实施方式中，细胞抗原结合模块可以包括i)肽/多肽，ii)能够结合至被靶向的细胞抗原上的非肽/非蛋白质配体，iii)抗体或抗体片段，iv)scFv结构域/片段，v)核酸适体，或vi)双特异性抗体或其片段。因此，用三氟硼酸盐和螯合剂两者的修饰可以应用于非肽小分子、药物、或具有不同特性的其他组合物或更大分子，例如，抗体、适体等。在一些实施方式中，被靶向的细胞抗原是被称为跨细胞极晚抗原4(VLA-4)的整联蛋白，并且化合物是或包含DOTA-AMBF3-PEG2-LLP2A。在一些实施方式中，被靶向的细胞抗原/蛋白质是前列腺特异性膜抗原(PSMA)，并且化合物是或包括PSMA-617-LysAMBF3-DOTA。在一些具体实施方式中，被靶向的细胞抗原是生长抑素受体(即，SSTR)，并且化合物是或包含DOTA-Lys(AMBF3)-TATE。在一些实施方式中，被靶向的细胞抗原是胃泌素释放肽受体(GRPR)，并且化合物是或包括DOTA-Lys(AMBF3)-RM2(DOTA-Lys-AMBF3-4-氨基-1-羧甲基-哌啶-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2)。在一些具体实施方式中，被靶向的细胞抗原是缓激肽受体(例如缓激肽-1-受体；B1R)，并且化合物是或包含DOTA-Lys(AMBF3)-BK。在一些实施方式中，容易用18F标记的含BF3的部分/辅基是如在以下专利申请中所公开的：WO/2005/077967、WO/2009/012596A1、以及WO/2014/134716，其要求US 61/775,280的优先权，将其各自通过引用以其全文结合。
在一些实施方式中，但不限于此，放射性毒素螯合部分可以包括金属离子螯合剂(例如，DOTA、NOTA、NODAGA、Octapa、Macropa等。在其他实施方式中，螯合剂可以用于螯合用于荧光、MRI应用、以及涉及金属的其他应用的金属，它们以将金属和螯合剂用于将被视为双峰或多峰的应用的方式进行治疗、诊断或发射。在一些实施方式中，但不限于此，治疗性放射性毒素/金属包括177Lu或210Bi或212Pb。对于实践本发明的治疗模式有用的其他适合的放射金属是已知的或可获得的。在一些实施方式中，螯合剂不与金属一起使用或与非放射性金属螯合，例如，Zn2+、Ca2+、Ni2+、Gd3+等。此类化合物可以用于成像(例如，PET成像)。在一些实施方式中，化合物可以包括18F和放射性金属两者(例如，225Ac)。此类化合物可以用于成像(例如，PET)，以识别不存在225Ac的稳定同位素而对225Ac的靶向疗法应答的患者。对于治疗，人们将使用19F-同位素，同时保留放射性毒物225Ac。在一些实施方式中，一种或多种三氟硼酸盐可以连接至包含至少一种螯合剂的示踪剂。因此，在一些实施方式中，化合物/组合物含有多于一个三氟硼酸盐基团。还有可能的是，人们可以使用有限量的18F-氟化物来制备用于成像应用的双重标记的放射性示踪剂，其中还期望放射性金属。
在此呈现的化合物结合肽，这些肽可以通过本领域中建立的多种方法中的任一种来合成。这包括但不限于使用9-芴基甲氧羰基(Fmoc)和/或叔丁氧羰基(Boc)化学方法的液相以及固相肽合成、和/或其他合成方法。
固相肽合成方法和技术是本领域熟知的。例如，可以通过依次连续并入感兴趣的氨基酸残基来合成肽。在此类方法中，典型地通过将感兴趣的肽的C末端氨基酸附接至适合的树脂上来启动肽合成。在此之前，通过适合的保护基团保护这些氨基酸的反应性侧链和α氨基基团免于反应，仅允许α羧基基团与固体载体上的官能团(诸如，胺基团、羟基基团或烷基卤基团)反应。在将C末端氨基酸偶联至支持物之后，选择性地去除侧链上的保护基团和/或氨基酸的α氨基，允许偶联下一感兴趣的氨基酸。重复该过程，直至完全合成所需的肽，此时可以从支持物上切割肽并且进行纯化。用于固相肽合成的仪器的非限制性实施例是Aapptec Endevaor 90肽合成仪。
为了允许另外的氨基酸的偶联，例如，在温和的碱性条件下，可以从固体支持物上的氨基酸去除Fmoc保护基团，诸如，在DMF中的哌啶(20-50％v/v)。待添加的氨基酸也必须被活化用于偶联(例如在α羧酸酯处)。活化试剂的非限制性实施例包括但不限于2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)、2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)、苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲基氨基)六氟磷酸鏻(BOP)、苯并三唑-1-基-氧基-三(吡咯烷基)六氟磷酸鏻(PyBOP)。外消旋化通过使用三唑(诸如，1-羟基-苯并三唑(HOBt)和1-羟基-7-氮杂-苯并三唑(HOAt))而最小化。偶联可以在合适的碱(诸如，N,N-二异丙基乙胺(DIPEA/DIEA)等)的存在下进行。对于长肽或如果期望的话，可以使用肽合成和连接。
除了形成典型的肽键以延长肽之外，可以通过附接至侧链官能团(例如，羧酸基团或氨基)以分支方式延长肽，或：侧链至侧链；或侧链至主链氨基或羧酸酯。偶联至氨基酸侧链可以通过任何已知的方法进行，并且可以在树脂上或树脂外进行。非限制性实施例包括：在含有羧基的氨基酸侧链(例如，Asp、D-Asp、Glu、D-Glu等)与含有氨基的氨基酸侧链(例如，Lys、D-Lys、Orn、D-Orn、Dab、D-Dab、Dap、D-Dap等)或肽N末端之间形成酰胺；在含有氨基的氨基酸侧链(例如.Asp、D-Asp、Glu、D-Glu等)与含有羧基的氨基酸侧链或肽C末端之间形成酰胺(例如，Lys、D-Lys、Orn、D-Orn、Dab、D-Dab、Dap、D-Dap等)；并且通过点击化学在包含叠氮基的氨基酸侧链之间形成1,2,3-三唑(例如，Lys(N3)、D-Lys(N3)等)和炔基(例如，Pra、D-Pra等)。适当的官能团上的保护基团必须在酰胺键形成之前选择性地去除，而炔烃与叠氮基之间通过点击反应形成1,2,3-三唑的反应不需要选择性脱保护。可选择性去除的保护基的非限制性实施例包括2-苯基异丙酯(O-2-PhiPr)(例如在Asp/Glu上)以及4-甲基三甲苯基(Mtt)、烯丙氧基羰基(alloc)、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基))乙基(Dde)和1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)-3-甲基丁基(ivDde)(例如，在Lys/Orn/Dab/Dap上)。O-2-PhiPr和Mtt保护基团可以在温和的酸性条件下选择性地脱保护，诸如，在DCM中的2.5％三氟乙酸(TFA)。可以使用在DCM中的四(三苯基膦)钯(0)和苯基硅烷将Alloc保护基团选择性地脱保护。可以使用在DMF中的2-5％肼对Dde和ivDde保护基团进行选择性脱保护。然后，例如，通过使用上述偶联反应条件，可以偶联Asp/Glu(L-或D-形式)和Lys/Orn/Dab/Dap(L-或D-形式)的脱保护的侧链。
肽主链酰胺可以是N-甲基化的(即，α氨基甲基化的)。这可以通过在肽合成期间直接使用Fmoc-N-甲基化氨基酸来实现。或者，可以在Mitsunobu条件下进行N-甲基化。首先，使用4-硝基苯磺酰氯(Ns-Cl)和2,4,6-三甲基吡啶(三甲基吡啶)在NMP中的溶液保护游离的伯胺基团。然后可以在三苯基膦、偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD)和甲醇的存在下实现N-甲基化。随后，可以在NMP中使用巯基乙醇和1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)进行N-脱保护。为了将受保护的氨基酸偶联至N-甲基化的α氨基，可以使用HATU、HOAt和DIEA。
接头和本发明的化合物/复合物的不同组分之间的偶联可能需要硫醚(-S-)或醚(-O-)键的形成；这可以在固相或在溶液相中实现。例如，硫醚(-S-)键的形成可以通过在碱(诸如，N,N-二异丙基乙胺等)的存在下，在适当的溶剂(诸如，N,N-二甲基甲酰胺等)中，在含硫醇的化合物(诸如，半胱氨酸侧链上的硫醇基)和烷基卤(诸如，3-(Fmoc-氨基)-丙基溴等)之间的偶联来实现。在三苯基膦和二异丙基叠氮二羧酸酯(DIAD)的存在下，在非质子性溶剂(诸如，1,4-二噁烷等)醚(-O-)键的形成可以通过醇(诸如，丝氨酸或苏氨酸侧链上的羟基)与酚基(诸如，酪氨酸的侧链)之间的Mitsunobu反应来实现。如果这些反应在溶液相中进行，所使用的反应物优选地是当量摩尔比(1比1)，并且所期望的产物可以通过快速柱色谱法或高效液相色谱法(HPLC)进行纯化。如果这些反应在固相上进行，意味着一种反应物已经附接至固相，则另一种反应物通常以过量的量使用(≥3当量的附接至固相的反应物)。在反应之后，过量的未反应的反应物和试剂可以通过使用溶剂(诸如，N,N-二甲基甲酰胺、甲醇和二氯甲烷)的组合依次洗涤固相(树脂)来去除。
非肽部分(例如，放射性标记基团、白蛋白结合基团和/或接头)可以偶联至肽N末端，同时肽附接至固体支持物。当非肽部分包括活化的羧酸酯(以及如果必要的受保护的基团)以使得可以在树脂上进行偶联时，这是容易的。例如但不局限于，双功能螯合剂(诸如，1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)三(叔丁酯)可以在N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)的存在下活化以用于偶联至肽。或者，非肽部分可以在液相或固相条件下经由铜催化的点击反应结合至化合物。铜催化的点击反应在本领域中是充分建立的。例如，2-叠氮基乙酸首先被NHS和DCC活化并且偶联至肽。然后，在Cu2+和抗坏血酸钠的存在下，可以在水和有机溶剂(诸如，乙腈(ACN)和DMF等)中将含炔的非肽部分点击至含叠氮化物肽。
放射性醛螯合剂的合成是众所周知的并且许多螯合剂是可商购的(例如，从Sigma-AldrichTM//Milipore SigmaTM以及其他公司)。用于将放射性金属轭合至螯合剂的方案也是熟知的(例如，参见以下实施例1)。
通常，通过在含BF3的叠氮基(或炔基)和接头上的炔基(或叠氮基)之间形成1,2,3-三唑环，含BF3的基序可以通过点击化学与接头偶联，或者通过在含BF3的羧酸酯与接头上的氨基之间形成酰胺键。为了制备含BF3的叠氮化物、炔或羧酸酯，首先通过在HCl、DMF和KHF2的混合物中将硼酸酯转化成BF3来制备含硼酸酯的叠氮化物、炔或羧酸酯。对于烷基BF3、含硼酸酯的叠氮化物、炔烃或羧酸酯可以通过将含硼酸酯的烷基卤化物(诸如，碘甲基硼酸频哪醇酯)与含胺的叠氮化物、炔烃或羧酸酯(诸如，N,N-二甲基炔丙基丙胺)偶联来制备。对于芳基BF3，硼酸酯可以通过Suzuki偶联使用芳基卤(碘或溴)和双(频哪醇)二硼烷来制备。
通过18F-19F同位素交换反应进行的含BF3部分的18F-氟化可以按照先前公开的程序来实现(Liu等人，Nat Protoc 2015 10：1423-1432，通过引用以其全文结合)。通常，将约100nmol的含BF3的化合物溶解于15μL的哒嗪-HCL缓冲液(pH＝2.0-2.5，1M)、15μL的DMF和1μL的7.5mM KHF2水溶液的混合物中。将18F-氟化物溶液(在盐水中，60μL)添加至反应混合物中，并且将所得溶液在80℃下加热20min。在反应结束时，所期望的产物可以通过固相萃取或通过使用水和乙腈的混合物作为流动相的反向高效液相色谱法(HPLC)进行纯化。
当肽已经在固体支持物上完全合成时，可以使用适合的试剂(诸如，TFA、三异丙基硅烷(TIS)和水)将所期望的肽/化合物从固体支持物上裂解。同时去除侧链保护基团，诸如，Boc、五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)、三苯甲基(Trt)和叔丁基(tBu)(即，脱保护)。粗肽/化合物可以通过加入冷醚，随后离心从溶液中沉淀并且收集。可以通过标准分离技术，诸如，基于肽的大小、电荷和极性的高效液相色谱(HPLC)进行肽的纯化和表征。可以通过质谱法或其他类似方法来确认纯化的肽的身份。
合成方案的实施例提供于实施例中。
如所讨论的，在本文公开的化合物/复合物是双模式，因为它们适合于成像或放射疗法，或可以用于两种应用。例如，当18F-标记的(“热F”)时，这些化合物/复合物可以用作显像/诊断剂，或者当与一种治疗性放射性金属同位素(“热M”)螯合时，这些化合物/复合物可以用作治疗剂。
因此，在一些实施方式中，金属螯合剂是热F/冷M，即，18F-标记的(优选用于PET)并且未螯合或与非放射性金属同位素螯合。此类实施例在不引起来自放射性金属同位素的负效应的情况下作为成像剂或诊断剂是有用的。如果成像揭示受试者是用于治疗性治疗的候选者，则可以给予相同的化合物/复合物(作为冷F/热M或热F/热M)。因此，热F/冷M化合物/复合物作为热M治疗剂的伴随诊断是有用的。因此，18F用于成像与非放射性金属同位素(例如，89Y、174Lu、208Pb)螯合的结合的化合物/复合物。用热F/冷M同位素显示阳性图像的患者可以用包含冷F/热M的放射性毒性同位素治疗。
当含BF3的部分组是18F-标记的(即，热F)时，公开化合物/复合物用于制备放射性标记的示踪剂的用途，该示踪剂用于对受试者中表达细胞标记物/抗原的组织成像。还公开使受试者中表达细胞标记物/抗原的组织成像的方法，其中，方法包括：向受试者给予包含化合物/复合物和合适的赋形剂的组合物；以及例如使用PET或SPECT使受试者的组织成像。当组织是患病组织时，然后可以选择使用热M版本的靶向治疗用于治疗受试者。
当金属螯合剂与治疗性放射性同位素螯合时，公开化合物/复合物(或其药物组合物)用于在受试者中治疗与细胞标记物/抗原的表达相关的病症或疾病的用途。因此，提供化合物在制备用于治疗受试者的与细胞标记物/抗原的表达相关的病症或疾病的药物中的用途。还提供治疗受试者的病症或疾病的方法，其中，方法包括：向受试者给予包含化合物/复合物和药学上可接受的赋形剂的组合物。
化合物或分子复合物的各种实施方式可以用于：使用标记有18F的化合物或分子复合物对受试者成像以确认疾病或病症的细胞标记物的存在；并且使用与治疗性放射性同位素螯合的化合物或分子复合物治疗疾病或病症。因此公开一种方法，包括：向受试者给予治疗诊断对的18F-标记的化合物或分子复合物；使用18F标记的化合物或分子复合物对受试者成像以确认疾病或病症的细胞标记物的存在；以及通过给予治疗诊断对的放射性酰化化合物或分子复合物来治疗疾病或病症。在一些实施方式中，方法/用途还包括进行18F/19F-同位素交换反应以制备放射性氟化的化合物/复合物。在一些实施方式中，方法/用途还包括进行螯合反应以制备放射性金属化的化合物/复合物。在一些实施方式中，将用于诊断步骤的化合物/复合物与螯合至用于治疗步骤的化合物/复合物的治疗用金属的非治疗性同位素金属化。
