CN113564255A - 一种lncRNA NEAT1_1的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种lncRNA NEAT1_1的应用，lncRNA NEAT1_1用于预测肺腺癌EGFR‑TKI的耐药。本发明的lncRNA NEAT1_1能够促进肺腺癌EGFR‑TKI耐药，可作为克服肺腺癌EGFR‑TKI耐药的治疗靶点，可用于制备克服肺腺癌EGFR‑TKI耐药的药物，具有广阔的临床应用前景。

Description

一种lncRNA NEAT1_1的应用

技术领域

本发明属于肿瘤学技术领域，具体涉及一种lncRNA NEAT1_1的应用。

背景技术

表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)显著改善了携带EGFR突变的肺腺癌患者的预后，但是耐药制约了该药物的进一步应用。筛选EGFR-TKI耐药的潜在人群对于提高有效率至关重要。EGFR T790M突变是目前已知的较为明确的导致EGFR-TKI耐药的因素之一，但其在中国临床的实际阳性率较低，仍有约35％的病例无法找到明确的耐药原因。近年来多项研究表明lncRNA在肺腺癌EGFR-TKI耐药中发挥重要作用。然而，lncRNA能否作为生物标志物预测肺腺癌EGFR-TKI耐药仍待探索。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种lncRNANEAT1_1的应用，该lncRNA NEAT1_1能够促进肺腺癌EGFR-TKI耐药，可作为克服肺腺癌EGFR-TKI耐药的治疗靶点，具有广阔的临床应用前景。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种lncRNA NEAT1_1的应用，所述lncRNA NEAT1_1用于预测肺腺癌EGFR-TKI的耐药，所述lncRNA NEAT1_1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

优选地，所述LncRNA NEAT1_1用于制备克服肺腺癌EGFR-TKI耐药的药物。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

本发明的lncRNA NEAT1_1能够促进肺腺癌EGFR-TKI耐药，可作为克服肺腺癌EGFR-TKI耐药的治疗靶点，具有广阔的临床应用前景。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1是本发明的实施例1的EGFR-TKI原发性耐药患者和敏感患者的lncRNA NEAT1_1表达水平图。

图2是本发明的实施例1的lncRNA NEAT1_1高表达患者和低表达患者的无进展生存时间和无进展生存患者累积比例关系图。

图3是本发明的实施例1的无进展生存时间为24个月时受试者工作特征曲线。

图4是本发明的实施例2的体外实验A的不同浓度的吉非替尼下PC9GR细胞活性图。

图5是本发明的实施例2的体外实验A的PC9GR细胞凋亡图。

图6是本发明的实施例2的体外实验B的不同浓度的吉非替尼下PC9GR细胞活性图。

图7是本发明的实施例2的体外实验B的PC9GR细胞凋亡图。

图8是本发明的实施例3的体内实验A的PC9GR细胞肿瘤体积图。

图9是本发明的实施例3的体外实验B的PC9GR细胞肿瘤体积图。

具体实施方式

实施例1

本实施例的lncRNA NEAT1_1的应用，所述lncRNA NEAT1_1(长链非编码RNANEAT1_1)用于预测肺腺癌EGFR-TKI(表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂)的耐药，所述lncRNA NEAT1_1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

收集活检组织，样本收集标准：①经病理学确诊为肺腺癌，②影像学评估已存在远处转移或肿瘤组织不可切除，③基因检测存在EGFR突变(19或21外显子)且不合并T790M突变，④口服EGFR-TKI类药物(包括吉非替尼、埃克替尼、厄洛替尼)作为一线治疗。共收集74例样本。

将活检组织用预冷的PBS清洗组织表面残余血液，在冰上分装，迅速置于液氮速冻30min，-80℃超低温冰箱中保存备用。组织RNA提取及定量分析：使用去酶眼科剪将组织剪碎，加入1000μL Trizol试剂，使用组织破碎仪裂解组织，室温静置10分钟后加入200μL的氯仿，涡旋10秒，室温静置3分钟，4℃、12000g离心15分钟；吸取400μL上清液并加入400μL预冷异丙醇，室温静置15分钟，4℃2000g离心10分钟；1mL无水乙醇洗涤沉淀，4℃条件下7500g离心10分钟；晾干，加入10μL的DEPC水溶解RNA沉淀。采用PrimeScript^TMRT试剂盒将提取的RNA反转录为cDNA，检测cDNA浓度后使用DEPC水将其稀释至10ng/μL。

应用CFX96 Real-Time PCR检测系统，以上述cDNA为模板，按照上海翊圣公司的HieffqPCR SYBR Green Master Mix试剂盒说明书进行实时定量PCR对lncRNA NEAT1_1进行检测，引物如下：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。用于检测GAPDH(内参)的引物如下：GAPDH上游引物的核苷酸序列如SEQID No.4所示，GAPDH下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5，所示实时定量PCR反应体系为：Hieff qPCR SYBR Green Master Mix 25μL、上游引物1μL、下游引物1μL、cDNA 2μL、无菌超纯水11μL；

