CN113683678A

CN113683678A - 一种重组i型人源化胶原蛋白c1l2t及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN113683678A
Application number: CN202111080699.3A
Authority: CN
Inventors: 杨霞; 武庚风; 张永健
Original assignee: Shanxi Jinbo Bio Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Shanxi Jinbo Bio Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2021-09-15
Filing date: 2021-09-15
Publication date: 2021-11-23
Anticipated expiration: 2041-09-15
Also published as: CN113683678B

Abstract

本发明公开了一种重组I型人源化胶原蛋白C1L2T及其制备方法和用途。本发明提供的重组I型人源化胶原蛋白C1L2T包含以SEQ ID No.3所示的序列，所述重组I型人源化胶原蛋白C1L2T任选地包含以SEQ ID No.2所示的序列，优选地，以SEQ ID No.2所示的序列和以SEQ ID No.3所示的序列直接相连。本发明所制备的重组I型人源化胶原蛋白C1L2T相比I型人胶原蛋白本身具有更加良好的细胞黏附效果，其氨基酸序列选自天然I型人胶原蛋白氨基酸序列，应用于人体产生免疫反应的可能性较低，且制备方法简单。

Description

一种重组I型人源化胶原蛋白C1L2T及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种重组I型人源化胶原蛋白C1L2T及其制备方法和用途。

背景技术

胶原蛋白(collagen)是哺乳动物体内含量最多的一类蛋白质，其广泛分布在动物的皮肤、骨骼、肌腱、韧带和血管之中。人体中胶原蛋白含量占总蛋白的25％～30％，是一种重要的结构蛋白，起着保护机体、支撑器官的重要作用。

目前已发现胶原蛋白有28种类型，不同类型的胶原蛋白具有不同的功能。一般分为两大类：一类是成纤维胶原蛋白；另一类是非成纤维胶原蛋白；成纤维胶原蛋白包括I、II、III、V、VI和XXVI型胶原蛋白，其余属于非纤维胶原蛋白。人体中含量最多的是I型胶原蛋白，约占85％以上，I型胶原蛋白在骨、皮肤、腱和角膜中含量高，II型存在于软骨、椎间盘和玻璃体中，III型存在于血管、新生皮肤和瘢痕组织中。

目前胶原蛋白主要以动物组织为来源，天然提取的胶原蛋白是多种不同分子量的胶原蛋白组成的混合物，不溶于水，生物相容性较差；此外，由于来源于动物组织，对于动物源疾病或者人传染疾病有交叉感染的风险，同时无法与人体相容，会导致出现免疫排斥和过敏症状。

生产胶原蛋白的传统方法是利用酸、碱、酶解法处理动物来源的组织，提取胶原蛋白衍生物。这些方法提取的胶原蛋白本身已经丧失了原本的生物学活性，无法应用于生物医学领域发挥真正的功能。所以，目前胶原蛋白只能在化妆品和保健品中使用，根本无法发挥胶原蛋白的原本生物学功能。

发明内容

发明要解决的问题

针对上述本领域中异源胶原蛋白生物活性差、难以发挥原有功能以及容易引起免疫反应的问题，本发明提供了一种重组I型人源化胶原蛋白C1L2T，同时提供了其制备方法和用途。

用于解决问题的方案

第一方面，本发明提供了一种重组I型人源化胶原蛋白C1L2T，其中，所述重组I型人源化胶原蛋白C1L2T包含以SEQ ID No.3所示的序列。

进一步地，上述重组I型人源化胶原蛋白C1L2T任选地包含以SEQ ID No.2所示的序列；优选地，以SEQ ID No.2所示的序列和以SEQ ID No.3所示的序列直接相连。

进一步地，上述重组I型人源化胶原蛋白C1L2T包含以下序列中的至少一种：以SEQID No.4所示的氨基酸序列；与以SEQ ID No.4所示的氨基酸序列具有大于等于90％的同一性的氨基酸序列，并且其保留以SEQ ID No.4所示的氨基酸序列的细胞黏附效果；以SEQ IDNo.4所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，并且其保留以SEQ ID No.4所示的氨基酸序列的细胞黏附效果；

由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码以SEQ ID No.4所示的氨基酸序列的多核苷酸序列在严格条件下杂交，并且所述氨基酸序列保留以SEQ ID No.4所示的氨基酸序列的细胞黏附效果，所述严格条件是中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件或非常高严格条件。

第二方面，本发明提供了多核苷酸，其编码上述重组I型人源化胶原蛋白C1L2T。

第三方面，本发明提供了表达载体，其包含上述多核苷酸。

第四方面，本发明提供了宿主细胞，其包含上述表达载体。

第五方面，本发明提供了上述重组I型人源化胶原蛋白C1L2T的生产方法，其包括以下步骤：①在培养基中培养上述本发明在第四方面提供的宿主细胞并生产蛋白；②收获并纯化所述蛋白，优选用Ni柱和/或离子交换层析纯化所述蛋白；③任选地对所述蛋白进行酶切，优选用PPase蛋白酶酶切所述蛋白。