例如，但不限于，细胞靶向结构域可以是LLP2A，并且待成像的组织可以是表达VLA-4的组织。例如，但不限于，细胞靶向域可以是LLP2A，并且病症或疾病可以是表达VLA-4的病症或疾病，诸如，多发性骨髓瘤、白血病和其他血液恶性肿瘤、以及黑素瘤、多发性硬化、哮喘、克罗恩病、炎性肠病等。例如，但不限于，化合物可以是DOTA-AMBF3-PEG2-LLP2A。
例如，但不限于，细胞靶向结构域可以是PSMA-617，并且待成像的组织可以是表达PSMA的组织。例如，但不限于，细胞靶向结构域可以是PSMA-617，并且疾病可以是表达PSMA的癌症。例如，但不限于，化合物可以是PSMA-617-LysAMBF3-DOTA。已经在不同癌症中检测到PSMA表达(例如，Rowe等人，2015，《核医学年鉴》(Annals of Nuclear Medicine)29：877-882；Sathekge等人，2015，《欧洲核医学分子成像杂志》(Eur J Nucl Med Mol Imaging)42：1482-1483；Verburg等人，2015，《欧洲核医学分子成像杂志》(Eur J Nucl Med MolImaging)42：1622-1623；以及Pyka等人，《核医学杂志》(J Nucl Med)，2015年11月19，jnumed.115.164442。因此，但不限于，表达PSMA的癌症可以是前列腺癌、肾癌、乳腺癌、甲状腺癌、胃癌、结肠直肠癌、膀胱癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、脑肿瘤、黑色素瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、或肉瘤。在一些实施方式中，癌症是前列腺癌。
例如，但不限于，细胞靶向结构域可以是TATE，并且有待成像的组织可以是表达生长抑素受体的组织。例如，但不限于，细胞靶向结构域可以是TATE，并且病症或疾病可以是表达生长抑素受体的病症或疾病，诸如，神经内分泌肿瘤、乳癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、以及胰腺癌。例如，但不限于，化合物可以是DOTA-Lys(AMBF3)-TATE。
例如，但不限于，细胞靶向结构域可以是蛙皮素或蛙皮素衍生物(例如，D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2)，并且待成像的组织可以是表达GRPR的组织。例如，但不限于，细胞靶向结构域可以是蛙皮素或蛙皮素衍生物(例如，D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2)，并且病症或疾病可以是表达GRPR的病症或疾病。已经在各种病症和疾病中检测到异常或异常GRPR表达，包括精神/神经障碍、炎性疾病和癌症。因此，但不限于，表达GRPR的病症或疾病可以是精神障碍、神经障碍、炎性疾病、前列腺癌、肺癌、头颈癌、结肠癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、神经胶质瘤、或成神经细胞瘤。在一些实施方式中，癌症是前列腺癌。例如，但不限于，化合物可以是DOTA-Lys(AMBF3)-Pip-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2。
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现在将在下列实施例中进一步阐述本发明。
实施例
18F-标记的伴随诊断与放射治疗剂在化学上是相同的。由于18F优选用于PET，制备用于成像的热F/冷M等位体，其用作可用于治疗的冷F/热M等位体的伴随诊断。因此，18F可以用于对与非放射性金属同位素(例如，89Y、174Lu、208Pb)螯合的肽成像。然后，表现出具有热F/冷M同位素影像阳性图像的患者可以用包含冷F/热M的放射性毒性同位素进行治疗。
对于治疗，可以使用放射性毒性金属(例如，90Y或177Lu 50,51等)。对于预处理成像，通常使用不同的诊断金属，例如，对于SPECT为111In或对于PET为64Cu。这种实践在将图像与潜在的治疗结果相关联时提出了问题。例如，DOTA-TATE用111In标记用于SPECT成像，然后用90Y标记用于治疗，但摄取存在明显差异。将相同的示踪剂与PET同位素86Y一起使用非常昂贵，并且不容易获得45,46。同时包含金属螯合剂(例如，DOTA)以及用于用18F-氟化物标记的侧挂有机三氟硼酸酯的肽是有利的。虽然最后螯合剂可以用于金属螯合——或者用于治疗用途的放射性毒性金属或者可以用作放射性毒物的替代物的非放射性金属(即，放射性毒性金属)或者用于其他目的，包括改变F-18标记的示踪剂的PKPC——具有螯合剂和BF3辅基两者的化合物/复合物(示踪剂)可以是优良的PET显像剂。
最初基于靶向PSMA的脲和靶向整联蛋白的肽配体LLP2A制备两种组合物(参见图2)。出人意料地，当通过同位素交换用18F-氟化物标记时，这些非金属化的组合物给出了优异的肿瘤摄取值以及异常的肿瘤：非肿瘤比率(参见表5、表6、表7以及图3和图4)。
细胞培养方法
B16F10黑色素瘤细胞系(小家鼠)可商购自ATTC(CRL-6475)。通过IMPACT1小鼠概况测试(IDEXX BioResearch)证实细胞系不含病原体。在37℃下，在含有5％的CO2的加湿培养箱中，在补充有10％的FBS、100U/mL的青霉素和100μg/mL链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，干细胞技术)中培养细胞。用无菌的1×PBS(pH 7.4)洗涤生长至约90％汇合的细胞，随后进行胰蛋白酶消化。
LNCap细胞系获自ATCC(LNCaP克隆FGC，CRL-1740)。它是从人前列腺腺癌的左锁骨上淋巴结的转移位点建立的。在37℃下，在含有5％的CO2的加湿培养箱中，在补充有10％的FBS、青霉素(100U/mL)和链霉素(100μg/mL)的PRMI 1640培养基中培养细胞。然后用无菌磷酸盐缓冲盐水(1×PBS pH 7.4)洗涤生长至80-90％汇合的细胞并且进行胰蛋白酶消化。
F-18LLP2A-Lys-AMBF3-DOTA的体内生物分布和PET/CT成像研究
所有动物实验都是根据加拿大动物护理委员会建立的指导方针进行的，并且由哥伦比亚大学的动物伦理委员会批准。将小鼠在无病原体条件下饲养，并且在加拿大温哥华的BC癌症研究中心的动物资源中心中保持12小时的光照和黑暗周期。使用雄性C57BL/6J小鼠进行PET成像和生物分布研究。对于肿瘤植入，通过在2.0L/min的氧气中用2％的异氟烷吸入来麻醉小鼠，并且在前肢水平的右后方皮下植入1×106个B16F10细胞。一旦肿瘤在8-10天内生长至直径达到8-10mm，就将小鼠成像或用于生物分布研究。
PET/CT成像研究在微PET/CT扫描仪(Inveon，西门子)上进行。简言之，对于静态PET扫描，在异氟烷镇静作用下经由尾侧尾静脉向每只荷瘤小鼠注射4-6MBq的F-18标记的LLP2A-Lys-AMBF3-DOTA。为了阻断研究，用100μg的非放射性LLP2A-Lys-AMBF3-DOTA共注射小鼠。注射后，允许小鼠恢复并且在其笼中自由漫步。50min后，将小鼠再次镇静并且定位在扫描仪中。获得基线CT扫描用于定位和衰减校正。这之后是10分钟的静态PET扫描。在采集期间通过加热垫使小鼠保持温热。在静态PET成像后使用CO2吸入对小鼠进行安乐死，然后进行生物分布。使用排序的子集期望最大化和最大后验算法(OSEM3D/MAP)，使用2次OSEM3D迭代再进行18次MAP迭代，以1.5mm的所需分辨率重建PET图像。
仅用于生物分布研究的小鼠通过吸入2％的异氟烷麻醉，并且注射12MBq的F-18标记的LLP2A-Lys-AMBF3-DOTA。为了阻断研究，将100μg的非放射性LLP2A-Lys-AMBF3-DOTA与放射性化合物共注射。注射后，使小鼠恢复并在其笼中自由漫步，并且在1小时后通过吸入CO2进行安乐死。迅速抽取血液，并且收获感兴趣的器官，用1×PBS(pH 7.4)冲洗，并且吸干。将每个器官称重并且使用WIZARD 2480(PerkinElmer)测量所收集的组织的放射性，使用标准曲线标准化至注射剂量并且表示为每克组织的注射剂量的百分比(％ID/g)。
F-18PSMA-Lys-AMBF3-DOTA的体内生物分布和PET/CT成像研究
使用NODSCID 1L2RγKO雄性小鼠进行成像和生物分布实验。维持小鼠，并且根据加拿大动物护理委员会建立的和英国哥伦比亚大学的动物伦理委员会批准的指导方针进行实验。通过在氧气中用2％的异氟烷吸入麻醉小鼠，并且在左肩后皮下植入1×107个LNCaP细胞。当肿瘤在5-6周期间生长至直径达到5-8mm时，将小鼠成像或用于生物分布研究。
使用Siemens Inveon(Erlanger，德国)微型PET/CT扫描仪进行PET成像实验。在麻醉下(在氧中2％的异氟烷)，通过尾静脉注射6-8MBq的F-18标记的PSMA-Lys-AMBF3-DOTA。为了阻断，将小鼠与非放射性DCFPyL(0.5mg)共注射。允许小鼠恢复并且在其笼中自由漫步。50min后，将小鼠在氧气吸入中再次用2％的异氟烷镇静并且定位在扫描仪中。首先进行10分钟CT扫描，用于局部化和分割后的衰减校正，用于重建PET图像。然后，进行10分钟静态PET成像以确定肿瘤和其他器官中的摄取。在采集期间通过加热垫使小鼠保持温热。
对于生物分布研究，用如上所描述的放射性示踪剂注射小鼠。为了阻断，将小鼠与非放射性DCFPyL(0.5mg)共注射。1小时后，用2％的异氟烷吸入麻醉小鼠，并且通过CO2吸入进行安乐死。立即从心脏抽取血液，并且收集感兴趣的器官/组织。将所收集的器官/组织称重，并且使用自动γ计数器计数。使用标准曲线将每个器官/组织中的摄取归一化为注射剂量，并且表示为％ID/g。
实施例1：通过DOTA轭合的18F-LLP2A三氟硼酸盐放射性示踪剂的调谐生物分布，用于黑色素瘤的VLA-4靶向PET成像
1.1摘要
跨细胞极晚抗原4(VLA-4)与肿瘤转移、耐药性相关，并且被许多癌症过表达。先前的报道已经显示，使用与LLP2A轭合物螯合的64Cu和68Ga，成功地对表达VLA-4的黑色素瘤进行PET显像，最近使用[18F]RBF3放射性辅基对18F进行成像。然而，这些先行文献[18F]RBF3-PEG2-LLP2A衍生物显示出适度的肿瘤摄取值和胃肠道中的显著积累。为了解决这个问题，我们设计了具有附加DOTA部分的新RBF3-LLP2A生物轭合物，其增加肿瘤摄取并且减少胃肠道积累。方法：本文中，我们描述了配备有18F-三氟硼酸盐放射性辅基、AMBF3和DOTA部分的修饰的LLP2A-PEG2-NH2(1)轭合物的合成。通过同位素交换放射性标记前体DOTA-AMBF3-PEG2-LLP2A(6)，并且通过半制备型HPLC和C18柱体洗脱进行纯化。使用携带过表达VLA-4靶标的B16-F10黑素瘤的雄性C57BL/6J小鼠，使用静态和动态PET扫描、生物分布研究和通过在注射后1小时(p.i.)共注射1超过[18F]6阻断的组合来评价DOTA-[18F]AMBF3-PEG2-LLP2A([18F]6)。结果：合成前体6并且18F-标记以提供具有131.72±50.32GBq/μmol的摩尔活性的[18F]6的制剂，其中平均(±SD)放射化学纯度为95.9±1.8％，放射性化学产率为4.8±2.9％。[18F]6的体内静态PET图像提供了清楚的肿瘤可视化，并且生物分布研究显示肿瘤摄取是9.46±2.19％注射剂量/克组织(％ID/g)，其中高肿瘤：肌肉和肿瘤：血液对比率分别是约8和约10。阻断证实肿瘤和骨髓中[18F]6对VLA-4的特异性。动态PET显示[18F]6主要经由肾通路清除，其中，与我们先前研究的[18F]RBF3-PEG2-LLP2A相比，肠中的积累减少约10倍，而脾摄取增加至与先前报道的LLP2A-螯合剂放射性示踪剂相似的水平。
结论：本研究突出了[18F]6作为有前景的VLA-4放射性示踪剂并且证明了LLP2A放射性示踪剂的生物分布如何可以从胃肠道重新路由到脾和膀胱。
1.2引言
跨细胞极晚抗原4(VLA-4)受体在若干癌症(1-15)中过表达，并且与肿瘤转移(11,16-18)和化疗(19)抗性相关。因此，其表示用于通过高亲和力肽模拟物配体LLP2A成像的通用生物标记物。自从Lam等人(20)开始发展以来，已经通过NIR荧光成像(21)、使用111In(22)和99mTc(23)的单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)、以及通过使用68Ga和64Cu的正电子发射断层摄影术(PET)针对体内VLA-4靶向验证了LLP2A药效团(23-27)。然而迄今为止，仅存在一个使用18F的PET成像的报道；将LLP2A-PEG2-NH2(1)附加于两个放射性辅基(二甲基-三氟硼酸铵(AMBF3)和N-吡啶基-对-三氟硼酸铵(N-Pyr-p-BF3))中的一个，然后在单一步骤中成功地18F-标记并且在具有B16-F10黑色素瘤肿瘤的小鼠中PET成像(28)。在注射后1h(p.i.)，这两个[18F]RBF3-PEG2-LLP2A的肿瘤摄取值是适度的(2.8和4.4％ID/g)，同时观察到高的肠积聚(约52％ID/g)。
相比之下，使用相同的鼠黑色素瘤肿瘤模型，LLP2A轭合物与螯合的放射性醛在1h至2h(p.i.)一致地展现出10-15％的ID/g范围内的肿瘤摄取值(23-27)。然而，由于通过网状内皮系统(RES)的部分清除，放射性金属化的LLP2A-螯合剂轭合物被一致地螯合在脾中。由于前述[18F]RBF3-PEG2-LLP2A显示出导致次优图像的疏水性质，我们假设将亲水性螯合剂DOTA结合到RBF3-PEG2-LLP2A生物轭合物上将有利于肾清除。因此，为了测试该假设，我们将1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)轭合至几乎相同的AMBF3-PEG2-LLP2A前体支架。为此，我们还设计了新的氨基酸Fmoc-Lys-(AMBF3)，其被接枝和脱保护以使得能够进一步附加DOTA部分。所得轭合物DOTA-[18F]AMBF3-LLP2A(6)通过18F/19F-同位素交换(IEX)(28,29)标记并且通过体内PET成像(静态和动态扫描)、生物分布研究和VLA-4阻断研究使用1作为验证的阻断剂来研究。据我们所知，此报告代表具有附加的DOTA-螯合剂的任何18F-标记的肽放射性示踪剂的首次研究，该DOTA-螯合剂用于调谐生物分布以有利于肾清除。
1.3材料和方法