在Applied Biosystems Step One仪器上机进行扩增，扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性10s、60℃退火延伸30s，循环40次。

患者在口服EGFR-TKI满4周后进行首次复查(影像学评估，采取RECIST v1.1标准)，之后每8周进行一次复查，首次复查即发现疾病进展被认为是原发性耐药，如图1所示，EGFR-TKI原发性耐药患者(图1中A)的lncRNA NEAT1_1表达水平显著高于敏感患者(图1中B)。

以患者从接受EGFR-TKI治疗至出现疾病进展之间的时间作为无进展生存时间(progression-free survival,PFS)。使用X-tile软件根据患者疾病进展情况、无进展生存时间(PFS)和lncRNA NEAT1_1表达水平对lncRNA NEAT1_1的阈值进行评估，最终lncRNANEAT1_1的表达阈值采用1.83×10^-7。根据表达阈值将患者分组为高表达组(47例)和低表达组(27例)。如图2所示，lncRNA NEAT1_1高表达组患者(图2中A)的PFS显著短于低表达组(图2中B)。

如图3所示，以24个月作为观察PFS的截止时间并绘制受试者工作特征曲线，结果表明lncRNA NEAT1_1作为生物标志物预测EGFR-TKI耐药的敏感性为82.35％，特异性为56.14％(图3中A为受试者曲线，B为对角线，仅作为参照)。

实施例2

本实施例的lncRNA NEAT1_1的应用，所述LncRNA NEAT1_1用于制备克服肺腺癌EGFR-TKI耐药的药物，所述药物中包含以LncRNA NEAT1_1序列为靶点的CRISPR技术或干扰质粒；所述lncRNA NEAT1_1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，本实施例为体外实验。

本实施例的lncRNA NEAT1_1能够促进肺腺癌EGFR-TKI耐药，可作为克服肺腺癌EGFR-TKI耐药的治疗靶点，抑制lncRNA NEAT1_1能够降低EGFR-TKI类药物(吉非替尼)处理PC9GR细胞时的IC₅₀值，而转染lncRNA NEAT1_1能够提高吉非替尼处理PC9细胞时的IC₅₀值，因此，抑制lncRNA NEAT1_1的表达将有助于克服EGFR-TKI耐药。

PC9细胞是一种携带EGFR 19外显子突变、对EGFR-TKI敏感的肺腺癌细胞，PC9GR细胞是一种PC9细胞经药物梯度递增法培养形成的携带EGFR 19外显子突变、无EGFR T790M突变且对EGFR-TKI耐药的细胞。

体外实验A：

使用shRNA敲低PC9GR细胞的lncRNA NEAT1_1，对其使用不同浓度的EGFR-TKI类药物吉非替尼(5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、50μM)处理48小时，使用CCK8-法检测PC9GR细胞的存活状态并计算吉非替尼的IC₅₀值，如图4所示，结果表明，与对照组(图4B)相比，吉非替尼处理敲低lncRNA NEAT1_1的PC9GR细胞(图4A)时的IC₅₀值显著降低。

使用30nM吉非替尼对敲低lncRNA NEAT1_1的PC9GR细胞以及对照组未做干预的PC9GR细胞进行干预，使用流式细胞术检测凋亡率，如图5所示，与对照组(图5B)相比，敲低lncRNA NEAT1_1的PC9GR细胞(图5A)的凋亡率显著提高(Annexin V-FITC/PI阳性细胞数量增加)。

体外实验B：

采用慢病毒转染在PC9细胞中过表达lncRNA NEAT1_1，对其使用不同浓度的EGFR-TKI类药物吉非替尼(5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、50μM)处理48小时，使用CCK8-法检测PC9细胞的存活状态并计算吉非替尼的IC₅₀值，结果表明，如图6所示，与对照组(图6B)相比，吉非替尼处理过表达lncRNA NEAT1_1的PC9细胞(图6A)时的IC₅₀值显著提高。

使用30μM吉非替尼对过表达lncRNA NEAT1_1的PC9细胞以及未做干预的PC9细胞(对照组)进行干预，使用流式细胞术检测凋亡率，如图7所示，与对照组(图7B)相比，过表达lncRNA NEAT1_1的PC9细胞(图7A)的凋亡率显著降低(Annexin V-FITC/PI阳性细胞数量减少)。