第六方面，本发明提供了上述重组I型人源化胶原蛋白C1L2T在制备产品中的用途，其中所述产品优选是组织工程产品、化妆品、保健品或药物。

第七方面，本发明提供了包含上述重组I型人源化胶原蛋白C1L2T的产品，其中所述产品优选是组织工程产品、化妆品、保健品或药物。

第八方面，本发明提供了上述重组I型人源化胶原蛋白C1L2T在制备具有促进细胞黏附作用的产品中的用途。

发明的效果

通过上述技术方案的实施，本发明所制备的重组I型人源化胶原蛋白C1L2T相比I型人胶原蛋白本身具有更加良好的细胞黏附效果，其氨基酸序列选自天然I型人胶原蛋白氨基酸序列，应用于人体产生免疫反应的可能性较低，且制备方法简单。

附图说明

图1为重组表达质粒pET32a-C1L2T的图谱，其中C1L2T对应的氨基酸序列为SEQ IDNo.4。

图2为蛋白C1L2T诱导表达及纯化后的凝胶电泳图，第1泳道为分子量Marker，第2泳道为用Ni柱提纯后的C1L2T蛋白，第3泳道为PPase酶切后的C1L2T蛋白，第4泳道为用Capto Q柱纯化后的C1L2T蛋白。

图3为商品化的人胶原蛋白和蛋白C1L2T的细胞黏附活性检测结果。

具体实施方式

以下对本发明的实施方式进行说明，但本发明不限定于此。除非另有说明，本发明中使用的仪器设备、试剂、材料等均可通过常规商业手段获得。

本发明中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。本说明书中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。

本发明中，“组织工程产品”是指用于组织工程的产品。组织工程是一门以细胞生物学和材料科学相结合，进行体外或体内构建组织或器官的新兴学科。

本发明中，“医疗器械”是指直接或者间接用于人体的仪器、设备、器具、体外诊断试剂及校准物、材料以及其他类似或者相关的物品。

本发明中，“中等严格条件”，“中-高严格条件”，“高严格条件”或“非常高严格条件”描述了核酸杂交和洗涤的条件。进行杂交反应的指导参见Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6，其通过引用并入本文。在该文献中描述了含水的和非含水的方法，且可以使用任一种。例如，具体的杂交条件如下：(1)低严格性杂交条件在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，在约45℃，然后在至少50℃，在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤2次(对于低严格性条件，可以将洗涤温度升高到55℃)；(2)中等严格性杂交条件在6×SSC，在约45℃，然后在60℃，在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤1次或多次；(3)高严格性杂交条件在6×SSC，在约45℃，然后在65℃，在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤1次或多次且优选；(4)非常高的严格性杂交条件是0.5M磷酸钠，7％SDS，在65℃，然后在65℃，在0.2×SSC，1％SDS中洗涤1次或多次。

在本发明中，宿主细胞可以是原核细胞，例如肠杆菌科细菌，也可以是真核细胞，例如真菌和酵母。本领域技术人员可以通过用其它表达菌株替换大肠杆菌菌株作为宿主细胞。

在本发明中，所述核酸分子包括编码本发明的重组I型人源化胶原蛋白C1L2T的核酸序列。核酸可以是DNA或cDNA。核酸分子可以主要由编码本发明所述蛋白的核酸序列组成，或可以仅由编码本发明所述蛋白的核酸序列组成。此类核酸分子可以用本领域已知的方法合成。由于遗传密码具有简并性，不同核酸序列的核酸分子可以编码相同的氨基酸序列。

在本发明中，所述载体中包括本发明所述的核酸序列。合适的载体是载体构建领域已知的，包括启动子的选择和其他调控元件，例如增强子元件。本发明所述的载体包括适合引入细胞的序列。例如，载体可以是表达载体，在该载体中，所述蛋白的编码序列受到它自身顺式作用调控元件的控制，载体的设计便于宿主细胞的基因整合或基因替换等。

在本发明中，术语“载体”包括DNA分子，例如质粒、噬菌体、病毒或其他载体，它含有一个或多个异源的或重组的核酸序列。合适的噬菌体和病毒载体包括，但不限于：λ-噬菌体、EMBL噬菌体、猿猴病毒、牛疣病毒、Epstein-Barr病毒、腺病毒、疱疹病毒、小鼠肉瘤病毒、鼠类乳癌病毒、慢病毒等。

在本发明中，重组I型人源化胶原蛋白C1L2T可以通过本领域中的常规方法进行制备。例如，可以通过如下步骤生产：(1)大肠杆菌基因工程菌的构建：a.得到目的基因片段；b.将得到的目的基因片段插入pET-32a表达载体中得到重组表达质粒；c.将重组表达质粒转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，筛选得到阳性大肠杆菌基因工程菌；(2)大肠杆菌基因工程菌的发酵培养及蛋白的诱导和表达：a.从LB平板中挑取优选后的大肠杆菌基因工程菌单菌落，置于含有氨苄抗生素的液体培养基中，37℃，220rpm培养5小时，降温至16℃；b.加入终浓度为0.25mM IPTG进行诱导，培养18小时。3000rpm、4℃离心20min收集菌体；(3)蛋白的纯化和任选的酶切：a.用Tris缓冲液(25mM Tris，200mM NaCl，pH8.0)重悬细菌，均质破碎，17000rpm 4℃离心20分钟，收集上清液；b.利用Ni₆FF亲和柱结合蛋白，用含有20mM咪唑的洗涤缓冲液(20mM咪唑，25mM Tris，200mM NaCl，pH 8.0)漂洗杂蛋白，用含有250mM咪唑的溶液(250mM咪唑，25mM Tris，200mM NaCl，pH 8.0)洗脱目的蛋白；c.在洗脱的蛋白样品中加入适量具有His标签的Prescission Protease(PPase)蛋白酶16℃，酶切2h；d.将上述酶切后的蛋白透析换液至溶液A(20mM Tris，10mM NaCl，pH 8.0)中，并流经Capto Q离子交换柱，收集流穿液，即为去除载体蛋白的目的蛋白。