DOTA-AMBF3-PEG2-LLP2A(6)的合成。如先前所描述(20)，在固相上合成LLP2A肽模拟物，同时使用O-双-(氨基乙基)乙二醇三苯甲基树脂用于锚定PEG2间隔基和-NH2轭合柄，如先前报道的(28,30)。将LLP2A-PEG2-NH2(1)(4.2mg，4.46μmol，1eq.)溶解于200μL的(1:19)DIPEA：DMF(v/v)中并且随后用于溶解Fmoc-Lys-(AMBF3)-NHS(2)(5.85mg，8.91μmol，2eq.)，其合成在补充信息中给出(方案2)。在室温下进行轭合2小时。将混合物通过快速真空(约50-100μL)浓缩，用1.0mL的Et2O沉淀并离心。去除上清液并且将产物再溶解于50μL的DMF中。重复所描述的Et2O沉淀/离心方法，并且通过快速真空干燥最终沉淀。这些方法以LLP2A-PEG2-AMBF3-Fmoc(3)的近定量产率给出了6.5mg(约4.3μmol)的产物。ESI-MS(+)：计算为，C76H98BF3N14O13，1483.5m/z；实测为，[M+Na]+＝1506.8m/z，[M+2Na-H]+＝1528.8m/z(图9)。TLC：[(1:19)NH4OH:EtOH，v/v]，Rf＝0.46(在254nm下可见)。将中间体3(1.5mg，1μmol，1eq.)用200μL的(1:4)哌啶：DMF(v/v)溶解，并且在室温下在2h内实现Fmoc-去除。将混合物浓缩并且经受两轮所描述的Et2O沉淀/离心方法。将最终的沉淀用快速真空干燥，得到定量产率的约1.3mg(约1μmol)的AMBF3-PEG2-LLP2A-NH2(4)。ESI-MS(+)：计算为，C61H88BF3N14O11，1261.3m/z；实测为[M+H]+＝1262.6m/z，[M+Na]+＝1284.6m/z(图10)。TLC：[(1:19)NH4OH:EtOH，v/v]，Rf＝0.18(用254nm可见，用茚三酮染色)。将中间体4(1.8mg，1.4μmol，1eq.)溶解于100μL的(1:19)DIPEA：DMF(v/v)中并且在室温下在2h内轭合至DOTA-NHS(5)(1.6mg，2.1μmol，1.5eq.)。将混合物浓缩并且经受两轮所描述的Et2O沉淀/离心方法。将最终的球粒通过快速真空干燥以提供2.4mg(约1.4μmol)的粗DOTA-AMBF3-PEG2-LLP2A(6)。重复前述步骤以获得42.1mg的粗品6用于HPLC纯化。将这些合并的样品溶解于1.0mL的(1:1)MeCN与0.1％的甲酸:H2O与0.1％的甲酸(v/v)中，并且通过HPLC方法A纯化。在tR＝8.9min时收集产物(6)，并且在用干冰冷冻和冻干之前用等体积的H2O稀释。这些方法产生3.1mg(1.9μmol)的纯化(>95％纯度)的放射性示踪剂前体6(通过ESI-MS表征，图11和HPLC表征，图12)，产率为7.4％。ESI-MS(+)：计算为，C77H114BF3N18O18，1647.6m/z；实测为，[M+H]+＝1648.9m/z，[M+Na]+＝1670.9m/z，[M+K]+＝1687.0m/z。TLC：[(1:19)NH4OH:MeOH]，Rf＝0.67(在254nm下可见，用溴甲酚绿用浅蓝色染色)。
方案2：Fmoc-Lys(AMBF3)-O-NHS的合成方案。
ESI-MS表征。使用Waters ZQ光谱仪用MeOH或CH3CN作为流动相获取质谱。
HPLC方法和表征。使用安捷伦(Agilent)1100HPLC(自动取样器单元和多通道PDA检测器)通过HPLC方法A纯化前体6。色谱专业公司Knauer Smartline泵100和Bioscan辐射检测器通过HPLC方法B纯化18F-放射性示踪剂7。在通过HPLC方法C注射动物之前，使用安捷伦科技(Agilent Technologies)1200HPLC(单通道1200系列PDA检测器和Bioscan辐射检测器，通过安捷伦接口(Agilent Interface)35900E连接)来研究前体6和7种制剂的QC的标准曲线。
HPLC方法A：用于6的纯化和分析。安捷伦Eclipse XDB-C18，9.4mm x 250mm，5μm柱；溶剂A＝MeCN，含0.1％的甲酸(v/v)，并且溶剂B＝H2O，含与0.1％甲酸(v/v)；流速＝2.0mL/min；吸收通道＝257nm(纯化)和241nm(分析)。梯度：i)在15分钟内25％至80％的溶剂A，ii)80％至100％的溶剂A持续1分钟，iii)100％的溶剂A持续6min，iv)100％至25％的溶剂A持续1分钟，v)25％的溶剂A持续6min。
HPLC方法B：用于纯化[18F]6。PhenomenexLuna C18-100A，10mm x 250mm，5μM柱；溶剂A＝H2O，含0.1％的TFA(v/v)，并且溶剂B＝MeOH，含0.1％的TFA(v/v)；流速＝4.5mL/min；吸光度通道＝257nm。最初，使用含有40％的溶剂B(v/v)的等度混合物持续12min，然后切换到100％的溶剂B(v/v)持续另一12min。在约21min至23min时收集18F-放射性示踪剂[18F]6。
HPLC方法C：用于分析[18F]6。Phenomenex Jupiter C18-300A，4.6mm x 250mm，10μm柱；溶剂A＝H2O，含0.1％的TFA(v/v)，溶剂B＝MeCN，含0.1％的TFA(v/v)；流速＝2.0mL/min；吸光度通道＝257nm。梯度：i)0％的溶剂B持续4min，ii)0％至40％的溶剂B持续2min，iii)40％的溶剂B持续4min，iv)40％至80％的溶剂B持续4min，v)80％的溶剂B持续11min，vi)80％至0％的溶剂B持续3min，并且vii)0％的溶剂B持续4min。
Fmoc-Lys-AMBF3-NHS的合成
化学品、溶剂、硬件。3-二甲氨基-1-丙炔和三氟甲基磺酰酸酐购自Sigma-Aldrich。碘代甲基硼酸频哪醇酯购自Frontier Scientific。氟化氢钾(KHF2)购自AcrosOrganics。叠氮化钠购自Honeywell Riedel-de Haen。Fmoc-Lys-OH购自Novabiochem。硫酸铜、抗坏血酸、氢氧化钠和碳酸钾购自Fisher Scientific。N-羟基琥珀酰亚胺和N,N’-二环己基碳二亚胺购自Alfa Aesar。使用购自Silicycle的硅胶(230-400目)进行快速色谱。在购自EMD Chemicals的硅胶60F254上进行薄层色谱(TLC)。在Bruker AV300仪器上在室温下记录1H、19F和13C NMR光谱。氘代溶剂乙腈-d3、氯仿-d和丙酮-d6购自Sigma-Aldrich。使用Micromass LCT仪器进行电喷雾电离质谱法(ESI-MS)。使用具有飞行时间(TOF)检测器的Waters-Micromass LCT进行HRMS。
N-炔丙基-N,N-二甲基氨甲基硼烯基频哪醇酯。在Ar(g)下，向经火焰干燥的圆底烧瓶中装入1.5mL的3-二甲基氨基-1-丙炔(13.8mmol，1.01eq.)，并且溶解在28mL的Et2O中。逐滴添加3.67g的碘甲基硼酸频哪醇酯(13.7mmol，1eq.)的样品，并且将反应在室温下搅拌30min。产物沉淀是白色固体并且经由真空过滤收集。将粗品用冷Et2O洗涤。将粗品转移至预先称重的闪烁瓶中并且在真空中干燥。这得到3.4g(9.81mmol)的呈浅米色粉末的1，产率为72％。1H NMR(300MHz，丙酮-d6)δppm：1.35(s，12H)，3.56(s，6H)，3.67(t，J＝2.4Hz，1H)，3.74(s，2H)，4.90(d，J＝2.3Hz，2H)。13C NMR(75MHz，丙酮-d6)δppm：25.04，53.61，57.75，73.01，82.88，86.48。ESI-MS(+)：计算为，C12H23BNO2 +＝224.1m/z；实测为，[M]+＝224.6m/z。
N-炔丙基-N,N-二甲基氨基甲基-三氟硼酸盐。制备3M的KHF2(aq)和4M的HCl(aq)的母液。将化合物1(1.87g，5.33mmol，1eq.)装入具有10mL的CH3CN的50mL的离心管中。添加9mL体积的3M KHF2(aq)(27mmol，5.1eq.)和8mL的4M HCl(aq)(32mmol，6eq.)并且将溶液搅拌2h，同时在45℃下加热。然后用浓溶液中和。NH4OH(aq)直到pH约7，这产生CH3CN的双相层和水层。将顶部的层(有机CH3CN层)收集到250mL的圆底烧瓶中，水层用CH3CN(3×10mL)洗涤。通过旋转蒸发干燥粗产物。使用20mL体积的丙酮来从粗产物样品中沉淀另外的盐并且使用玻璃烧结漏斗过滤混合物。将滤液收集在圆底烧瓶中，通过旋转蒸发进行浓缩，并且在真空中进一步干燥。然后用20mL的二乙醚并且然后用20mL的氯仿洗涤粗产物以溶解任何剩余的过量频哪醇。将粗样品用最少量的丙酮溶解并且进行柱色谱法(硅胶，43-60μm，230-400目，约40g；等度丙酮)，同时通过TLC(丙酮，Rf＝0.41，用I2染色)监测洗脱级分。将含有纯化2的级分合并，通过旋转蒸发进行浓缩并且在真空中进一步干燥。将固体产物收集在预称重的小瓶中并且在真空中干燥。这得到911mg(5.52mmol)的呈浅橙色固体的2，定量产率。1H NMR(300MHz，丙酮-d6)δppm：2.54(br.s，2H)，3.24(s，6H)，3.47(t，J＝2.4Hz，1H)，4.40(d，J＝2.3Hz，2H)。13C NMR(75MHz，丙酮-d6)δppm：52.21，56.57，73.13，80.48。19F NMR(282MHz，丙酮-d6)δppm：-138.66(q，3F)。ESI-MS(+)：计算为，C6H11BF3N，165.0m/z；实测为，[M+Na]+＝188.4m/z。
Fmoc-Lys(N3)-OH。三氟甲基磺酰叠氮化物用于重氮转移Fmoc-Lys-OH的伯胺。将2.94g的NaN3样品(45.2mmol，8.63eq.)装入圆底烧瓶中并且溶于20mL的(2:3)H2O:CH2Cl2(v/v)。在搅拌混合物时，在30min内滴加1.02mL的三氟甲磺酸酐(Tf2O)(6mmol，1.15eq.)。将反应在约0℃下在冰水浴中搅拌5h。将有机层用CH2Cl2(2×20mL)萃取，随后将收集的有机层用饱和NaHCO3(aq)洗脱。将三氟甲基磺酰叠氮化物溶解在所描述的收集的有机层中。将1.93g的Fmoc-Lys-OH样品(5.24mmol，1eq.)装入装有2.32g的K2CO3(16.8mmol，3eq.)和15mg的Cu(II)SO4(94.0μmol，0.39mol％)的圆底烧瓶中，并且将其溶解于15mL的(1:1)MeOH:H2O(v/v)中。在30分钟内滴加含有三氟甲磺酸叠氮化物的有机层。将溶液在室温下搅拌21h并且将反应用60mL的2.5M HCl(aq)淬灭。将有机层用CH2Cl2(3×20mL)萃取，并且用盐水(2×50mL)洗涤。将收集的有机层用无水Na2SO4干燥，并且通过真空过滤去除盐。通过旋转蒸发来浓缩所收集的溶液。进行柱色谱(硅胶，43-60μm，230-400目，约80g；(0.5:99.5)MeOH:CH2Cl2(v/v)至(1:99)MeOH:CH2Cl2(v/v)的溶剂梯度)，同时通过TLC((1:9)MeOH:CH2Cl2(v/v)监测洗脱级分，Rf＝0.37，在254nm下可见，用I2和溴甲酚绿染色)。将纯的级分通过旋转蒸发进行浓缩并且在真空中进一步干燥。这得到1.60g(4.06mmol)的呈白色蜡质固体的3，产率为77％。1H NMR(300MHz，CDCl3)δppm：1.052.21(m，6H)，3.05-3.36(m，2H)，4.23(t，J＝6.9Hz，1H)，4.39-4.74(m，3H)，5.57(d，J＝8.2Hz，1H)，7.32(t，J＝7.32Hz，2H)，7.41(t，J＝7.4Hz，2H)，7.51-7.67(m，J＝7.5Hz，2H)，7.77(d，J＝7.5Hz，2H)，9.76(s，1H)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δppm：22.48，28.36，31.86，47.16，51.07，53.59，67.22，120.09，125.10，127.14，127.83，141.37，143.67，156.27，176.84。ESI-MS(-)：计算为，C21H22N4O4，394.4m/z；实测为，[M-H]-＝393.4m/z，并且[2M-H]-＝787.7m/z。
Fmoc-Lys(AMBF3)-OH。通过将1.98g的抗坏血酸钠(0.01mol)溶解在10mL的DI H2O中制备1M的抗坏血酸钠的新鲜储备溶液。然后通过将1.60g的无水Cu(II)SO4(aq)(0.01mol)溶解在10mL的DI H2O中来制备1M Cu(II)SO4的母液。将414.6mg的化合物2样品(2.513mmol，5.24eq.)装入圆底烧瓶中并且溶于2.5mL的(3:2)CH3CN:H2O(v/v)。首先添加1.5mL体积的1MCu(II)SO4(aq)(1.5mmol，3.1eq.)，随后添加3mL的1M抗坏血酸钠(3mmol，6.2eq.)。然后将189mg的化合物3的样品(479μmol，1eq.)添加到溶液中。然后通过添加101mg的K2CO3(732μmol，1.5eq.)将溶液中和至pH约7，然后在45℃下搅拌16h。将混合物真空过滤以去除沉淀物，并且将滤液通过旋转蒸发进行浓缩。将干燥的粗产物悬浮于(1:1)MeOH:CH2Cl2(v/v)(5×10mL)中，真空过滤以去除沉淀，并且通过旋转蒸发干燥滤液。然后，将干燥的粗品再悬浮于(5:95)MeOH:CH2Cl2(v/v)(5×10mL)中，真空过滤以去除沉淀，并且将滤液再次通过旋转蒸发干燥。进行柱色谱法(硅胶，230-400目，约50g；溶剂(1:4:95)AcOH:MeOH:CH2Cl2(v/v/v))同时通过TLC((1:10:89)AcOH:MeOH:CH2Cl2(v/v/v)，Rf＝0.21，在254nm光下可见，用I2染色)监测洗脱级分，通过旋转蒸发浓缩并且进一步在真空中干燥。这得到192mg(343μmol)呈深黄色油状的4，产率为71％。1H NMR(300MHz，CD3CN)δppm：1.27-1.91(m，6H)，2.29(d，J＝4.57Hz，2H)，2.95(s，6H)，4.08(br s，1H)，4.22(t，J＝6.90Hz，1H)，4.32(d，J＝7.08Hz，2H)，4.38(t，J＝6.97Hz，2H)，4.43(s，2H)，6.01(d，J＝5.94Hz，1H)，7.33(t，J＝7.30Hz，2H)，7.42(t，J＝7.50Hz，2H)，7.66(d，J＝4.34Hz，2H)，7.83(d，J＝7.54Hz，2H)，8.02(s，1H)。13C NMR(75MHz，CD3CN)δppm：23.22，30.19，31.56，47.97，50.79，53.45，54.73，61.28，67.20，120.93，126.16，128.07，128.43，128.65，137.30，142.07，145.08，157.09。19F NMR(282MHz，CD3CN)δppm：-138.16(d，3F)。ESI-MS(-)：计算为，C27H33BF3N5O4，559.4m/z；实测为，[M-H]-＝558.5m/z，并且[M+I]-＝686.4m/z。