实施例3

本实施例的lncRNA NEAT1_1的应用，所述LncRNA NEAT1_1用于制备克服肺腺癌EGFR-TKI耐药的药物，所述药物中包含以LncRNA NEAT1_1序列为靶点的CRISPR技术或干扰质粒；所述lncRNA NEAT1_1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，本实施例为体内实验。

体内实验A：

分别采用4×10⁶个敲低lncRNA NEAT1_1的PC9GR细胞和未经干预的PC9GR细胞(对照组)通过皮下注射的方法使用BALB/c裸鼠建立荷瘤小鼠模型。每3天测量一次肿瘤大小并根据公式计算肿瘤体积(计算公式：肿瘤体积＝0.5×长×宽2)。待肿瘤体积约为100mm³时，每天给小鼠喂食EGFR-TKI类药物吉非替尼(剂量：50mg/kg小鼠体重)。6周后处死小鼠并切下肿瘤组织。如图8所示，与对照组相比，敲低lncRNA NEAT1_1的PC9GR细胞肿瘤增长更为缓慢，表明其对吉非替尼更敏感。

体内实验B：

分别采用4×10⁶个过表达lncRNA NEAT1_1的PC9细胞和未经干预的PC9细胞(对照组)通过皮下注射的方法使用BALB/c裸鼠建立荷瘤小鼠模型。每3天测量一次肿瘤大小并根据公式计算肿瘤体积(计算公式：肿瘤体积＝0.5×长×宽2)。待肿瘤体积约为100mm³时，每天给小鼠喂食吉非替尼(剂量：50mg/kg小鼠体重)。6周后处死小鼠并切下肿瘤组织。如图9所示，与对照组相比，过表达lncRNA NEAT1_1的PC9细胞肿瘤增长更为迅速，表明其对吉非替尼产生耐药。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