在实际应用中，可以将本发明的蛋白多肽或其药用盐、其衍生物或其药用盐、上述偶合物、上述多聚体和上述组合物作为药物直接给予患者、或者与适宜的载体或赋形剂混合后给予患者。这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。其中优选的是水溶性载体材料。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。其中，栓剂可为阴道栓剂，也可以是阴道环，也可以是适于阴道应用的药膏、乳霜或凝胶。所述蛋白多肽剂型可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。

使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腹腔注射、脑池内注射或灌输等；腔道给药，如经直肠、阴道和舌下；呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药。上述给药途径优选的是注射给药，优选的注射途径是皮下注射。

本发明的蛋白多肽或其药用盐、其衍生物或其药用盐、上述缀合物、上述多聚体和上述组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，所用的具体活性成分，给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。对于任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；所采用的具体活性成分的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体活性成分的给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；与所采用的具体活性成分组合使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，活性成分的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。

在本发明中，所述I型人胶原蛋白序列如下：

MFSFVDLRLLLLLAATALLTHGQEEGQVEGQDEDIPPITCVQNGLRYHDRDVWKPEPCRICVCDNGKVLCDDVICDETKNCPGAEVPEGECCPVCPDGSESPTDQETTGVEGPKGDTGPRGPRGPAGPPGRDGIPGQPGLPGPPGPPGPPGPPGLGGNFAPQLSYGYDEKSTGGISVPGPMGPSGPRGLPGPPGAPGPQGFQGPPGEPGEPGASGPMGPRGPPGPPGKNGDDGEAGKPGRPGERGPPGPQGARGLPGTAGLPGMKGHRGFSGLDGAKGDAGPAGPKGEPGSPGENGAPGQMGPRGLPGERGRPGAPGPAGARGNDGATGAAGPPGPTGPAGPPGFPGAVGAKGEAGPQGPRGSEGPQGVRGEPGPPGPAGAAGPAGNPGADGQPGAKGANGAPGIAGAPGFPGARGPSGPQGPGGPPGPKGNSGEPGAPGSKGDTGAKGEPGPVGVQGPPGPAGEEGKRGARGEPGPTGLPGPPGERGGPGSRGFPGADGVAGPKGPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGARGERGFPGERGVQGPPGPAGPRGANGAPGNDGAKGDAGAPGAPGSQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGDRGDAGPKGADGSPGKDGVRGLTGPIGPPGPAGAPGDKGESGPSGPAGPTGARGAPGDRGEPGPPGPAGFAGPPGADGQPGAKGEPGDAGAKGDAGPPGPAGPAGPPGPIGNVGAPGAKGARGSAGPPGATGFPGAAGRVGPPGPSGNAGPPGPPGPAGKEGGKGPRGETGPAGRPGEVGPPGPPGPAGEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQRGVVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGKQGPSGASGERGPPGPMGPPGLAGPPGESGREGAPGAEGSPGRDGSPGAKGDRGETGPAGPPGAPGAPGAPGPVGPAGKSGDRGETGPAGPAGPVGPVGARGPAGPQGPRGDKGETGEQGDRGIKGHRGFSGLQGPPGPPGSPGEQGPSGASGPAGPRGPPGSAGAPGKDGLNGLPGPIGPPGPRGRTGDAGPVGPPGPPGPPGPPGPPSAGFDFSFLPQPPQEKAHDGGRYYRADDANVVRDRDLEVDTTLKSLSQQIENIRSPEGSRKNPARTCRDLKMCHSDWKSGEYWIDPNQGCNLDAIKVFCNMETGETCVYPTQPSVAQKNWYISKNPKDKRHVWFGESMTDGFQFEYGGQGSDPADVAIQLTFLRLMSTEASQNITYHCKNSVAYMDQQTGNLKKALLLQGSNEIEIRAEGNSRFTYSVTVDGCTSHTGAWGKTVIEYKTTKTSRLPIIDVAPLDVGAPDQEFGFDVGPVCFL(SEQ ID No.1)。

在本发明中，使用的SEQ ID No.2序列为：GAPGPCCGG(SEQ ID No.2)，该序列为增强胶原活性的端序列肽段。

在一些具体的实施方案中，本发明所述的重组I型人源化胶原蛋白C1L2T包含以SEQ ID No.3所示的序列，其中以SEQ ID No.3所示的序列为I型人胶原蛋白肽段。