Fmoc-Lys(AMBF3)-O-NHS。将163.3mg的样品4(291.7μmol，1eq.)加入圆底烧瓶中并用8mL的(1:1)CH2Cl2:CH3(v/v)溶解。将305mg的DCC样品(1.48mmol，5.07eq.)添加到溶液中；随后添加170mg的NHS(1.48mmol，5.07eq.)，并且将溶液在室温下搅拌21小时。使用烧结漏斗真空过滤反应混合物，并且通过旋转蒸发浓缩收集的滤液。进行柱色谱法(柱直径＝0.5cm；硅胶(230-400目)，约10g；从CH2Cl2每50mL增加10％的CH3CN(v/v)至(1:1)CH2Cl2:CH3CN(v/v)的梯度)，同时通过TLC(1:1)CH2Cl2:CH3CN(v/v)监测洗脱级分，Rf＝0.52，在254nm下可见，用I2染色)。将含有纯5的级分合并，旋转蒸发浓缩，并且在真空中进一步干燥。这得到118mg(180μmol)的呈黄色油状物的5，产率为61％。1H NMR(300MHz，CD3CN)δppm：1.47-1.53(m，1H)，1.86-1.98(m，5H)，2.33(d，J＝4.1Hz，2H)，2.79(s，4H)，2.98(s，6H)，4.26(t，J＝6.9Hz，1H)，4.38(d，J＝7.5Hz，2H)，4.42(d，J＝7.0Hz，2H)，4.46(d，J＝4.3Hz，2H)，4.49-4.56(m，1H)，6.33(d，J＝7.8Hz，1H)，7.36(t，J＝7.4Hz，2H)，7.45(t，J＝7.4Hz，2H)，7.68(d，J＝7.3Hz，2H)，7.86(d，J＝7.5Hz，2H)，8.06(s，1H)。13C NMR(75MHz，CD3CN)δppm：22.04，25.16，25.24，25.40，29.10，30.55，46.95，49.83，52.31，52.55，54.34，60.27，66.63，117.34，120.02，125.21，127.16，127.54，127.76，136.42，141.14，144.02，155.99，168.64，169.83。19F NMR(282MHz，CD3CN)δppm：-138.21(d，3F)。ESI-MS(+)：计算为，C31H36BF3N6O6，656.5m/z；实测为，[M+Na]+＝679.8m/z。HRMS：计算为，C31H36BF3N6O6，656.4702m/z；实测为，[M+Na]+＝679.2618m/z。
Lys-AMBF3的结构表征示出在图15至图33中。
饱和结合测定。按照公开的程序(n＝3)在B16-F10细胞上进行体外结合饱和测定。(28)使细胞在24孔聚-D-赖氨酸板上生长至接近融合。去除生长培养基，并且添加反应介质(RPMI，1％的BSA，100U/mL的青霉素/链霉素)并且允许在37℃下孵育至少1h。将递增浓度(5pM至20nM)的[18F]6添加至细胞，并且在25℃伴随轻轻搅动孵育1小时。通过用[18F]6重复所描述的孵育同时添加1(10μM)来确定非特异性结合。孵育后，将细胞用冰冷的PBS洗涤两次，用胰蛋白酶孵育后收获，并且使用WIZARD 2480γ计数器(PerkinElmer))测量放射性。从特异性结合测定的相应值中减去来自非特异性结合测定的值。使用具有单位点特异性结合模型的GraphPad PRISM 7测定解离常数(Kd)。
用[18F]氟阴离子放射标记DOTA-AMBF3-PEG2-LLP2A(6)。将前体6(80nmol)溶解于15μL的1M哒嗪-HCl(pH＝2)、10μL的DMF、15μL的MeOH和4μL的5mM KHF2(aq)(50mol％19F-载体)中，最终pH为约2.0(方案1)。使18F/H2 18O(～1Ci)通过活化的9mg的QMA筒(用1.7mL的盐水预处理，然后用2.5mL的水冲洗并且用3mL的空气干燥)以捕获18F(>95％效率)，然后使用约80-100μL的0.9％盐水(>90％效率)将其洗脱到含有前体的隔膜密封的反应容器中。将溶液在82-84℃下加热5min并且然后在真空中加热15min。用2mL的40mM NH4HCO2(aq)(pH＝6.8)淬灭后，通过半制备型HPLC用两个连续的等度溶剂条件(HPLC方法B)纯化溶液。收集放射性示踪剂[18F]6，并且将其直接稀释到50mL的H2O中。通过向容器施加小压力的He(g)，使所得溶液通过Sep-Pak Light C18筒(依次用9mL EtOH、9mL H2O和10mL空气预洗涤)。将捕获的[18F]6用0.5mL的(9:1)EtOH:0.9％盐水(v/v)洗脱到隔膜密封的小瓶中，并且最后用4mL的PBS配制以提供pH约7的在(1:9)EtOH:PBS(v/v)中的[18F]6用于动物注射。通过分析型HPLC(方法C)表征[18F]6的所有纯化制剂以基于动物注射前的标准曲线(图13)定量放射化学纯度、放射化学产率和摩尔活性。
方案1。4和用于制备[18F]6的前体6的合成
携带B16-F10肿瘤的小鼠中DOTA-[18F]AMBF3-PEG2-LLP2A([18F]6)的PET成像。在37℃下，在5％的CO2(g)下，将B16-F10细胞(ATTC，CRL-6475)在具有10％的FBS(v/v)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM中培养。所有动物实验都是按照加拿大动物护理委员会的指导方针进行的，并且由大学哥伦比亚的动物伦理委员会批准。用2％的异氟烷麻醉雄性C57BL/6J小鼠，并且在右肩皮下注射1×106个B16-F10细胞。允许肿瘤生长直到达到7-9mm的直径。PET和CT成像研究涉及如先前报道的微PET/CT扫描仪(Inveon，Siemens)。对于静态PET扫描(记录10分钟)，首先经由尾静脉向小鼠注射4-6MBq的([18F]6)，同时用2％的异氟烷麻醉，并且在PET成像之前使小鼠经受基线CT扫描(记录10分钟)。对于涉及竞争性VLA-4阻断的静态PET图像，将200μg的1与4-6MBq的[18F]6共注射，并且使用所描述的方法来在1hp.i获得基线CT和PET图像两者。动态PET扫描涉及所描述的麻醉、注射4-6MBq的[18F]6、基线CT扫描、以及从5秒至52.5min p.i(28个时间点)记录的PET扫描。在每次静态PET成像研究之后使用CO2(g)吸入将小鼠最终安乐死，并且收获它们的器官用于生物分布测量。
DOTA-[18F]AMBF3-PEG2-LLP2A([18F]6)在携带有B16-F10肿瘤的小鼠中的生物分布。使用2％的异氟烷麻醉小鼠，并且经尾静脉注射2-3MBq的[18F]6。对于竞争性VLA-4阻断研究，将200μg的1与2-3MBq的[18F]6共注射。在1h p.i时，通过CO2(g)吸入使小鼠安乐死，收集血液，并且切除器官。在漂洗和干燥样品后，对器官称重，使用Wallac WIZARD2γ计数器(PerkinElmer)记录它们的放射性，并且对于每个器官将值表示为％ID/g。使用双尾ANOVASidak多重比较试验(GraphPad PRISM)来评价单独的[18F]6的生物分布与通过共注射1竞争性阻断VLA-4相比之间的统计显著性。
另外的细节提供于Lepage等人，ChemBioChem 10.1002/cbic.201900632中。
1.4结果
DOTA-AMBF3-PEG2-LLP2A(6)的合成及VLA-4亲和力。LLP2A肽模拟物如先前由其他人(20)描述的那样合成，具有由我们的实验室(28)报道的修饰(PEG2-NH2在树脂裂解时掺入)。中间体1的末端伯胺经由NHS化学以定量产率偶联至Fmoc-保护的赖氨酸-AMBF3轭合物2。使随后的中间体3经受有效的Fmoc-去除(中间体4)并且在碱性条件下偶联至未保护的DOTA-NHS(5)。重复这些方法以提供用于HPLC纯化的大致粗样品(42.1mg)的6。此策略给出3.1mg(1.9μmol)的冻干前体6，具有高纯度(通过HPLC>95％)，用于随后的18F-放射性标记。计算6.9±0.59nM(n＝3)的Kd值(图14)，并且比其他[18F]RBF3-PEG2-LLP2A轭合物实测的Kd值高至少5倍(图8)。
DOTA-[18F]AMBF3-PEG2-LLP2A([18F]6)的放射性合成。在71.8±1.0min(±SD)内，经由IEX在酸性水性哒嗪缓冲液中用[18F]氟化物放射性标记前体6(80nmol)(18F/H2 18O-递送至制剂，n＝4)。在通过HPLC(图5b)确认样品与6的18F-标记的衍生物的身份之后，[18F]6的平均放射化学纯度计算为95.9±1.8％(±SD)(图5a)。[18F]6的平均放射化学产率为4.8±2.9％，并且平均摩尔活性(Am)计算为131.72±50.32Gbq/μmol(3.56±1.36Ci/μmol)。
携带B16-F10肿瘤的小鼠中DOTA-[18F]AMBF3-PEG2-LLP2A([18F]6)的PET成像。在B16-F10荷瘤小鼠的肿瘤、脾脏、肾脏和骨髓中，[18F]6的静态PET图像示出在1h p.i(n＝2)时优先摄取示踪剂(图6a和图6b)。阻断研究，涉及[18F]6与1(n＝2)的共注射，将肿瘤和骨髓中的示踪剂摄取值降低至接近基线水平，而活性在脾中保持可见(图6c和图6d)。所有图像指示膀胱中的实质性活性，证实了[18F]6经由肾脏的肾小管清除。
动态PET扫描示出[18F]6通过循环并且在4min p.i内第一次通过肝脏的初始灌注(图7)。放射性示踪剂在1.9min p.i内在肿瘤中示出有效摄取，并且在其中稳定积累直至52.5min p.i通过骨髓中放射性示踪剂积累也观察到VLA-4靶向。这些扫描鉴定了肠中[18F]6的初始存在，并且在扫描期间保留在肠内。动态PET扫描还重现了高对比度静态PET图像，因为在背景肌肉组织中[18F]6的积聚保持较低。
生物分布研究显示[18F]6在脾中的高积累，在1h p.i时在肺和肠中大量摄取(表5)。通过在肿瘤和骨髓中高摄取[18F]6来证明特异性VLA-4结合。1的共注射减少[18F]6在脾(低于88％，p<0.0001)、肠(低于43％，p<0.05)、肺(低于85％，p<0.0001)、骨髓(低于78％，p<0.0001)中和在肿瘤(低于75％，p<0.0001)中的积累。与背景肌肉(约7倍高)和血池(约9倍高)相比，对比率(表6)示出[18F]6的相对高的肿瘤摄取。对于[18F]6，VLA-4阻断导致这些肿瘤与肌肉(低于92％，p<0.0001)和肿瘤与血液(低于85％，p<0.0001)的对比度降低，而肿瘤与肾脏和肿瘤与骨髓和骨髓的对比度没有显著影响(p>0.05)。
表5.在1h p.i时在B16-F10荷瘤小鼠并且共注射(200μg)阻断剂1下，[18F]6的生物分布(平均％ID/g，具有±SD)
a.包括具有4.45％ID/g的一只小鼠
表6.在1h p.i后在B16-F10荷瘤小鼠中并且共注射(200μg)阻断剂1下，[18F]6的肿瘤与组织比率(平均比率和±SD)。
1.5讨论
先前产生了18F-标记的LLP2A放射性示踪剂，其中的每一种通过在两种结构相关但相对疏水的[18F]RBF3-PEG2-LLP2A示踪剂上进行同位素交换来标记。虽然存在若干方法来增加放射性示踪剂的极性(例如，添加谷氨酸盐，增加PEG接头的长度)，但本公开呈现一种引入DOTA部分作为增加亲水性的手段并且由此调节示踪剂清除的新方法。先前观察到[18F]RBF3-PEG2-LLP2A轭合物的高肠摄取。为了测试LLP2A类配体作为肽支架，将化合物6设计为使得DOTA将附加在其他方面几乎相同的LLP2A轭合物上以最小化除DOTA部分之外的所有差异(参见图8中的结构的比较)。DOTA修饰的LLP2A衍生物6的合成以一种有效逐步的方式进行，对于大多数化学反应具有几乎定量产率。最终步骤中6的回收产率较低，这归因于严格的HPLC纯化条件造成的样品损失。然而，所收集的材料具有高纯度，并且对于所有描述的18F-放射性标记和体内研究以足够的量来获得。
如先前针对AMBF3放射性辅基和由我们的实验室评估的其他三氟硼酸盐所证明，在水性条件下，通过18F-IEX在单个水步骤中实现[18F]6的放射性合成。放射合成时间、放射化学产率、纯度和摩尔活性适合于体内研究，并且类似于先行文献[18F]AMBF3-PEG2-LLP2A和[18F]N-Pyr-p-BF3-PEG2-LLP2A(28)。虽然产率相对低，但是对于每次体内研究，一致地获得足够活性的[18F]6，0.37-1.85GBq(10-50mCi)(n>6)。由于标记和回收方法都是未优化的，我们确信在HPLC纯化期间(例如缓冲的、水性的、等渗的乙醇溶液)通过使用用于直接配制和收集[18F]6的替代溶液可以增加这些产率。这将避免对标记后[18F]6的C18筒分离的需要，其中，亲水性示踪剂在初始捕获步骤期间可能丢失。
对表达靶VLA-4的标准鼠黑色素瘤模型B16-F10进行成像。在1h p.i时，[18F]6在脾脏、肿瘤和骨髓中显示优先积累。令人高兴的是，B16-F10黑色素瘤肿瘤中的[18F]6的摄取以及相应的肿瘤与肌肉和肿瘤与血液比率类似于针对[64Cu]Cu-CB-TE1A1P-PEG4-LLP2A所观察到的相似，具有相同肿瘤模型的[64Cu]Cu-CB-TE2A-LLP2A、[64Cu]Cu-NODAGA-PEG4-LLP2A和[68Ga]Ga-NODAGA-PEG4-LLP2A在相同的时间点(1h-2h p.i.)具有相同的肿瘤模型(23,25-27)。阻断证实了[18F]6对肿瘤和骨髓中的VLA-4的特异性，并且与在骨髓中发现的B16-F10肿瘤和造血干细胞中熟知的VLA-4表达一致(2,9,10,34-37)。虽然脾中[18F]6的高积累是不期望的，但是对于上述64Cu和68Ga标记的LLP2A衍生物，已经观察到LLP2A放射性示踪剂对RES的螯合(23,25-27)。我们的结果还证实了[18F]6的清除途径是经由肾和膀胱的，正如所有先前报道的使用LLP2A放射性示踪剂的体内研究(22,24,26,38-40)。
[18F]6在比先前对于64Cu标记的LLP2A衍生物报道的那些更高的摩尔活性下标记(24,26,27)。尽管高摩尔活性可能促成了[18F]6的高对比度静态PET图像，但是对于两个先前报道的[18F]RBF3-PEG2-LLP2A示踪剂也实现了类似的高摩尔活性，这些示踪剂展现出对VLA-4的4.6倍和23倍更高的体外结合亲和力。然而在两种先行情况中，肿瘤摄取值比在此所示值低2至3倍。
值得注意的是，6与先行AMBF3-PEG2-LLP2A轭合物之间的唯一可察觉的差异(图8)是DOTA部分，我们认为这主要是由于较高的肿瘤摄取值和有利的肾清除。相比之下，与[18F]6相比，我们先前报道的[18F]RBF3-PEG2-LLP2A是更疏水的(如通过HPLC保留差异所证明)；因此，这些衍生物在GI道中表现出低约3倍至约5倍的脾保留和高约11倍的积累。通常，作为影响LLP2A生物轭合物的清除途径(即，肾对肝胆)的手段，这些结果与其他结果一起支持高度亲水性部分(先前使用的磷酸酯和羧酸酯基团，此处为DOTA)的附录。与已经安装以有利于肾清除的其他化学官能团不同，DOTA可以提供另外的优点，因为它可以与不同的非放射性金属(例如，Zn2+、Ca2+)螯合，以进一步研究其通过18F-PET成像对体内PK/PC的影响。此外，易于设想发展成对双同位素“热冷/冷热”同位素治疗诊断学(例如，18F/174Lu和19F/177Lu)的潜力，其将分别依赖于F-18用于PET成像和放射性金属治疗。