序列表

<110> 河北医科大学第四医院

<120> 一种lncRNA NEAT1_1的应用

<130> 2019.4.20

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3756

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 1

ggagttagcg acagggaggg atgcgcgcct gggtgtagtt gtgggggagg aagtggctag 60

ctcagggctt caggggacag acagggagag atgactgagt tagatgagac gagggggcgg 120

gctgggggtg cgagaaggaa gcttggcaag gagactaggt ctagggggac cacagtgggg 180

caggctgcat ggaaaatatc cgcagggtcc cccaggcaga acagccacgc tccaggccag 240

gctgtcccta ctgcctggtg gagggggaac ttgacctctg ggagggcgcc gctcttgcat 300

agctgagcga gcccgggtgc gctggtctgt gtggaaggag gaaggcaggg agaggtagaa 360

ggggtggagg agtcaggagg aataggccgc agcagccctg gaaatgatca ggaaggcagg 420

cagtgggtgc agggctgcag gagggccggg agggctaatc ttcaacttgt ccatgccagc 480

agcccctttt tttccagacc aagggctgtg aacccgcctg gggatgaggc ctggtcttgt 540

ggaactgaac ttagctcgac ggggctgacc gctctggccc agggtggtat gtaattttcg 600

ctcggcctgg gacggggccc aggccgggcc cagcctggtg gagcgtccag gtctgggtgc 660

gaagccaggc ccctgggcgg aggtgagggg tggtctgagg agtgatgtgg agttaaggcg 720

ccatcctcac cggtgactgg tgcggcacct agcatgtttg acaggcgggg actgcgaggc 780

acgctgctcg ggtgttgggg acaacattga ccaacgcttt attttccagg tggcagtgct 840

ccttttggac ttttctctag gtttggcgct aaactcttct tgtgagctca ctccacccct 900

tcttcctccc tttaacttat ccattcactt aaaacattac ctggtcatct ggtaagcccg 960

ggacagtaag ccgagtggct gttggagtcg gtattgttgg taatggtgga ggaagagagg 1020

ccttcccgct gaggctgggg tggggcggat cggtgttgct tgcctgcaga gagggtgggg 1080

agtgaatgtg cacccttggg tgggcctgca gccatccagc tgaaagttac aaaaatgctt 1140

catggaccgt ggtttgttac tatagtgttc ctcatggcga gcagatggaa ccgggagaca 1200

tggagtccct ggccagtgtg agtcctagca ttgcaggagg ggagaccctg gaggagagag 1260

cccgcctcaa ttgatgcctg cagattgaat ttccagaggc ttaggaggag gaagttctcc 1320

aatgttctgt ttccaggcct tgctcaggaa gccctgtatt caggaggcta ccatttaaag 1380

tttgcagatg agcttatggg gggcaatctt aaaaagtcca cagcagatgc atccggctcg 1440

aggggccatc agctttgaat aaatgcttgt tccagagccc atgaatgcca gcaggcaccc 1500

ctcctttcct ggggtaaagg ttttcagatg ctgcatcttc taaattgagc ctccggtcat 1560

actagttttg tgcttggaac cttgcttcaa gaagatccct aagctgtaga acattttaac 1620

gttgatgcca caacgcagat tgatgccttg tagatggagc ttgcagatgg agccccgtga 1680

cctctcacct acccacctgt ttgcctgcct tcttgtgcgt ttctcggaga agttcttagc 1740

ctgatgaaat aacttggggc gttgaagagc tgtttaattt taaatgcctt agactgggga 1800

tatattagag gaagcagatt gtcaaattaa gggtgtcatt gtgttgtgct aaacgctggg 1860

agggtacaag ttggtcattc ctaaatctgt gtgtgagaaa tggcaggtct agtttgggca 1920

ttgtgattgc attgcagatt actaggagaa gggaatggtg ggtacaccgg tagtgctctt 1980

ttgttcttgc ttcgtttttt taaacttgaa ctttacttcg ttagatttca taatactttc 2040

ttggcattct agtaagagga ccctgaggtg ggagttgtgg gggacgggga gaaggggaca 2100

gcttggcacc ggtcccgtgg gcgttgcagt gtgggggatg ggggtatgca gcttggcact 2160

ggtactggga gggatgaggg tgaagaaggg gagagggttg gttagagata cagtgtgggt 2220

ggtgggggtg gtaggaaatg caggttgaag ggaattctct ggggctttgg ggaatttagt 2280

gcgtgggtga gccaagaaaa tactaattaa taatagtaag ttgttagtgt tggttaagtt 2340

gttgcttgga agtgagaagt tgcttagaaa ctttccaaag tgcttagaac tttaagtgca 2400

aacagacaaa ctaacaaaca aaaattgttt tgctttgcta caaggtgggg aagactgaag 2460

aagtgttaac tgaaaacagg tgacacagag tcaccagttt tccgagaacc aaagggaggg 2520

gtgtgtgatg ccatctcaca ggcaggggaa atgtctttac cagcttcctc ctggtggcca 2580

agacagcctg tttcagaggg ttgttttgtt tggggtgtgg gtgttatcaa gtgaattagt 2640

cacttgaaag atgggcgtca gacttgcata cgcagcagat cagcatcctt cgctgcccct 2700

tagcaactta ggtggttgat ttgaaactgt gaaggtgtga ttttttcagg agctggaagt 2760

cttagaaaag ccttgtaaat gcctatattg tgggctttta acgtatttaa gggaccactt 2820

aagacgagat tagatgggct cttctggatt tgttcctcat ttgtcacagg tgtcttgtga 2880

ttgaaaatca tgagcgaagt gaaattgcat tgaatttcaa gggaatttag tatgtaaatc 2940

gtgccttaga aacacatctg ttgtcttttc tgtgtttggt cgatattaat aatggcaaaa 3000

tttttgccta tctagtatct tcaaattgta gtctttgtaa caaccaaata accttttgtg 3060

gtcactgtaa aattaatatt tggtagacag aatccatgta cctttgctaa ggttagaatg 3120

aataatttat tgtattttta atttgaatgt ttgtgctttt taaatgagcc aagactagag 3180

gggaaactat cacctaaaat cagtttggaa aacaagacct aaaaagggaa ggggatgggg 3240

attgtgggga gagagtgggc gaggtgcctt tactacatgt gtgatctgaa aaccctgctt 3300

ggttctgagc tgcgtctatt gaattggtaa agtaatacca atggcttttt atcatttcct 3360

tcttcccttt aagtttcact tgaaatttta aaaatcatgg ttatttttat cgttgggatc 3420

tttctgtctt ctgggttcca ttttttaaat gtttaaaaat atgttgacat ggtagttcag 3480

ttcttaacca atgacttggg gatgatgcaa acaattactg tcgttgggat ttagagtgta 3540

ttagtcacgc atgtatgggg aagtagtctc gggtatgctg ttgtgaaatt gaaactgtaa 3600

aagtagatgg ttgaaagtac tggtatgttg ctctgtatgg taagaactaa ttctgttacg 3660

tcatgtacat aattactaat cacttttctt cccctttaca gcacaaataa agtttgagtt 3720

ctaaactcat tagaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 3756

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 2

ctgaacttag ctcgacgggg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 3

gcgccttaac tccacatcac 20

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 4

gtcaccttca ccgttccagt ttt 23

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 5

cttagttgcg ttacaccctt tctt 24

Claims (2)

1.一种lncRNA NEAT1_1的应用，其特征在于，所述lncRNA NEAT1_1用于预测肺腺癌EGFR-TKI的耐药，所述lncRNA NEAT1_1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种lncRNA NEAT1_1的应用，其特征在于，所述LncRNANEAT1_1用于制备克服肺腺癌EGFR-TKI耐药的药物。

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