GQPGAKGANGAPGIAGAPGFPGARGPSGPQGPGGPPGPKGNSGEPGAPGSKGDTGAKGEPGPVGVQGPPGPAGEEGKRGARGEPGPTGLPGPPGERGGPGSRGFPGADGVAGPKGPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPP(SEQ IDNo.3)在另外一些具体的实施方案中，本发明所述的重组I型人源化胶原蛋白C1L2T包含以SEQ ID No.3所示的序列和以SEQ ID No.2所示的序列，其中以SEQ ID No.3所示的序列和以SEQ ID No.2所示的序列直接相连。

GQPGAKGANGAPGIAGAPGFPGARGPSGPQGPGGPPGPKGNSGEPGAPGSKGDTGAKGEPGPVGVQGPPGPAGEEGKRGARGEPGPTGLPGPPGERGGPGSRGFPGADGVAGPKGPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAPGPCCGG(SEQ ID No.4)

在其它一些优选的实施方案中，本发明所述的重组I型人源化胶原蛋白C1L2T包含以SEQ ID No.4所示的氨基酸序列或以SEQ ID No.4所示的序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或多个氨基酸的序列，只要本发明的重组I型人源化胶原蛋白C1L2T保留SEQ IDNo.4的氨基酸序列的细胞黏附效果。“多个”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个。

氨基酸添加指在氨基酸序列，例如在以SEQ ID No.4所示的氨基酸序列的C端或N端添加氨基酸，只要本发明的重组I型人源化胶原蛋白C1L2T保留以SEQ ID No.4所示的氨基酸序列的细胞黏附效果。

氨基酸取代指在氨基酸序列，例如以SEQ ID No.4所示的氨基酸序列中的某个位置的某个氨基酸残基被其他氨基酸残基替代，只要本发明的重组I型人源化胶原蛋白C1L2T保留以SEQ ID No.4所示的氨基酸序列的细胞黏附效果。

氨基酸插入指在氨基酸序列，例如在以SEQ ID No.4所示的氨基酸序列中的适当位置插入氨基酸残基，插入的氨基酸残基也可以全部或部分彼此相邻，或插入的氨基酸之间都不彼此相邻，只要本发明的重组I型人源化胶原蛋白C1L2T保留以SEQ ID No.4所示的氨基酸序列的细胞黏附效果。

氨基酸缺失指可以从氨基酸序列，例如从以SEQ ID No.4所示的氨基酸序列中删除1、2或3个以上氨基酸，只要本发明的重组I型人源化胶原蛋白C1L2T保留以SEQ ID No.4所示的氨基酸序列的细胞黏附效果。

在本发明中，取代可以是保守氨基酸取代，指与以SEQ ID No.4所示的氨基酸序列相比，有3个，更佳地2个氨基酸或1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成肽。这些保守性变异肽可以根据下表进行氨基酸替换而产生。

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。

实施例1：重组I型人源化胶原蛋白C1L2T的制备

1.构建C1L2T基因表达载体

本实施例中使用的重组I型人源化胶原蛋白C1L2T氨基酸序列全长为以SEQ IDNo.4所示的序列，共222aa，对应的基因全长666bp，针对大肠杆菌的密码子进行了密码子优化，优化后的序列为：GGACAACCCGGAGCAAAAGGTGCTAATGGGGCGCCTGGCATCGCCGGTGCTCCGGGATTCCCGGGCGCGAGAGGCCCGAGCGGTCCGCAGGGTCCGGGCGGTCCGCCGGGGCCGAAGGGAAACAGCGGTGAGCCGGGTGCGCCAGGCTCCAAAGGTGATACGGGTGCTAAAGGCGAACCGGGCCCGGTTGGTGTCCAGGGTCCACCGGGACCGGCTGGTGAGGAAGGTAAACGTGGTGCTCGCGGTGAGCCGGGTCCGACCGGTCTGCCGGGTCCGCCGGGCGAGCGCGGCGGTCCTGGTAGCCGTGGCTTTCCGGGCGCGGACGGCGTTGCAGGTCCGAAGGGCCCGGCCGGTGAGCGTGGTTCCCCGGGCCCAGCGGGCCCCAAGGGCAGCCCGGGCGAAGCGGGTCGTCCGGGTGAAGCAGGCCTGCCGGGTGCCAAAGGTTTGACCGGCTCTCCGGGCTCGCCGGGCCCAGATGGTAAAACCGGTCCGCCAGGTCCGGCGGGCCAAGACGGCCGTCCGGGTCCGCCGGGTCCTCCGGGCGCGCGTGGTCAAGCAGGCGTGATGGGTTTCCCGGGCCCGAAGGGTGCGGCAGGCGAGCCGGGTAAGGCGGGCGAACGCGGGGTGCCGGGCCCGCCGGGTGCACCGGGTCCGTGTTGTGGTGGT(SEQ ID No.5)。

委托北京盛元科萌基因生物科技有限公司进行上述基因片段的合成，并将合成后的基因片段插入pET-32a表达载体的BamHI和XhoI酶切位点之间，得到对应的重组表达质粒pET32a-C1L2T，详细图谱参见图1。

2.重组表达质粒的转化

将上述重组表达质粒转入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，筛选得到阳性大肠杆菌基因工程菌。