此实施例显示，18F-标记的RBF3-PEG2-LLP2A的肿瘤摄取可以通过使用亲水性不含金属的DOTA来增强，该DOTA可以以简单的合成方法引入，而18F-标记通过在高摩尔活性下的同位素交换进行。体内PET成像和生物分布研究证明DOTA部分将放射性示踪剂累积从GI道转移至RES，最值得注意地在脾中。因为我们已经呈现了用于VLA-4靶向成像的大大改进的18F-标记的LLP2A放射性示踪剂，所以附加的DOTA似乎充当用于调节示踪剂清除的新的和有用的组。这也可以与其他18F-标记的放射性辅基一起使用。
实施例2：PSMA-617-LysAMBF3-DOTA
按照报道的方法制备AMBF3和Fmoc-LysN3-OH。Perrin等人，Angew.Chem.Int.Ed.2014，53，11876-11880。Nakahar等人，Tetrahedron Lett.，2008，49，5492-5494。
I.Fmoc-LysAMBF3-OH
通过将1.98g的抗坏血酸钠(0.01mol)溶解在10mL的去离子水中来制备1M抗坏血酸钠的新鲜储备溶液。然后通过将1.60g的无水Cu(II)SO4(0.01mol)溶解在10mL的去离子水中来制备1M Cu(II)SO4(aq)的储备溶液。将AMBF3(414.6mg，2.513mmol，5.24eq.)装入烧瓶中并且溶于(3:2)MeCN:H2O(v/v)(2.5mL)。首先添加1.5mL体积的1M Cu(II)SO4(aq)(1.5mmol，3.1eq.)，随后添加3mL的1M抗坏血酸钠(3mmol，6.2eq.)。然后将Fmoc-LysN3-OH(189.1mg，0.479mmol，1eq.)添加到溶液中。然后通过加入K2CO3(101.1mg，0.732mmol，1.5eq.)将溶液中和至pH 7。将溶液在45℃下搅拌16h。将混合物真空过滤以去除沉淀物，并且将滤液通过旋转蒸发进行浓缩。将干燥的粗品再悬浮于(1：1)MeOH:DCM(v/v)(5×10mL)中，真空过滤以去除沉淀物，并且将滤液通过旋转蒸发干燥。然后将干燥的粗品再悬浮于(5:95)MeOH:DCM(v/v)(5×10mL)中，真空过滤以去除沉淀物，并且将滤液再次通过旋转蒸发干燥。进行柱色谱法(硅胶，230-400目，50g；(1:4:95)AcOH:MeOH:DCM(v/v)的溶剂，同时通过TLC(1:10:90AcOH:MeOH:DCM(v/v)，产物的Rf＝0.21，在254nm UV灯下可见，用I2/二氧化硅染色)监测洗脱级分。将纯的级分通过旋转蒸发进行浓缩并且在真空中进一步干燥。这得到呈深黄色油状的Fmoc-LysAMBF3-OH(192.0mg，0.343mmol)，产率为71％。1H NMR(300MHz，CD3CN))δ(ppm)：1.27-1.91(m，6H)，2.30(d，J＝4.57Hz，2H)，2.95(s，6H)，4.11(q，J＝5.00Hz，1H)，4.22(t，J＝6.90Hz，1H)，4.32(d，J＝7.08Hz，2H)，4.38(t，J＝6.97Hz，2H)，4.44(s，2H)，6.02(d，J＝5.94Hz，1H)，7.33(t，J＝7.30Hz，2H)，7.42(t，J＝7.50Hz，2H)，7.66(d，J＝4.34Hz，2H)，7.83(d，J＝7.54Hz，2H)，8.02(s，1H)。13C NMR(75MHz，CD3CN)δ(ppm)：23.22，30.19，31.56，47.97，50.79，53.45，54.73，61.28，67.20，120.93，126.16，128.07，128.43，128.65，137.30，142.07，145.08，157.09。19F NMR(282MHz，CD3CN)δ(ppm)：-138.16(m，3F)。ESI-MS(-)：计算为，C27H33BF3N5O4，559.4m/z；实测为，[M-H]-＝558.5m/z，并且[M+I]-＝686.4m/z。光谱表征参见图33至图37。
II.Fmoc-LysAMBF3-O-NHS
将Fmoc-LysAMBF3-OH(163.3mg，295.5μmol，1eq.)添加至烧瓶中并且溶解于8mL的(1:1)DCM:MeCN(v/v)中。将二环己基碳二亚胺(DCC)(305mg，1.48mmol，5eq.)添加到溶液中，随后添加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(170mg，1.48mmol，5eq.)。在室温下搅拌溶液21小时。使用烧结漏斗真空过滤反应混合物，并且通过旋转蒸发浓缩收集的滤液。进行柱色谱法(柱直径＝0.5cm；硅胶(230-400目)，10g；梯度从DCM每50mL增加10％CH3CN(v/v)至(1:1)DCM:MeCN(v/v))，同时通过TLC(1:1DCM:CH3CN，产物的Rf＝0.52，在254nm UV灯下可见，用I2/二氧化硅染色)监测洗脱级分。将纯的级分合并，通过旋转蒸发器浓缩并且在真空中进一步干燥。这得到61％产率的呈黄色油状的Fmoc-LysAMBF3-O-NHS(118.3mg，180.2mmol)。1H NMR(300MHz，CD3CN)δ(ppm)：1.36-1.91(m，6H)，2.24-2.34(m，2H)，2.74(s，4H)，2.93(s，6H)，4.21(m，J＝6.85Hz，1H)，4.30-4.34(m，2H)，4.38(t，J＝7.08Hz，2H)，4.43(s，2H)，4.43-4.52(m，1H)，7.31(t，J＝7.30Hz，2H)，7.40(t，J＝7.30Hz，2H)，7.63(d，J＝7.31Hz，2H)，7.81(d，J＝7.54Hz，2H)，8.01(s，1H)。13C NMR(75MHz，CD3CN)δ(ppm)：22.96，26.32，30.02，31.46，47.86，50.74，53.23，53.46，61.22，67.54，120.93，126.12，128.07，128.45，128.67，137.33，142.05，144.93，156.90，169.56，170.75。19F NMR(282MHz，CD3CN)δ(ppm)：-138.13(m，3F)。ESI-MS(+)：计算为，C31H36BF3N6O6，656.5m/z；实测为，[M+Na]+＝679.8m/z。参见图38至图41。
III.PSMA-617-NH2
树脂上的PSMA-617-Fmoc由SPPS按照报告的程序合成。Eder等人，J.Nucl.Med.2015，56，914-920。
将树脂上的PSMA-617-Fmoc(45.6mg，15.1μmol)置于微量离心管中。添加DMF(400μL)以通过将样品置于旋转烧杯振荡器中使树脂溶胀30min。将混合物离心下来并且去除上清液。将(1:4)哌啶:DMF(200μL)添加到树脂中，并且将混合物在室温下用旋转烧杯振荡器搅拌30min。然后将混合物离心下来并且去除上清液。使用DMF(3x200μL)通过涡旋、离心和去除上清液来洗涤树脂。添加(3:7)HFIP:DCM(200μL)以将产物从树脂上切割下来，并且将混合物在旋转烧杯振荡器中搅拌30min。将产物混合物在1mL移液管过滤器吸头中过滤以去除树脂，并且将滤液收集在单独的微量离心管中。通过吹入温和空气将混合物浓缩直到体积是约50至100μL。然后添加冷二乙醚(1mL)以破碎产物。将产物涡旋并且离心。然后去除上清液，并且将产物溶解在50μL的DMF中。添加二乙醚(1mL)用于另外的洗涤，并且将混合物涡旋并且离心。去除上清液，将混合物用快速真空干燥，以定量产率得到预期的PSMA-617-NH2(11.6mg，15.1μmol)。ESI-MS(+)：计算为，C41H61N5O9，767.97m/z；实测为，[M+H]+＝768.7m/z。TLC(2:98)MeOH，产物的Rf＝0.29，在254nm UV灯下可见。参见图42的数据。
IV.PSMA-617-LysAMBF3-NH2
将在微量离心管中的PSMA-617-NH2(12.2mg，9.3μmol，1eq.)溶解于(1:19)DIPEA:DMF(200μL)中并且转移至含有Fmoc-LysAMBF3-O-NHS(25.2mg，38.4μmol，4.1eq.)的单独的微量离心管中。将混合物在室温下使用旋转搅拌器搅拌2小时。将混合物用快速真空浓缩直至体积为约50至100μL。添加冷二乙醚(1mL)以沉淀产物。然后将混合物涡旋并且离心以去除上清液。将最少的DMF(50μL)添加到产物中以溶解产物并且添加二乙醚(1mL)以洗涤粗产物。将混合物涡旋并且离心以去除上清液。然后通过快速真空干燥产物。然后添加MeCN(500μL)以溶解并且去除过量的Fmoc-LysAMBF3-O-NHS。将混合物离心下来，并且去除含有过量试剂的上清液。将产物在快速真空中再干燥一次。将产物PSMA-617-LysAMBF3-Fmoc的小样品溶解于用于MS的MeOH中。ESI-MS(+)：计算为，C68H92BF3N10O12，1309.35m/z；实测为，[M-F]+＝1290.1m/z，[M+Na]+＝1332.0m/z。TLC(1:19NH4OH:EtOH，产物的Rf＝0.42，在254nm下可见)。参见图43。
然后将PSMA-617-LysAMBF3-Fmoc溶解于(1:4)哌啶:DMF(200μL)中以去除Fmoc。在室温下通过在旋转式搅拌器中混合反应进行30分钟。使用快速真空浓缩混合物直到体积是约50至100μL。添加冷二乙醚(1mL)以沉淀产物。然后将其涡旋并且离心以除去上清液。向产物中添加最少的DMF(50μL)以溶解，使得二乙醚洗涤再一次进行。将混合物涡旋并且离心。去除上清液，然后通过空速(speed-vac)干燥产物，得到含有PSMA-617-LysAMBF3-NH2的粗混合物。ESI-MS(+)：计算为，C53H82BF3N10O10，1087.10m/z；实测为，[M-F]+＝1068.1m/z，[M+H]+＝1088.1m/z，[M+Na]+＝1110.1m/z。TLC(1:19NH4OH:MeOH，产物的Rf＝0.23，在254nm UV灯下可见，用茚三酮染色)。参见图44。
V.PSMA-617-LysAMBF3-DOTA
称出DOTA-NHS HPF6TFA(20.2mg，26.2μmol，2.8eq.)，并且添加到微量离心管中的粗PSMA-617-LysAMBF3-NH2(最大9.3μmol，1eq.)中。将(1:19)DIPEA:DMF(v/v)添加到混合物中并且使用旋转搅拌器在室温下搅拌2小时。将混合物通过快速真空浓缩直至最小体积(50至100μL)并且将混合物通过二乙醚(1mL)沉淀。将混合物涡旋并且离心。去除上清液，然后通过快速真空干燥产物。通过添加(95:2.5:2.5)TFA:TIPS:H2O(v/v/v)(200μL)将叔丁基脱保护，并且将混合物在室温下搅拌1h。然后通过吹入温和的空气将混合物浓缩直到体积是50至100μL。添加二乙醚(1mL)以沉淀产物，并且将混合物涡旋并且离心。去除上清液，并且然后将混合物通过快速真空干燥以提供含有PSMA-617-LysAMBF3-DOTA的粗残余物(33mg)。ESI-MS(+)：计算为，C61H93BF3N13O17，1360.31m/z；实测为，[M-3F-2H]+＝1302.1m/z，[M+H]+＝1362.1m/z。参见图45。
将粗残余物(33mg)溶解于(1:1)MeCN:H2O(+0.1％甲酸)(1mL)中，并且在HPLC(柱：Agilent Eclipse XDB-C18，5μm，9.4mm×250mm；流速：2mL/min；UV-vis检测器：276nm；梯度：15％至65％MeCN:H2O(+0.1％甲酸)持续19min)上进行纯化。在9.25min时收集峰。将产物收集在50mL离心管中并且在干冰上冷冻。一旦完全冷冻，将所收集的级分冻干以提供纯的PSMA-617-LysAMBF3-DOTA(2.5mg，1.8μmol，19％)。
VI.PSMA-617-LysAMBF3-DOTA(Cu)
通过用0.1M CuCl2-NaOAc(1.55mL，pH＝4)连同MeCN(1.5mL)一起处理PSMA-617-LysAMBF3-DOTA(44.2mg，31.1μmol)来合成PSMA-617-LysAMBF3-DOTA(Cu)。将混合物在65℃加热板中放置30分钟。然后使用快速真空将混合物浓缩以提供含有预期的铜-螯合物的粗残余物。ESI-MS(+)：计算为，C61H90BCuF3N10O10，1422.8m/z；实测为，[M-3F-2H]+＝1362.8m/z，[M-F]+＝1402.8m/z，[M+H]+＝1423.8m/z，[M+Na]+＝1444.8m/z。
将粗残余物(44.2mg)溶解于(1:1)MeCN:H2O(+0.1％甲酸)(1mL)中。并且在HPLC(柱：Agilent Eclipse XDB-C18，5μm，9.4mm x 250mm；流速：2mL/min；UV-vis检测器：276nm；梯度：15％至40％MeCN:H2O(+0.1％甲酸)持续23min)上进行纯化。将产物收集在50mL的离心管中并且在干冰上冷冻。一旦完全冷冻，将所收集的级分冻干以提供纯的PSMA-617-LysAMBF3-DOTA(Cu)(8.5mg，6.0μmol，19％)。参见图46。
VII.18F标记的PSMA-617-LysAMBF3-DOTA或PSMA-617-LysAMBF3-DOTA(Cu)
将80nmol的19F-PSMA-617-LysAMBF3-DOTA或19F-PSMA-617-LysAMBF3-DOTA(Cu)悬浮于聚丙烯管中的哒嗪-HCl水溶液(15μL，1M，pH＝2)、DMF(15μL)和KHF水溶液(4μL，5mM)中。通过用18MeV质子轰击H2 18O，随后在阴离子交换柱(9mg，QMA，氯化物形式)上捕获，未获得添加载体的18F-氟化物。将18F-氟化物用盐水(100μL)洗脱到反应管中。将反应混合物在真空下在80℃下加热20min并且用40mM甲酸铵水溶液(2mL)稀释。将溶液使用半制备型柱通过HPLC进行纯化，用MeCN/水(+0.1％TFA)(v/v)(30：70)以4.5mL/min的流速进行洗脱。螯合和非螯合示踪剂的保留时间为约10分钟。对于18F-PSMA-617-LysAMBF3-DOTA或18F-PSMA-617-LysAMBF3-DOTA(Cu)，衰减校正的放射性化学产率分别是1.0％±0.3％(n＝3)或2.7％±0.7％(n＝3)。如通过放射HPLC确定的，对于两种标记的示踪剂实现了>99％的放射性化学纯度。使用分析HPLC系统测量比活性。其通过将最终产物溶液中注射的放射性(1.5至3mCi)除以注射溶液中的质量来计算。通过比较从注射获得的UV吸光度与先前制备的标准曲线来估计注射产物的质量。18F-PSMA-617-LysAMBF3-DOTA或18F-PSMA-617-LysAMBF3-DOTA(Cu)的比活性分别是3.7±2.5Ci/μmol(n＝3)或4.8±2.2Ci/μmol(n＝3)。
结果
表7示出F-18标记的PSMA-617-Lys-AMBF3-DOTA在携带有表达PSMA的LNCaP前列腺癌异种移植物的小鼠中的生物分布(注射后1小时)。PSMA-617-LysAMBF3-DOTA的结构在图2中示出。图4示出携带有LNCaP前列腺癌异种移植的小鼠中F-18标记的PSMA-617-Lys-AMBF3-DOTA的最大强度投影PET图像(注射后1小时)。