具体过程为：①取1μL的该质粒于100μL的大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，冰上静置30min；②将该混合物于42℃水浴锅中热激90s，然后迅速置于冰上静置2min；③向该混合物中加入700μL无抗性的LB液体培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠)，37℃，220rpm条件下培养1h；④取200μL该菌液均匀的涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，15g/L琼脂，100μg/mL氨苄青霉素)上；⑤将平板倒置培养于37℃恒温箱中，培养约16h，待长出清晰可见的菌落。

3.目的蛋白的诱导表达

从上述LB平板中挑取优选后的大肠杆菌基因工程菌单菌落，置于含有氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养5小时，降温至16℃后加入终浓度为0.25mM的IPTG进行诱导，培养18小时。3000rpm、4℃离心20min收集菌体。

4.C1L2T的纯化

用Tris缓冲液(25mM Tris，200mM NaCl，pH8.0)重悬细菌、进行溶菌，均质破碎，17000rpm 4℃离心20分钟，收集上清液；用清水洗涤Ni亲和柱柱材，用buffer 1(25mMTris，200mM NaCl，pH8.0)平衡柱材，上样，用含有20mM咪唑的洗涤缓冲液(20mM咪唑，25mMTris，200mM NaCl，pH 8.0)漂洗杂蛋白，用含有250mM咪唑的溶液(250mM咪唑，25mM Tris，200mM NaCl，pH 8.0)洗脱目的蛋白；用含有1M咪唑的溶液洗涤柱材，再用水洗涤柱材，最后用20％乙醇填充柱材。

在上述洗脱的蛋白样品中加入适量具有His标签的Prescission Protease(PPase)蛋白酶，16℃酶切2h。

将酶切后的蛋白透析换液至溶液A(20mM Tris，10mM NaCl，pH 8.0)中；用5倍柱体积的溶液A平衡Capto Q(Cytiva公司，货号：17531610)离子交换柱，将酶切换液后的蛋白流经Capto Q柱，并收集流穿液，即为去除载体蛋白的目的蛋白。

5.C1L2T的电泳检测

所得C1L2T利用SDS-PAGE检测纯度。具体过程为：取纯化后的蛋白液20μL，加入5μl5×的蛋白上样缓冲液(250mM的Tris-HCl(pH 6.8)，10％SDS，0.5％溴酚蓝，50％甘油，5％β-巯基乙醇)，置于100℃沸水中煮5min，然后每孔10μl加入SDS-PAGE蛋白胶中，电压150V电泳1h后，用考马斯亮蓝染色液(0.1％考马斯亮蓝R-250，25％乙醇，10％冰醋酸)进行蛋白染色3min，再利用蛋白脱色液(10％醋酸，5％乙醇)进行脱色。

检测结果如图2，C1L2T通过电泳所得的表观分子量为33kDa，分子量对应重组I型人源化胶原蛋白C1L2T，表明蛋白C1L2T得到正确的表达。

实施例2：重组I型人源化胶原蛋白C1L2T的生物活性检测

胶原蛋白的活性检测方法可以参考文献Juming Yao,Satoshi Yanagisawa,Tetsuo Asakura,Design,Expression and Characterization of Collagen-LikeProteins Based on the Cell Adhesive and Crosslinking Sequences Derived fromNative Collagens,J Biochem.136,643-649(2004)。具体实施方法如下：

(1)利用紫外吸收法检测待测蛋白样品的浓度，包括商品化的人胶原蛋白(Sigma，C7774)、本发明提供的重组I型人源化胶原蛋白C1L2T。

具体为分别测定样品在215nm和225nm下的紫外光吸收，利用经验公式C(μg/mL)＝144×(A215-A225)计算蛋白质浓度，注意需在A215<1.5的情况下检测。检测完蛋白浓度后，用PBS将所有待测蛋白浓度调整到0.5mg/ml。

(2)向96孔板中加入100μL各个蛋白溶液和空白PBS溶液对照，室温静置60min。

(3)每孔中加入10⁵个培养状态良好的3T3细胞，37℃孵育60min。

(4)每孔用PBS清洗4次。

(5)用LDH检测试剂盒(Roche，04744926001)检测在492nm的吸光度OD_492nm。根据空白对照的数值，可以计算出细胞的贴壁率。计算公式如下：细胞贴壁率＝(测试孔-空白孔)×100％/(阳性孔-空白孔)。

结果如图3所示，从对比中可知，相比于商品化的人胶原蛋白，添加了本发明的重组I型人源化胶原蛋白C1L2T的孔OD_492nm更大，意味着该孔细胞的贴壁率越大。证明本发明的蛋白C1L2T具有比商品化的人胶原蛋白更高的生物活性，能在更短的时间内给细胞提供优质的外环境，帮助细胞贴壁。

序列表

<110> 山西锦波生物医药股份有限公司

<120> 一种重组I型人源化胶原蛋白C1L2T及其制备方法和用途

<130> 6C39-2183050I

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1464

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Phe Ser Phe Val Asp Leu Arg Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Thr

1 5 10 15

Ala Leu Leu Thr His Gly Gln Glu Glu Gly Gln Val Glu Gly Gln Asp

20 25 30

Glu Asp Ile Pro Pro Ile Thr Cys Val Gln Asn Gly Leu Arg Tyr His

35 40 45

Asp Arg Asp Val Trp Lys Pro Glu Pro Cys Arg Ile Cys Val Cys Asp

50 55 60

Asn Gly Lys Val Leu Cys Asp Asp Val Ile Cys Asp Glu Thr Lys Asn

65 70 75 80

Cys Pro Gly Ala Glu Val Pro Glu Gly Glu Cys Cys Pro Val Cys Pro

85 90 95

Asp Gly Ser Glu Ser Pro Thr Asp Gln Glu Thr Thr Gly Val Glu Gly

100 105 110

Pro Lys Gly Asp Thr Gly Pro Arg Gly Pro Arg Gly Pro Ala Gly Pro

115 120 125

Pro Gly Arg Asp Gly Ile Pro Gly Gln Pro Gly Leu Pro Gly Pro Pro

130 135 140

Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu Gly Gly Asn Phe Ala

145 150 155 160

Pro Gln Leu Ser Tyr Gly Tyr Asp Glu Lys Ser Thr Gly Gly Ile Ser

165 170 175

Val Pro Gly Pro Met Gly Pro Ser Gly Pro Arg Gly Leu Pro Gly Pro

180 185 190

Pro Gly Ala Pro Gly Pro Gln Gly Phe Gln Gly Pro Pro Gly Glu Pro

195 200 205

Gly Glu Pro Gly Ala Ser Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly

210 215 220

Pro Pro Gly Lys Asn Gly Asp Asp Gly Glu Ala Gly Lys Pro Gly Arg

225 230 235 240

Pro Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Ala Arg Gly Leu Pro

245 250 255

Gly Thr Ala Gly Leu Pro Gly Met Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly

260 265 270

Leu Asp Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Glu

275 280 285

Pro Gly Ser Pro Gly Glu Asn Gly Ala Pro Gly Gln Met Gly Pro Arg

290 295 300

Gly Leu Pro Gly Glu Arg Gly Arg Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly

305 310 315 320

Ala Arg Gly Asn Asp Gly Ala Thr Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gly Pro

325 330 335

Thr Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Phe Pro Gly Ala Val Gly Ala Lys

340 345 350

Gly Glu Ala Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Ser Glu Gly Pro Gln Gly

355 360 365

Val Arg Gly Glu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Ala Gly Pro

370 375 380

Ala Gly Asn Pro Gly Ala Asp Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Ala Asn

385 390 395 400

Gly Ala Pro Gly Ile Ala Gly Ala Pro Gly Phe Pro Gly Ala Arg Gly

405 410 415

Pro Ser Gly Pro Gln Gly Pro Gly Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asn

420 425 430

Ser Gly Glu Pro Gly Ala Pro Gly Ser Lys Gly Asp Thr Gly Ala Lys

435 440 445

Gly Glu Pro Gly Pro Val Gly Val Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly

450 455 460

Glu Glu Gly Lys Arg Gly Ala Arg Gly Glu Pro Gly Pro Thr Gly Leu

465 470 475 480

Pro Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Gly Pro Gly Ser Arg Gly Phe Pro

485 490 495

Gly Ala Asp Gly Val Ala Gly Pro Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly

500 505 510

Ser Pro Gly Pro Ala Gly Pro Lys Gly Ser Pro Gly Glu Ala Gly Arg

515 520 525

Pro Gly Glu Ala Gly Leu Pro Gly Ala Lys Gly Leu Thr Gly Ser Pro

530 535 540

Gly Ser Pro Gly Pro Asp Gly Lys Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly

545 550 555 560

Gln Asp Gly Arg Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Arg Gly Gln

565 570 575

Ala Gly Val Met Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Ala Ala Gly Glu Pro

580 585 590

Gly Lys Ala Gly Glu Arg Gly Val Pro Gly Pro Pro Gly Ala Val Gly

595 600 605

Pro Ala Gly Lys Asp Gly Glu Ala Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly Pro

610 615 620

Ala Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Glu Gln Gly Pro Ala Gly Ser Pro

625 630 635 640

Gly Phe Gln Gly Leu Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly

645 650 655

Lys Pro Gly Glu Gln Gly Val Pro Gly Asp Leu Gly Ala Pro Gly Pro

660 665 670

Ser Gly Ala Arg Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Val Gln

675 680 685

Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly

690 695 700

Asn Asp Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser

705 710 715 720

Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala

725 730 735

Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly

740 745 750

Ala Asp Gly Ser Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Thr Gly Pro

755 760 765

Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Asp Lys Gly Glu Ser

770 775 780

Gly Pro Ser Gly Pro Ala Gly Pro Thr Gly Ala Arg Gly Ala Pro Gly

785 790 795 800

Asp Arg Gly Glu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Phe Ala Gly Pro

805 810 815

Pro Gly Ala Asp Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Glu Pro Gly Asp Ala

820 825 830

Gly Ala Lys Gly Asp Ala Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly

835 840 845

Pro Pro Gly Pro Ile Gly Asn Val Gly Ala Pro Gly Ala Lys Gly Ala

850 855 860

Arg Gly Ser Ala Gly Pro Pro Gly Ala Thr Gly Phe Pro Gly Ala Ala

865 870 875 880

Gly Arg Val Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Asn Ala Gly Pro Pro Gly