表7.F-18标记的PSMA-617-Lys-AMBF3-DOTA在携带表达PSMA的LNCaP前列腺癌异种移植物的小鼠中的生物分布(注射后1小时)。
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实施例3和4：DOTA-Lys(AMBF3)-RM2(DOTA-Lys-AMBF3-4-氨基-1-羧甲基-哌啶-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2)和DOTA-Lys(AMBF3)-BK的合成和表征
结果和讨论
DTPA的合成
二亚乙基五乙酸(DTPA)是在治疗和诊断药物两者合成中用作放射性金属(例如，64Cu)的伴随分子的酸性螯合剂25。因为这种螯合剂具有五个可用于轭合到肽上的臂，所以必须在特定于应用的设计中保护臂本身。为此，游离臂对于固相化学是所期望的，而其他四个臂将由酸不稳定的保护基团(化合物4)保护。然后，当肽从树脂上最终酸性TFA裂解时，可以去除保护基团。这种设计概念导致从文献中改编的合成方案3 26,27：
方案3.DTPA的合成方案
通过在碱性条件下将可商购的乙醇胺与2当量的叔丁基溴乙酸酯混合来进行化合物4的合成。在用二乙醚萃取并且随后碳酸氢钠和盐水洗涤时，在二氧化硅柱上纯化油状残余物。纯化易于按比例放大，因为以71％产率纯化了几乎3g的化合物1。化合物的1H-NMR表明高纯度，可忽略水和己烷的信号(参见附录)。随后通过在无水条件下在DCM中用NBS/PPh3处理叔氨基醇将化合物1转化成2，并且以71％产率纯化。在反应完成后，通过在短二氧化硅柱上过滤粗反应混合物来去除三苯基膦氧化物副产物，其后通过使用5:1己烷/乙醚的第二二氧化硅柱来纯化所需产物。通过1H-NMR证实该化合物的纯度，ESI-MS显示预期的溴同位素模式(数据未显示)。
此时，将合适的甘氨酸酯用2进行双烷基化以得到DTPA衍生物(3)。我们最初选择甲酯，因为我们已经设想了通过皂化容易地去除甲基，这将在其他四个臂上留下叔丁基保护基不受影响。为此，3a的合成在由磷酸钠盐制成的磷酸缓冲乙腈水溶液中进行。不幸的是，磷酸盐的溶解度如此低，以致于如果环境温度降低则盐经常沉淀。这样，代替使用磷酸盐的一钾盐和二钾盐来产生缓冲液，其中添加NaOH或HCl水溶液以将pH调节至8。当与乙腈混合时，该高度浓缩的溶液形成双相系统。24小时后，将混合物过滤并且将有机层去除并且蒸发。为了去除剩余的无机盐，将无定形油溶于CHCl3中并且再过滤。该化合物的色谱纯化是有问题的，因为三个叔氨基可以容易地在酸性二氧化硅上质子化。对于我们的失望，甚至当用三乙胺对二氧化硅进行预处理并且用1％的三乙胺洗脱时，仍然无法完全纯化。然而，我我们选择将不纯3a置于1当量的LiOH水溶液中以实现甲酯(4)的皂化。如通过TLC所指示的反应完成之后，将产物萃取到二乙醚中。质谱分析证实单脱保护的DTPA加合物的存在，显示m/z＝640处的[M+Na+]信号(数据未显示)。尽管皂化导致一些所期望的物质的形成，但反应既不是干净的也不是高产率的。我们假设皂化条件妨碍产物的纯化；实际上，文献调查表明没有报道合成单甲基四叔丁基保护的DTPA(3a)。而是使用苄基保护的甘氨酸酯，并且对于该甘氨酸酯，钯催化的氢化提供了所期望的产物(3b)26,28。
为了合成3b，首先用醚/碳酸酯萃取从苄基甘氨酸盐对甲苯磺酸盐中分离甘氨酸苄基酯并且立即使用。在类似条件下(参见上文)将其与化合物2反应以产生27％粗产率的苄基保护的DTPA。再次，由于官能团的性质，用色谱法纯化证明是困难的，而且没有得到彻底的研究。未研究其他纯化方法(例如，酸性/碱性/中性氧化铝、C18反相、蒸馏)。而是，将粗3b通过钯催化的氢化在MeOH中以81％产率过夜脱保护。完成后，通过在烧结玻璃漏斗上过滤混合物来去除Pd/C固体。有趣的是，化合物4不需要进一步纯化，如通过1H-NMR证实的(参见附录)。经4个步骤，总产率是11.4％。
新型AMBF3的合成
在该项目的这一点，我们的重点从合成DTPA螯合剂(4)转移到构建可以结合到任何肽链中的新型三氟硼酸盐。选择二甲基铵三甲基三氟硼酸酯(AMBF3)(7)作为前体，因为它的高水解稳定性、易于制备、以及与铜辅助的叠氮化物-炔环加成反应的可用性19。事实上，甚至在pH 7.5的高度稀释条件(～5mM)下，化合物7以非常缓慢的第一级速率损失游离的氟化物，如图4中所示19。这种体外稳定性，加上化合物7的直接合成，使得AMBF3结构成为PET显像剂的独特靶标。
化合物6从可商购的碘甲基硼酸酯频哪醇酯和N,N-二甲基炔丙基胺在二乙醚中的等摩尔反应获得(参见方案4)。盐的快速沉淀随后过滤以>90％的产率产生NMR纯的产物(参见附录)。在pH 2下用KHF2氟化得到化合物7(参见方案4)。通过穿过用20％的ACN/EtOH洗脱的短二氧化硅塞来去除游离的氟化物。产物的1H-NMR显示δ＝1.15ppm，指示频哪醇二醇杂质。此外，由于污染物，诸如，氟化物盐、KBF4(在-150ppm下在19F-NMR上可见)、溶解的硅酸盐以及其他未表征的无机杂质，反应产率通常是200％-300％。为了补救这些问题中的一些，将粗固体在二乙醚中吸收并且再过滤。所得白色粉末是1H-NMR和19F-NMR纯，排除仍未去除的KBF4杂质。
方案4.AMBF3(7)的合成方案
对烷基三氟硼酸盐的电子性质的增强讨论可以基于化合物6和7的1H-NMR光谱进行。两个NMR实验均在D2O中进行，因为两种化合物可溶的唯一溶剂不干扰目标信号。铵基与硼之间的亚甲基质子的信号在氟化时显著偏移。具体地，针对6的2H单线态处于δ＝3.09ppm，而在化合物7中，信号驻留在δ＝2.55ppm(参见附录)。虽然显然化合物7中的硼具有形式上的负电荷，这应赋予更屏蔽的NMR环境，但三个氟原子的存在为亚甲基质子提供高度吸电子的(并且由此解除屏蔽)环境。这种冲突的功能实际上表现为电子屏蔽(给电子)，因为在D2O和MeOD中都观察到向上电场位移(数据未示出)。除了亚甲基信号的化学位移的变化之外，它的外观从强的单线态变为宽的单线态或可能的多重峰。可以排除与硼-11的偶联，因为这在化合物6的光谱中没有看到。因此，这可以通过与氟-19的长距离偶联或由于在NMR时间尺度内的一些构象非柔性来解释。对于这些理论中的任何一个的验证没有彻底地研究。
关于化合物7和8的19F-NMR，在高分辨率下未观察到由11B-19F偶联预期的1:1:1:1四重峰。尽管11B具有3/2的核自旋，但是其相对快速的松弛通常抑制使用标准脉冲程序的NMR实验对分裂模式的可视化29-31。所看到的是在-140ppm处的相当宽的信号。如先前所提及的，化合物7的二乙醚洗涤在去除四氟硼酸盐杂质方面不成功，并且对于此的信号出现在化合物7的-150ppm处。然而，在下一步骤中产生的修饰的AMBF3残基不具有-150ppm的信号。应注意，化合物6、7和8的11B-NMR分析没有阐明任何附加信息，因为峰非常宽(5ppm)，因此不能获得分裂模式(数据未显示)。
点击反应的叠氮化物配偶体采取修饰的赖氨酸残基(5)的形式。如方案5中所示，这种短的合成方案将提供一种可能通用的肽结构单元，该肽结构单元可以用于使用标准固相肽合成来结合必需的三氟硼酸盐官能度。这是一个重要的区别，因为先前由Perrin等人使用的芳基三氟硼酸盐仅可以在肽从固体支持物切割并且HPLC纯化之后附加到肽上。在过去两年中，若干出版物已经描绘了这种技术，主要集中在RGD的叠氮化物衍生物与炔-ArBF3之间的铜催化的点击反应18,32-35。用炔取代的芳基三氟硼酸酯合成和纯化这些肽存在困难，因为这些化合物在SPPS过程中树脂裂解所需的低pH下的不稳定性。事实上，即使使用0.1％的TFA/H2O溶剂系统用于HPLC也导致芳基三氟硼酸盐的降解19。第2.3节中的讨论将概述与新赖氨酸-AMBF3轭合的两种肽的稳定性。为了合成5，将NaN3和Tf2O在DCM中的混合物添加到Fmoc-Lys-OH中。该反应的机理通过三氟甲磺酰叠氮化物(三氟甲磺酸叠氮化物)中间体进行，该中间体为赖氨酸上的ε-氨基提供亲电体。这种二级反应中间体随后在ε-碳处被最近释放的叠氮阴离子攻击，从而以86％的产率提供Fmoc-Lys(N3)-OH(5)。
方案5.Lys(AMBF3)(8)的合成方案
点击反应最初由Sharpless和合作者在2001年描述，被定义为“模块化、范围广、高产率、立体特异性、并且仅生成无污染副产物”的任何反应36。在点击化学不断增长的发展趋势下，属于最广泛使用的实施例：由罗尔夫胡伊斯根(Rolf Huisgen)在60年代早期推出的铜催化的叠氮化物-炔烃环加成反应。使用炔烃化合物7和叠氮化合物5，将这种化学过程用于化合物8的合成。由于反应条件和重现性问题的优化，8的合成具有挑战性(表8)。
表8.用于合成Lys(AMBF3)的反应条件
使用抗坏血酸钠在原位将铜从Cu(II)还原为Cu(I)，以便使炔底物初始结合。所有反应的溶剂大致为3:2ACN/H2O。如果需要，调节该比率以保持单相系统。所有反应在45℃下进行过夜。新鲜制备还原剂，1M抗坏血酸钠。通过TLC监测反应进程，因为Fmoc-Lys-(N3)-OH在9:1DCM/MeOH中具有Rf＝0.37，而化合物8在Rf＝0.15处接近基线运行。反应1和2在24小时内没有导致起始材料向产物的显著转化(UV可视化)。类似的问题出现在反应3中，该反应未被1M碳酸氢钠中和。以类似于反应1-3的方式，中和反应4，并且另外进行柱纯化。溶剂系统导致非常缓慢的纯化，并且产物在许多级分上洗脱。将反应5的粗混合物吸收在DCM中，并且用盐水(3x5 mL)洗涤以去除无机盐。尽管有机萃取物更易于进行柱纯化，但总反应产率仍然低。反应6采用粗反应混合物的简单DCM萃取以从有机层去除无机盐。然后通过硅胶柱色谱法纯化有机提取物(产率为65％)。不幸地，当按比例放大时，此方法的再现性是低的，因为反应7和8(2x和4x标度)分别提供了45％和<0％的产率。需要更多的见解来理解为什么这种点击反应不能与克标度条件相符。经4个步骤(收敛合成)，化合物8的总产率计算为56％。
最近，提出了一种“干降”法通过浓缩混合物并且使溶液脱气以促进抗坏血酸钠的还原环境来推动反应完成。使用增加当量的铜和抗坏血酸盐进行反应9-11。尽管这些反应未被纯化，TLC板的目视检查表明使用干燥法不存在可辨别的改进。然而，可以确定在24小时后，与11相比反应9和10保留显著更多的起始材料。这表明使用化学计量的或甚至过量的铜对于该反应是必要的。
固相肽合成
最近，已经合成了两种将Lys(AMBF3)残基并入其序列中的肽。使用自动肽合成仪制备第一肽，DOTA-和AMBF3-轭合的RM2(DOTA-Lys-AMBF3-4-氨基-1-羧甲基-哌啶-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2)，并且通过HPLC由Zhibo Liu纯化(图47)19。树脂连接的肽RM2由Lin Lab在BC癌症协会(BCCA)提供给我们。RM2是对前列腺肿瘤、乳腺肿瘤和胃肠道肿瘤中发现的胃泌素释放肽受体(GRPr)具有高亲和力的蛙皮素拮抗剂20,38-42。以下讨论将集中于第二肽(缓激肽衍生的AMBF3轭合物)的合成(图48)。方案6首先用于RM2轭合物的合成，并且随后外推至手动固相肽合成。
统称为激肽的天然缓激肽及其类似物作为疼痛和正常生理调节的信号存在于体内43。这些九肽具有两种类型的受体，B1和B244。后者(在细胞中比B1受体更常见)结合正常的九聚体和类似的激肽类似物。相反，B1受体仅结合一个氨基酸更短的激肽，特别是[des-Arg9]-BK44。破坏体内BK的主要酶是血管紧张素I转化酶(ACE)，其在7-8和5-6键处切割45。BK受体在癌症疗法中的作用由以下事实证明：B2受体，由于其在整个身体中的高浓度，不产生有吸引力的药物靶标。相反，在增加的炎症和肿瘤生长期间变得更普遍的B1受体是有期望的药物靶标，因为它们对癌症部位是特异性的。为此，我们选择将Lys(AMBF3)轭合在B1受体特异性[des-Arg9]缓激肽类似物上。
这些肽的设计是基于若干因素。首先，如在章节1.5中所提及的，这些天然亲脂性肽已经显示在小鼠的PET扫描中在肝脏和肠道中积聚21。添加药物代谢动力学调节剂(诸如，螯合剂DOTA)促进肝胆清除率的降低并且改进图像对比度22,23。然而，这不是附加螯合剂的唯一目的。如该名称所示，螯合官能团(诸如，DOTA和DTPA)用于螯合某些金属(例如，90Y或186Re)，该金属可以用作疾病的治疗剂或用作类似于18F的诊断成像剂(例如，68Ga)25,46,47。这种相对新的医学领域(由Funkhouser在2002年作为治疗诊断学创作)是非常有前景的，因为靶向疗法可以既可视化又攻击疾病47,48。据推测，利用我们的结构，当与18F-PET成像偶联时，AMBF3将用作诊断，并且螯合至DOTA的金属将用作针对癌症的潜在治疗剂。这两个功能均依赖于高肿瘤摄取，这使得Lys(AMBF3)与天然肽之间的阳离子接头极其重要。Mansi等人显示4-氨基-1-羧甲基-哌啶当与肽轭合并且在生理pH下质子化时，可以使DOTA-RM2的Kd降低几乎3倍20。
方案6.DOTA-Lys(AMBF3)-BK肽(9)的合成方案。(i)标准Fmoc合成。在Lin Lab中在BCCA下进行的程序。通过合作向我们提供在步骤(ii)中使用的树脂偶联的BK；(ii)20％哌啶/DMF，室温，3x5 min，然后Fmoc-4-氨基-1-羧甲基-哌啶，HBTU，DIPEA，DMF，室温，2小时；(iii)20％哌啶/DMF，室温，3x5 min，然后Fmoc-L-Lys-AMBF3-OH(8)，HBTU，DIPEA，DMF，室温，24小时；(iv)20％哌啶/DMF，室温，3x5分钟，然后DOTA-三-叔丁基-酯，NHS，DCC，DCM，室温，24小时；(v)95:2.5:2.5TFA/H2O/TIPS，含30mM KHF2。
方案6示出用于产生肽9的手动固相肽合成方案。固体支持物是由Lin实验室在BCCA与Fmoc保护的改性缓激肽偶联的羟甲基苯基官能化树脂(Wang树脂)。为了提供更高的体内稳定性，分别使用Hyp3和Cha5在位置3和位置5修饰用于此合成的BK类似物(图48)。这些修饰改变了ACE在这些位置处的作用，使得肽的半衰期更长，这将产生优异的PET图像49。赖氨酸和精氨酸残基分别被Boc(叔丁氧基羰基)和Pbf(2,2,4,6,7-五甲基-二氢苯并呋喃-5-磺酰基)基团保护。这些基团是酸不稳定的并且因此仅在最终的TFA树脂裂解中脱离。附加末端亮氨酸残基以将激动剂BK转化为拮抗剂形式，因为天然缓激肽不含该残基。所有反应均在3mL旋转柱中进行。脱保护条件包括用2.5mL的20％哌啶/DMF连续洗涤3次，每次5分钟。在用DMF和DCM洗涤树脂之后，第一偶联反应(方案6ii)连接阳离子间隔物并且在DMF中使用HBTU作为活化剂完成。在每次脱保护/偶联反应(方案6ii-6iv)之后使用Kaiser(茚三酮)测试以完成测试。简而言之，由于伯氨基的存在，这种颜色测试可以在受保护的肽和未受保护的肽之间快速辨别50。尽管这是半定量分析方法(因为人们不能仅基于这些珠粒的视觉检查准确地区分保护胺的多少已经被脱保护)，但是使用阳性对照有助于确定这些珠粒应该被加热多长时间。测试涉及取几个树脂珠粒并且用茚三酮、溶解在乙醇中的苯酚以及在吡啶中的KCN水溶液处理它们。一个试管包含具有游离氨基的Rink酰胺树脂(阳性对照)，并且另一试管包含具有所讨论的肽的树脂。在加热时，预期游离末端胺的颜色为深蓝色，而Fmoc保护的肽没有观察到颜色变化。