885 890 895

Pro Pro Gly Pro Ala Gly Lys Glu Gly Gly Lys Gly Pro Arg Gly Glu

900 905 910

Thr Gly Pro Ala Gly Arg Pro Gly Glu Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro

915 920 925

Gly Pro Ala Gly Glu Lys Gly Ser Pro Gly Ala Asp Gly Pro Ala Gly

930 935 940

Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val

945 950 955 960

Val Gly Leu Pro Gly Gln Arg Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Leu Pro

965 970 975

Gly Pro Ser Gly Glu Pro Gly Lys Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly

980 985 990

Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Met Gly Pro Pro Gly Leu Ala Gly Pro

995 1000 1005

Pro Gly Glu Ser Gly Arg Glu Gly Ala Pro Gly Ala Glu Gly Ser Pro

1010 1015 1020

Gly Arg Asp Gly Ser Pro Gly Ala Lys Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly

1025 1030 1035 1040

Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro

1045 1050 1055

Val Gly Pro Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala

1060 1065 1070

Gly Pro Ala Gly Pro Val Gly Pro Val Gly Ala Arg Gly Pro Ala Gly

1075 1080 1085

Pro Gln Gly Pro Arg Gly Asp Lys Gly Glu Thr Gly Glu Gln Gly Asp

1090 1095 1100

Arg Gly Ile Lys Gly His Arg Gly Phe Ser Gly Leu Gln Gly Pro Pro

1105 1110 1115 1120

Gly Pro Pro Gly Ser Pro Gly Glu Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly

1125 1130 1135

Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Lys

1140 1145 1150

Asp Gly Leu Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg

1155 1160 1165

Gly Arg Thr Gly Asp Ala Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly

1170 1175 1180

Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Ser Ala Gly Phe Asp Phe Ser Phe

1185 1190 1195 1200

Leu Pro Gln Pro Pro Gln Glu Lys Ala His Asp Gly Gly Arg Tyr Tyr

1205 1210 1215

Arg Ala Asp Asp Ala Asn Val Val Arg Asp Arg Asp Leu Glu Val Asp

1220 1225 1230

Thr Thr Leu Lys Ser Leu Ser Gln Gln Ile Glu Asn Ile Arg Ser Pro

1235 1240 1245

Glu Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp Leu Lys Met

1250 1255 1260

Cys His Ser Asp Trp Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Ile Asp Pro Asn Gln

1265 1270 1275 1280

Gly Cys Asn Leu Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn Met Glu Thr Gly

1285 1290 1295

Glu Thr Cys Val Tyr Pro Thr Gln Pro Ser Val Ala Gln Lys Asn Trp

1300 1305 1310

Tyr Ile Ser Lys Asn Pro Lys Asp Lys Arg His Val Trp Phe Gly Glu

1315 1320 1325

Ser Met Thr Asp Gly Phe Gln Phe Glu Tyr Gly Gly Gln Gly Ser Asp

1330 1335 1340

Pro Ala Asp Val Ala Ile Gln Leu Thr Phe Leu Arg Leu Met Ser Thr

1345 1350 1355 1360

Glu Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser Val Ala Tyr

1365 1370 1375

Met Asp Gln Gln Thr Gly Asn Leu Lys Lys Ala Leu Leu Leu Gln Gly

1380 1385 1390

Ser Asn Glu Ile Glu Ile Arg Ala Glu Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr

1395 1400 1405

Ser Val Thr Val Asp Gly Cys Thr Ser His Thr Gly Ala Trp Gly Lys

1410 1415 1420

Thr Val Ile Glu Tyr Lys Thr Thr Lys Thr Ser Arg Leu Pro Ile Ile

1425 1430 1435 1440

Asp Val Ala Pro Leu Asp Val Gly Ala Pro Asp Gln Glu Phe Gly Phe

1445 1450 1455

Asp Val Gly Pro Val Cys Phe Leu

1460

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Ala Pro Gly Pro Cys Cys Gly Gly

1 5

<210> 3

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly Ile Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Gly Phe Pro Gly Ala Arg Gly Pro Ser Gly Pro Gln Gly Pro

20 25 30

Gly Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asn Ser Gly Glu Pro Gly Ala Pro

35 40 45

Gly Ser Lys Gly Asp Thr Gly Ala Lys Gly Glu Pro Gly Pro Val Gly

50 55 60

Val Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Glu Glu Gly Lys Arg Gly Ala

65 70 75 80

Arg Gly Glu Pro Gly Pro Thr Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Glu Arg

85 90 95

Gly Gly Pro Gly Ser Arg Gly Phe Pro Gly Ala Asp Gly Val Ala Gly

100 105 110

Pro Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Pro

115 120 125

Lys Gly Ser Pro Gly Glu Ala Gly Arg Pro Gly Glu Ala Gly Leu Pro

130 135 140

Gly Ala Lys Gly Leu Thr Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly Pro Asp Gly

145 150 155 160

Lys Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Gln Asp Gly Arg Pro Gly Pro

165 170 175

Pro Gly Pro Pro Gly Ala Arg Gly Gln Ala Gly Val Met Gly Phe Pro

180 185 190

Gly Pro Lys Gly Ala Ala Gly Glu Pro Gly Lys Ala Gly Glu Arg Gly

195 200 205

Val Pro Gly Pro Pro

210

<210> 4

<211> 222

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gly Gln Pro Gly Ala Lys Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly Ile Ala Gly

1 5 10 15

Ala Pro Gly Phe Pro Gly Ala Arg Gly Pro Ser Gly Pro Gln Gly Pro

20 25 30

Gly Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asn Ser Gly Glu Pro Gly Ala Pro

35 40 45

Gly Ser Lys Gly Asp Thr Gly Ala Lys Gly Glu Pro Gly Pro Val Gly

50 55 60

Val Gln Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Glu Glu Gly Lys Arg Gly Ala

65 70 75 80

Arg Gly Glu Pro Gly Pro Thr Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Glu Arg

85 90 95

Gly Gly Pro Gly Ser Arg Gly Phe Pro Gly Ala Asp Gly Val Ala Gly

100 105 110

Pro Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ser Pro Gly Pro Ala Gly Pro

115 120 125

Lys Gly Ser Pro Gly Glu Ala Gly Arg Pro Gly Glu Ala Gly Leu Pro

130 135 140

Gly Ala Lys Gly Leu Thr Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly Pro Asp Gly

145 150 155 160

Lys Thr Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Gln Asp Gly Arg Pro Gly Pro

165 170 175

Pro Gly Pro Pro Gly Ala Arg Gly Gln Ala Gly Val Met Gly Phe Pro

180 185 190

Gly Pro Lys Gly Ala Ala Gly Glu Pro Gly Lys Ala Gly Glu Arg Gly

195 200 205

Val Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Cys Cys Gly Gly

210 215 220

<210> 5

<211> 666

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggacaacccg gagcaaaagg tgctaatggg gcgcctggca tcgccggtgc tccgggattc 60

ccgggcgcga gaggcccgag cggtccgcag ggtccgggcg gtccgccggg gccgaaggga 120

aacagcggtg agccgggtgc gccaggctcc aaaggtgata cgggtgctaa aggcgaaccg 180

ggcccggttg gtgtccaggg tccaccggga ccggctggtg aggaaggtaa acgtggtgct 240

cgcggtgagc cgggtccgac cggtctgccg ggtccgccgg gcgagcgcgg cggtcctggt 300

agccgtggct ttccgggcgc ggacggcgtt gcaggtccga agggcccggc cggtgagcgt 360

ggttccccgg gcccagcggg ccccaagggc agcccgggcg aagcgggtcg tccgggtgaa 420

gcaggcctgc cgggtgccaa aggtttgacc ggctctccgg gctcgccggg cccagatggt 480

aaaaccggtc cgccaggtcc ggcgggccaa gacggccgtc cgggtccgcc gggtcctccg 540

ggcgcgcgtg gtcaagcagg cgtgatgggt ttcccgggcc cgaagggtgc ggcaggcgag 600

ccgggtaagg cgggcgaacg cggggtgccg ggcccgccgg gtgcaccggg tccgtgttgt 660

ggtggt 666

Claims

1.一种重组I型人源化胶原蛋白C1L2T，其中，所述重组I型人源化胶原蛋白C1L2T包含以SEQ ID No.3所示的序列。

2.根据权利要求1所述的重组I型人源化胶原蛋白C1L2T，其特征在于，所述重组I型人源化胶原蛋白C1L2T任选地包含以SEQ ID No.2所示的序列；优选地，以SEQ ID No.2所示的序列和以SEQ ID No.3所示的序列直接相连。

3.根据权利要求1或2所述的重组I型人源化胶原蛋白C1L2T，其特征在于，所述重组I型人源化胶原蛋白C1L2T包含以下序列中的至少一种：

以SEQ ID No.4所示的氨基酸序列；

与以SEQ ID No.4所示的氨基酸序列具有大于等于90％的同一性的氨基酸序列，并且其保留以SEQ ID No.4所示的氨基酸序列的细胞黏附效果；

以SEQ ID No.4所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，并且其保留以SEQ ID No.4所示的氨基酸序列的细胞黏附效果；

4.多核苷酸，其编码根据权利要求1至3中任一项所述的重组I型人源化胶原蛋白C1L2T。

5.表达载体，其包含根据权利要求4所述的多核苷酸。

6.宿主细胞，其包含根据权利要求5所述的表达载体。

7.根据权利要求1至3中任一项所述的重组I型人源化胶原蛋白C1L2T的生产方法，其包括以下步骤：

①在培养基中培养根据权利要求6所述的宿主细胞并生产蛋白；

②收获并纯化所述蛋白，优选用Ni柱和/或离子交换层析纯化所述蛋白；

③任选地对所述蛋白进行酶切，优选用PPase蛋白酶酶切所述蛋白。

8.根据权利要求1至3中任一项所述的重组I型人源化胶原蛋白C1L2T在制备产品中的用途，其中所述产品优选是组织工程产品、化妆品、保健品或药物。

9.包含根据权利要求1至3中任一项所述的重组I型人源化胶原蛋白C1L2T的产品，其中所述产品优选是组织工程产品、化妆品、保健品或药物。

10.根据权利要求1至3中任一项所述的重组I型人源化胶原蛋白C1L2T在制备具有促进细胞黏附作用的产品中的用途。