下一偶联反应(方案6iii)使用类似的条件，但是混合24小时以确保最大可能的产率，因为化合物8比阳离子接头显著更有价值。首先尝试使用NHS/DCC在DMF中偶联DOTA-三-叔丁基-酯(方案6iv)24小时。在反应期之后，仍然通过Kaiser测试观察到显著的蓝色。在额外的24小时之后看到类似的结果。这样，将溶剂转换成DCM，这在48小时之后令人满意地产生阴性的Kaiser测试。尽管已经显示HBTU与DOTA一起用于小肽的合成，但是对RM2和BK类似物的先前经验已经表明，通过DCC偶联合成DOTA的NHS酯是更有效的方法19,51。
当我们尝试使用在水中的95％TFA从树脂上切割肽时，出现困难。切割的肽的HPLC迹线显示从10至20分钟的多个峰，并且没有产物可以通过MALDI-TOF分析来验证(数据未显示)。假设AMBF3在从树脂切割序列后降解，或TFA潜在地在多个位置切割肽。这是令人沮丧的，因为这种新技术的目的是其水解稳定性。然而，重要的是认识到这些是极其苛刻的条件，并且因此任何三氟硼酸盐不可能存在。为了解决这个问题，建议将过量的游离氟化物添加到裂解混合物中以在三氟硼酸盐的方向上而不是朝向硼酸推动平衡。这是基于由Ting等人进行的动力学研究，在方案4中示出。鉴于该理由，将30mM的KHF2添加到95:2.5:2.5的TFA/H2O/TIPS中，并且使裂解反应进行最多2小时。将溶液过滤，并且收集，蒸发，并且使用MeOH/二乙醚研磨。将沉淀的固体溶解在50％乙腈水溶液中并且通过HPLC进行纯化，如图50中所示(参见用于详细HPLC方案的方法和材料)。收集在10-11分钟(峰1)、11.1-12分钟(峰2)、14-14.8分钟(峰3)、以及14.9-15.7分钟(峰4)处的峰并且通过MALDI-TOF进行分析。仅前两个峰提供有用的表征数据(图51至图54)。
缓激肽衍生物的HPLC纯化已经证明是困难的，因为这些峰在性质上在保留时间宽上是相似的。虽然这可能是由于合成程序的质量，但是之前已经针对其他BK类似物观察到类似的HPLC迹线19。解释可能是BK肽由于分别在位置3/4和8的Pro和Hyp残基而倾向于具有多种构象。因此，甚至化学纯的肽也可以用宽峰洗脱。如图50中所见，峰1和峰2分别洗脱；遗憾的是，分离不是完全有效的，因为峰1中的化合物(m/z＝1807)可以在峰2的MALDI-TOF中找到，并且反之亦然。峰1的同一性被认为是肽9的脱甲酰化产物(图55)。结构的预测的同位素模式非常好地对应于观察到的MALDI-TOF光谱(图52)。
图53显示峰2的MALD1-T0F，其为所需产物DOTA-Lys(AMBF3)-BK。遗憾的是，由于难以进行HPLC纯化，光谱显示除了少量的脱硼产物之外，还存在一些额外的未表征的杂质。这被认为对缓激肽具有特异性，因为先前提及的RM2肽提供更清洁的HPLC迹线和显著更合格的MALDI-TOF光谱(图56)。
肽9的产率仅为5.5％，这可以由于几个原因进行解释。首先，固相合成的总规模非常低，因为仅使用16.5μmol的受保护的BK。另外，如以上所讨论的，产物的HPLC纯化被具有与所期望的肽相似的保留时间的其他峰混杂。最后，DOTA-Lys(AMBF3)-BK的脱甲酰化是低产率的部分原因。尽管如此，我们还是很高兴看到验证：该方法甚至在合成挑战性肽(如缓激肽)上是成功的，如通过MADLI-TOF分析所证实的。
肽11的MALDI-TOF在m/z＝[M+H+]+1959.1处显示单峰。与BK(肽9)相比，此纯光谱阐明了合成RM2的相对容易性。
基于以上讨论，出现了以下问题：所提出的技术特定于AMBF3，或可以与芳基三氟硼酸盐一起使用？芳基三氟硼酸盐可以偶联至氨基酸残基并且通过固相合成掺入肽中？本文呈现的观察表明，使用Lys(AMBF3)官能度比使用ArBF3更容易合成这些肽。ArBF3官能团只能在SPPS和可点击肽的纯化后偶联，因为切割和纯化条件将破坏三氟硼酸盐21。这是由于与芳基三氟硼酸盐同系物相比，当三氟硼酸盐邻近铵基团时，三氟硼酸盐的水解稳定性更高(图3和图4)19。此外，AMBF3的固有有用的优点是由于其潜在的体内稳定性而降低游离氟化物的骨摄取。虽然只有两种肽已经与新的AMBF3合成，但是我们预期在适当的过程中再研究几种。
结论
此项目的目的是改进困扰芳基三氟硼酸盐衍生的18F-PET显像剂的若干问题。具体地，高亲脂性和与固相肽合成的不相容性分别赋予差的图像质量和有限的合成多功能性。为此，靶向受保护的金属螯合剂，其目标是轭合到肽上以增加极性。经4个步骤以11％的总产率合成四叔丁基保护的DTPA(4)。化合物3a和3b的纯化问题导致这种不令人满意的产率。
由于在AMBF3(7)与修饰的赖氨酸-叠氮基氨基酸(5)之间的点击反应，合成一种新型烷基三氟硼酸盐(8)。基于显示AMBF3对水解的改进的体外稳定性的先前动力学研究，假设该残基与具有高肿瘤亲和力的小肽的固相肽合成相容16。选择缓激肽拮抗剂作为附加Lys(AMBF3)残基的底物。还偶联至肽的是DOTA(金属螯合剂)和阳离子铵接头，已知它们分别对于低亲脂性和高肿瘤摄取是至关重要的20。通过HPLC纯化肽并且通过MALDI-TOF分析进行表征。
这种新技术的优势是通过固相肽合成来合成三氟硼酸盐肽类似物的高多样性。AMBF3由于其水解稳定性也是固有有用的，水解稳定性应降低游离氟化物的骨摄取。这个工作通过将18F-标记的肽与螯合至DOTA的治疗性金属偶联来实现双模式治疗诊断学研究。
实验
所有商业化学品均购自Sigma-Aldrich、Fischer Scientific、Alfa-Aesar、Oakwood Chemicals、或Combi-Blocks，并且无需进一步纯化即可使用。溶剂购自FischerScientific或Sigma-Aldrich，并且无需进一步纯化即可使用。无水THF通过用二苯甲酮作为指示剂在钠金属上蒸馏获得。在使用前，通过在活化的4A分子筛上储存溶剂至少24小时来干燥DMF。氘代溶剂购自Cambridge Isotope Laboratories。在300MHz Bruker Avance光谱仪上收集1H-NMR数据，并且相对于作为参考点的溶剂信号，所有化学位移以δ标度上的ppm报告：CDCl3为δ7.26，CD3CN为δ1.94，D2O为δ4.79，CD2Cl2为δ5.32，以及CD30D为δ3.31。多重性报告为单峰(s)、双峰(d)、三重峰(t)、四重峰(q)、多重峰(m)、或宽峰(br)。使用与用于样品注射的Waters 2695HPLC偶联的WWaters ZQ GC-MS获取质谱。用于快速柱色谱的HPLC硅胶是来自SiliCycle的SiliaFlash F60(230-400目)硅胶。使用Agilent 1100系列系统通过Agilent Eclipse XDB-C18柱进行HPLC纯化。通过在229nm处的UV吸光度进行检测。梯度程序如下：溶剂A：乙腈，溶剂B：0.1％TFA/H2O；0至2分钟：0％至5％A，2至15分钟：5％至20％A，15至16分钟：20％至35％A，16至18分钟：35％至100％A，18至19分钟：100％至5％A；流速＝3mL/min；柱温：50℃至51℃。从文献修饰的合成程序在下文已参考指出。
N,N-双[(叔丁氧羰基)甲基]-2-氨基乙醇(1)26
在火焰干燥的圆底烧瓶中，将溴乙酸叔丁酯(5.00mL，33.9mmol，2.5eq.)、无水KHCO3(3.45g，34.5mmol，2.5eq.)和DMF(22mL)的混合物冷却至0℃。在惰性气氛下，经5分钟的时间将乙醇胺(0.826mL，13.7mmol，1eq.)在DMF(1.68mL)中的溶液滴加到烧瓶中，并且搅拌30分钟。将反应在室温下再搅拌24小时。然后过滤混合物，并且向滤液中添加乙醚(25mL)和饱和NaHCO3(17mL)。随后用二乙醚(3x10 mL)萃取水层，并且用盐水(3x10 mL)洗涤合并的有机萃取物。用MgSO4干燥后，过滤有机混合物并且在减压下蒸发，得到粘稠油状物，将其在二氧化硅柱上通过快速色谱法(石油醚/乙醚，2:1；Rf＝0.17)纯化。产率：2.79g，71％。1HNMR(300MHz，CDCl3，室温)：δ(ppm)＝1.51(s，18H，叔丁基CH3)，2.93(t，2H，J＝5.01，HOCH2CH2N)，3.47(s，4H，N(CH2)2)，3.57(m，2H，HOCH2)，3.81(t，1H，J＝5.75，OH)；ESI-LRMS：[M+Na+]+312.4(100％)。
N,N-双[(叔丁氧羰基)甲基]-2-溴乙胺(2)26
在火焰干燥的圆底烧瓶中，将1(2.77g，9.51mmol，1eq.)溶解在DCM(15mL)中。向此溶液中添加三苯基膦(2.17g，8.27mmol，0.8eq.)并且将混合物冷却至0℃。然后在5分钟的过程中缓慢添加N-溴代琥珀酰亚胺(1.47g，8.27mmol，0.8eq.)。将无色混合物在0℃下搅拌90分钟，几乎没有可观察到的颜色变化。将混合物在减压下蒸发以产生淡粉色固体。向其中添加二乙醚(28mL)并且将所得白色沉淀物过滤。将滤液再次在减压下蒸发以提供黄色油状物，将该黄色油状物加载到短二氧化硅柱上并且用二乙醚洗脱。将粗洗脱液再蒸发一次，最后在二氧化硅柱(己烷/乙醚，5:1；Rf＝0.65)上通过快速色谱法纯化。产量：2.38g，71％。1HNMR(300MHz，CDCl3，室温)：δ(ppm)＝1.51(s，18H，叔丁基CH3)，3.18(t，2H，J＝7.54，HOCH2CH2N)，3.48(dd，2H，J1＝8.16，J2＝6.96，HOCH2)，3.52(s，4H，N(CH2)2)；ESI-LRMS：[M+K+]+390.0(60％)。
N,N,N”,N”-四[(叔丁氧羰基)甲基]-N’-[(甲氧羰基)甲基]二亚乙基三胺(3a)52
由甘氨酸甲酯盐酸盐(32.5mg，259μmol，1eq.)和2(187mg，533μmol，2.1eq.)在乙腈(2mL)中制备溶液。然后添加通过在H2O(10mL)中混合K2HPO4(3.26g，18.8mmol)和KH2PO4(167mg，1.23mmol)制备的磷酸盐缓冲液(1mL，2M，pH 8)，并且将反应在室温下搅拌24小时。过滤反应混合物，并且将滤液转移至分液漏斗。将有机层从水层中去除并且用MgSO4干燥。减压蒸发得到黄色油状物，将其负载在二氧化硅柱上(CHCl3/MeOH/NEt3 150:3:1；Rf＝0.3)。除其他尝试外(例如，Hex/醚/NEt3、Hex/EtOAc/NEt3)，该溶剂系统由于酸性和碱性官能团的性质并且由于溶解度问题而无法以高纯度分离目标化合物。ESI-LRMS：[M+K+]+670.5(100％)。
N,N,N”,N”-四[(叔丁氧羰基)甲基]-N’-[(苄氧羰基)甲基]二亚乙基三胺(3b)52,27
将甘氨酸苄酯对甲苯磺酸酯(200mg，592μmol，1eq.)添加到乙醚(4mL)中，并且添加Na2CO3水溶液(189mg，1.8mmol，3eq.，4mL的溶液)。在室温下搅拌30分钟后，分离醚层，用MgSO4干燥，并且在减压下蒸发，得到苄基甘氨酸酯(89mg，540μmol)。该中间体不经进一步纯化用于目标化合物3b。将磷酸盐缓冲液(1mL，2M，pH＝8)添加至溶解于乙腈(2mL)中的苄基甘氨酸酯(60mg，364μmol，1eq.)和2(280mg，795μmol，2.2eq.)。将该两相反应在室温下搅拌24小时。滤出沉淀的盐，分离有机层，用MgSO4干燥，并且减压蒸发。然后将半固体残余物吸收在氯仿中，过滤，并且再次蒸发。将所得黄色油装入二氧化硅柱用于快速色谱法(CHCl3/MeOH/NEt3 150:3:1；Rf＝0.35)。类似于3a，由于碱性官能团的性质，经由二氧化硅色谱法的完全纯化具有挑战性。粗产率：73.1mg，28％。ESI-LRMS：[M+K+]+670.5(100％)。
N,N,N”,N”-四[(叔丁氧羰基)甲基]-N’-[乙酸]二亚乙基三胺(4)52,27将3b(76mg，108μmol，1eq.)溶解在甲醇(1mL)中，并且添加Pd/C 10％(20mg，催化剂，50％湿)。将反应在氢气气氛(2个大气球)下在室温下搅拌24小时。将反应经烧结玻璃漏斗过滤并且在减压下蒸发至粘性黄色油状物。产率：53.5mg，81％。1H NMR(300MHz，CDCl3，室温)：δ(ppm)＝1.48(s，36H，叔丁基CH3)，3.02(m，4H，C(O)OHCH2NCH2CH2N)，3.14(m，4H，C(O)OHCH2NCH2CH2N)，3.47(s，8H，NCH2C(O)OtBu)，3.59(s，2H，NCH2C(O)OH)；ESI-LRMS：[M+K+]+654.5(100％)。
Fmoc-(L)-Lys(N3)-OH(5)24
在0℃下，将NaN3(7.3g，113mmol)添加到H2O(20mL)和DCM(30mL)的混合物中。经30分钟的时间向其中滴加Tf2O(3.8mL，22.45mmol)。将该反应在0℃下搅拌5小时，并且随后用DCM(2x50 mL)萃取。将有机层合并，用Na2CO3饱和水溶液(1x50 mL)洗涤，不经进一步纯化即可使用。然后产生K2CO3(5.6g，39.5mmol)、CuSO45H2O(25mg，催化剂)和Fmoc-(L)-Lys-OH(4.78g，13mmol)在1:1MeOH/H2O(33mL)中的混合物。经30分钟的一段时间向其中滴加有机萃取物，并且将混合物在室温下进一步搅拌过夜。使用2.5N Hcl(150mL)淬灭反应，然后用DCM(3x50 mL)萃取产物，用盐水(2x50 mL)洗涤，并且用无水Na2SO4干燥。将混合物过滤并且在减压下蒸发以给出粗油状物，将该粗油状物立即装入二氧化硅柱上用于快速色谱法(MeOH/DCM的梯度0.5:99.5至1:99)。Rf＝0.37(1:9MeOH/DCM)。产率：4.4g，86％。1H NMR(300MHz，CD2Cl2，室温)：δ(ppm)＝1.30-1.60(m，6H，β，γ，δCH2)，3.32(t，2H，J＝6.38Hz，εCH2)，4.28(t，1H，J＝6.60Hz，αCH)，4.39-4.47(m，3H，Fmoc-CHCH2OC(O))，5.32(s，1H，OC(O)NH)，7.36(t，J＝7.11Hz，Fmoc芳基H)，7.45(t，J＝7.26Hz，Fmoc芳基H)，7.65(d，J＝7.37Hz，Fmoc芳基H)，7.82(d，J＝7.37Hz，Fmoc芳基H)；ESI-LRMS：[M+Na+]+417.3(100％)。
N-炔丙基-N,N-二甲基-铵甲基-硼烯基频哪醇酯(6)53
在火焰干燥的圆底烧瓶中，将N,N-二甲基炔丙基胺(0.67mL，6.27mmol，1eq.)添加到二乙醚(28mL)中，并且将反应加热至45℃。将碘代甲基鞘硼酸酯(1.144mL，6.27mmol，1eq.)逐滴添加到溶液中。在添加后，混合物立即变浑浊，随后白色固体从溶液中沉淀出来。将反应再搅拌15分钟并且将产物过滤并且用冷二乙醚洗涤。将残余物在高真空下干燥以产生片状白色固体。产率：1.4g，100％。1H NMR(300MHz，D2O，室温)：δ(ppm)＝1.13(s，12H，2x(CH3)2)，3.09(s，2H，N(CH3)2CH2BF3)，3.15(t，1H，J＝2.53，CH2CCH)，3.19(s，6H，N(CH3)2)，4.27(d，2H，J＝2.51，HCCCH2N(CH3)2)；ESI-LRMS：[M]+224.4(100％)。
N-炔丙基-N,N-二甲基-氨甲基-三氟硼酸盐(7)
将6(1g，4.46mmol，1eq.)溶解于乙腈(12mL)中并且通过添加KHF水溶液(3M，4.25mL，12.8mmol，2.8eq.)和HCl(4M，4.25mL，17mmol，3.8eq.)在45℃下氟化2小时。通过添加浓NH4OH水溶液(约1.5mL)至pH 7来淬灭澄清橙色溶液。将该混合物转移到更大的圆底烧瓶中，并且添加20％乙腈/乙醇溶液(100mL)。将二氧化硅(40mL)直接置于该溶液中，并且将混合物搅拌20分钟。先前明亮的黄色溶液失去其大部分颜色并且变成澄清的无色混合物。将该混合物加载到设定在烧结玻璃漏斗上的短二氧化硅柱上，并且用20％乙腈/乙醇洗脱。在减压下蒸发并且随后在高真空下干燥之后，分离出淡黄色固体。将其洗涤并且用冷二乙醚(20mL)过滤以产生NMR纯的两性离子。由于除了碘化物(通过ESI-MS可观察到的)和KBF4(在19F-NMR上可见)之外，产物中剩余的过量盐，产物产率高于定量。对于其他反应，假设合成7的产率是定量的。1H NMR(300MHz，D2O，室温)：δ(ppm)＝2.55(m，2H，N(CH3)2CH2BF3)，3.08(s，6H，N(CH3)2)，3.12(t，1H，J＝2.46，CH2CCH)，4.10(d，2H，J＝2.41，HCCCH2N(CH3)2)；19FNMR(282.4MHz，CD3OD，室温)：δ(ppm)＝-140(q，3F，BF3)，-154(s，BF4)；ESI-LRMS：[M-F-]+146.1(100％)。
Fmoc-(L)-Lys-ε-1,2,3-三唑-N,N-二甲基-氨甲基-三氟硼酸盐[Fmoc-Lys(AMBF3)](8)
将CuSO4水溶液(1M，0.75mL，0.75mmol)和抗坏血酸钠(1M，1.5mL，1.5mmol)的混合物添加至溶解于乙腈/水3:2(2.5mL)中的7(250mg，约0.75mmol，约3eq.)中。将5(100mg，0.25mmol，1eq.)溶解在最小量的乙腈中并且滴加到混合物中，并且在45℃下搅拌过夜。通常看到一些Cu或抗坏血酸盐在整个反应中沉淀出来。通过硅胶TLC监测该反应并且起始材料在20-24小时的反应时间之间消失。在规模放大时，并不总是实现可重复性，并且通常必须添加更多的催化剂、还原剂或炔烃以推动反应完成。将沉淀物过滤，并且将反应混合物在减压下蒸发。将深红色残余物吸收在1:1MeOH/DCM中，过滤，并且再次蒸发。使用5:95MeOH/DCM将该过程再重复一次以去除所有过量的盐和不溶性杂质。将最终的粗油状物完全溶解于5:95MeOH/DCM中，并且随后填充到二氧化硅柱上，并且经由快速色谱法用MeOH/DCM的梯度系统(5％-10％)洗脱。Rf＝0.15(1:9MeOH/DCM)。产率：91.5mg，65％。1H NMR(300MHz，CD3OD，室温)：δ(ppm)＝1.37-1.93(m，6H，β，γ，δCH2)，3.06(s，6H，N(CH3)2)，4.11(m，1H，αCH)，4.23(m，2H，N(CH3)2CH2BF3)，4.40(m，2H，εCH2)，4.49(m，3H，Fmoc-CHCH2OC(O))，4.55(s，2H，CH＝CCH2N(CH3)2)，5.52(s，1H，OC(O)NH)，7.34(t，J＝7.00Hz，Fmoc芳基H)，7.42(t，J＝7.13Hz，Fmoc芳基H)，7.70(m，Fmoc芳基H)，7.83(d，J＝7.38Hz，Fmoc芳基H，8.27(s，1H，CH＝CCH2N(CH3)2))；19F NMR(282.4MHz，CD3OD，室温)：δ(ppm)＝-140(m，3F，BF3)；ESI-LRMS：[M+Na+]+582.3(100％)。
DOTA-((L)-Lys-ε-1,2,3-三唑-N,N-二甲基-氨甲基-三氟硼酸盐)-4-氨基-1-羧甲基-哌啶-Lys-Arg-Pro-Hyp-Gly-Cha-Ser-Pro-Leu-COOH(9)
使用标准Fmoc固相肽合成化学在Wang(羟甲基苯基)树脂上制备这种线性经修饰的肽。将非天然形式的缓激肽(Fmoc-Lys-Arg-Pro-Hyp-Gly-Cha-Ser-Pro-Leu-COOH)预加载到树脂上并且用于附接阳离子间隔物、Lys(AMBF3)残基和DOTA螯合剂的支架。将树脂负载量值预先计算为0.44mmol/g。将干燥的树脂(37.5mg，16.7μmol)添加到3mL旋转柱中，并且在第一偶联反应之前在DMF(2.5mL)中溶胀2小时。将DMF滤出并且将Fmoc用20％哌啶/DMF(3x2.5 mL，每次5分钟)去除。用DMF(3x2.5 mL)、DCM(3x2.5 mL)和DMF(3x2.5 mL)洗涤树脂。将Fmoc-4-氨基-1-羧甲基-哌啶(25mg，65μmol，4eq.)、HBTU(25mg，65μmol，4eq.)和DIPEA(11.4μL，65μmol，4eq.)溶解在DMF(2.5mL)中，并且添加到带盖的旋转柱中。将反应在室温下振荡2小时。将溶液通过旋转柱过滤并且在下一偶联反应之前用DMF(3x2.5 mL)、DCM(3x2.5 mL)、以及DMF(3x2.5 mL)洗涤。将8(14mg，25μmol，1.5eq.)、HBTU(10mg，25μmol，1.5eq.)和DIPEA(5.6μL，32.5μmol，2eq.)溶解于DMF(2.5mL)中，并且添加到带盖的旋转柱中。将该反应在室温振摇过夜。再次将溶液通过旋转柱过滤并且在下一偶联反应之前用DMF(3x2.5 mL)、DCM(3x2.5 mL)、以及DMF(3x2.5 mL)洗涤。将DOTA-三-叔丁基-酯(24mg，41.6μmol，2.5eq.)、NHS(4.6mg，41.6μmol，2.5eq.)、和DCC(8.5mg，41.6μmol，2.5eq.)溶解在DCM(2.5mL)中并且添加到带盖的旋转柱中。将该反应在室温振荡48小时。由于这个最终附属物不具有保护性Fmoc基团，因此使用由储备溶液TFA(9.5mL)、H2O(0.25mL)、TIPS(0.25mL)和30mM KHF2(10μL的3M KHF2)制成的混合物(2.5mL)将肽从树脂上裂解。将混合物在室温下振荡2小时，过滤，并且在减压下蒸发。在0℃下，将残余物用1:11MeOH/Et2O(24mL)研磨，以得到白色固体。将混合物等分到24个1.5mL的微量离心管中并且离心以除去乙醚上清液。将二乙醚(1mL)再次添加到每个管中，离心，并且去除上清液。用1:1H20/乙腈(总共2mL)收集残留固体，并且通过HPLC纯化(上述条件)。产率：1.7mg，5％。MALDI-TOF LRMS：[M+H]+1867.0。
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实施例5：DOTA-Lys(AMBF3)-TATE和DOTA-Bn-NH-Lys-(AMBF3)-NHFmoc
奥曲酸(OctreoTATE)
将19.9mg具有TATE(4.6μmol，1eq.)的树脂用DMF溶胀30分钟。通过离心去除DMF并且去除上清液。添加6mM的DMF中的三氟乙酸铊(III)(713μL，4.28μmol，0.93eq.)，并且将反应在室温下搅拌8小时。将树脂离心并且去除上清液。使用DMF(200μL)洗涤三次。然后添加DCM(500μL)并且离心。去除上清液，并且通过快速真空干燥样品。用微量移液管吸头汲取少量树脂样品并且置于单独的微量离心管中，其中使用(3:7)HFIP:DCM(100μL)在室温下切割产物10分钟。使用过滤器移液管吸头过滤混合物，并且将滤液收集在单独的微量离心管中。通过吹入温和的空气干燥混合物，并且添加二乙醚以破碎产物。将混合物离心并且去除上清液。添加MeOH(200μL)以溶解用于MS的产物。ESI-MS(+)：计算为，C101H127N11O15S2Si2＝1855.5m/z；实测为，[M-Trt+2H]+＝1615.8m/z；[M-TBS-tBu]+＝1684.9m/z。
将(1:4)哌啶:DMF(200μL)添加到树脂中，并且将混合物在室温下搅拌1小时。将混合物离心下来并且去除上清液。添加DMF(3x200μL)以洗涤树脂。将混合物涡旋并且离心。去除上清液，并且通过快速真空干燥混合物。用微量移液管吸头汲取少量树脂样品并且置于单独的微量离心管中，其中(3：7)使用HFIP：DCM(100μL)在室温下切割产物10分钟。使用过滤器移液管吸头过滤混合物，并且将滤液收集在单独的微量离心管中。通过吹入温和的空气干燥混合物，并且添加二乙醚以破碎产物。将混合物离心并且去除上清液。添加MeOH(200μL)以溶解用于MS的产物。ESI-MS(+)：计算为，C86H117N11O13S2Si2，1633.2m/z；实测为，[M]+＝1663.0；[M+2CH3CN+2H]+＝1390.7m/z。
称出Fmoc-Lys(AMBF3)-NHS(15.1mg，23.0μmol，5eq.)并且溶解于200μL的(1:19)DIPEA:DMF中。然后将溶液添加到树脂中，并且在室温下搅拌混合2小时。将混合物离心下来并且去除上清液。添加DMF(3x200μL)以洗涤树脂。将混合物涡旋并且离心。去除上清液，并且通过快速真空干燥混合物。用微量移液管吸头汲取少量树脂样品并且置于单独的微量离心管中，其中(3:7)使用HFIP:DCM(100μL)在室温下切割产物10分钟。使用过滤器移液管吸头过滤混合物，并且将滤液收集在单独的微量离心管中。通过吹入温和的空气干燥混合物，并且添加二乙醚以破碎产物。将混合物离心并且去除上清液。添加MeOH(200μL)以溶解用于MS的产物。ESI-MS(+)：计算为，C113H148BF3N16O16S2Si2，2173.03m/z；实测为，[M+CH3CN+Na]+＝2236.5m/z。
将(1:4)哌啶:DMF(200μL)添加到树脂中，并且将混合物在室温下搅拌1小时。将混合物离心下来并且去除上清液。添加(3x200μL)DMF以洗涤树脂。添加DCM(200μL)并且离心。去除DCM，并且通过快速真空干燥树脂。用微量移液管吸头汲取少量树脂样品并且置于单独的微量离心管中，其中(3:7)使用HFIP:DCM(100μL)在室温下切割产物10分钟。使用过滤器移液管吸头过滤混合物，并且将滤液收集在单独的微量离心管中。通过吹入温和的空气干燥混合物，并且添加二乙醚以破碎产物。将混合物离心并且去除上清液。添加MeOH(200μL)以溶解用于MS的产物。ESI-MS(+)：计算为，C98H138BF3N16O14S2Si2，1952.3m/z；实测为，[M+Na]+＝1975.4m/z。
将DOTA-NHS·HPF6·TFA(8.75mg，11.5μmol，2.5eq.)溶解于(1:19)DIPEA:DMF(200μL)中，并且将混合物与H2N-Lys(AMBF3)-TATE一起添加至树脂中并且在室温下搅拌2小时。用DMF(3x200μL)洗涤树脂。将混合物涡旋并且离心。去除上清液。通过快速真空干燥树脂。用微量移液管吸头汲取少量树脂样品并且置于单独的微量离心管中，其中使用(3:7)HFIP:DCM(100μL)在室温下切割产物10分钟。使用过滤器移液管吸头过滤混合物，并且将滤液收集在单独的微量离心管中。通过吹入温和的空气干燥混合物，并且添加二乙醚以破碎产物。将混合物离心并且去除上清液。添加MeOH(200μL)以溶解用于MS的产物。ESI-MS(+)：计算为，C114H164BF3N20O21S2Si2，2337.1m/z；实测为，[M+K]+＝2375.4m/z。
将(95:2.5:2.5)TFA:TIPS:H2O(200μL)添加到树脂中以进行通用脱保护，并且将DOTA-Lys(AMBF3)-TATE从树脂上切割。将树脂在室温下搅拌30分钟。使用移液管吸头过滤器收集滤液以去除树脂。通过温和吹入空气将滤液浓缩直到体积为约50至100μL。添加二乙醚(1mL)以破碎产物，并且将混合物涡旋并且离心。去除上清液，并且通过快速真空干燥混合物。产率为3.2mg。ESI-MS(+)：计算为，C79H114BF3N20O21S2，1811.8m/z；实测为，[M+2Na]+＝1855.1m/z。
DOTA-Bn-NH-Lys-(AMBF3)-NHFmoc的合成：
将在微量离心管中的DOTA-Bn-NH2(10mg，0.015mmol，1eq.)溶解于(2:18)DIPEA:DMF(200μL)中并且转移至Fmoc-Lys(AMBF3)-NHS(14mg，0.025mmol，1.5eq.)的单独的微量离心管中。使用旋转搅拌器将混合物在室温下搅拌2小时。然后，添加1mL冷二乙醚以沉淀产物。然后将其涡旋并且离心以除去上清液。将最少的DMF(约50μL)添加到产物中以再溶解产物，并且添加二乙醚(1mL)以洗涤粗产物。将混合物涡旋并且离心以去除上清液。然后将产物干燥并且然后添加MeCN(约500μL)以重新溶解，并且去除过量的Fmoc-Lys(AMBF3)-NHS。将混合物离心下来，并且去除含有过量试剂的上清液。将产物在快速真空中再干燥一次。将产物的小样品溶解在MeOH中用于MS。ESI-MS(+)：计算为，C50H66BF3N10O11，1050.94m/z；实测为，[M+H]+＝1051.7m/z，[TLC(1:19NH4OH:EtOH，产物的Rf＝0.2，在254nm下可见)。
本领域技术人员进一步理解，上述DOTA-Lys(AMBF3)可以进一步轭合至荧光分子。这样的实施例在下文被提供为可以由在多模态成像应用领域中熟知的人考虑的许多中的一个。这样的实施例将不限于DOTA、Cy7或LysAMBF3以被发现是可预期的。
本发明已经关于一个或多个实施方式进行了描述。然而，对于本领域内技术人员明显的是，能够作出许多变型和修改，而不会偏离本发明的范围。本发明的范围不应受实施例中阐述的优选实施方式的限制，而是应给予与作为整体的描述一致的最宽泛的解释。
优先权申请。本申请要求2018年12月18日提交的美国62/781,584的优先权，其全部通过参考并入。

Claims (6)

1.一种化合物，其具有结构：
2.一种化合物，其具有结构：
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中，BF3的部分中至少一个的氟是18F。
4.根据权利要求1或2所述的化合物，其中，所述化合物用于诊断成像，其中BF3的部分中的至少一个氟是18F。
5.根据权利要求4所述的化合物，其中所述诊断成像是体内的。
6.根据权利要求4所述的化合物，其中所述诊断成像是离体的。
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